طريقة تصوير بصري متوافقة مع المجهر الإلكتروني الماسح لرسم خرائط الدماغ لجميع الخلايا بالمنظار

Summary

قدمنا تقنية تصوير جديدة تسمى التصوير المقطعي متعدد الطبقات البصري (OMLIT)، والتي تتيح التصوير غير المتحيز لجميع الخلايا في عينات الدماغ على المستوى المتوسط ويمكن دمجها بسلاسة في سير عمل التصوير الخاص بالمجهر الإلكتروني الماسح التسلسلي المعتمد على الشريط على نفس العينة.

Abstract

يتطلب فهم العلاقات الهيكلية والوظيفية داخل الشبكات العصبية المعقدة في الدماغ بناء أطالس دماغية تمتلك مجال رؤية واسع ودقة تحت الخلية معا. ومع ذلك، فإن طرق التصوير البصري والميكروسكوب الإلكتروني الحالية تعاني من قيود، مما يصعب تصوير جميع الخلايا داخل عينة واحدة. يقدم هذا البروتوكول تقنية تصوير تسمى التصوير المقطعي متعدد الطبقات البصري (OMLIT)، والتي تتيح التصوير البصري غير التمييزي لجميع الخلايا في عينات الدماغ التي تم إنتاجها بعد تحضير عينات بالمجهر الإلكتروني، مما يعيد بناء أطلس كامل لجميع الخلايا العصبية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن دمج تصوير OMLIT بسلاسة مع سير عمل التصوير في المجهر الإلكتروني الماسح فائق الميكروتومي الآلي لجمع الأشرطة (ATUM-SEM). يتيح ذلك للباحثين الحصول على معلومات بنيوية متوسطة المستوى للخلايا قبل تصوير المجهر الإلكتروني، مما يسهل اختيار المناطق المهمة بدقة ويقلل بشكل كبير من المساحة وحجم البيانات المطلوبة لتصوير المجهر الإلكتروني عالي الدقة. قمنا بالتحقق من دقة وتوافق هذه الطريقة في عينات فعلية من قشرة دماغ الفأر البالغ، مما أظهر آفاقها الواسعة في بناء أطلس الدماغ متعدد المقاييس.

Introduction

يعد رسم الخرائط الشاملة للدوائر العصبية بدقة خلوية وتحت خلوية ضرورية لكشف بنية ووظيفة الدماغ. مكنت طرق التصوير البصري التقليدية، مثل المجهر ذو الفوتونين¹، والتصوير المقطعي المقطعي البصري الفلوري (fMOST)^2,3,4، ونظام VISoR⁵، من التصوير العصبي المتوسط النطاق والتصوير الوظيفي في الجسم الحي. ومع ذلك، وبسبب اعتمادها على وضع العلامات المتفرقة، فشلت في التقاط كامل المجموعة الخلوية. من ناحية أخرى، تمتلك تقنيات التصوير البصري الخالي من العلامات، مثل المجهر الضوئي الصوتي الوظيفي (fPAM)^6,7، والتصوير المقطعي التماسكي البصري (OCT)⁸، والمجهر الكمي^{في الطور 9}، القدرة على رؤية جميع الخلايا العصبية في مجال الرؤية في آن واحد. ومع ذلك، فإن هذه الطرق عادة ما تقتصر على انخفاض الدقة المحورية وعمق التصوير الضحل، كما أن تعقيد أجهزتها يعيق التطبيق الواسع في بناء أطلس الدماغ. على النقيض من ذلك، تقنيات المجهر الإلكتروني المقطع التسلسلي (ssEM)، بما في ذلك المجهر الإلكتروني ذو الوجه التسلسلي (SBF-SEM)^10,11، وSEM بشعاع الأيون المركز (FIB-SEM)12,13,14، ونظام جمع الشريط الآلي لتحليل المجهر الميكروبي (ATUM-SEM)15,16,17، يمكنها الكشف عن شبكات اتصال مشبكية كثيفة بدقة نانومتر، مما يوفر أدوات أساسية لأنظمة الاتصال عالية الدقة. ومع ذلك، تعاني هذه التقنيات من انخفاض معدل الإنتاجية، وأوقات الاقتناء الطويلة، ومحدودية مجالات الرؤية المتاحة، وتكاليف معالجة البيانات والأجهزة العالية¹⁸.

