مقالة منهجية

التحسين السريع لنظام محفز للضوء للتحكم في التعبير الجيني للثدييات

DOI:

10.3791/68779

⸱

نوفمبر 4, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of California, Davis, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Davis

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه الدراسة طريقة للتجارب عالية الإنتاجية باستخدام مصفوفة LED مطبوعة ثلاثية الأبعاد لتحسين التعبير الجيني المحفز للضوء في HEK293T الخلايا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن لأدوات التعبير الجيني المحرضة أن تفتح تطبيقات جديدة في صحة الإنسان والتكنولوجيا الحيوية ، ولكن الخيارات الحالية غالبا ما تكون باهظة الثمن ، ويصعب عكسها ، ولها تأثيرات غير مرغوب فيها خارج الهدف. تستخدم أنظمة الوراثة البصرية بروتينات مستجيبة للضوء للتحكم في نشاط المنظمين بحيث يتم التحكم في التعبير من خلال "قلب المفتاح". تعمل هذه الدراسة على تحسين نظام مستجيب CRISPR المبسط المنشط بالضوء (2pLAC) ، والذي يوفر تحكما قابلا للضبط وقابلا للعكس ودقيقا في التعبير الجيني للثدييات. يتيح OptoPlate-96 الفحص عالي الإنتاجية عبر قياس التدفق الخلوي لتحليل الخلية المفردة والتحسين السريع ل 2pLACE. توضح هذه الدراسة كيفية استخدام نظام 2pLACE مع OptoPlate-96 في HEK293T الخلايا لتحديد نسب المكونات المثلى لتعظيم النطاق الديناميكي وإيجاد منحنى استجابة شدة الضوء الأزرق. يمكن تطوير تدفقات عمل مماثلة لخلايا الثدييات الأخرى وللأنظمة البصرية الأخرى والأطوال الموجية للضوء. تعزز هذه التطورات الدقة وقابلية التوسع والقدرة على التكيف لأدوات الوراثة البصرية لتطبيقات التصنيع الحيوي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قدمت أدوات البيولوجيا التركيبية مثل أنظمة التعبير الجيني المحرضة مساهمات كبيرة في البحث البيولوجي. يمكن أن تؤدي قدرتها على تنظيم التعبير الجيني بطريقة قابلة للضبط وقابلة للعكس ودقيقة إلى تحسين التحكم في إنتاج البروتين1،2،3،4،5،6 ، مورفولوجيا الخلية7،8،9،10،11،12 ، مسارات التمثيل الغذائي13،14،15، 16 ، 17 ، 18 ، وأهداف أخرى للتصنيع الحيوي والتطبيقات العلاجية. يمكن أن يكون للأنظمة المحفزة للمواد الكيميائية19,20 أو تأثيرات غير مستهدفة. يمكن أن تكون الإضافات الكيميائية باهظة الثمن ويصعب توسيع نطاقها صناعيا بسبب عمليات التنقية الإضافية في المصب21،22،23. يمكن أن توفر أنظمة التعبير الجيني المحفزة للضوء طريقة قابلة للتطوير ودقيقة لممارسات التصنيع الحيوي24،25،26،27.

تم تطوير العديد من أنظمة التعبير الجيني المحفزة للضوء كأدوات مفيدة للبيولوجيا التركيبية في مجموعة متنوعة من التطبيقات28،29،30،31،32،33،34،35،36 والأطوال الموجية من الأزرق35،37،38 ، الأحمر / الأحمر البعيد12،39 ،40 ، أو أخضر41 ضوء. في حالة تنظيم الجينات البصرية الوراثية المستندة إلى CRISPR ، يمكن أن يؤثر تعديل كمية الحمض النووي الريبي التوجيهي الفردي (gRNAs) الذي يتم تسليمه على تعبير mRNA للجينات الداخلية42 ، وسيحتاج إلى تحسينه لخطوط الخلايا المختلفة. يمكن أيضا استخدام بروتينات التنشيط مثل VP6437،42،43،44 أو VP1639،40،44،45،46 أو p6544 أو اندماجها47 ، مما يزيد من نمطية الأنظمة البصرية الوراثية. من أجل التحقيق في المسارات البيولوجية المعقدة والمتشابكة12،40،48،49،50،51،52،53 ، يمكن اختبار مجموعات مختلفة من هذه المكونات المعروفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تظهر خطوط الخلايا المختلفة اختلافات في الحث مع نفس النظام52. يمكن أن تؤدي مستويات الحث المختلفة إلى عدم كفاية التعبير الجيني أو الحساسية في التحكم الدقيق في التعبير الجيني ، مما يتطلب اختبارا صارما للعثور على نظام بصري مثالي في خطوط الخلايا الجديدة أو الأكثر صلة بيولوجيا. مع الوتيرة المتزايدة واتساع قابلية تطبيق تنظيم الجينات البصرية ، من الضروري توصيف هذه الأنظمة المختلفة بسرعة.

