مقالة منهجية

التحقيق في آلية تعديل LINC00511 بوساطة β-Elemene لقمع مقاومة السيسبلاتين في سرطان الرئة

DOI:

10.3791/68825

⸱

أغسطس 19, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Changchun University of Traditional Chinese Medicine, 2Health Care Department, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 3Teaching Department, The Third Affiliated Clinical Hospital of Changchun University of Chinese Medicine, 4The Research Center of The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 5Northeast Asia Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, 6Affiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحد مقاومة سيسبلاتين (DDP) من فعالية العلاج الكيميائي في سرطان الرئة. تهدف هذه الدراسة إلى توضيح كيفية قيام β-Elemene (β-Ele) بعكس المقاومة في خلايا A549 / DDP عن طريق تقليل تنظيم LINC00511. أظهرت تحليلات المختبر و RNA-seq أن هذا التنظيم يثبط تحلل السكر الهوائي وإشارات Wnt / β-catenin ، مما يوفر استراتيجية محتملة للتغلب على المقاومة الكيميائية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحد مقاومة السيسبلاتين بشكل كبير من فعالية العلاج الكيميائي في سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة ، مما يستلزم تطوير استراتيجيات جديدة للتغلب على هذا الحاجز. تهدف هذه الدراسة المختبرية إلى توضيح الآلية التي يعكس بها β-Ele مقاومة السيسبلاتين في خلايا سرطان الرئة الغدي عبر تحلل السكر بوساطة LINC00511 ومسارات إشارات Wnt / β-catenin. تم إنشاء خط خلايا سرطان الرئة البشري المقاوم للسيسبلاتين (A549 / DDP) ، إما مع الإفراط في التعبير أو الضربة القاضية LINC00511 ، من خلال تعداء البلازميد. تم تقييم كفاءة التعدي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR) للكشف عن مستويات التعبير LINC00511. أشار التقييم عبر اختبار 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) إلى تثبيط كبير بوساطة β-Ele لتكاثر خلايا A549 / DDP. كشف تحليل الحمض النووي الريبي الإضافي أن التأثير المثبط ل β-Elemene على مقاومة السيسبلاتين كان مرتبطا ارتباطا وثيقا بتداخل تحلل السكر الخلوي وقمع تنشيط مسار إشارات Wnt / β-catenin. أظهر تحليل اللطخة الغربية للبروتينات الرئيسية ، بما في ذلك ناقل الجلوكوز 1 (GLUT1) ، وبيروفات كيناز M2 (PKM2) ، ونازعة هيدروجين اللاكتات A (LDHA) ، و β-catenin ، و glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) ، أن β-Elemene عكس مقاومة السيسبلاتين عن طريق تثبيط تحلل السكر الهوائي ومنع تنشيط مسار إشارات Wnt / β-catenin من خلال تقليل تنظيم LINC00511. بشكل جماعي ، تظهر هذه النتائج أن β-Elemene يتغلب على مقاومة السيسبلاتين في سرطان الرئة من خلال استهداف LINC00511 ومسار تحلل السكر الهوائي المرتبط به / Wnt / β-catenin. هذا يضع إطارا نظريا للتحقيقات قبل السريرية والسريرية المستقبلية مع الكشف عن الأهداف العلاجية المحتملة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من بين الأورام الخبيثة في جميع أنحاء العالم ، يظهر سرطان الرئة معدلات عالية بشكل استثنائي من الإصابة والوفيات ، وتتميز بالتحول الخبيث والنمو الغازي للخلايا الظهارية القصبية1،2. بناء على السمات النسيجية المرضية ، يتم تصنيف سرطان الرئة على أنه إما سرطان الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) أو سرطان الخلايا الصغيرة (SCLC) 3. ومن الجدير بالذكر أن NSCLC يمثل ما يقرب من 85٪ من إجمالي حالات سرطان الرئة4،5. كمعيار علاج كيميائي من الخط الأول ل NSCLC ، لا غنى عن سيسبلاتين (DDP)سريريا 6. ومع ذلك ، فقد كشفت الملاحظات السريرية أن الخلايا السرطانية يمكن أن تطور مقاومة للأدوية عبر آليات متعددة ، تتضمن في المقام الأول تنشيط مسارات الهروب المناعي ، والطفرات في الجينات المستهدفة للأدوية ، وعدم تنظيم مسارات التمثيل الغذائي للأدوية7،8،9.

