يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نموذج الفئران لانتكاس ابيضاض الدم إلى العلاج الكيميائي التعريفي لسرطان الدم الليمفاوي الحاد

1.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68797

⸱

أكتوبر 17, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Leukemia Biology Laboratory, Boldrini Children's Center, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, University of Campinas, 3Boldrini Children's Center, 4Department of Translational Medicine, Faculty of Medical Sciences, University of Campinas

في هذه المقالة

ملخص

يهدف البروتوكول إلى وصف نموذج الفأر لتوليد انتكاسات سرطان الدم الليمفاوي الحاد ، بناء على ديناميكيات الاستجابة للعلاج الكيميائي التحريضي.

الملخص

ابيضاض الدم الليمفاوي الحاد (ALL) هو ورم من الخلايا السلائف اللمفاوية غير الناضجة وأحد أكثر الأورام الخبيثة شيوعا في مرحلة الطفولة. على الرغم من أن معدلات الشفاء في ابتداب الدم الابيضاضي الحاد للأطفال تقترب من 90٪ ، إلا أن الانتكاس ومقاومة الأدوية لا يزالان تحديات. في هذا السياق ، تعد دراسة بيولوجيا السرطان في الجسم الحي أمرا ضروريا ، وتستخدم الطعوم الغريبة المشتقة من المريض (PDX) باستخدام نماذج الفئران على نطاق واسع لهذا الغرض. ومع ذلك ، فإن PDXs من العينات الانتكاسية - أو بالمقارنة مع العينات التشخيصية - لا تقيم بشكل كامل الآليات الكامنة وراء بدء الانتكاس وتطوره. يعتمد هذا البروتوكول على توليد انتكاسات B-ALL PDX في الفئران ، مما يسمح بجمع خلايا سرطان الدم طوال عملية اكتساب مقاومة للأدوية. يتم التعامل مع المطهبة بخلايا B-ALL PDX بمزيج من أربعة أدوية شائعة الاستخدام في علاج ابيضاض الدم الابيضاضي الحاد اللواتي ، والتي تمثل آليات عمل متميزة: ديكساميثازون ، فينكريستين ، L-asparaginase ، و daunorubicin. بعد مرحلة تحريض مغفرة لمدة 4 أسابيع ، تتم مراقبة بحثا عن الانتكاسات خلال فترة الراحة. تتكرر دورة العلاج والانتكاس حتى يقصر وقت الانتكاس ، مما يؤدي إلى زيادة مقاومة الأدوية في الجسم الحي. لاستكشاف الآليات الكامنة وراء الانتكاس والمقاومة ، يتم جمع خلايا سرطان الدم قبل وبعد كل دورة علاج لتحليل النمط الظاهري والجيني. للتحقق من صحة النموذج ، تم اختبار عينات مختلفة من ابتلافات الدم المجهود اللمفاوي للأطفال ، بما في ذلك المستجيبين الجيدين والضعيفين ، كما تم تقييمها من خلال وجود انفجارات في الدم المحيطي بعد 7 أيام من العلاج بالكورتيكوستيرويدات والحد الأدنى من المرض المتبقي (MRD) في الأيام 15 و 33 و 78/96. كانت النتائج التي لوحظت في الفئران متوافقة مع بيانات المريض ، مما يؤكد دقة النموذج في محاكاة الاستجابة السريرية للعلاج الكيميائي. يتيح هذا النهج الدراسة الديناميكية للانتكاس ومقاومة الأدوية في B-ALL ، ودعم التحقيقات الميكانيكية وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة.

المقدمة

ابيضاض الدم الليمفاوي الحاد (ALL) هو أكثر أنواع السرطان انتشارا عند الأطفال. على الرغم من معدلات الشفاء المرتفعة التي تحققت في العقود الأخيرة حيث بلغ البقاء على قيد الحياة الإجمالي لمدة 5 سنوات 90٪ في البلدان المرتفعةالدخل 1 والجهود الكبيرة في البحث عن استراتيجيات علاجية جديدة ، في البلدان المتقدمة ، ينتكس 15٪ -20٪ من المرضى من المرض ، ويتراوح معدل البقاء على قيد الحياة بين 30٪ و 60٪ اعتمادا على ما إذا كان الانتكاس الأول يحدث مبكرا (أقل من 18 شهرا) أو بعد ذلك (36 شهرا) بعد التشخيص2 ، 3. في ضوء ذلك ، لا يزال المقاوم للحرارة والانتكاس الجميع تحديات يجب التغلب عليها. من حيث التشخيص ، يتميز ابيضاض الدم اللمفاوي المقاوم للحرارة عن الانتكاس بسبب ضعف الحساسية للعلاج الكيميائي ، بينما يتميز انتكاسة ابيضاض الدم اللمفاوي الحاد بتكرار المرض بعد فترة من الهدوء. كما هو الحال مع أنواع السرطان الأخرى ، يتميز مفارض الدم الملوفاوي الحاد بتشوهات وراثية ، بما في ذلك اختلال الصيغة الصبغية ، وإعادة ترتيب الكروموسومات ، والطفرات الجينية المختلفة المرتبطة بالاستجابات العلاجية المختلفة وخطر الانتكاس4. نظرا لأن انتكاسات ابيضاض الدم الابيضاضي اللواتي تحدث بشكل متكرر في المرضى المعرضين لمخاطر عالية - الذين تلقوا بالفعل علاجا كيميائيا قصوى الشدة - فمن غير المرجح أن تكون التعديلات الإضافية على جرعات أو مجموعات الأدوية كافية. بدلا من ذلك ، يجب توجيه الجهود نحو تحديد الآليات الكامنة وراء مقاومة الأدوية وانتكاسها.

في ضوء ذلك ، حاول الباحثون فهم كيف يساهم ضغط الاختيار الذي يمارسه العلاج الكيميائي في ظهور الخلايا المقاومة. تعزو معظم الأدبيات الموجودة الانتكاس إلى انتشار نسخة فرعية خبيثة مقاومة كانت موجودة بالفعل في وقت التشخيص5. ومع ذلك ، تشير دراسة حديثة إلى وجود آليات بديلة ، مثل التعديلات اللاجينية التي تنظم برامج النسخ ، والتي قد تساهم أيضا في الانتكاس6.

تم تكريس جهد كبير لإنشاء نماذج دقيقة في الجسم الحي لدراسة جميع الانتكاسات. تم استخدام الفئران التي تعاني من نقص المناعة بنجاح في جميع عمليات النقش بابتيضاض الدم المفاوي ، مع الحفاظ على خصائص المرض الأصلية7،8 ، مما أدى إلى تطوير الطعوم الغريبة المشتقة من المريض (PDXs). يسمح هذا النموذج بنقش وتكاثر خلايا الورم / سرطان الدم الأصلية في بيئة مكروية متوافقة. تتمثل إحدى مزاياها الرئيسية في القدرة على تقييم استجابة جميع خلايا ابيضاض الدم المزروعة للعلاج الكيميائي9.

كما تم استخدام نماذج PDX لتقليد ودراسة جميع الانتكاسات. على سبيل المثال ، استخدم بروتوكول طوره Samuels et al.10 الفئران غير السمنة المصابة بالسكري / نقص المناعة المركبة (NOD / SCID) المزروعة بخلايا سرطان الدم المريضة للتحقيق في آليات المقاومة لنظام العلاج الكيميائي الشبيه بالتحريض. وصف المؤلفون العلاج بالفينكريستين والديكساميثازون و L-asparaginase و daunorubicin (VXLD) وقدموا أمثلة على عدد دورات العلاج وتوقيت الانتكاس. ومع ذلك ، ركز النموذج على تحليل الخلايا مباشرة بعد العلاج - تلك التي نجت من العلاج الأولي - من المحتمل أن تمثل الحد الأدنى من المرض المتبقي (MRD) بدلا من الانتكاس.