تستخدم الطرق الحالية في توصيف أدوات البصريات الوراثية إما تعبيرا مستقرا أو عابرا للجينات12،54. يمكن أن يستغرق إنشاء خطوط خلوية معبرة بثبات وتحسين ديناميكيات النظام لتحقيق أقصى قدر من التعبير وقتا طويلا وبالتالي مكلفا. يتيح التعبير العابر رؤى سريعة وقيمة ، خاصة عند اختبار أنظمة البصريات متعددة المكونات. هنا ، استخدمنا نظام مستجيب CRISPR-dCas9 (LACE) 37 الذي يتم تنشيطه بالضوء الأزرق ، والذي يتكون من cryptochrome 2 (CRY2) ومحطة N الحلزونية الأساسية الحلزونية التي تتفاعل مع cryptochrome. تم استخدامه للتحكم في التعبير الجيني في خلايا الثدييات مثل HEK293T (خلايا الكلى الجنينية البشرية) 37،38 ، CHO-DG44 (خلايا مبيض الهامستر الصيني) 55 ، و C2C12 (خلايا الأرومة العضلية للفأر) 38. طبيعتها المعيارية مثالية لتوصيف أداء النظام بسرعة من خلال التعبير العابر وطرق الإنتاجية العالية. على سبيل المثال ، قد تحتاج الأنظمة متعددة المكونات مثل LACE إلى تحسين نسب الكتلة لتحسين الحث ، وهي خطوة لا تستخدم عادة في توصيف النظام البصري الوراثي.

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل التحسين والتوصيف السريع لنظامين من البلازميد LACE (2pLAC) 38 . في هذا الإعداد ، يتحكم 2pLACE في التعبير عن مراسل الفلورسنت ، eGFP (بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن) ، في HEK293T خلايا. يتم تنفيذ التنشيط في ألواح 96 بئرا زجاجية سوداء باستخدام OptoPlate-96 ، وهي مجموعة LED مطبوعة ثلاثية الأبعاد صممها وشيدها Lukasz Bugaj وزملاؤه56،57،58،59. يعمل هذا البروتوكول على وجه التحديد على تحسين الحد الأقصى للتعبير بنسب كتلة مختلفة لنظام البلازميد. يتضمن أيضا رمزا سهل الاستخدام للتحكم في شدة الضوء المختلفة للتحقق من قابلية ضبط النظام ونطاقه الديناميكي الكامل. يستخدم قياس التدفق الخلوي لجمع البيانات وتحليلها. يمكن العثور على بروتوكولات توليد تركيبات البلازميد ومواد الطباعة ثلاثية الأبعاد لمصفوفة LED في المنشورات السابقة54،56. تسلط هذه الطرق الضوء على خط أنابيب سريع وعالي الإنتاجية لتوصيف أنظمة التعبير الجيني المحفزة للضوء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. طلاء HEK293T الخلايا بتنسيق 96 بئرا

  1. في خزانة السلامة البيولوجية ، اجمع حاوية نفايات التبييض ، والماصات المصلية ، ومساعدات الماصات ، والمحلول الملحي الفوسفات المخزن من Dulbecco (DPBS) ، ووسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) مع مصل أبقار الجنين بنسبة 10٪ (FBS) ، وقارورة زراعة الخلايا T-75 مع خلايا HEK293T متجمعة. قم بتسخين الوسائط إلى 37 درجة مئوية.
  2. في قارورة T-75 ، تأكد من أن التقاء الالتقاء حوالي 80٪ -100٪ من خلال مجهر مقلوب.
  3. في خزانة السلامة البيولوجية ، استخدم ماصة مصلية لشفط الوسائط المستهلكة من قارورة مزرعة الخلية. تجنب لمس سطح القارورة أو بلاستيكها. تخلص من الوسائط المستهلكة والشفاط في حاوية النفايات.
  4. اغسل الخلايا برفق بحوالي 10 مل من DPBS عن طريق شفطها في زاوية من القارورة وتدويرها برفق حول السطح. استنشق DPBS من القارورة وتخلص من الغسيل والشفاط في حاوية النفايات.
  5. أضف 1.5 مل من 0.05٪ Trypsin-EDTA لتغطية سطح القارورة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة. اضغط برفق على القارورة لفك الخلايا من السطح.
  6. أضف 8.5 مل من DMEM الطازج إلى القارورة. أعد تعليق الخلايا وخلطها باستخدام ماصة مصلية حتى يتم تكسير جميع الركام عن طريق الشفط لأعلى ولأسفل.
  7. اجمع 9 مل من تعليق الخلية في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
    1. أضف 9 مل من DMEM الطازج إلى القارورة وضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2
  8. باستخدام مقياس الخلايا الدموية ، امزج 10 ميكرولتر من الخلايا العالقة مع 10 ميكرولتر من صبغة تريبان الزرقاء بنسبة 1: 1 لحساب تركيز الخلايا. استخدم هذه القيمة لتحضير خلايا كافية للبذر على الطبق.
  9. بذرة ~ 35,000 خلية في 100 ميكرولتر لكل بئر من صفيحة سفلية زجاجية سوداء عالية الأداء # 1.5 بئر 96 بئر وضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة.