لتجاوز القيود السابقة، طورنا طريقة تصوير تسمى التصوير المقطعي متعدد الطبقات البصري (OMLIT)، والتي تقدم حلا منخفض التكلفة وعالي الإنتاجية للتصوير العشوائي عالي التباين والمجال الواسع لجميع الخلايا على مقاطع رقيقة جدا، محققا دقة تحت ميكرون عبر مناطق الأنسجة الكبيرة. وفي الوقت نفسه، فإن OMLIT متوافق بطبيعته مع سير عمل SEM المقطع التسلسلي: قبل المجهر الإلكتروني عالي الدقة، يوفر OMLIT معلومات هيكلية على نفس الأقسام، مما يسمح بالتنقل الدقيق في العائد على الاستثمار، ويقلل بشكل كبير من المساحة وحجم البيانات المطلوبة للتصوير الكهرومغناطيسي اللاحق. يقدم OMLIT مزايا فريدة على مستوى التصوير المتوسط ويعمل كجسر حاسم يربط الخرائط الهيكلية العصبية عبر مقاييس مكانية مختلفة. طبيعته غير المدمرة تحافظ على إمكانية الدمج المستقبلي مع استراتيجيات وسم محددة، مثل استخدام بروتينات فلورية مقاومة للأوزميوم¹⁹ لتحضير العينات والتصوير. تمكن هذه الطريقة من التصوير على نطاق متوسط لمناطق دماغية مختارة، مما يسمح بالحصول السريع على شكل الخلايا العصبية وكميتها وتوزيعها وكثافتها في المناطق. كما يسهل التوصيف الكمي للإسقاطات المحاور وتوزيع التغصنات بين الخلايا العصبية في مناطق دماغية مختلفة. بالنسبة لمناطق محددة ذات أهمية في نتائج التصوير، يمكن التحقيق بشكل أعمق في التفاصيل الفائقة البنية الميدانية باستخدام المجهر الإلكتروني.

تم وصف مبدأ التصوير في OMLIT في عمل هاو فان²⁰. باختصار، أثناء التصوير، تشكل الطبقة فائقة الرقيقة، الطبقة المطلية، شريط الجمع، الشريط الموصل، والرقاقة بنية متعددة الطبقات من الأغشية الرقيقة. عندما تتفاعل موجة مستوية مع هذا البناء، تولد موجات منعكسة عند واجهات مختلفة وتتداخل في فضاء الكشف، مما يؤدي إلى تداخل بصري بسبب اختلافات الانعكاس، ومعامل الانكسار، والامتصاص بين المواد. أظهر برنامج محاكاة قائم على MATLAB تم تطويره بناء على هذا المبدأ توافقا معقولا مع نتائج التجارب.

يمكن تصنيف مخطط التصوير OMLIT إلى نوعين بناء على استراتيجية معالجة الشريط. الأولى هي استراتيجية الانعكاسية العالية، حيث تستخدم معادن مثل Cr أو Cu أو Al أو Ag لتغطية سطح الشريط، مما يؤدي إلى زيادة شدة بصرية في المناطق السيتوبلازمية والمناطق الوعائية المملوءة بالراتنج مقارنة بالمناطق المحيطة. الثانية هي استراتيجية الانعكاس المنخفض، التي تستخدم شريط كابتون غير المطلي أو شريط D-50 أو شريط PET المطلي بالكربون النانوي. في هذه الحالة، تكون نتيجة التصوير البصري عكس الأولى: تظهر مناطق خالية من الأغشية الغنية بالراتنج (مثل السيتوبلازم واللومين الوعائي) بشدة أقل.

نقوم بتلخيص ووضع بروتوكولات موحدة بشكل منهجي مصممة لاستراتيجيتين تصويريتين مختلفتين. البروتوكولات المعروضة هنا تقدم إجراءات تجريبية شاملة ومفصلة. بالإضافة إلى ذلك، يتم تلخيص القضايا الشائعة التي تم مواجهتها خلال التجارب، إلى جانب الحلول المقترحة. نركز على تقديم مجموعة بيانات لقشرة الفئران التي تم الحصول عليها باستخدام استراتيجية الانعكاس المنخفض (805 × 857.5 × 11.66 ميكرومتر مكعب)، موضحا الميزات والمزايا المميزة لنهج التصوير OMLIT.