قيمت دراسة حديثة ما إذا كان العلاج قصير المدى ل NUD المزروعة بالكل. يمكن أن تتنبأ الفئران التي تعاني من نقص المناعة Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl / SzJ (NOD scid جاما أو NSG) بالانتكاس في المرضى المقابلين11. تم زرع جميع العينات متوسطة الخطورة - من كل من المرضى الانتكاسيين وغير الانتكاسيين - في الفئران وعولجت بنظام يشبه الحث يتكون من فينكريستين وديكساميثازون و L-asparaginase (VXL). تم قياس ومقارنة وقت الطعم والانتكاسات بعد المعالجة. أشارت النتائج إلى أن نموذج PDX هذا يمكن أن يكون بمثابة أداة تنبؤية للتنبؤ بنتائج المرضى. تدعم هذه النتيجة فائدة نماذج فئران PDX في دراسة بيولوجيا انتكاسات ابيضاض الدم المفاوي اللمپي. على سبيل المثال ، كان من الممكن فحص الخلايا الانتكاسية في نقاط زمنية مختلفة للكشف عن الآليات الكامنة وراء الانتكاس.

في هذه المخطوطة ، نقدم تحسينات على نموذج الفئران PDX لدراسة انتكاس B-ALL. نهدف إلى دراسة تكرار المرض وخصائص الخلايا الانتكاسية بعد تشكيلها عن طريق العلاج الكيميائي التحريضي. تم توحيد نظام من أربعة أدوية يشبه الحث - فينكريستين ، ديكساميثازون ، L-asparaginase ، ودونوروبيسين - باستخدام سلالة الفئران NSG. من المعروف أن هذه السلالة لها قيود في تحمل دورات العلاج الكيميائي المتكررة بسبب طفرةPrkdc scid وزيادة الحساسية للإجهاد السام الجيني12. لذلك ، تمت مراقبة وزن جسم كعلامة على سمية العلاج. يمكن تقسيم نموذج انتكاس B-ALL إلى ثلاث خطوات رئيسية: (1) زرع جميع خلايا ابيضاض الدم المفاوي في الفئران ، بهدف عتبة النقش من 0.2-1٪ خلايا CD45⁺ البشرية في الدم المحيطي. (2) 4 أسابيع من العلاج الكيميائي ، تليها فترة راحة حتى الانتكاس الأول (R1) ؛ و (3) عند الكشف عن R1 ، تكرار دورات العلاج من نوع الحث لمدة أسبوع واحد. الانتكاسات اللاحقة (R2 ، R3 ... RN) ، ويتم تسجيل الفاصل الزمني بين العلاج والانتكاس (Δt). يتم تفسير التقصير التدريجي ل Δt على أنه مؤشر على مقاومة الأدوية المكتسبة. كجزء من تحقيقات أكثر تعمقا في آليات الانتكاس ، يمكن جمع خلايا B-ALL قبل وبعد مراحل مختلفة من البروتوكول. من المهم التأكيد على أنه اعتمادا على الوقت بين حدوث الانتكاس وتعافي الخلايا ، قد لا يتم الحفاظ على الآليات المتأصلة في هذه الظاهرة. في ضوء ذلك ، من المهم للغاية أن يتم جمع خلايا الانتكاس بسرعة بعد تأكيد الانتكاس. يمكن استخدام الخلايا التي تم جمعها لتحليلات النمط الظاهري والجيني المستقبلية ، بما في ذلك تقييمات ديناميكيات دورة الخلية ، وهجرة الخلايا ، وتكرار الخلايا التي تبدأ سرطان الدم ، وتغيرات الكروموسومات ، والتعديلات اللاجينية ، من بين أمور أخرى.

لأغراض هذه المقالة ، سنركز على وصف نموذج فأر الانتكاس. سيتم توفير معلومات مفصلة عن المراحل التجريبية الثلاث - الزرع ، والعلاج حتى الانتكاس الأول (R1) ، والعلاج الدوري حتى الانتكاسات المتعددة (R2 ، R3 ...). نأمل أن يسمح هذا النموذج للباحثين بتوليد خلايا B-ALL مقاومة للعلاج الكيميائي من أنواع فرعية متنوعة ، مما يتيح تحقيقا أعمق في التغيرات الخلوية والجزيئية المرتبطة بالانتكاس. في النهاية ، قد يساهم هذا في فهم أفضل لآليات المقاومة وتسهيل تطوير علاجات أكثر فعالية وتخصيصا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء جميع التجارب على وفقا للوائح والمبادئ التوجيهية الأخلاقية ل Comissão de Ética no Uso de Animais من Centro Infantil Boldrini (CEUA / Boldrini 0047-2024). تم الحصول على عينات سرطان الدم المستخدمة في هذه الدراسة من قوارير بيولوجية للمرضى الذين عولجوا في Centro Infantil Boldrini ، والذين سمحوا باستخدام خلاياهم من خلال نموذج الموافقة المستنيرة. تمت الموافقة على المشروع من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية (CAAE 34601120.7.0000.5376).