تمثل الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر (lncRNA) نسخا > 200 نيوكليوتيد (nt) تفتقر إلى قدرة ترميز البروتين10. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن lncRNA يمكن أن يعكس مقاومة السيسبلاتين في الخلايا السرطانية من خلال آليات متعددة ، مثل العمل كحمض مضمض مربي داخلي متنافس (ceRNAs) لإسفنجية miRNAs وإطلاق جيناتها المستهدفة11 ، وتعديل مسارات إشارات موت الخلايا المبرمج12 ، والمشاركة في إصلاح تلف الحمض النووي13 ، وتنظيم الالتهام الذاتي الخلوي14. علاوة على ذلك ، مع تقدم الأبحاث حول إعادة برمجة التمثيل الغذائي للورم ، ظهرت أدلة قوية تثبت أن lncRNA يلعب دورا تنظيميا مهما في هذه العملية. يشكل تأثير واربورغ ، الذي يدل على تحلل السكر الهوائي ، خاصية أيضية أساسية للخلاياالخبيثة 15. فهو لا يوفر الطاقة للتكاثر السريع للخلايا فحسب ، بل يولد أيضا مستقلبات وسيطة تعمل كسلائف للتخليق الحيوي ، وتدعم تخليق البروتين والدهون لتلبية متطلبات نمو الورم الخبيث16. في سرطان الرئة ، تم التأكيد على أن lncRNA يؤثر بشكل كبير على تطور الورم ومقاومة العلاج الكيميائي من خلال تنظيم مسار تحلل السكر الهوائي17،18.

من بين هؤلاء ، تم الإبلاغ عن LINC00511 ، وهو جزيء lncRNA تمت دراسته على نطاق واسع في السنوات الأخيرة ، أنه يرتبط ارتباطا وثيقا ببدء وتطور الأورام الخبيثةالمختلفة 19. لا توضح هذه النتائج الآليات المحددة لمشاركة lncRNA في إعادة برمجة التمثيل الغذائي للورم فحسب ، بل توفر أيضا أساسا نظريا لاستراتيجيات علاج الورم التي تستهدف lncRNA ، مما يفتح طرقا علاجية محتملة.

مشتق من جذور الكركم zedoaria ، β-Ele هو سيسكويتيربينويد نشط بيولوجيا ذو فعالية مضادة للأورام. أظهرت دراساتنا السابقة أن β-Ele يعمل كمثبط انتقائي لمسار إشارات PI3K / Akt / mTOR وينتج تأثيرا تآزريا مع سيسبلاتين من خلال استهداف عملية التمثيل الغذائي للورم. قمع بشكل كبير نمو الورم في نموذج NSCLC xenograftللفأر 20. توضح التحقيقات اللاحقة قدرة β-Ele على تخفيف تحلل السكر الهوائي في خلايا NSCLC عن طريق تعديل محور إشارات miR-301a-3p / AMPKα ، مما يؤدي إلى نتائج الأورام21. بناء على النتائج السابقة التي توصلنا إليها ، أكدنا أن LINC00511 يخفف من مقاومة السيسبلاتين في سرطان الرئة. ومع ذلك ، لا يزال يتعين توضيح الآلية الجزيئية الدقيقة للعمل بشكل كامل.

بالنظر إلى الدور المحوري لتحلل السكر الهوائي في إعادة برمجة التمثيل الغذائي للورم والدور الحاسم LINC00511 في تطور الورم وتطوره ، تهدف هذه الدراسة إلى التحقيق فيما إذا كان β-Ele يمكنه عكس مقاومة السيسبلاتين في سرطان الرئة عن طريق تعديل مسار تحلل السكر الهوائي بوساطة LINC00511.