Protocol

تم إجراء جميع إجراءات الحيوانات وفقا للإرشادات المؤسسية لجامعة العلوم والتكنولوجيا الصينية واللوائح الوطنية ذات الصلة. يتبع تحضير العينة لتصوير OMLIT نفس البروتوكول المستخدم في EM التقليدي، وقد تم وصف الإجراء المحدد الذي استخدمناه في مكان آخر²¹. باختصار، بعد التخدير، تم تثبيط الفئران عبر القلب بشكل متسلسل باستخدام محلول كاكوديلات الصوديوم، والسائل الدماغي الشوكي الصناعي (ACSF)، وأخيرا مثبت يحتوي على جلوتارالديهايد وبارافورمالديهايد. تمت إزالة الدماغ بعناية، وتم تقسيم كتل من نسيج الدماغ بحجم 1 × 1 × 1 ملم مكعب. ثم تم تثبيت العينات كيميائيا، وتعرضها لتلوين معدني ثقيل متسلسل، وتجفيفها، وغرسها في الراتنج. يتم عرض سير العمل العام للبروتوكول في الشكل 1.

الشكل 1: نظرة عامة على سير العمل. (أ) أشرطة الجمع المذكورة في البروتوكول (من اليسار إلى اليمين: البولي إيميد، D-50، وPET المغلف بالنانوية النانوية (CNT). (ب) التقسيم التسلسلي وجمع العينات المقذوعة. (ج) تركيب الشرائط التي تحتوي على المقاطع المجمعة على رقاقة سيليكون دائرية. (د) تصوير المجهر الضوئي، شريط مقياس 100 ميكرومتر. (ه) طلاء كربوني. (F) يتوافق تصوير المجهر الإلكتروني مع المنطقة الموضحة في الشكل 1D، شريط المقياس: 10 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

1. تحضير الشريط

ملاحظة: يجب إجراء الإجراءات التالية في غرفة نظيفة لمنع تلوث الشريط من الغبار.

1. استراتيجية الانعكاس العالي
   1. اختر شريط كابتون (المعروف لاحقا بشريط البولي إيميد، بسماكة 50 ميكرومتر) أو فيلم بانلايت (الذي يشار إليه لاحقا باسم D-50، بسماكة 50 ميكرومتر) وركبه على نظام اللف المحرك. هنا، يستخدم شريط البولي إيميد كمثال.
      ملاحظة: تم استخدام جهاز لف محرك، مصمم ليشغل بواسطة محرك متدرج يتم التحكم فيه عبر لوحة أردوينو، لتمرير الشريط من بكرة إلى أخرى عبر مخروط بلازما السبتر. لتعويض زيادة سرعة الخط في ترجمة الشريط الناتجة عن تراكم الشريط على بكرة القيادة، مما يزيد من قطر بكرة الالاتاح، تم كتابة برنامج لضبط سرعة زاوية بكرة السحب تسلسليا بعد كل دورة بزاوية 360°.
   2. يتم وضع طبقة رقيقة منتظمة من الكرامينيوم (أو معادن أخرى مثل الألبوميوم أو الزراعة أو النحس) على سطح الشريط باستخدام نظام رشش ماجنترون (رذاذ الرأسين). ضع الشريط على مسافة 80 مم من هدف التقطيع للحصول على ترسيب مثالي. أجر العملية تحت طاقة تيار مستمر وبضغط 1.0 باسكال منظم بغاز الأرجون بنسبة 99.99٪.