1. زرع خلايا سرطان الدم ومراقبة النقش

  1. تحضير عينات سرطان الدم لزراعة الفئران
    1. ذوبان الجليد سابقا عينات محجوزة بالتبريد من جميع خلايا ابيضاض الدم المأخوذة من شفط نخاع العظم للمريض. استخدم حماما مائيا مضبوطا على 37 درجة مئوية. قم بإذابة العينات عن طريق تحريك أنبوب التبريد بحركة دائرية.
    2. انقل العينة المذابة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. أضف 14 مل من 1x PBS المعقم إلى العينة لغسل الخلايا وإزالة محلول الحفظ بالتبريد. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية.
  2. تحضير محلول الزرع
    1. أعد تعليق الخلايا المذابة في 1x PBS المعقم. استخدم 5-10 ×10 6 خلايا قابلة للحياة بحجم 100 ميكرولتر من PBS لكل يتم زرعه. احتفظ بمحلول الزرع على الثلج حتى الزرع.
      ملاحظة: تم حساب الخلايا باتباع الطريقة شبه التلقائية13.
  3. زرع الفئران
    1. حدد ذكرا أو أنثى يبلغ من العمر شهرين. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) الفئران لزرع سرطان الدم.
      ملاحظة: للحفاظ على تصميم تجريبي متجانس خال من التدخل الجنسي للحيوان ، تم زرع جميع العينات في كلا جنسين الفئران ، مما يضمن تمثيل جميع أنواع سرطان الدم المستجيبة الجيدة والفقيرة بالتساوي في كلا الجنسين. نتيجة لذلك ، وجدنا أن إناث الفئران يتم تطعيمها في وقت أبكر من ذكور الفئران. بالنظر إلى أنه لتجنب التدخل المحتمل لجنس الفأر في التحليلات المستقبلية (مثل حركية النقش) ، نقترح استخدام جنس فأر واحد فقط عند العمل مع نفس عينة سرطان الدم. لم يتم استخدام أي معلمات أخرى لاختيار جنس واحد على الآخر بشكل تفضيلي.
    2. ضع فأرا واحدا في كل مرة في مصيدة فئران آمنة ومعتمدة لضمان الاحتواء الصحيح للحيوان. تأكد من أن ذيل خارج المصيدة ويمكن الوصول إليه بسهولة للزرع.
      ملاحظة: يتم زرع خلايا سرطان الدم في الفئران عن طريق الحقن الوريدي (IV). تستخدم البروتوكولات المعمول بها الأوردة الجانبية للذيل لهذا الغرض11.
    3. استخدم ضوء الأشعة تحت الحمراء لضمان تمدد الوريد بشكل صحيح. حقن 100 ميكرولتر من محلول الزرع باستخدام إبرة حقن معقمة وحادة وتستخدم مرة واحدة. احتفظ بالفئران المزروعة في منشأة معينة خالية من مسببات الأمراض. دعهم يرتاحون لمدة 15 يوما.
      1. لاستخدام ضوء الأشعة تحت الحمراء ، احتفظ بالحيوان المقيد بالفعل خارج القفص وعلى بعد 30 سم من الضوء. اعتمادا على طاقة الضوء المحتملة ، اضبط وقت التعرض. عند استخدام مصباح متوسط الطاقة ، تكفي فترة 5 دقائق لضمان تمدد الوريد. قد يؤدي ترك الذيل مكشوفا لفترة أطول إلى حروق وإجهاد للحيوان.
      2. للحقن ، استخدم حقنة الأنسولين بإبرة متصلة ، بحجم 1 مل وحجم إبرة 12.7 مم × 0.33 مم. يمكن العثور على مواصفات الإبرة المستخدمة في جدول المواد. حافظ على الفئران في نظام دورة الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة / 12 ساعة. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإيواء المستخدمة في هذه الدراسة في قفص من البولي كربونات الكهرماني الشفاف القابل للتعقيم مع التخصيب البيئي لإنشاء أعشاش.
  4. جمع الدم المحيطي
    1. اجمع عينة دم محيطية بسعة 50 ميكرولتر من كل فأر بعد أسبوعين من التلقيح وكل أسبوع بعد ذلك.
    2. قم بتقييد يدويا باليد اليسرى ، مع التأكد من أن رأسه ممسك بإحكام. باليد اليمنى ، استخدم إبرة وخز معقمة وحادة يمكن التخلص منها لثقب الوريد الوجهي للضفيرة تحت الفك السفلي للحيوان.
      ملاحظة: هذا إجراء يحتمل أن يكون ضارا للفئران ويجب القيام به بعناية.
      1. تأكد من أن يمكنه التنفس بسهولة أثناء ضبط النفس. راقب التغيرات في معدل التنفس (ضيق التنفس) والتغيرات في لون الفم (يجب ألا يتحول إلى اللون الأرجواني أو الأزرق الداكن). إذا لم يتم ثقب الضفيرة تحت الفك السفلي بشكل صحيح ، فقد يحدث نزيف في الأذن بسبب ثقب قناة الأذن. لتوجيه المجربين في المستقبل ، يتوفر الشكل التكميلي 1 لضمان الموقع المناسب للضفيرة.
        ملاحظة: كبديل ، يمكن أيضا استخدام نزيف وريد الذيل لجمع عينات الدم.
    3. بعد التجميع ، لا تترك دون رقابة. يجب أن تكون نشطة وغير مصابة بأذى. إذا أظهر الفأر علامات السقوط (الرأس أو الجسم) والخمول ، فيجب القتل الرحيم. لا تتجاوز حجم 50 ميكرولتر ، لأن كميات أكبر من الدم قد تؤدي إلى موت.
    4. احتفظ بعينة الدم التي تم جمعها في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل يحتوي على 8 ميكرولتر من 50 ملي EDTA لتجنب تخثر العينة.
      ملاحظة: هنا ، استخدمنا محلول EDTA معد مسبقا كمضاد للتخثر. إذا كنت تفضل ذلك، يمكن أيضا استخدام أنابيب EDTA منخفضة الحجم المتوفرة تجاريا لجمع الدم في هذه الخطوة. يجب معالجة عينات الدم في نفس اليوم.
  5. تحضير عينات الدم المحيطية للمعالجة
    1. تجانس الدم مع EDTA. انقل 50 ميكرولتر من الخليط إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي.
    2. قم بإعداد خليط من الأجسام المضادة لإضافته إلى كل عينة يتكون من الجسم المضاد CD45 المضاد للفأر (mCD45) ، والأجسام المضادة CD45 المضادة للإنسان (hCD45) ، والأجسام المضادة CD19 المضادة للإنسان (hCD19) و 1x PBS المعقمة كمخفف.
  6. معالجة عينات الدم
    1. أضف 10 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة إلى كل عينة دم. تجانس عن طريق النقر برفق بإصبع السبابة. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء.
      ملاحظة: حدد الأجسام المضادة المناسبة الموضحة أعلاه ، مع مراعاة القنوات المتاحة لمقياس الخلوة. لتحديد كمية الجسم المضاد المستخدم لكل عينة ، ضع في اعتبارك إجراء منحنى المعايرة بالتحليل الحجمي لكل جسم مضاد. الأجسام المضادة المستخدمة في دراستنا ، والفلوروكرومات ، والحجم المختار للعينات مذكورة في الجدول التكميلي 1. يتم سرد وصف كامل لأرقام كتالوج الأجسام المضادة وأسماء المستنسخة في جدول المواد.
    2. أضف 1 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) التجاري 1x إلى كل عينة. تجانس بقوة مع السبابة. احتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، محميا من الضوء.
      ملاحظة: حل التحلل المستخدم في هذه الخطوة هو محلول تحلل RBC 10x متوفر تجاريا. إذا تم استخدام كاشف مختلف ، فيجب ضبط حجم العمل 1x للتحلل.