تشير الأدلة السابقة إلى أن β-Ele يمكن أن يعكس مقاومة السيسبلاتين ويعزز آثاره المضادة للورم عن طريق تنشيط مسارات موت الخلايا المبرمج22 ، وتنظيم إفراز الإكسوسوم23 ، وإيقاف دورة الخلية24. ومع ذلك ، فإن هذه الآليات المعروفة عادة ما تظهر تأثيرات واسعة وتفتقر إلى التنظيم الدقيق لأهداف جزيئية محددة ، مما يحد من قابليتها للترجمة السريرية. لذلك ، هناك حاجة ملحة لاستكشاف استراتيجيات جديدة أكثر استهدافا ، ولها آليات محددة جيدا ، وإظهار إمكانات قوية للترجمة السريرية للتغلب على مقاومة السيسبلاتين. على عكس الأبحاث السابقة التي تؤكد على الإجراءات البيولوجية الفورية ل β-Ele ، تميز هذه الدراسة تأثير β-Ele على عملية التمثيل الغذائي في Warburg ومسار إشارات Wnt / β-catenin في خلايا A549 / DDP من خلال تنظيم المسارات الجزيئية بوساطة lncRNA ، بهدف توضيح آلية جديدة تقوم عليها عكس التحسس الكيميائي في سرطان الرئة. لا تكشف هذه المقالة عن نهج جديد ل β-Ele لعكس المقاومة الكيميائية من خلال استهداف lncRNA فحسب ، بل توفر أيضا أساسا نظريا جديدا وأهداف تدخل محتملة للإدارة السريرية لسرطان الرئة. تظهر هذه النتائج ، من خلال توضيحها التفصيلي لهدف جزيئي محدد (LINC00511) ومسارات الإشارات الرئيسية (Warburg و Wnt / β-catenin) ، إمكانات انتقالية سريرية محسنة بشكل كبير. ومن المتوقع أن توفر أساسا علميا متينا لتحسين حساسية العلاج الكيميائي لدى مرضى سرطان الرئة وتحسين نوعية حياتهم، فضلا عن تعزيز تطوير استراتيجيات العلاج الدقيق لسرطان الرئة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير المذيبات

  1. تحضير محلول متوسط لخلايا A549 / DDP: قم بزراعة خلايا A549 / DDP في وسط هام الكامل F-12K (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) ، مع استكماله بمصل بقري جنين بنسبة 10٪ (FBS ، انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) ، محلول البنسلين والستربتومايسين بنسبة 1٪ (P / S ، انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) ، و 2 ميكروغرام / مل سيسبلاتين (DDP ، انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل).
    1. تحضير محلول متوسط كامل: قم بإعداد محلول متوسط كامل عن طريق إضافة 50 مل من FBS و 5 مل من P / S إلى 500 مل من وسط F-12K من لحم الخنزير ، متبوعا بالخلط الشامل.
    2. تحضير محلول متوسط كامل يحتوي على سيسبلاتين: قم بوزن 1 مجم من مسحوق السيسبلاتين (DDP ، انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) وقم بإذابه في 1 مل من الماء المقطر المزدوج (ddH2O) لتحضير محلول المخزون. أضف 200 ميكرولتر من محلول المرق إلى 100 مل من الوسط الكامل (المحضر وفقا للخطوة 1.1.1) واخلطه جيدا لتحضير محلول عمل من وسط كامل يحتوي على 2 ميكروغرام / مل من السيسبلاتين.
      ملاحظة: نظرا لأن السيسبلاتين مادة سامة للخلايا ، فقم بتنفيذ جميع الإجراءات في غطاء الدخان أو خزانة السلامة الحيوية وارتداء معدات الحماية مثل القفازات ومعاطف المختبر والنظارات الواقية.
  2. حل إعطاء β-Ele: استند تركيز الدواء المستخدم في هذه الدراسة إلى نتائج التجارب السابقة التي أجراها فريق البحثلدينا 20،21. قم بإذابة 1 مجم من β-Ele (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) في 20 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO ، انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) لتحضير محلول المخزون. قم بتخفيف محلول المرق إلى 25 مل باستخدام وسط كامل للحصول على محلول عمل β-Ele 40 ميكروغرام / مل.
    ملاحظة: نظرا لأن DMSO يمكن أن يعزز امتصاص المواد الأخرى عبر الجلد ، فقم بتنفيذ جميع خطوات التشغيل في غطاء الدخان أو خزانة السلامة الحيوية وارتداء معدات الحماية مثل القفازات وملابس المختبر والنظارات الواقية.