   3. اضبط سرعة لف الشريط على 0.6 مم/ثانية لتحقيق سمك طلاء معدني يبلغ 50 نانومتر. بعد الترسب، قم بتبريد الحجرة ببطء إلى درجة حرارة الغرفة (RT) تحت فراغ عالي لتقليل إجهاد الطلاء.
      ملاحظة: يمكن أن يختلف سمك الطلاء الأمثل لنفس الشريط حسب نوع المعدن المستخدم. اضبط سرعة الترجمة للشريط لتحقيق مجموعة متنوعة من سماكات الطلاء، مثل 50، 70، 100، 150، و200 نانومتر.
   4. قيم سمك وتجانس الطلاء باستخدام جهاز تحليل القلم أو المجهر الذري للقوة الذرية، أو المجهر الإلكتروني الماسح.
   5. نظف الشريط وجعله مهيبا للماء باستخدام منظف بلازما بقوة 80 واط، بسرعة حركة الشريط 7 مم/ثانية. بعد المعالجة، يجب أن تنتشر قطرات الماء الموضوعة على سطح الشريط بسرعة إلى طبقة رقيقة (الشكل 2A).
2. استراتيجية الانعكاس المنخفض
   ملاحظة: يسمح هذا البروتوكول باستخدام إما شريط D-50 أو شريط تجاري من أنابيب الكربون النانوية (CNT) مطلية بالبولي إيثيلين تيريفثالات (PET). ونظرا لأن الأخيرة قد تسبب بعض الضوضاء الخلفية أثناء تصوير المجهر الإلكتروني - رغم أنه ليس قويا - فقد يؤثر على تقسيم الصور الكهرومغناطيسية. لذلك، سيظل الوصف التالي يستخدم شريط D-50 كمثال.
   1. جهز أفلام D-50 وقص الورقة الكاملة إلى أشرطة بعرض حوالي 7 مم. استخدم جانبا مكشوفا من الشريط لجمع الأجزاء، مع حماية الجانب الآخر بطبقة من الفيلم غير اللامع لمنع الخدوش والتلوث. قم بإزالة الفيلم المطفي أثناء خطوة تركيب رقائق السيليكون التالية.
   2. للحصول على عدد أكبر من الأقسام، قم بربط أقسام مختلفة من شريط D-50 معا. ثبت الوصلات بين مقاطع الشريط باستخدام شريط لاصق مزدوج الوجه.
      ملاحظة: عند لصق مقاطع الشريط، تأكد من أن الشريط الأمامي يتداخل مع الشريط الخلفي من الأعلى إلى الأسفل عبر الشريط ذو الوجهين. قلل من مساحة اللاصق واترك هامشا على حواف الشريط لمنع ضغط الغراء أثناء لف الشريط، مما قد يلوث الشريط (الشكل 2B).
   3. نظف وجعل الشريط محبا للماء باستخدام منظف بلازما، باتباع نفس الإجراء وتحقيق نفس التأثير الموصوف سابقا.
      ملاحظة: باستثناء خطوات الطلاء المعدني وخطوات الترشيد الكربوني، فإن الخطوات الأخرى في كلتا الاستراتيجيتين متشابهة.