2. 2pLACE تحسين تعداء

  1. للحصول على بئر واحد و 10٪ فائض ، قم بإضافة 11 ميكرولتر من DMEM الدافئ الخالي من المصل (SFM) في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
  2. باستخدام CRY2-eGFP: نسب كتلة البلازميد CIBN-gRNA تساوي 1: 9 و 2: 8 و 3: 7 و 4: 6 و 5: 5 و 6: 4 و 7: 3 و 8: 2 و 9: 1 ، aliquot 110 نانوغرام لكل بئر من إجمالي الحمض النووي إلى نسب الكميات من SFM (الجدول 1).
  3. كعنصر تحكم إيجابي ، قم بتقسيم نفس كتلة بلازميد CMV-eGFP إلى نطاقات مختلفة من SFM.
  4. لكل بئر ، اقتباس 11 ميكرولتر من SFM لتخفيف كاشف التعداد.
  5. قم بإعداد كاشف التعداء بنسبة كتلة 1: 3 (ميكروغرام) إلى الحجم (ميكرولتر) من الحمض النووي وكاشف التعدي.
  6. أضف كاشف تعداء مخفف إلى الحمض النووي المخفف واحتضنه لمدة 12 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإنشاء مجمعات التعدي.
  7. أضف ~ 20 ميكرولتر من مركب التعداء إلى كل بئر. تأكد من أنه لا يلمس جدران البئر.
  8. لف الطبق بورق الألمنيوم وضعه في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة.

3. تنشيط 2pLACE

  1. قم بتعديل رمز إدخال المتحكم الدقيق لإضاءة الآبار المطلوبة باستخدام هذه الإعدادات (ملف الترميز التكميلي 1 ، الأسطر 147 - 158).
    1. شدة LED: 9.27 ميجاوات / سم2 (ملف الترميز التكميلي 1 ، الأسطر 200 - 215).
    2. طول النبض: 1 ثانية (ملف الترميز التكميلي 1 ، الأسطر 280 - 290).
    3. تردد النبض: 0.067 هرتز (كل 15 ثانية) (ملف الترميز التكميلي 1 ، الأسطر 264 - 278).
      ملاحظة: يتم تحديد إعدادات الطول الموجي حسب أنواع مصابيح LED المثبتة.
  2. رش الغطاء المطبوع ثلاثي الأبعاد ل OptoPlate بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركه يجف في خزانة السلامة الحيوية.
  3. قم بتشغيل مصباح الضوء الأحمر المظلم وضع اللوحة ذات 96 بئرا في خزانة السلامة الحيوية ، واستبدل الغطاء بالغطاء المجفف المطبوع ثلاثي الأبعاد.
    ملاحظة: يمكن للمرء أن يعرض اختياريا خلايا CMV-eGFP باستخدام الفحص المجهري الفلوري لتقدير كفاءة التعاءة.
  4. خذ لوحة 96 بئرا وضعها على مصفوفة LED لبناء جهاز مصفوفة LED. تأكد من أن اللوحة تستقر في مكانها.
  5. قم بتوصيل منافذ المتحكم الدقيق ومؤشر LED والمروحة بمصدر طاقة.
  6. رش الأسلاك بعناية بنسبة 70٪ من الإيثانول وامسحها حتى تجف.
  7. ضع جهاز صفيف LED في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة. تأكد من تشغيل مصابيح LED على النحو المنشود وأن الأسلاك ليست مشدودة عند إغلاق الحاضنة.

4. إعداد قياس التدفق الخلوي

  1. أثناء وجودك في بيئة الضوء الأحمر ، أخرج OptoPlate وضع اللوحة في خزانة السلامة الحيوية
    ملاحظة: يمكن للمرء اختياريا عرض الخلايا عن طريق الفحص المجهري الفلوري لتأكيد تحريض الضوء بصريا.
  2. استنشق بعناية جميع الوسائط من كل بئر.
  3. افصل الخلايا باستخدام 30 ميكرولتر من 0.05٪ Trypsin-EDTA واحتضنها لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. امزج كل منها جيدا مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS البارد (1٪ FBS في PBS) حتى تصبح وحيدة الخلية.
  5. انقل كل عينة إلى طبق 96 بئر على شكل حرف V.
  6. قم بالطرد المركزي للوحة 96 بئر على شكل V عند 164 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. استنشاق 80 ميكرولتر من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات.
  8. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS البارد لإعادة تعليق الحبيبات.
  9. لف لوحة 96 بئر على شكل V بورق ألومنيوم لعزل الضوء.
  10. ضع الطبق في صندوق الستايروفوم به ثلج للنقل.