    3. أضف 2 مل من 1x PBS المعقم إلى كل عينة لخطوة الغسيل الأولى. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم (في دوار متأرجح) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية برفق عن طريق قلب وتجفيف أي سائل متبقي في الجزء العلوي من الأنبوب عن طريق النشاف برفق بالمناشف الورقية.
      ملاحظة: في خطوات الغسيل ، سيتم تكوير خلايا سرطان الدم في الجزء السفلي من أنبوب مقياس الخلية ، وسيتم التخلص من السائل المتبقي. من الضروري توخي الحذر عند التعامل مع العينات, كما هو الحال في بعض الحالات, قد لا تكون الحبيبات ملحوظة. لضمان سلامة الحبيبات, تجنب هز العينة, لأن ذلك قد يؤدي إلى فقدانها.
    4. كرر الخطوة 1.6.3. أعد تعليق خلايا سرطان الدم ب 200 ميكرولتر من 1x PBS المعقم عن طريق النقر برفق على أنبوب قياس الخلايا بإصبع السبابة. العينات جاهزة للتحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي. يجب إجراء مراقبة الطعم في نفس يوم جمع الدم.
  7. مراقبة النقش عن طريق قياس التدفق الخلوي
    1. استخدم منهجيات قياس التدفق الخلوي القياسية9،14 لتحديد النسبة المئوية لخلايا CD45 + البشرية في الدم المحيطي بالنسبة لخلايا CD45 + للفئران (٪ hCD45 +).
    2. اجمع البيانات الناتجة عن قياس التدفق الخلوي للتحليل اللاحق للنسبة المئوية ل hCD45 + على إجمالي خلايا CD45 (hCD45 + بالإضافة إلى mCD45 +) باستخدام برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي.
      ملاحظة: لضمان المراقبة المناسبة للنقش، يجب إجراء خطوات التحليل التالية في نفس اليوم. هذا التسلسل اليومي مهم بشكل خاص عند التفكير في بدء جدول العلاج المستقبلي ، والذي نقترح بدءه يوم الاثنين. في حالة استحالة البدء يوم الاثنين ، يمكن أن يبدأ العلاج في أي يوم من أيام الأسبوع ، اعتمادا على تحقيق hCD45 +٪ (0.2٪ -1٪) على الدم المحيطي.
  8. إعداد البيئة لتحليل بيانات قياس التدفق الخلوي
    1. قم بتشغيل برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي. قم باستيراد البيانات التي تم جمعها وانتظر التعرف عليها بواسطة الأداة.
    2. افتح البيانات من العينة الأولية لإنشاء البوابة المسماة الخلايا الليمفاوية. التحقق من إعدادات المحور: حدد FSC-A للمحور X و SSC-A للمحور Y. في لوحة إنشاء البوابة العلوية ، حدد أداة poly-liner وحدد مجموعة الخلايا الرئيسية.
      ملاحظة: تظهر الخلايا الليمفاوية عادة بين 50,000-100,000 على المحور X و 0-50,000 على المحور Y. قد تختلف القيم حسب خصائص كل سرطان دميا.
    3. انقر نقرا مزدوجا فوق السكان المسورين لإنشاء بوابة جديدة. لاستبعاد مضاعفات الخلية، قم بتعيين FSC-A على المحور X و FSC-H على المحور Y. استخدم أداة poly-liner لعزل مجموعة الخلايا الأولية. ارسم البوابة عن كثب حول السكان ، باستثناء الأحداث البعيدة على طول المحور X.
      ملاحظة: تميز هذه الخطوة أحداث الخلية الفردية.
  9. إنشاء لوحة قياس الخلايا لتمييز مجموعات الخلايا
    1. انقر نقرا مزدوجا فوق المحتوى المحدد للتمييز بين خلايا CD45 البشرية والماوس. اضبط المحور X على الفلوروفور mCD45 والمحور Y على SSC-A. باستخدام أداة الشكل، ارسم مربعا حول مجموعة mCD45 سالبة.
    2. انقر نقرا مزدوجا فوق المحتوى الناتج لتمييز خلايا hCD19+ و/أو hCD45+. اضبط المحور X على الفلوروفور hCD19 والمحور Y على hCD45. في لوحة إنشاء البوابة، حدد خطوط عمودية لفصل المجموعات المميزة.
      ملاحظة: كبديل ، يمكن للمحقق استخدام البوابة أو إمكانية التمييز بين خلايا hCD45 و mCD45. يعتبر هذا الاحتمال مجموع الأحداث بنسبة 100٪ ، مما يخلق استراتيجية أكثر دقة لتحديد السكان.
  10. تطبيق الإحصائيات على اللوحة التي تم إنشاؤها
    1. احسب النسبة المئوية لكل مجموعة خلية معزولة بالنسبة لجميع الأحداث المكتسبة. في نافذة البرنامج الرئيسية، انقر بزر الماوس الأيمن فوق أيقونة Subgraph المشتق من الرسم البياني الرئيسي لكل عينة وحدد إنشاء إحصائيات. في النافذة المفتوحة، انقر فوق تكرار الخلايا وحدد الخلايا الفردية. قم بتنفيذ هذه الخطوة بشكل فردي لكل رسم بياني فرعي.
    2. حدد جميع التعديلات التي تم إجراؤها لتطبيق استراتيجية البوابات والإحصائيات المرتبطة بها على جميع العينات. بعد ذلك ، باستخدام زر الماوس الأيسر ، اسحب التعديلات المحددة إلى خيار جميع العينات في نافذة البرنامج الرئيسية.
    3. انقر فوق محرر الجدول في النافذة الرئيسية لإنشاء جدول بجميع الترددات المحسوبة. في النافذة المنبثقة، اختر تنسيق الملف .xls، وقم بتعيين المجلد الوجهة، ثم انقر فوق إنشاء جدول.
      ملاحظة: يمكن تصور جميع الخطوات التي تم إجراؤها باستخدام برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي في الشكل التكميلي 2. يحتوي الجدول النهائي الذي تم إنشاؤه بواسطة هذه الخطوة على النسبة المئوية ل hCD45 + اللازمة لإنشاء رسوم بيانية لتحليل تقدم النقش بمرور الوقت.
  11. التخطيط لتقدم النقش
    1. قم بتشغيل برنامج رسم وتحليل الرسم البياني. حدد تنسيق جدول XY. في النافذة الرئيسية، اختر إدخال البيانات أو استيرادها إلى جدول جديد، وقم بتعيين X إلى Numbers، وY لإدخال قيم النسخ المتماثل في أعمدة فرعية جنبا إلى جنب.
    2. في الجدول المفتوح ، قم بتنظيم عناوين الأعمدة: أدخل أيام النقش للعمود X و ٪ hCD45 + على PB للمجموعة الأولى من الأعمدة الفرعية Y. أكمل العمود X بالأيام التي تلي الحقن المقابلة لأيام جمع الدم لمراقبة الطعم. أدخل النسبة المئوية المجمعة أسبوعيا من بيانات hCD45+ يدويا لكل ماوس في الأعمدة الفرعية Y.
    3. في قائمة البرامج، ضمن المجموعة الفرعية للعائلة، حدد البيانات 1. في النافذة المنبثقة ، اختر خيار الرسم البياني الثاني المسمى Points & Connecting Line with Error Bars ، وقم بتمكين رسم أشرطة المتوسط والخطأ.
    4. اضبط محاور الرسم البياني على النطاقات المطلوبة. انقر فوق تصدير في الزاوية اليمنى العليا من القائمة لتنزيل الرسم البياني النهائي.
      ملاحظة: يجب رسم جميع البيانات التي تم جمعها أثناء التجارب مع أي ALL واحد على نفس الرسم البياني لتسهيل التحليلات بمرور الوقت منذ بداية التجربة. يمكن العثور على مثال وصفي لرسم الرسم البياني في الشكل التكميلي 3.