2. التقسيم التسلسلي فائق الرقة وجمع الشريط

1. باستخدام مطحنة صغيرة أو أداة قطع مشابهة، قم بتقليم الراتنج على الجانب الذي يحتوي على العينة، وإزالة الراتنج الفارغ المحيط لكشف منطقة العينة.
2. ضع الكتلة المدمجة بالراتنج في حامل العينات، وشد مقبض الحامل لتثبيت الكتلة بإحكام.
3. ثبت حامل العينات على ذراع الميكروتوم المتحركة. قم بتركيب سكين زجاجي أو سكين تقليم من الألماس (بزاوية 45°) على حامل السكين. تحت المجهر، قم بقص سطح العينة على شكل هرم وقم بتنعيمه.
   ملاحظة: يجب أن تكون الحواف الأمامية والخلفية لكتلة العينة المقذوعة متوازية قدر الإمكان (انظر الشكل 2C).
4. قم بتقليم وتنعيم الجوانب الأربعة لكتلة العينة لإزالة أي راتنج زائد حول الحواف، مما يمنع الاصطدام المحتمل بالسكين الماسي. قم بتدوير المقبض لضمان محاذاة الحواف الأمامية والخلفية للكتلة المقذوفة في وضع أفقي.
5. أزل سكين التشطيم واستبدله بسكين ألماس مثبت بزاوية 45°. اضبط زاوية ميل قاعدة الميكروتوم على 6°. حرك حامل السكين ببطء باستخدام المقبض حتى تصبح الحافة الأمامية لسكين الألماس على بعد 1-2 مم من سطح العينة.
6. راقب الشريط الساطع بين سطح العينة وحافة السكين، واضبط زاوية الميل بحيث يكون الشريط متساويا من الأعلى إلى الأسفل ومن الجانب إلى الجانب. هذا يساعد في ضمان أن يشمل القسم الأول كامل سطح العينة، وليس مجرد زاوية.
7. حقن الماء المقطر في أخدود سكين الألماس، مما يسمح لمستوى السائل بالارتفاع وضمان رطوبة النصل. ثم استخدم حقنة لإزالة بعض الماء حتى ينخفض مستوى السائل، ويبدو الانعكاس فضيا.
8. اضبط سمك القسم (التغذية)، سرعة القطع، ونافذة القطع في وحدة التحكم. اضبط سرعة التقسيم إلى 0.6 مم/ثانية واضبط سمك المقطع إلى 60 نانومتر (السرعة والسمك النوعية يعتمدان على جودة العينة).
9. ابدأ التقسيم. بمجرد أن يعمل الميكروتوم بثبات وتنتج مقاطع متجانسة، توقف عملية التقسيم. استخدم فرشاة دقيقة لإزالة الأجزاء المقطوعة وأي حطام.
10. قم بتركيب كل من بكرة الشريط المطلي وبكرة السحب الفارغة على نظام جمع الأقسام فائقة الرقة الأوتوماتيكية. قم بتثبيت آلية القفل وقم بتجربة تشغيل لضمان تحرك الشريط بسلاسة بسرعة ثابتة وجمعه بشكل صحيح على البكرة الفارغة.
11. اغمر رأس جمع جهاز جمع الشريط في حمام الماء الخاص بسكين الألماس. اضبط موضع رأس الجمع بحيث يكون موازيا لحافة السكين، على مسافة 1.5 ضعف طول شريحة العينة، لضمان جمع الأجزاء المقطوعة بسلاسة على الشريط. قم بتأمين جهاز الجمع واستأنف التقسيم أثناء تشغيل جهاز جمع الأشرطة في نفس الوقت.
12. بعد جمع عدد كاف من المقاطع المستمرة، توقف عملية التقسيم. اقطع الشريط في منطقة القسم التي لم يتم جمع أي أقسام فيها، واستمر في تشغيل جهاز جمع الشريط حتى يتم جمع كل الشريط المتبقي على البكرة.
13. أزل البكرة التي تحتوي على الأقسام المجمعة وضعها في فرن تجفيف إلكتروني. نظف جهاز جمع الشريط والميكروتوم، وأعد جميع الملحقات إلى أماكنها الصحيحة.

الشكل 2: التحضيرات قبل التقسيم. (أ) قطرات الماء على سطح شريط D-50 قبل (الأعلى) وبعد (الأسفل) المعالجة المحبة للماء. (ب) مشاهد مخططية علوية وجانبية لمنطقة التقاطع لشريط D-50. الأزرق: شريط D-50؛ برتقالي: لاصق مزدوج الوجه؛ Green Arrow: اتجاه حركة الشريط. (ج) منظر أمامي للعينة بعد القص، مع إظهار الحواف العلوية والسفلية المتوازية. (د) جهاز جمع الأشرطة الآلي. أ: بكرة شريط لتغذية شريط D-50؛ ب: بكرة شريط لاصق لاسترجاع الشريط؛ السهم الأحمر: اتجاه حركة الشريط. (ه) موقع رأس الجمع على جهاز جمع الشريط الآلي. الصندوق الأصفر في أسفل اليمين يشير إلى قسم مقطوع حديثا على وشك جمعه بواسطة الجهاز. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. التركيب على شريحة سيليكون

ملاحظة: تأكد من نظافة مساحة العمل لتجنب تلوث الشريط بالغبار خلال الخطوات التالية.