5. بوابات قياس التدفق الخلوي وجمع البيانات

  1. قم بتشغيل مقياس التدفق الخلوي باستخدام المفتاح الموجود في الخلف ، وافتح برنامج قياس التدفق الخلوي المعني على الكمبيوتر.
  2. قم بتشغيل برنامج بدء تشغيل النظام وقم بتحميل 2 مل من ماء DI في محمل العينة (الشكل التكميلي 1 أ).
  3. قم بتشغيل مراقبة الجودة (QC) باستخدام حبات مراقبة الجودة المتوفرة (الشكل التكميلي 1 ب).
  4. تأكد من أن مقياس التدفق الخلوي في وضع أخذ عينات اللوحة (الشكل التكميلي 1C).
  5. قم بإعداد وتحديد آبار العينة (الشكل التكميلي 1 د).
  6. قم بإنشاء مخططات وجداول التبعثر التالية (الشكل التكميلي 2 أ).
    1. التشتت الجانبي (SSC-A) مقابل المبعثر الأمامي (FSC-A).
    2. SSC-H مقابل SSC-A.
    3. SSC-A مقابل FITC-A.
    4. جدول إحصائيات FITC-A (الشكل التكميلي 2 ب).
  7. قم بتثبيت اللوحة السفلية على شكل حرف V في محمل اللوحة الخاص بمقياس الخلوة.
  8. حدد بئرا غير منقوش وانقر فوق تهيئة ، ثم انقر فوق تشغيل. تأكد من أن معدل عينة الحجم هو 10 ميكرولتر / دقيقة (الشكل التكميلي 2 ج).
  9. اضبط الفولتية SSC و FITC لتمركز السكان المعنيين على مخطط SSC-A مقابل FSC-A (الشكل التكميلي 2C).
    1. قم بإنشاء مضلع لبوابة مجموعة الخلايا السليمة ذات الأهمية (الشكل التكميلي 2D).
    2. قم بإنشاء مضلع لبوابة التمييز المزدوج على مخطط SSC-H مقابل SSC-A.
    3. اضبط جهد FITC لوضع الخلايا غير المنقولة باتجاه يسار مخطط SSC-A مقابل FITC-A (الشكل التكميلي 2D).
  10. كرر ذلك مع الآبار المتبقية غير المنقولة وسجل متوسط بيانات FITC-A.
  11. حدد CMV-eGFP تم نقلها جيدا وانقر فوق تشغيل.
  12. اضبط جهد FITC لالتقاط كل من خلايا التألق الذاتي والخلايا الفلورية في مخطط SSC-A مقابل FITC-A.
    1. قم بإنشاء مضلع لبوابة الخلايا الفلورية ضد الخلايا غير الفلورية مع الإشارة إلى البوابة الأولية في الخلايا غير المتفلورة (الشكل التكميلي 2E).
  13. سجل العينات تلقائيا عند 60 ميكرولتر / دقيقة حتى يتم الوصول إلى 200 ثانية و / أو وصلت الأحداث إلى 10,000 (الشكل التكميلي 2F).
  14. تصدير متوسط FITC كملف CSV وتحليل البيانات.
  15. قم بتنظيف مقياس التدفق الخلوي من خلال خيار التنظيف اليومي (الشكل التكميلي 2G).

6. تحسين كثافة LED

  1. قم بتحرير البرنامج النصي للمتحكم الدقيق لاختبار شدة LED المطلوبة (ملف الترميز التكميلي 1 ، الأسطر 200-215).
    ملاحظة: يتم الإبلاغ عن شدة LED المكافئة فيما يتعلق بالقيم الموجودة في البرنامج النصي للمتحكم الدقيق في مكان آخر38. قد تكون المعايرة الذاتية ضرورية عند استخدام مصابيح LED مختلفة.
  2. تأكد من أن البرنامج النصي يحتوي على القيم التالية في (ملف الترميز التكميلي 1 ، الأسطر 200-215) كما هو مصمم في الجدول 2 ، وقم بتحميل الكود إلى المتحكم الدقيق.
  3. كرر الخطوات من 1 إلى 5.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من خلال اعتماد عناصر سير العمل من الأدبيات السابقة37،38،55 ، أضفنا إضاءة متزامنة عالية الإنتاجية من OptoPlate-96 وأظهرنا خط أنابيب لتحسين نظام التعبير الجيني المحفز للضوء بسرعة في خلايا الثدييات (الشكل 1).

بالنسبة لأنظمة التعبير الجيني المحفزة ، تعد النطاقات الديناميكية العالية علامة أداء مهمة ، بالإضافة إلى التعبير المطلق للتشغيل والإيقا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول التحكم البصري الجيني للتعبير الجيني العابر متعدد المكونات في خلايا الثدييات ، مما يسمح للباحثين الآخرين بتوصيف أنظمة البصريات المعيارية بسرعة وفي وقت واحد باستخدام مراسل الفلورسنت.