2. زراعة الخلايا 

  1. استخدم خط الخلايا المقاوم لسرطان الرئة الغدي البشري (A549 / DDP ، Procell ، انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) في هذه الدراسة. تأكد من أن خط الخلية هذا قد تم تحديده عن طريق تحليل التكرار الترادفي القصير (STR) ومطابقته بنجاح مع السلالات القياسية في ATCC وقواعد البيانات الأخرى.
    1. بالنسبة لطريقة تحليل STR ، اجمع ما يقرب من 1 × 106 خلايا ، واستخرج الحمض النووي الجيني باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي التجارية (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل).
    2. استخدم نظام STR متعدد الإرسال تم التحقق من صحته ومناسب لكتابة الحمض النووي لتضخيم 20 موقعا من مواقع STR جنبا إلى جنب مع موضع تحديد الجنس. قم بإجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل في ظل ظروف التدوير الحراري التالية: التمسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، متبوعا ب 29 دورة من التمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتلدين عند 59 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، مع خطوة تمديد نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    3. قم بتحليل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل الناتجة عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري باستخدام محلل جيني آلي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. هنا ، تم إجراء كتابة الأليل باستخدام برنامج تحليل الشظايا (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) ، مع تعيين عتبة الكشف عن الذروة عند 150 وحدة مضان نسبي (RFU).
      ملاحظة: تمت مقارنة المظهر الجانبي STR المتولد 20 موضع مع الملامح المرجعية لخطوط الخلايا A549/DDP المتوفرة في قواعد البيانات العامة. اعتبر معدل المطابقة الذي يتجاوز 80٪ مؤشرا على التماثل. أكد عدم وجود قمم أليل غريبة عدم وجود تلوث متبادل.
  2. استرجع الخلايا من النيتروجين السائل وضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية لإذابة الجليد بسرعة حتى يذوب السائل تماما. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 5 مل ، وأضف مجلدين من المحلول المتوسط الكامل ، وأعد تعليق الخليط برفق. بعد الطرد المركزي (358 × جم ، 5 دقائق ، درجة حرارة الغرفة) ، تخلص من المادة الطافية بعناية.
    ملاحظة: عند استخدام أنابيب الحفظ بالتبريد الخلوية من النيتروجين السائل ، ارتد قفازات مضادة للتجمد ونظارات واقية أو قناع للوجه ، ولا تواجه فم الأنبوب.
  3. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من الوسط الكامل باستخدام ماصة لطيفة ، ثم قم بتخفيف التعليق إلى 10 مل بإضافة 9 مل من الوسط الكامل. قم بزرع الخلايا في أطباق زراعة الخلايا مقاس 100 مم وزرعها في حاضنة (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. تم الحفاظ على نسبة مرور الخلية بين 1: 2 و 1: 3.
    ملاحظة: سيسبلاتين هو دواء العلاج الكيميائي البلاتيني مع سمية خلاوية. في هذه الطريقة ، يتم زراعة خلايا A549 / DDP بوسط يحتوي على سيسبلاتين. لذلك ، قم بجمع وسط زراعة النفايات الذي يحتوي على السيسبلاتين في برميل سائل نفايات خاص وأرسله بانتظام إلى شركة معالجة النفايات الخطرة للتخلص منه بشكل احترافي.

3. تعداء البلازميد 

  1. استخدم بنية البلازميد للإفراط في التعبير LINC00511 و LINC00511 استهداف siRNA خاص بالجين (معرف الجين: 400619 ؛ معرف النسخ: NR_033876.1) لتعداء الخلية. يتم توفير تسلسلات siRNA المستخدمة في الجدول 1.
تسلسل siRNA
اسمالإحساس 5'-3'Antisense 5'-3'
LINC00511 - هومو - 1625
CAGCUGUGAACUUCUCCUUUATT
UAAAGGAAGUUCACACCUGTT