2. علاج الفئران

  1. تحضير حلول العمل الدوائية
    1. تحضير محلول عمل فينكريستين بتركيز 1 مجم / مل. تحضير محلول عمل ديكساميثازون بمعدل 4 مجم / مل. قم بإعداد محلول عمل L-asparaginase بمعدل 2,000 وحدة دولية / مل. تحضير محلول عمل داونوروبيسين بمعدل 2 مجم / مل.
      ملاحظة: الأدوية المستخدمة في هذا البروتوكول تعادل تلك المستخدمة في العلاج السريريللمرضى 15. تتكون مركبة محلول عمل ديكساميثازون من الكرياتينين ، وثنائي هيدرات سترات الصوديوم ، وهيدروكسيد الصوديوم ، وثنائي كبريتيت الصوديوم ، وميثيل بارابين ، وبروبيل بارابين ، والماء للحقن. تتكون مركبة محلول عمل Vincristine من المانيتول وحمض الكبريتيك وهيدروكسيد الصوديوم والماء للحقن. يتوفر L-asparaginase و daunorubicin في كثير من الأحيان في شكل مجفف بالتجميد. في مثل هذه الحالات ، فإن الوسيلة الموصى بها لإعادة التكوين هي الماء المعقم للحقن ، والذي يجب استخدامه لتحقيق التركيز الصحيح. لمنع فقدان نشاط الدواء بسبب دورات الذوبان المتكررة ، يجب تقسيم الأدوية إلى حصص عاملة لا تستخدم أكثر من 3x.
  2. التي تزن عند اكتشاف سرطان الدم
    1. ابدأ العلاج عند النقطة التي تصل عندها النسبة المئوية لخلايا hCD45 + في الدم المحيطي للفئران إلى نطاق متوسط يتراوح بين 0.2٪ و 1٪. عند الوصول إليه ، قسم الفئران المزروعة إلى مجموعتين متميزتين: واحدة لتلقي العلاج والأخرى لتكون بمثابة عنصر تحكم.
    2. عند الوصول إلى العتبة المحددة ، استمر في المراقبة الأسبوعية لتطور سرطان الدم. جمع بيانات hCD45٪ باستمرار لمراقبة الاستجابة للعلاج وحدوث الانتكاسات والكشف عن مقاومة الأدوية.
    3. وزن المراد علاجها. استخدم المتوسط الحسابي للأوزان للتأكد من جرعة كل دواء سيتم إعطاؤه للمجموعة. قم بوزن المجموعة الضابطة لمقارنة زيادة / فقدان الوزن بين المجموعات.
      1. استخدام جرعات الدواء التالية: فينكريستين ، 0.15 مجم / كجم ؛ ديكساميثازون ، 5 مجم / كجم ؛ L-asparaginase ، 1,000 وحدة دولية / كجم ؛ ودونوروبيسين ، 1.2 مجم / كجم. قم بوزن جميع 3 مرات على الأقل في الأسبوع: أيام الاثنين والأربعاء والجمعة. استخدم الأوزان لضبط جرعات العلاج من الأدوية ومراقبة مستوى سمية العلاج.
  3. تحضير حلول إدارة الأدوية من حلول حل العمل
    ملاحظة: تتكون محاليل إدارة الأدوية من معقم 1x PBS كمخفف والحجم الصحيح (وفقا لوزن) لمحاليل الأدوية العاملة (يستخدم الماء المعقم حصريا لإعادة التكوين وليس للحقن) يتم إعطاؤه كل يوم من أيام الأسبوع. يمكن توحيد الأدوية التي تدار داخل الصفاق في نفس الحل ؛ ومع ذلك ، إذا تم إعطاء أي دواء عن طريق الوريد ، فيجب وضعه في محلول فردي. حجم محلول إدارة الدواء الذي سيتم إعطاؤه لكل هو 100 ميكرولتر.
    ملاحظة: تم استخدام حقنة أنسولين معقمة بإبرة متصلة (1 مل ، بأبعاد إبرة 12.7 مم × 0.33 مم) في الخطوة الموضحة أعلاه. يمكن العثور على وصف كامل للحقنة في جدول المواد.
    1. يوم الاثنين ، قم بإعداد محلول إدارة الدواء الذي يتكون من ديكساميثازون وفينكريستين و PBS. إدارة الأدوية داخل الصفاق.
    2. يومي الثلاثاء والخميس ، قم بإعداد محلول إعطاء الدواء الذي يتكون من ديكساميثازون و L-asparaginase و PBS. إدارة الأدوية داخل الصفاق.
    3. يوم الأربعاء ، قم بإعداد محلول إعطاء الدواء الذي يتكون من ديكساميثازون و PBS وقم بإدارته داخل الصفاق. قم بإعداد محلول ثان لإعطاء الدواء يتكون من daunorubicin و PBS. قم بإدارته عن طريق الوريد.
    4. يوم الجمعة ، قم بإعداد محلول إعطاء الدواء الذي يتكون من ديكساميثازون و PBS. إدارة الدواء داخل الصفاق.
    5. اسمح للحيوانات بالراحة خلال أيام عطلة نهاية الأسبوع. كرر دورة العلاج لمدة 4 أسابيع.
      ملاحظة: يمكن العثور على جدول علاج شامل في الجدول التكميلي 2. من المهم توضيح أن البروتوكولات الأخرى التي تم إنشاؤها بالفعل لعلاج الفئران قد تم اختبارها ، ولكنها أدت إلى مستويات عالية من السمية لسلالة NSG. لذلك ، تم تقديم جدول العلاج المقترح أولا إلى عملية توحيد للحد من السمية ، مما أدى إلى الجرعات وتواتر الإعطاء المعروضة في هذا البروتوكول. من المتوقع أن تنخفض النسبة المئوية ل hCD45 + في المجموعة المعالجة مقارنة بنسبة hCD45 + في المجموعة الضابطة بسبب إعطاء العلاج.
  4. إعطاء الأدوية ومراقبة استجابة ابيضاض الدم
    1. كبح جماح يدويا باليد اليسرى لإعطاء الأدوية داخل الصفاق. حافظ على مع الجزء البطني لأعلى. في الجزء البطني ، حدد موقع الربع الأيمن السفلي.
    2. باستخدام اليد اليمنى ، استخدم إبرة حقن معقمة وحادة تستخدم مرة واحدة وحقن 100 ميكرولتر من محلول إدارة الدواء في الربع الأيمن السفلي للفئران.
      ملاحظة: كن حذرا عند تقييد ؛ لا ينبغي أن يكون إجراء ضارا للفئران. كما هو الحال في جمع الدم ، كن على دراية بأي مضاعفات في الجهاز التنفسي. في حالة الحقن داخل الصفاق ، أمسك الإبرة دائما بشكل عمودي لتجنب حفر الأعضاء.
    3. اتبع نفس التعليمات المستخدمة لزرع خلايا ابيضاض الدم لإعطاء الأدوية عن طريق الوريد. اسمح للفئران بالراحة بعد 4 أسابيع من إعطاء العلاج حتى ظهور جميع خلايا ابيضاض الدم المفاوي المجهزون ، المسمى هنا الانتكاس الأول (R1).
      ملاحظة: على الرغم من الاختلاف في مسار الإعطاء ، يستخدم الحقن الوريدي نفس حجم الحقن داخل الصفاق.
  5. مراقبة استجابة ابيضاض الدم والكشف عن الانتكاس الأول (R1)
    1. لا تتوقف عن المراقبة الأسبوعية لقياس التدفق الخلوي لسرطان الدم أثناء العلاج أو مراحل الراحة.
      ملاحظة: بالنظر إلى العلاج لمدة 5 أيام في الأسبوع ، يوصى بشدة بإجراء المراقبة في بداية الأسبوع. في دراستنا ، تم دائما جمع الدم ومعالجة العينات والتحليل يوم الاثنين.
    2. إجراء جمع الدم وأي إجراءات لاحقة مطلوبة للمراقبة وفقا للخطوات 1.4 - 1.11.
      ملاحظة: بعد فترة الراحة المحددة ، سيتم اكتشاف خلايا R1 من خلال الزيادة المفاجئة في النسبة المئوية ل hCD45 + في الدم المحيطي للفئران. الفترة بين نهاية العلاج وحدوث الانتكاس متغيرة ويمكن أن تكون مميزة لكل سرطان الدم يتم فحصه. عند اكتشاف R1 ، يجب إجراء المرحلة الثالثة والأخيرة من نموذج الفأر المقترح للانتكاس. لتحسين تحليلات المراقبة والاستجابة ، نقترح استخدام مقاييس استجابة موضوعية مثل المرض التدريجي ، والمرض المستقر ، ومستوى الاستجابة (جزئيا أو كاملا أو مستمرا) ، مغفرة ، ومقاومة ، باتباع الإرشادات التي وصفها راندال وآخرون (2024) 16.

3. دورات العلاج المتكررة حتى ظهور الخلايا المقاومة

  1. الكشف عن الانتكاس الأول
    1. يجب إعطاء أسبوع كامل من العلاج التحريضي لأي فأر يعاني من انتكاسة ابيضاض الدم (يسمى R1) ، أي عند الوصول إلى عتبة 0.2٪ hCD45+ في الدم المحيطي. لمدة أسبوع واحد ، من الاثنين إلى الجمعة ، اتبع جدول إدارة الدواء المستخدم في العلاج من نوع الحث لمدة 4 أسابيع.
      ملاحظة: يهدف إعطاء أسبوع واحد فقط من العلاج في هذه المرحلة إلى اختبار ما إذا كانت خلايا سرطان الدم قد اكتسبت مقاومة للعلاج الكيميائي بينما تؤدي في النهاية إلى تطور سرطان الدم إلى انتكاسات متتالية بمرور الوقت ، تحت ضغط العلاج الكيميائي. اخترنا عدم إدارة جدول ثان مدته 4 أسابيع كوسيلة لتجنب السمية المفرطة وفقدان.
    2. اسمح للفئران بالراحة في نهاية الأسبوع الكامل من إعطاء الدواء. استمر في المراقبة الأسبوعية للاستجابة لسرطان الدم عن طريق قياس التدفق الخلوي باتباع الخطوات 1.4 - 1.11.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، من المتوقع أن تظل خلايا سرطان الدم مستجيبة للعلاج. وبالتالي ، عند مراقبة سرطان الدم ، يجب أن تنخفض النسبة المئوية ل hCD45 + في الفئران وتظل سلبية لفترة معينة.
  2. مراقبة مظهر R2
    1. انتظر حتى يظهر الانتكاس R2 (خلايا hCD45 + ≥ 0.2٪). عندما يظهر ، احسب الوقت المنقضي بين نهاية العلاج وظهور R2. أطلق على هذه الفترة Δt1.
    2. انتقل إلى أسبوع كامل ثان من إعطاء العلاج التحريضي. اتبع نفس الإرشادات التي تم إدخالها لأول مرة لهذا الجدول الزمني.
    3. اسمح للفئران بالراحة في نهاية العلاج. استمر في مراقبة ابيضاض الدم.
  3. مراقبة مظهر R3
    1. انتظر حتى يظهر الانتكاس R3. احسب الوقت بنفس الطريقة كما في الخطوة 3.2.1. أطلق عليها اسم Δt2.
    2. قارن بين Δt1 و Δt2. كرر الخطوات المذكورة أعلاه N مرات للحصول على انتكاسات متعددة لسرطان الدم (R1 ، R2 ... RN) إذا ظلت فترة Δt كما هي. توقف عن دورات العلاج بمجرد تقصير فترة Δt.
      ملاحظة: انخفاض Δt للانتكاس هو مؤشر على مقاومة الأدوية المكتسبة بواسطة خلايا سرطان الدم. تعزز هذه النتيجة قدرة نموذج الفئران للانتكاس على توليد خلايا ابيضاض الدم المفاوي المقاوم للعلاج الكيميائي.
    3. استعادة خلايا ابيضاض الدم كما هو موضح في الخطوة 4 أدناه. قم بتخزينها حية عن طريق الحفظ بالتبريد أو عن طريق أي مادة حافظة متوافقة مع التحليلات اللاحقة المقصودة.
      ملاحظة: الحدث الموصى به لتعافي خلايا سرطان الدم هو ما يصل إلى 25٪ من hCD45 + في الدم المحيطي ، كما هو موضح في الأدبيات الحديثة16.