في هذه الحالة ، تم تحسين نظام ثنائي البلازميد المحفز للضوء للتعبير عن eGFP في HEK293T الخلايا. من أجل التعداء المشترك الناجح ، من الضروري تحسين كثافة البذر ونسب الكتلة للحصول على أعلى كفاءة تعدي. هذا أمر بالغ الأهمية بشكل خاص عند تنفيذ ذلك في زراعة الخلايا الجذعي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا العمل مدعوم من قبل معهد البحوث الانتقالية من خلال اتفاقية ناسا التعاونية NNX16AO69A ومعهد الأغذية الجيدة. تم دعم هذا المشروع من قبل مختبر الموارد المشتركة لقياس التدفق الخلوي بجامعة كاليفورنيا في ديفيس بمساعدة فنية من بريدجيت ماكلولين وجوناثان فان دايك وآشلي كاراجه ، بتمويل من NCI P30 CA093373 (مركز السرطان الشامل) و S10OD018223 (مقياس الخلية بيكمان كولتر "Cytoflex").

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب الطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 ملVWR10025-724
خزانات كاشف بسعة 10 ملVWR77395-252
ماصات مصلية بسعة 10 ملVWR75816-100
1000 μ رؤوس فلتر LVWR76322-154
15 مل & رطوب; أنابيب الطرد المركزي عالية الأداء، غطاء مسطحVWR89039-664
عداد القدرة البصرية 1931-Cنيوبورت1931-C
2 مل من الماصات المصليةVWR75816-104
20 & mu; رؤوس فلتر LVWR76322-134
200 μ رؤوس فلتر LVWR76322-150
أنابيب طرد مركزي عالي الأداء بسعة 50 مل، غطاء مسطحVWR89039-656
ألواح قاع V ذات 96 بئرلوحات العلامة التجارية781661
A21، مصباح LED أحمرمصابيح بلوكسلا يوجدمصدر الضوء الأحمر
برنامج تطوير تطوير أردوينوأردوينولا يوجد
خزانة السلامة الحيوية، الفئة الثانيةNuAireلا يوجد
مقياس الخلايا الدموية ذو الخط الساطعهاوسر العلمي3110
شرائح عد الخلايابيوراد1450016
صفيحة زراعة الخلايا 96-بئر، صفيحة زجاجية #1.5HسيلفيسP96-1.5H-N
برنامج CytExpertبيكمان كولترلا يوجد
سايتوفليكس جاهزة للاستخدام اليومية للفلوروسفيراتبيكمان كولترC657194 & deg; C
جهاز قياس تدفق CytoFLEX-S (4 بنفسجي، 2 أزرق، 4 أصفر أخضر، 3 قنوات حمراء)بيكمان كولترC09766
مسحوق الملح الفوسفات من دولبيكو، بدون كاليكيوم، بدون مغنيسيومفيشر ساينتيفك21600069درجة حرارة الغرفة
جهاز الطرد المركزي في إبندورف 5804إبندورف  022622501خطوة الطرد المركزي ذو اللوحة السفلية V
جهاز الطرد المركزي إيبندورف 5810Rإبندورف22625501
إبندورف ريسيرش بلس، 8 قنوات، حجم متغير، 30 - 300 & mu؛ Lإبندورف3125000052
أبحاث إبندورف بلس، قناة واحدة، حجم متغير، 100 - 1000 & mu; Lإبندورف3123000063
أبحاث إبندورف بلس، قناة واحدة، حجم متغير، 2 - 20 & mu; Lإبندورف3123000039
أبحاث إبندورف بلس، قناة واحدة، حجم متغير، 20 - 200 & mu; Lإبندورف3123000055
شريط المعلم المختبري العامVWR89097-920
Gibco DMEM، مسحوق، ارتفاع الجلوكوزفيشر ساينتيفك121000614 & deg; C
محلول جيبكو تريبان الأزرق، 0.4٪فيشر ساينتيفك15-250-061درجة حرارة الغرفة
جهاز جيبكو فاليو للحرارة الميدانية المعطلةفيشر ساينتيفكA5256901-20 & deg; C
جيبكو، تريبسين-إيدتا (0.05٪)، مع EDTA، أنيمال أوريجن، 1X، فينول ريد، 500 ملجيبكو25300062-20 & deg; C
HEK293T الخلاياATCCCRL-11268-80 & درجة؛ C، النيتروجين السائل
علامات المختبر، ميكرونوفاVWR89205-944
مصباح مكتب معدنيتصاميم بسيطةلا يوجدمصباح للضوء الأحمر
أوبتوبليت-96LABmakerلا يوجد
خبرة مساعد الأنابيبدروموند4-000-101
البلازميد: CIBN-gRNAلا يوجدلا يوجد-20 & deg; C
البلازميد: CMV-eGFPلا يوجدلا يوجد-20 & deg; C
البلازميد: CRY2-eGFPلا يوجدلا يوجد-20 & deg; C
كاشف النقل الصناعي للحمض النووي بولي جيتفيشر ساينتيفكNC15361174 & deg; C
قارورة زراعة الخلايا T-75VWR10062-860
حاضنة CO2 مغطاة بالماءVWR10810-884