1. استخدم رقاقة سيليكون دائرية بحجم 4 إنش تم تنظيفها مسبقا وهيدروفيليبية في نظام معالجة بلازما (بقوة 80 واط، 3 دقائق).
2. ارتد قفازات نظيفة، وضع رقاقة السيليكون على سطح مستو، وقص قطعة من شريط الكربون الموصل ذو الوجهين إلى طول مناسب (مع بروز 2-3 سم على كلا الطرفين). قم بإزالة الطبقة الواقية البيضاء من أحد جانبي شريط التوصيل ثنائي الجانب، وطبقها من الأعلى إلى الأسفل على رقاقة السيليكون.
   ملاحظة: يجب أن يكون جانبي الشريط الموصل متباعدين بحوالي 2 مم، ويجب أن تكون حواف الشريط مرئية على رقاقة السيليكون. بالنسبة لشريط موصل مزدوج الوجه بعرض 25 مم، يمكن تطبيق ثلاثة أجزاء من الشريط على رقاقة سيليكون واحدة بحجم 4 إنش.
3. ارسم مخططا لشريحة السيليكون بحجم 4 إنشات على طاولة العمل وحدد الطول التقريبي لكل جزء من الشريط الذي سيتم تطبيقه على الرقاقة. اقطع الشريط الذي جمع الأقسام حسب الأطوال التي تم تحديدها سابقا.
   ملاحظة: يجب ألا يتجاوز شريط القطع حافة رقاقة السيليكون، ولا يقطع الأقسام.
4. قم بإزالة الفيلم الشفاف الواقي من الشريط الموصل ذو الوجهين، وبالنسبة لشريط D-50، أزل الفيلم الواقي من ظهر الشريط في هذه المرحلة. ضع الشريط بشكل مواز على الشريط الموصل ذو الوجهين. قم بتطبيق ما يصل إلى ثلاثة أجزاء من الشريط اللاصق على كل قطعة من الشريط الموصل مزدوج الوجه.
   ملاحظة: لتقليل خطر عدم محاذاة شريط D-50 أو تلوثه بالغبار، غط جزءا من الشريط الموصل بالفيلم الشفاف الذي تم تقشيره سابقا، مع ترك جزء صغير فقط من الشريط الموصل مكشوفا لتثبيت نهاية شريط D-50. هذا يسمح بضبط اتجاه الشريط بسهولة أكبر. بعد ذلك، قم بإزالة الفيلم الشفاف المتبقي ببطء، مما يسمح لبقية شريط D-50 بالسقوط بلطف والالتصاق بالشريط الموصل.
5. بعد تركيب الشريط، قد تتكون فقاعات هواء بين الشريط والشريط الموصل، مما قد يتداخل مع عملية التصوير اللاحقة. ضع رقاقة السيليكون في غرفة تفريغ (أو معدات تفريغ أخرى) وطبقها على الفراغ. بعد اكتمال عملية التفريغ، تأكد من اختفاء فقاعات الهواء.

4. ما بعد التلوين

1. حضر 4٪ أسيتات يورانيل و3٪ سترات رصاص، وسخنهما مسبقا إلى 50°C باستخدام قدر حمام مائي.
   تحذير: أسيتات اليورانيل مشعة وتحمل سمية كبيرة للكبد والكلى. يمكن أن يسبب الرصاص التسمم بالرصاص، مما يؤثر على الجهاز العصبي والكلى والجهاز المسبب للدم. يجب أن يتم العمل باستخدام هذه المواد باستخدام غطاء بخار، ويجب ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE)، بما في ذلك معطف المختبر، وقفازات النيتريل، الكمامة، ونظارات السلامة. في حال وجود اتصال جلدي أو عيني، اغسله فورا بكميات كبيرة من الماء، وتوجه إلى فريق السلامة في المختبر، واطلب الرعاية الطبية.
2. ضع رقاقة السيليكون، التي تم تفريغها وخالية من الفقاعات، في نظام تخصيب البلازما للهيدروفيليشن والتنظيف.
3. باستخدام حقنة بسعة 10 مل مع إزالة الإبرة، قم بتركيب مرشح حقنة بحجم 0.22 ميكرومتر وقم بترشيح أسيتات اليورانيل بنسبة 4٪. ضع المحلول على المقطع حتى يغطي سطح القسم بالكامل على رقاقة السيليكون، ثم انتظر لمدة 3 دقائق.
4. اغسله بالماء المقطر لمدة 3 دقائق، كرر ذلك ثلاث مرات، ثم جفف سطح العينة بالنيتروجين.
5. باستخدام حقنة 10 مل مع إزالة الإبرة، قم بتثبيت فلتر حقنة بحجم 0.22 ميكرومتر وترشيح سيترات الرصاص بنسبة 3٪. ضع المحلول على القسم حتى يغطي سطح القسم بالكامل على رقاقة السيليكون، ثم انتظر لمدة 5 دقائق.
6. اغسله بالماء المقطر لمدة 3 دقائق، كرر ذلك ثلاث مرات، ثم جفف سطح العينة بالنيتروجين.