4. استعادة خلايا اللوكيميا من خلال حصاد الأعضاء

  1. القتل الرحيم للفئران بجرعة زائدة من التخدير الكيميائي
    1. القتل الرحيم للفئران عن طريق جرعة زائدة من التخدير الكيميائي ، متبوعا بخلع عنق الرحم لتأكيد القتل الرحيم كما هو موضح أدناه.
    2. تحضير خليط يحتوي على ثلاثة مخدرات مخففة في معقمة 1x PBS للتخدير العميق. استخدم 150 ميكرولتر من أسيبرومازين ماليات التجاري ، و 50 ميكرولتر من الزيلازين التجاري ، و 80 ميكرولتر من الكيتامين التجاري ، و 220 ميكرولتر من PBS لكل يتم قتله رحيما.
    3. يتم تطبيق 500 ميكرولتر من الخليط المحضر عن طريق الحقن داخل الصفاق. اتبع نفس إرشادات التقييد والحقن كما هو موضح في الخطوة 2.4.
    4. تحت تأثير جرعة زائدة من التخدير الكيميائي ، تستلقي الفئران على قاع القفص. بعد بضع دقائق ، لاحظ ما إذا كانت الفئران تعاني من توقف التنفس. إذا كان الأمر كذلك ، فانتظر حتى يتوقف جهد الجهاز التنفسي. للتحقق من أن إجراء القتل الرحيم كان فعالا ، تحقق من وجود رد فعل لا إرادي عن طريق الضغط على إحدى الأرجل الخلفية للحيوان. لتأكيد القتل الرحيم ، انتقل إلى خلع عنق الرحم.
  2. خلع عنق الرحم
    1. أمسك مع الجزء الخلفي من الجسم مقابل شبكة تغذية القفص. استخدم أصابع السبابة والإبهام لليد اليسرى لتشكيل شكل الملقط. ضع الأصابع على شكل ملاقط مباشرة تحت رأس. اضغط بقوة على الجزء العنقي من العمود الفقري.
    2. أمسك ذيل باليد اليمنى. اسحبه للخلف بحركة ثابتة وثابتة حتى يتم فصل رأس عن بقية جسمه.
      ملاحظة: خلع عنق الرحم هو أحد الطرق المقبولة لتأكيد القتل الرحيم17،18،19. يمكن استخدام طرق أخرى ، مثل التعرض المستمر لثاني أكسيد الكربون2 لمدة 15 دقيقة على الأقل بعد توقف التنفس ، كبديل.
  3. تحضير لحصاد الأعضاء
    1. عقم الفئران عن طريق وضع 70٪ كحول على الجسم بالكامل. ضع جسم فوق منصة جراحية للقوارض مع الجزء البطني لأعلى. احلق الجزء البطني من الجسم.
      ملاحظة: يمكن العثور على وصف كامل لمنصة التشغيل الجراحية للقوارض في جدول المواد.
  4. حصاد الطحال
    1. قم بعمل شق صغير بمقص وملاقط جراحية معقمة على جلد البطن. قم بإزالته من منطقة البطن ، مما يؤدي إلى تعريض الصفاق.
    2. قم بعمل شق صغير في الصفاق. قم بقصه حتى يتم الوصول الكامل إلى الأعضاء الموجودة في البطن.
    3. حدد موقع الطحال أسفل معدة مباشرة. إزالة الطحال. ضعه في جهاز استقبال يحتوي على 1x PBS معقم لمزيد من المعالجة.
  5. حصاد عظم الفخذ
    1. استمر في فتح التجويف البريتوني للوصول إلى الأرجل الخلفية للحيوان.
    2. حدد موقع عظم الفخذ. قم بإزالته عن طريق قطع المفاصل التي توحدها مع عظم الحوض ومع الظنبوب والشظية. قم بهذه العملية لكل من عظام عظم الفخذ.
    3. نظف العظام عن طريق إزالة أي عضلات أو جلد أو أنسجة متبقية. ضعها في جهاز استقبال يحتوي على 1x PBS معقم لمزيد من المعالجة. تخلص من جثة وفقا لإرشادات لجنة أخلاقيات.
      ملاحظة: اعتمادا على أهداف الدراسة ، يمكن أيضا جمع جميع الخلايا من الكبد والجهاز العصبي المركزي والغدة الصعترية والغدد الليمفاوية وما إلى ذلك. في هذه المخطوطة ، على سبيل المثال ، نصف مجموعة جميع الخلايا من الطحال ونخاع العظم.
  6. التحضير لمعالجة الأعضاء
    1. اجمع أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل ، ومحاقن معقمة سعة 1 مل ، وإبرة معقمة تحت الجلد مقاس 25 مم × 0.6 مم ، ومصافي خلية معقمة 70 ميكرومتر.
  7. معالجة الطحال
    1. ضع مصفاة خلية واحدة أعلى أنبوب طرد مركزي مفتوح سعة 50 مل. ضع الطحال على سطح مصفاة الخلية. انقع العضو بالجزء المسطح من مكبس المحقنة حتى لا تظهر أجزاء كبيرة.
    2. أضف 1x PBS معقم إلى الطحال المتبل. قم بحركات دائرية مع الجزء المسطح من مكبس المحقنة لضمان ترشيح الخلايا.
      ملاحظة: يمكن صب PBS تدريجيا. ومع ذلك ، لا يمكن أن يتجاوز الحجم النهائي المستخدم 6 مل. عند الانتهاء من معالجة الطحال ، يجب أن تكون مصفاة الخلية واضحة وخالية من أي أنسجة متبقية. في حالة تشبع مصفاة الخلية ، من الممكن استخدام مصفاة خلية بديلة. يمكن نقل محتويات المصفاة الأولية إلى المصفاة الثانية ، ويمكن بعد ذلك مواصلة المعالجة. للوصول إلى عبء الورم داخل هذا العضو ، يمكن فصل جزء من الطحال للتقييم النسيجي المرضي.
  8. معالجة نخاع العظم
    1. قم بدمج مصفاة خلوية جديدة لمعالجة نخاع العظم في أنبوب الطرد المركزي المستخدم بالفعل. اقطع حواف عظم الفخذ حتى يمكن الوصول إلى فتحات نخاع العظم. أدخل الإبرة تحت الجلد في حقنة جديدة. أضف 1 مل من 1x PBS المعقمة إلى المحقنة.
      ملاحظة: اعتمادا على أهداف الدراسة ، يجب جمع جميع الخلايا التي تم الحصول عليها من الطحال ونخاع العظم بشكل منفصل. في هذه الحالة ، يجب استخدام أنبوب طرد مركزي منفصل لكل نسيج. يمكن فصل جزء من عظم الفخذ للتقييم النسيجي المرضي لتقييم عبء الورم داخل هذا العضو.
    2. قم بتنفيذ تدفق نخاع العظم فوق مصفاة الخلية. أدخل طرف الإبرة في جانب واحد من فتحة نخاع العظم. ادفع مكبس المحقنة بحركة ثابتة ومستمرة. كرر الإجراء مع عظم الفخذ الآخر.
    3. افصل الإبرة. استخدم الجزء المسطح من المحقنة لنقع نخاع العظم المتوهج. أضف 1x PBS معقم إلى نخاع العظم المتبل. قم بحركات دائرية مع الجزء المسطح من مكبس المحقنة لضمان ترشيح الخلايا. عند الانتهاء من إجراء المعالجة ، سيحتوي أنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل على حجم إجمالي قدره 10 مل ، ويشتمل على مزيج من خلايا الطحال ونخاع العظم التي تم تخفيفها في برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: يمكن تنفيذ عملية صب PBS تدريجيا ؛ ومع ذلك ، من الضروري التأكد من أن الحجم النهائي المستخدم لا يتجاوز 2 مل.