الجدول 1: قائمة تسلسل siRNA

  1. حدد بشكل عشوائي خلايا A549 / DDP التي تم تمريرها إلى الجيل الثالث بعد الإنعاش ، وقم بتلقيحها بشكل موحد في ألواح مكونة من 6 آبار بكثافة 1 × 105 خلايا / بئر. تم ترقيم كل بئر عشوائيا ، وتم تخصيص الآبار لمجموعات تجريبية بناء على هذه الأرقام العشوائية.
  2. قم بنقل الخلايا باستخدام كاشف التعدي (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) عندما تصل كثافتها إلى 70٪ تقريبا.
    1. تحضير محلول تعداء siRNA.
      1. امزج 250 ميكرولتر من الحد الأدنى من الوسط الأساسي المحسن (Opti-MEM ، انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) مع 5 ميكرولتر من كاشف التعدي ، وقم بدوامة برفق 3-5x لضمان التجانس ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      2. خفف 5 ميكرولتر من siRNA (50 نانومتر) في 250 ميكرولتر من Opti-MEM ، دوامة برفق 3-5x لخلطها جيدا. اجمع بين كاشف التعداء المخفف مع محلول siRNA واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لتشكيل مركب تعداء siRNA.
    2. تحضير محلول تعداء البلازميد.
      1. امزج 250 ميكرولتر من Opti-MEM مع 5 ميكرولتر من كاشف الإرسال ، وقم بدوامة برفق 3-5x لضمان التجانس ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      2. قم بتخفيف 2 ميكروغرام من البلازميد في 250 ميكرولتر من Opti-MEM ، مع دوامة برفق 3-5x لضمان الخلط الشامل. اجمع بين كاشف التعداء المخفف مع محلول البلازميد واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لتحضير محلول تعداء البلازميد.
      3. أضف محلول تعداء siRNA ومحلول تعداء البلازميد إلى الألواح المكونة من 6 آبار ، على التوالي. أضف 1,500 ميكرولتر من الوسط الكامل لكل بئر. امزج ألواح الخلايا برفق قبل الإضافة وبعدها لضمان التوزيع المتساوي. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة بعد التعدي قبل التحليل.

4. الكشف عن كفاءة التعدي عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR)

ملاحظة: خذ الخلايا بعد التعدي لمدة 24 ساعة في الخطوة 3.3 لاكتشاف qRT-PCR وفقا للإجراء التالي. تم إجراء جميع التجارب في ثلاثة تكرارات بيولوجية مستقلة (ن = 3).