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Poulain, A., Perret, S., Malenfant, F., Mullick, A., Massie, B., Durocher, Y. Rapid protein production from stable CHO cell pools using plasmid vector and the cumate gene-switch. J Biotechnol. 255, 16-27 (2017).
  2. Li, Y., et al. A cross-species inducible system for enhanced protein expression and multiplexed metabolic pathway fine-tuning in bacteria. Nucleic Acids Res. 53 (2), gkae1315(2025).
  3. De Baets, J., De Paepe, B., De Mey, M. Delaying production with prokaryotic inducible expression systems. Microb Cell Fact. 23, 249(2024).
  4. Wang, J., et al. Design and characterization of allantoin-inducible expression systems in budding yeast. Biotechnol Biofuels Bioprod. 18 (1), 26(2025).
  5. De Carluccio, G., Fusco, V., di Bernardo, D. Engineering a synthetic gene circuit for high-performance inducible expression in mammalian systems. Nat Commun. 15 (1), 3311(2024).
  6. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  7. Bibek, G. C., Zhou, P., Naha, A., Gu, J., Wu, C. Development of a xylose-inducible promoter and riboswitch combination system for manipulating gene expression in Fusobacterium nucleatum. Appl Environ Microbiol. 89 (9), e00667-e00723 (2023).
  8. Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
  9. Villegas, L. D., et al. Generation of three isogenic gene-edited Huntington's disease human embryonic stem cell lines with DOX-inducible NGN2 expression cassette in the AAVS1 safe locus. Stem Cell Res. 77, 103408(2024).
  10. Lange, L., et al. Inducible forward programming of human pluripotent stem cells to hemato-endothelial progenitor cells with hematopoietic progenitor potential. Stem Cell Rep. 14 (1), 122-137 (2020).
  11. Gupta, S., Schoer, R. A., Egan, J. E., Hannon, G. J., Mittal, V. Inducible, reversible, and stable RNA interference in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (7), 1927-1932 (2004).
  12. Beyer, H. M., et al. Genetically-stable engineered optogenetic gene switches modulate spatial cell morphogenesis in two- and three-dimensional tissue cultures. Nat Commun. 15 (1), 10470(2024).
  13. Lee, S. H., Hu, Y., Chou, A., Chen, J., Gonzalez, R. Metabolic flux optimization of iterative pathways through orthogonal gene expression control: application to the β-oxidation reversal. Metab Eng. 82, 262-273 (2024).
  14. Lan, M. S., Wang, H. W., Chong, J., Breslin, M. B. Coupling of glucose response element from L-type pyruvate kinase and G6Pase promoter enhances glucose-responsive activity in hepatoma cells. Mol Cell Biochem. 300 (1), 191-196 (2007).
  15. Zhang, J., Liu, Y. J., Cui, G. Z., Cui, Q. A novel arabinose-inducible genetic operation system developed for Clostridium cellulolyticum. Biotechnol Biofuels. 8 (1), 36(2015).
  16. Mukherjee, P., Sivaprakasam, S. Engineering the D-lactic acid responsive promoter/repressor system as dynamic metabolic engineering tool in Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus for controlled D-lactic acid biosynthesis. Enzyme Microb Technol. 185, 110606(2025).
  17. Sathesh-Prabu, C., Tiwari, R., Kim, D., Lee, S. K. Inducible and tunable gene expression systems for Pseudomonas putida KT2440. Sci Rep. 11 (1), 18079(2021).
  18. Banerjee, A., Leang, C., Ueki, T., Nevin, K. P., Lovley, D. R. Lactose-inducible system for metabolic engineering of Clostridium ljungdahlii. Appl Environ Microbiol. 80 (8), 2410-2416 (2014).
  19. Stout, A. J., et al. Engineered autocrine signaling eliminates muscle cell FGF2 requirements for cultured meat production. Cell Rep Sustain. 1 (1), 100009(2024).
  20. Shahini, A., et al. NANOG restores the impaired myogenic differentiation potential of skeletal myoblasts after multiple population doublings. Stem Cell Res. 26, 55-66 (2018).
  21. Torres, M., et al. Engineering mammalian cell growth dynamics for biomanufacturing. Metab Eng. 82, 89-99 (2024).
  22. Shupe, J., Zhang, A., Odenwelder, D. C., Dobrowsky, T. Gene therapy: Challenges in cell culture scale-up. Curr Opin Biotechnol. 75, 102721(2022).
  23. Siddiqui, M., Tous, C., Wong, W. W. Small molecule-inducible gene regulatory systems in mammalian cells: progress and design principles. Curr Opin Biotechnol. 78, 102823(2022).
  24. Minami, S. A., Garimella, S. S., Shah, P. S. Computational evaluation of light propagation in cylindrical bioreactors for optogenetic mammalian cell cultures. Biotechnol J. 19 (1), 2300071(2024).
  25. Das, M., Maiti, S. K. Employment of light-inducible promoter in genetically engineered cyanobacteria for photosynthetic isobutanol production with simulated diurnal sunlight and CO2. J Biotechnol. 393, 31-40 (2024).