5. جمع البيانات

1. المجهر البصري
   ملاحظة: في هذا القسم، يستخدم ماسح شرائح البحث (VS200، أوليمبوس) كمثال على المجهر البصري. مجاهر أخرى، مثل Axio Imager.A2 Vario (زايس، ألمانيا)، مناسبة أيضا للتصوير البصري الموصوف هنا. الخطوات في المجاهر البصرية الأخرى عادة ما تكون نفسها.
   1. ضع رقاقة السيليكون على منصة المجهر البصري وثبتها بشريط لاصق غير بقايا.
   2. استخدم عدسة هدف 5x للحصول على صورة عامة لشريحة السيليكون، والشريط الريفي، والعينة.
   3. في صورة النظرة العامة، رسم مخطط لكل قسم وفرزه، ثم أضف نقاط التركيز ونقاط التعريض لإجراء تصوير تلقائي بتكبير 20x أو 50x عبر كامل شريحة السيليكون مع جميع الأقسام.
   4. بعد الانتهاء من التصوير، احفظ الصور، ثم تحقق من جودة الصورة. إذا كانت هناك صور غير واضحة أو ذات جودة منخفضة، أعد التركيز وأعد التصوير.
2. المجهر الإلكتروني
   ملاحظة: يمكن لأنواع متعددة من المجاهر الإلكترونية إجراء تصوير مستمر للمقاطع فائقة الرقة الموضوعة على رقائق السيليكون. هنا، يستخدم جهاز Multibeam 505 (Zeiss) كمثال.
   1. قم بطلاء الكربون على سطح العينة باستخدام طبقة طلاء عالية الفراغ، بسماكة كربونية تبلغ 5.7 نانومتر.
      ملاحظة: يمكن تخطي هذه الخطوة للأشرطة التي تم طلاؤها بالمعادن باستراتيجية الانعكاس العالي أو مطلية بأنابيب الكربون النانوية (CNT) في استراتيجية الانعكاس المنخفض.
   2. استخدم المجهر البصري (Axio Imager.A2 Vario, Zeiss) لالتقاط خريطة الملاحة البصرية لشريحة السيليكون.
   3. ضع رقاقة السيليكون في غرفة العينة في SEM. ربط خريطة الملاحة البصرية بصورة المجهر الإلكتروني عن طريق تحديد علامتي الحرف L المتداخلتين على شكل حرف L على مرحلة العينة بشكل متسلسل.
   4. استخدم وحدة SAT في برنامج المجهر (v3.2، 64-بت) لتحديد مواقع الأقسام ومناطق التصوير بشكل شبه تلقائي من خريطة الملاحة البصرية.
   5. اضبط حجم بكسل الصورة إلى 4 نانومتر، ووقت البقاء إلى 0.8 ميكروثانية، ونقاط التركيز والمواقع، ومواقع التخزين.
   6. ابدأ التصوير المستمر.

6. معالجة البيانات

ملاحظة: يتم تنفيذ خياطة صور OMLIT ثنائية الأبعاد تلقائيا بواسطة البرنامج. لتسجيل وتقسيم صور OMLIT ثلاثية الأبعاد واسعة النطاق، تتوفر خوارزميات ذكاء اصطناعي أكثر قوة. هنا، ولتسهيل معظم المختبرات للتحقق من العملية، يتم عرض عملية التطريز والتسجيل والتقسيم باستخدام فيجي (v1.54p، 64-بت) وVAST (v1.5.0، 64-بت).

1. افتح مجموعة بيانات الصور في فيجي عن طريق سحب المجلد الذي يحتوي على جميع ملفات الصور إلى واجهة فيجي، واختر المكدس الافتراضي عند الطلب.
2. استخدم أداة المستطيل لاختيار المنطقة المعنية (ROI)، ثم اقتصاص مجموعة البيانات عبر Image > Crop.
3. محاذاة مكدس الصور باستخدام إضافة Register Virtual Stack Slices (الإضافات > التسجيل > شرائح المكدس الافتراضي للتسجيل).
4. احفظ مجموعة البيانات المحاذية بصيغة TIFF (ملف > حفظ > تيف).
5. استيراد مكدس صور TIFF إلى VAST²² باستخدام Import > Import Image volume volume من الصور إلى . ملف VSV.
   ملاحظة: لمزيد من الشرح التفصيلي، يرجى الرجوع إلى الموقع الإلكتروني: https://lichtman.rc.fas.harvard.edu/vast/
6. عند توصيل جهاز لوحي خارجي، استخدم أداة الفرشاة في وضع رسم مقاطع لبدء التقسيم اليدوي والتتبع (استخدم مفاتيح الاختصار A و Z للتنقل السريع بين شرائح الصورة).
7. تصور الهيكل المقسم ثلاثي الأبعاد باستخدام نافذة > عارض ثلاثي الأبعاد > عرض > تحديث.
8. احفظ نتائج التقسيم عبر ملف > حفظ التقسيم.