5. عزل خلايا سرطان الدم عن طريق الطرد المركزي المتدرج

  1. التحضير لعزل خلايا سرطان الدم
    1. اجمع أنبوب طرد مركزي واحد سعة 15 مل ، وماصات باستور معقمة يمكن التخلص منها ، وأنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل الذي يحتوي على الأعضاء التي تمت معالجتها ، ووسط تدرج الكثافة لعزل الخلايا الليمفاوية.
      ملاحظة: يسهل الوسيط عزل الخلايا أحادية النواة عن طريق إنشاء تدرج كثافة من خلال الطرد المركزي. تشكل الخلايا أحادية النواة (الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة وجميع الخلايا) طبقة عند الواجهة بين الوسط والبلازما.
  2. عزل خلايا اللوكيميا
    1. أضف 5 مل من وسط تدرج الكثافة لعزل الخلايا الليمفاوية إلى أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل باستخدام ماصة باستور يمكن التخلص منها. أضيفي تدريجيا 10 مل من خليط خلايا الطحال ونخاع العظم فوق الطبقة المتوسطة. أمسك الأنبوب بزاوية ضحلة ، حوالي 30 درجة أو أقل ، وأضف خليط الخلية ببطء على طول جدار الأنبوب حتى لا تتأثر الطبقة متوسطة الكثافة.
      ملاحظة: توخي الحذر أثناء هذه العملية للتأكد من أن الخلايا لا تختلط مع وسط الكثافة. يمكن أن يؤدي الاضطراب أثناء هذه العملية إلى فشل تكوين تدرج الكثافة أثناء الطرد المركزي.
    2. قم بالطرد المركزي للأنبوب سعة 15 مل عند 420 × جم على دوار دلو متأرجح ، لمدة 30 دقيقة ، دون تسارع وبدون انقطاع ، لتجنب إزعاج المراحل المشكلة.
      ملاحظة: ستشكل خلايا سرطان الدم طبقة بين وسط الكثافة والمراحل المائية.
    3. قم بإزالة المرحلة المائية العلوية والتخلص منها باستخدام ماصة باستور معقمة يمكن التخلص منها. اجمع طبقة الخلايا المصابة بسرطان الدم المكونة من ماصة باستور معقمة يمكن التخلص منها. انقله إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل.
      ملاحظة: لا تقلق إذا تم سحب بعض الطبقة المتوسطة منخفضة الكثافة مع خلايا ابيضاض الدم.
  3. غسل خلايا اللوكيميا
    1. أضف 1x PBS معقم إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا المجمعة حتى يتم الوصول إلى حد 15 مل.
    2. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × جملمدة 5 دقائق. استعادة أقصى قدر من التسارع والفرملة. قم بإزالة الطافق وتخلص منه. أعد تعليق الخلايا في البرد المعقم الجديد 1x PBS.5.3.3.انتقل إلى التحقق من صلاحية الخلية والخلية. اتبع إرشادات إجراءات تعداد الخلايا القياسية13. يمكن تلطيخ الخلايا المغسولة بالجسم المضاد CD45 المضاد للفأر (mCD45) ، والأجسام المضادة CD45 المضادة للإنسان (hCD45) ، والأجسام المضادة CD19 المضادة للإنسان (hCD19) ، متبوعة بخطوات الغسيل والحصول على البيانات.
      ملاحظة: في حالة معالجة خلايا الطحال وخلايا نخاع العظم في أنابيب طرد مركزي مختلفة ، يمكن استخدام جزء من هذه العينات للوصول إلى عبء الورم داخل هذه الأعضاء من خلال قياس التدفق الخلوي.
  4. حفظ خلايا اللوكيميا بالتبريد
    1. قم بإزالة الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من الطواقي. حافظ على الخلايا على الجليد.
    2. قم بإعداد وسط تجميد يتكون من 90٪ مصل أبقار الجنين البارد المعقم (FBS) و 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). استخدم 1 مل من هذا المحلول لكل قارورة حفظ بالتبريد.
    3. على الجليد ، أعد تعليق الخلايا في المحلول المحضر بتركيز 2 × 107 خلايا / مل. أدخل الخلايا في أنابيب الحفظ بالتبريد. خلايا الحفظ بالتبريد باتباع إرشادات الحفظ بالتبريد القياسيةلثقافة الخلايا 20.
      ملاحظة: يمكن استخدام هذه الخلايا لمزيد من التحليلات. بدلا من تجميد الخلايا القابلة للحياة ، يمكن للمرء أيضا أن يجمع الخلايا ويحافظ عليها في مواد حافظة مختلفة لتحليلات الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين والمستقلبات اللاحقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في سياق دراساتنا ، تم اختيار عينات السليفة من الخلايا البائية من مجموعتين من المرضى: واحدة أظهرت استجابة إيجابية ، كما هو محدد من خلال عدم وجود خلايا سرطان الدم في الدم المحيطي لليوم 8 وغياب خلايا سرطان الدم المتبقية في نخاع العظام في الأيام 15 و 33 و 78/96. تم تشكيل المجموعة الأخرى بواسطة ALLs التي تطابقت مع المجموعات الفرعية الجزيئية للمجموعات السابقة ، والتي تم الحصول عليها من المرضى الذين لديهم استجابة سريرية ضعيفة كما تم تقييمها بواسطة الحد الأدنى من...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعد فهم الآليات البيولوجية الكامنة وراء أمراض الأورام أمرا ضروريا لتطوير علاجات أكثر فعالية وتحسين نتائج المرضى. في حالات مثل ابيضاض الدم الليمفاوي الحاد لدى الأطفال ، فإن هذه الأساليب الاستقصائية ليست ذات صلة فقط بزيادة معدلات الشفاء ولكنها تحمل أيضا قيمة خاصة للمرضى الذين وصلت العلاجات القياسية إلى حدود شدة العلاج والقدرة على التحمل. في حالة الانتكاس ومقاومة العلاج ، لم يعد من الممكن معالجة التحدي بمجرد تعديل أنظمة العلاج الكيميائي. بدلا من ذلك ، فإنه يستلزم الكشف عن الآليات الجزيئية و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نشكر Centro Infantil Boldrini وجميع المرضى الذين تبرعوا بعيناتهم للدراسة. حصلت مانويلا إم هوف على زمالة من Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) من مؤسسة أبحاث ساو باولو (FAPESP ، 2024 / 03383-2). حصل خوسيه أ. يونس على زمالة الإنتاجية من المستشار الوطني للتنمية التكنولوجية والعلمية (CNPq، 308399/2021-8). تم دعم هذا العمل من خلال تمويل بحثي من وزارة الصحة البرازيلية من قبل برنامج PRONON (Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica، NUP 25000.211174/2019-45).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 ملل & غير ملكي؛ حقنةBD #309628حصاد الأعضاء
ماء معقم بسعة 10 مل للحقنهاليكس إيستار إنديانت وكيوت؛ ستريا فارماسيوتيكا LTDAhttps://www.medstoremaringa.com.br/produtos/agua-destilada-10ml-pack-c-5un-isofarma/إعادة تشكيل الأدوية
محلول تحليل 10X RBCبيو ليجند#420302معالجة عينات دم الفئران
محلل الخلايا ذو الخمسة قنواتبكالوريوس العلوم الحيوية658226R1مقياس التدفق الخلوي  
مصفاة خلايا 70 ميكروميموالفالكوم#352350حصاد الأعضاء
أسيبرومازين ماليات إنج فيتنيل LTDAhttps://vetnil.com.br/produto/acepran-r-1تخدير الفئران
APC مضاد للبشر CD45 - فأر متشابك IgG1 - نسخة HI30بيو ليجند#304037صبغة الخلايا اللمفاوية
Asparaginase 10000 Uأجيناز/ميداك#88660100علاج الفئران
Brilliant-Violet 605 مضاد للفأر CD45 - فأر متشابك IgG2 - نسخة 30-F11بيو ليجند#103139صبغة الخلايا اللمفاوية
داونوروبسينفارمارين#116880025علاج الفئران
ديكساميثازونAché#00000066علاج الفئران
ثنائي ميثيل كبريتاتسيغما-ألدرتش#589569حفظ الخلايا اللمفاوية بالتبريد
إبرة قابلة للاستخدام مرة واحدة - 0.60 × 25 مم (23G × 1' ’)دينار بحريني#300388حصاد الأعضاء
لانست قابل للتخلص من الطلقة المعقم  يانتشنغ هويدا للأدوات الطبية  https://www.cralplast.com.br/produto/lanceta-manual/جمع دم الفئران
حمض الإيثيلين ديامين التتريستيكتقنيات الحياة#15576-O28حل EDTA
مصل الأبقار الجنينيكولتيلاب#F083حفظ الخلايا اللمفاوية بالتبريد
تحليل برمجيات قياس التدفق الخلوي - الإصدار 10.10.0بكالوريوس العلوم الحيويةhttps://www.flowjo.com/تحليل قياس التدفق الخلوي
تحليل برمجيات الرسوم البيانية والرسم - الإصدار 9.5.1دوتماتكسhttps://www.graphpad.com/featuresرسم وتحليل الرسوم البيانية
حقنة الأنسولين مع إبرة مرفقة 1 مل FX 12.7 مم × 0.33 ممديسكارباكe0342101زراعة الفئران وإعطاء الأدوية
كيتامين إنجSespo Indú الخطوط التجارية والحاجة؛ RCIO LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/dopalen-pecuaria/تخدير الفئران
منصة جراحية متعددة الوظائف للقوارضمؤسسة كينت العلميةhttps://www.kentscientific.com/products/surgisuite/إجراءات جراحة الفئران
PE مضاد للبشر CD19 - فأر من النمط النظيري IgG1 - نسخة HIB19بيو ليجند#302208صبغة الخلايا اللمفاوية
كلوريد البوتاسيومسيغما-ألدرتشP3911-1KGحل PBS
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعديسيغما-ألدرتشP0662-1KGحل PBS
كاشف لعزل الخلايا اللمفاويةسيتيفا#17-1440-02، حزمة من 6 مرات &; 100  ملعزل الخلايا اللمفاوية من الأعضاء المحصودة
كلوريد الصوديومسيغما-ألدرتشS9888-1kgحل PBS
فوسفات الصوديوم ديبيسيك سيغما-ألدرتشS9763-1KGحل PBS
ملقط تشريحي معقم - 12 سم ABC 0170مختبر Lí دير120إجراءات الفئران الجراحية
مقص معقم 12 سم - ABC 0321مختبر Lí دير136إجراءات الفئران الجراحية
فينكريستينليبس#7896094208483علاج الفئران
زيلازين إنجSespo Indú الخطوط التجارية والحاجة؛ RCIO LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/anasedan-10-ml-bovinos-e-equinos/تخدير الفئران