  26. Borella, L., Sforza, E., Bertucco, A. An internally LED illuminated photobioreactor to increase energy conversion efficiency: design and operation. Energy Convers Manag. 270, 116224(2022).
  27. Choi, S. Y., et al. Scalable cultivation of engineered cyanobacteria for squalene production from industrial flue gas in a closed photobioreactor. J Agric Food Chem. 68 (37), 10050-10055 (2020).
  28. Müller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnol Bioeng. 112 (7), 1483-1487 (2015).
  29. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  30. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat Biotechnol. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  31. Müller, K., et al. A red/far-red light-responsive bi-stable toggle switch to control gene expression in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 41 (7), e77(2013).
  32. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
  33. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).
  34. Müller, K., Naumann, S., Weber, W., Zurbriggen, M. D. Optogenetics for gene expression in mammalian cells. Biol Chem. 396 (2), 145-152 (2015).
  35. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  36. Qiao, L., et al. A sensitive red/far-red photoswitch for controllable gene therapy in mouse models of metabolic diseases. Nat Commun. 15, 10310(2024).
  37. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nat Chem Biol. 11 (3), 198-200 (2015).
  38. Garimella, S. S., et al. A simplified two-plasmid system for orthogonal control of mammalian gene expression using light-activated CRISPR effector. BMC Biotechnol. 25 (1), 58(2025).
  39. Kaberniuk, A. A., Shemetov, A. A., Verkhusha, V. V. A bacterial phytochrome-based optogenetic system controllable with near-infrared light. Nat Methods. 13 (7), 591-597 (2016).
  40. Redchuk, T. A., Omelina, E. S., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Near-infrared optogenetic pair for protein regulation and spectral multiplexing. Nat Chem Biol. 13 (6), 633-639 (2017).
  41. Chatelle, C., et al. A green-light-responsive system for the control of transgene expression in mammalian and plant cells. ACS Synth Biol. 7 (5), 1349-1358 (2018).
  42. Nihongaki, Y., Yamamoto, S., Kawano, F., Suzuki, H., Sato, M. CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription system. Chem Biol. 22 (2), 169-174 (2015).
  43. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  44. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  45. Baloban, M., Kasatkina, L. A., Verkhusha, V. V. iLight2: A near-infrared optogenetic tool for gene transcription with low background activation. Protein Sci. 33 (5), e4993(2024).
  46. Kaberniuk, A. A., Baloban, M., Monakhov, M. V., Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Single-component near-infrared optogenetic systems for gene transcription regulation. Nat Commun. 12 (1), 3859(2021).
  47. Zhou, X. X., et al. A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription. ACS Chem Biol. 13 (2), 443-448 (2018).
  48. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  49. Tak, Y. E., et al. Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors. Nat Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).
  50. Varma, S., Gulati, K. A., Sriramakrishnan, J., Ganla, R. K., Raval, R. Environment signal dependent biocontainment systems for engineered organisms: Leveraging triggered responses and combinatorial systems. Synth Syst Biotechnol. 10 (2), 356-364 (2025).
  51. Chen, X., Li, T., Wang, X., Yang, Y. A light-switchable bidirectional expression module allowing simultaneous regulation of multiple genes. Biochem Biophys Res Commun. 465 (4), 769-776 (2015).
  52. Nihongaki, Y., Yamamoto, S., Kawano, F., Suzuki, H., Sato, M. CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription system. Chem Biol. 22 (2), 169-174 (2015).
  53. Muench, P., et al. A modular toolbox for the optogenetic deactivation of transcription. Nucleic Acids Res. 53 (3), gkae1237(2025).
  54. Guinn, M. T., Coraci, D., Guinn, L., Balázsi, G. Reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells. J Vis Exp. (173), e62109(2021).
  55. Minami, S. A., Shah, P. S. Transient light-activated gene expression in Chinese hamster ovary cells. BMC Biotechnol. 21 (1), 13(2021).
  56. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nat Protoc. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  57. Chen, S. Y., et al. Optogenetic control reveals differential promoter interpretation of transcription factor nuclear translocation dynamics. Cell Syst. 11 (4), 336-353.e24 (2020).