  1. استخراج الحمض النووي الريبي
    1. استخدم مجموعة شفط الحمض النووي الريبي فائقة النقاء (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل). تخلص من الوسط في اللوحة المكونة من 6 آبار وفقا لتعليمات المجموعة واغسل الخلايا باستخدام PBS. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من محلول كاشف التحلل القائم على الفينول والجوانيدين إلى كل بئر ، وقم بتفجير الخلايا برفق بطرف البندقية لتعليقها بالكامل ، ونقل الخليط إلى أنبوب الطرد المركزي. اتركه لمدة 5 دقائق لضمان التحلل الكامل لعينة الخلية.
    2. أضف 100 ميكرولتر من كاشف تحلل الفينول جوانيدين إيزوثيوسيانات ، ورجه بحدة لمدة 15 ثانية ، واتركه لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. أخيرا ، قم بشفط الطور المائي العلوي بعناية ، وانقله إلى عمود الامتزاز ، وجهاز الطرد المركزي عند 13,400 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. ربط الحمض النووي الريبي بغشاء هلام السيليكا. اغسله باستخدام Buffer RW1 و Buffer RW2 لإزالة البروتينات. بعد ذلك ، أضف DNase I لهضم الحمض النووي المتبقي وقم بإجراء غسيل ثانوي باستخدام Buffer RW2 لضمان الإزالة الكاملة للشوائب. أخيرا ، اجمع عينات الحمض النووي الريبي عن طريق مسح الحمض النووي الريبي بالماء الخالي من RNase والطرد المركزي عند 13,400 × جم لمدة 1 دقيقة.
  2. قياس تركيز الحمض النووي الريبي.
    1. ضع كل 1.5 ميكرولتر من محلول الحمض النووي الريبي العينة في كاشف الحمض النووي الدقيق (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) واقرأ قيم A260 / A280.
      ملاحظة: إذا كانت قيم A260 / A280 المقاسة ضمن النطاق من 1.8 إلى 2.0 وكان تركيز الحمض النووي الريبي بين 20 نانوغرام / ميكرولتر و 200 نانوغرام / ميكرولتر ، فهذا يشير إلى أن جودة الحمض النووي الريبي مقبولة ويمكن استخدامها في التجارب اللاحقة.
    2. بناء على القياسات ، قم بتخفيف محلول الحمض النووي الريبي بماء ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) لضمان تركيزات متسقة من الحمض النووي الريبي لجميع العينات ، باستخدام الحد الأدنى لتركيز الحمض النووي الريبي المقاس كمعيار ، متبوعا بتجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
  3. النسخ العكسي للحمض النووي الريبي
    1. استخدم الحمض النووي الريبي الكلي المستخرج كقالب وقم بتصنيع (كدنا) وفقا لتعليمات مجموعة النسخ العكسي (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل). قم بإعداد نظام التفاعل وفقا لمتطلبات المجموعة.
    2. أضف محلول الحمض النووي الريبي المستخرج ونظام التفاعل إلى أنبوب من ثمانية صفوف ، وقم بتعيين بئرين مكررين في كل مجموعة. ابدأ التفاعل بظروف متسلسلة: 15 دقيقة من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، 5 ثوان من التمسخ الحراري عند 85 درجة مئوية ، 5 دقائق تبريد عند 4 درجات مئوية.
  4. تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)
    1. قم بإجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الكمي الفلوري في الوقت الفعلي (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) باستخدام المزيج الرئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل المختلط مسبقا القائم على SYBR Green (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل). استخدم GADPH كجين مرجعي ، مع تسلسلات أولية مدرجة في الجدول 2 ، وقم بإعداد خليط التفاعل على النحو التالي: أضف بالتتابع 0.4 ميكرولتر من التمهيدي المقابل ، و 2 ميكرولتر من قالب (كدنا) ، وخليط التفاعل إلى أنبوب شريطي مكون من ثمانية آبار لتحقيق حجم التفاعل النهائي.
    2. تشغيل تضخيم PCR: 95 درجة مئوية 30 ثانية (دورة واحدة) ، 95 درجة مئوية 5 ثوان (40 دورة) ، 60 درجة مئوية 20 ثانية (40 دورة). احسب مستويات التعبير النسبية للجينات المستهدفة باستخدام طريقة 2 -ΔΔCt 25. كرر جميع التجارب ثلاث مرات بشكل مستقل لضمان موثوقية البيانات.
      ملاحظة: يجب جمع النفايات الكيميائية المتولدة أثناء الإجراءات التجريبية في حاويات نفايات خطرة مخصصة والتخلص منها من قبل خدمات إدارة النفايات الخطرة المعتمدة وفقا للسياسات المؤسسية.
تسلسل التمهيدي
التمهيديتسلسل (5'-3')
الإنسان LINC00511 FTTTCCCAGCACAGCTCAATC
الإنسان LINC00511 رTCCCTTCTCCCTCGGTCA
جابد إفAATCCCATCACCATCTTCCA
جابد دي إتش آرAAATGAGCCCCAGCCCTCT