المراجع

  1. Hunger, S. P., Mullighan, C. G. Acute Lymphoblastic Leukemia in Children. N Engl J Med. 373 (16), 1541-1552 (2015).
  2. Mengxuan, S., Fen, Z., Runming, J. Novel treatments for pediatric relapsed or refractory acute B-cell lineage lymphoblastic leukemia: Precision medicine era. Front Pediatr. 10, 923419(2022).
  3. Bailey, L. C., Lange, B. J., Rheingold, S. R., Bunin, N. J. Bone-marrow relapse in paediatric acute lymphoblastic leukaemia. Lancet Oncol. 9 (9), 873-883 (2008).
  4. Inaba, H., Mullighan, C. G. Pediatric acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 105 (11), 2524-2539 (2020).
  5. Mullighan, C. G., et al. Genomic analysis of the clonal origins of relapsed acute lymphoblastic leukemia. Science. 322 (5906), 1377-1380 (2008).
  6. Turati, V. A., et al. Chemotherapy induces canalization of cell state in childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Nat Cancer. 2 (8), 835-852 (2021).
  7. Uckun, F. M., et al. Prognostic significance of B-lineage leukemic cell growth in SCID mice: a Children's Cancer Group Study. Leuk Lymphoma. 30 (5-6), 503-514 (1998).
  8. Borgmann, A., et al. Childhood all blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice. Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).
  9. Lock, R. B., et al. The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mice model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis andrelapse. Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).
  10. Samuels, A. L., et al. A pre-clinical model of resistance to induction therapy in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Blood Cancer J. 4 (8), e232(2014).
  11. Alruwetei, A. M., et al. Examining treatment responses of diagnostic marrow in murine xenografts to predict relapse in children with acute lymphoblastic leukaemia. Br J Cancer. 123 (5), 742-751 (2020).
  12. Wunderlich, M., et al. Improved chemotherapy modeling with RAG-based immune deficient mice. PLoS One. 14 (11), e0225532(2019).
  13. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnol Rep. 7, 9-16 (2015).
  14. Liem, N. L., et al. Characterization of childhood acute lymphoblastic leukemia xenograft models for the preclinical evaluation of new therapies. Blood. 103 (10), 3905-3914 (2004).
  15. Treatment protocol for children and adolescents with acute lymphoblastic leukemia - AIEOP-BFM ALL 2017. , AIEOP-BFM Study Group. https://clinicaltrials.gov/study/NCT03643276#study-overview (2017).
  16. Randall, J., et al. In vivo activity of the second-generation proteasome inhibitor ixazomib against pediatric T-cell acute lymphoblastic leukemia xenografts. Exp Hematol. 132, 104176(2024).
  17. Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
  18. Guidelines to promote the wellbeing of animals used for scientific purpose. , National Health and Medical Research Council (NHMRC). https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/guidelines-promote-wellbeing-animals-used-scientific-purposes (2008).
  19. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020).
  20. Ramos, T. V., Mathew, A. J., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. Standardized cryopreservation of human primary cells. Curr Protoc Cell Biol. 64, A.3I.1-A.3I.8 (2014).
  21. Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: Technologies and applications. Sig Transduct Target Ther. 8, 160(2023).
  22. Jin, J., Yoshimura, K., Sewastjanow-Silva, M., Song, S., Ajani, J. A. Challenges and prospects of patient-derived xenografts for cancer research. Cancers. 15 (17), 4352(2023).
  23. Duy, C., et al. Chemotherapy induces senescence-like resilient cells capable of initiating AML recurrence. Cancer Discov. 11 (6), 1542-1561 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نموذج الفئران لانتكاس ابيضاض الدم إلى العلاج الكيميائي التعريفي لسرطان الدم الليمفاوي الحاد
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.