Results

يبدأ سير العمل العام للبروتوكول (الشكل 1) بتحضير أشرطة مجموعات مختلفة. يوضح الشكل 1 الأنواع الثلاثة من الأشرطة المذكورة في البروتوكول (من اليسار إلى اليمين: Kapton، D-50، وPET المطلي بالنانوية النانوية النانية)، والتي تظهر خصائص بصرية مميزة عند وضعها على نفس الركيزة الخلفية. بعد تحضير العينة وتقليم الكتل، يجب أولا جمع بعض المقاطع لتصوير المجهر الإلكتروني لضمان تلبية التوقعات. باستخدام نظام جمع أشرطة آلي، يمكن جمع آلاف الأقسام وت...

Discussion

هنا، طورنا نهجا للتصوير البصري، يسمى OMLIT، يتيح التصوير الميزوسكوبي ويتوافق مع سير عمل المجهر الإلكتروني الماسح التسلسلي المعتمد على الشريط. باستخدام طريقة OMLIT، يمكن استخدام المجهر البصري لالتقاط الخصائص البنيوية الميزوسكوبية من عينات الدماغ، بما في ذلك الأوعية الدموية، وأجسام الخلايا، والنوى، والفروع الشجرانتية الرئيسية، وبعض المحاور المحورية الكبيرة ذات المييلين. بالإضافة إلى ذلك، يمكن دمج OMLIT بسلاسة في خط أنابيب SEM التسلسلي، مما يوفر معلومات هيكلية قبل التصوير بالمجهر الإلكتروني...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
شريط لاصق	3M	B5005094008	لاصق مزدوج الوجه
مجهر القوة الذرية	بروكر	أيقونة البعد
نظام جمع الأقسام فائقة الرقة الأوتوماتيكي	ليهوا	أوتو كاتس II
شريط لاصق موصل	تيد بيلا	FP16084-8
Dektak Stylus Profilers	بروكر	ديكتاك إكس تي
سكين الماس للتقسيمات	دياتوم	DUJ3530	سكين دياتومي جامبو
سكين الألماس للتشذيب	دياتوم	DTB90	سكين زجاجي
المجهر الإلكتروني	زايس	MultiSEM505	بديل: GeminiSEM 300، Zeiss
FIJI (v1.54p، 64-بت)	المصدر المفتوح	https://fiji.sc
سكين تقليم الزجاج	صنع ذاتي
سترات الرصاص	لايكا	T534/2
المجهر الضوئي	أوليمبوس	VS200	بديل: أكسيو ميججر. A2 فاريو، زايس
المجهر الضوئي	زايس	أكسيو إيميجر.A2 فاريو
منظف البلازما	تقنيات ييدون	هيدرو-إس4	بدائل: تيد بيلا بيلكو أو منظف بلازما آخر على سطح الطاولة
شريط البوليمر	ميلتون	كابتون	لم يعد موقع الشركة متاحا. نوصي الباحثين بتجربة أشرطة KAPTON المتوفرة محليا.
شريط البوليمر	تيجين	PET	https://www.teijin.com/
شريط البوليمر	تيجين	D-50	https://www.teijin.com/
رقاقة السيليكون	سايتشي	912303	الويفر مصقول من جهة واحدة.
سبتر كوتر	لايكا	ACE600	بديل: سبتر رأس مزدوج، يوجي
ألترا ميكروتوم	لايكا	UC7	بديل: RMC PT-PC
أورانيلاسيتات	خدمات الطوارئ الطبية	22400
VAST (الإصدار 1.5.0، 64-بت)	معهد هوارد هيوز الطبي	https://software.dvid.io/vast/	VAST A1:D32Lite هو أداة مجانية للتعليق اليدوي وتقسيم مجموعات بيانات المجهر ثلاثي الأبعاد الكبيرة.
برنامج ZEN (الإصدار 3.2، 64-بت)	زايس	https://www.zeiss.com/microscopy/zh/products/software/zeiss-zen.html