  58. Meyer, K., Lammers, N. C., Bugaj, L. J., Garcia, H. G., Weiner, O. D. Optogenetic control of YAP reveals a dynamic communication code for stem cell fate and proliferation. Nat Commun. 14 (1), 6929(2023).
  59. Benman, W., et al. A temperature-inducible protein module for control of mammalian cell fate. Nat Methods. 22 (3), 539-549 (2025).
  60. Stadinski, B. D., Huseby, E. S. How to prevent yourself from seeing double. Cytometry A. 97 (11), 1102-1104 (2020).
  61. Merah-Mourah, F., Cohen, S. O., Haziot, A. A two-stage flow cytometry strategy to distinguish single cells from doublets in heterogeneous cell mixtures and improve cell cluster identification: Application to human monocyte subpopulations. Curr Protoc. 1 (8), e229(2021).
  62. Cheng, Y. S., et al. A protocol for culture and characterization of human induced pluripotent stem cells after induction. Curr Protoc. 3 (8), e866(2023).
  63. Wu, S. H., Liao, Y. T., Huang, C. H., Chen, Y. C., Chiang, E. R., Wang, J. P. Comparison of the confluence-initiated neurogenic differentiation tendency of adipose-derived and bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Biomedicines. 9 (11), 1503(2021).
  64. Yang, B., Cao, L., Liu, B., McCaig, C. D., Pu, J. The transition from proliferation to differentiation in colorectal cancer is regulated by the calcium activated chloride channel A1. PLoS One. 8 (4), e60861(2013).
  65. Chua, K. H., et al. Effects of serum reduction and VEGF supplementation on angiogenic potential of human adipose stromal cells in vitro. Cell Prolif. 46 (3), 300-311 (2013).
  66. Messmer, T., et al. A serum-free media formulation for cultured meat production supports bovine satellite cell differentiation in the absence of serum starvation. Nat Food. 3 (1), 74-85 (2022).
  67. Li, V. C., Kirschner, M. W. Molecular ties between the cell cycle and differentiation in embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (26), 9503-9508 (2014).
  68. Binder, B. Y. K., Sagun, J. E., Leach, J. K. Reduced serum and hypoxic culture conditions enhance the osteogenic potential of human mesenchymal stem cells. Stem Cell Rev Rep. 11 (3), 387-393 (2015).
  69. Vincent, R. K., Odorico, J. S. Reduced serum concentration is permissive for increased in vitro endocrine differentiation from murine embryonic stem cells. Differentiation. 78 (1), 24-34 (2009).
  70. An-adirekkun, J., et al. A yeast optogenetic toolkit (yOTK) for gene expression control in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Bioeng. 117 (3), 886-893 (2020).
  71. Zhou, X. X., et al. A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription. ACS Chem Biol. 13 (2), 443-448 (2018).
  72. Hashemi, A., et al. Optimization of transfection methods for Huh-7 and Vero cells: a comparative study. Cytol Genet. 46 (6), 347-353 (2012).
  73. Nihongaki, Y., Kawano, F., Nakajima, T., Sato, M. Photoactivatable CRISPR-Cas9 for optogenetic genome editing. Nat Biotechnol. 33 (7), 755-760 (2015).
  74. Jayaraman, P., Devarajan, K., Chua, T. K., Zhang, H., Gunawan, E., Poh, C. L. Blue light-mediated transcriptional activation and repression of gene expression in bacteria. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6994-7005 (2016).
  75. Nicoletti, I., Migliorati, G., Pagliacci, M. C., Grignani, F., Riccardi, C. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. J Immunol Methods. 139 (2), 271-279 (1991).
  76. Riccardi, C., Nicoletti, I. Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. Nat Protoc. 1 (3), 1458-1461 (2006).
  77. Choi, S., et al. Protective effect of melatonin against blue light-induced cell damage via the TRPV1-YAP pathway in cultured human epidermal keratinocytes. Biofactors. 51 (2), e70015(2025).
  78. Alghamdi, R. A., Exposito-Rodriguez, M., Mullineaux, P. M., Brooke, G. N., Laissue, P. P. Assessing phototoxicity in a mammalian cell line: How low levels of blue light affect motility in PC3 cells. Front Cell Dev Biol. 9, 738786(2021).
  79. Yokoi, Y., et al. Potential consequences of phototoxicity on cell function during live imaging of intestinal organoids. PLoS One. 19 (11), e0313213(2024).
  80. Flores-Ibarra, A., et al. Light-oxygen-voltage (LOV)-sensing domains: activation mechanism and optogenetic stimulation. J Mol Biol. 436 (5), 168356(2024).
  81. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
  82. Lan, T. H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends Genet. 38 (12), 1253-1270 (2022).
  83. Baloban, M., Kasatkina, L. A., Verkhusha, V. V. iLight2: A near-infrared optogenetic tool for gene transcription with low background activation. Protein Sci. 33 (5), e4993(2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CRISPR HEK293T

مقالات ذات صلة