الجدول 2: التسلسلات التمهيدية لمقايسات تفاعل البوليميراز المتسلسل

5. كشف EdU

  1. تقييم تأثير التعبير LINC00511 المتغير على تكاثر خلايا A549 / DDP باستخدام مجموعة فحص EdU (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل).
    1. حدد بشكل عشوائي خلايا A549 / DDP التي تم تمريرها إلى الجيل الثالث بعد الإنعاش ، وقم بتلقيحها بشكل موحد في ألواح 24 بئرا بكثافة 2 × 104 خلايا / بئر.
      ملاحظة: هنا ، تم إجراء جميع التجارب في ثلاث تكرارات بيولوجية مستقلة (ن = 3).
    2. قم بترقيم كل بئر بشكل عشوائي ، وقم بتعيين الآبار لواحدة من أربع مجموعات تجريبية بناء على هذه الأرقام العشوائية: المجموعة الضابطة ، ومجموعة β-Ele ، ومجموعة β-Ele + LINC00511 الإفراط في التعبير (β-Ele + OV-LINC00511) ، ومجموعة β-Ele + LINC00511 ضربة قاضية (β-Ele + si-LINC00511).
  2. عندما تصل كثافة الخلية إلى حوالي 70٪ ، قم بإجراء تعداء البلازميد ومعالجة التداخل وفقا للخطوة 3.3. بعد 24 ساعة من التعدي ، تخلص من الوسط الأصلي وأضف 1 مل من المحلول المتوسط الذي يحتوي على β-Ele (40 ميكروغرام / مل) إلى كل بئر من مجموعة العلاج الدوائي.
  3. احتضان الخلايا باستخدام EdU لوضع العلامات عليها بعد معالجتها ب 40 ميكروغرام / مل من β-Ele لمدة 24 ساعة. ثم قم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق ونفغلها بنسبة 0.5٪ Triton X-100.
  4. أضف محلول تفاعل النقر (المحضر عن طريق إذابة قارورة واحدة من كاشف Click Additive المقدم من المجموعة في 1.3 مل من الماء منزوع الأيونات مع الخلط الشامل) في الظلام وحافظ على التفاعل في الظلام لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا باستخدام PBS بعد اكتمال التفاعل ، متبوعا بتلوين Hoechst لمدة 5 دقائق. أخيرا ، لاحظ النتائج باستخدام المجهر الفلوري (الشكل 1 والشكل 2).
    ملاحظة: DMSO شديد النفاذية وسائل قابل للاشتعال. في هذا المخطط، يحتوي حل إدارة β-Ele على DMSO. لذلك ، قم بجمع محلول إدارة β-Ele في برميل سائل نفايات خاص بعد الاستخدام وتسليمه إلى شركة معالجة النفايات الخطرة للتخلص منه بشكل احترافي على أساس منتظم.

6. الكشف عن محتوى الجلوكوز 

ملاحظة: تم إجراء جميع التجارب في ثلاثة مكررات بيولوجية مستقلة (ن = 3).

  1. حدد بشكل عشوائي خلايا A549 / DDP التي تم تمريرها إلى الجيل الثالث بعد الإنعاش ، وقم بتلقيحها بشكل موحد في ألواح مكونة من 6 آبار بكثافة 1 × 105 خلايا / بئر. قم بترقيم كل بئر بشكل عشوائي ، وقم بتعيين الآبار للمجموعات التجريبية بناء على هذه الأرقام العشوائية.
  2. عندما تصل كثافة الخلية إلى ما يقرب من 70٪ ، استمر في تعداء البلازميد والتداخل كما هو موضح في الخطوة 3.3. بعد 24 ساعة من التعدي ، عالج الخلايا في المجموعات المعالجة ب 40 ميكروغرام / مل من β-Ele.
  3. بعد 24 ساعة من العلاج بالعقاقير ، اجمع وسط الثقافة العلوي من الخلايا وقم بطرده عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق. اجمع المادة الطافية. وفقا للتعليمات الموجودة في مجموعة اختبار الجلوكوز (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) ، قم بإعداد محلول التفاعل واخلطه جيدا مع المادة الطافية.
  4. ضع العينات في ألواح 96 بئرا مع خمسة آبار مكررة لكل مجموعة. رج الأطباق برفق واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بقياس امتصاص كل بئر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة بطول موجي 505 نانومتر ، واحسب محتوى الجلوكوز باستخدام الصيغة المتوفرة في مجموعة الاختبار:
    figure-protocol-1
    هنا ،معيار C = 5.55 مليمول / لتر ، N = عامل التخفيف.
    ملاحظة: يجب جمع النفايات الكيميائية المتولدة أثناء الإجراءات التجريبية في حاويات نفايات خطرة مخصصة والتخلص منها من قبل خدمات إدارة النفايات الخطرة المعتمدة وفقا للسياسات المؤسسية.

7. الكشف عن محتوى حمض اللاكتيك 

ملاحظة: تم إجراء جميع التجارب في ثلاثة مكررات بيولوجية مستقلة (ن = 3).

  1. حدد بشكل عشوائي خلايا A549 / DDP التي تم تمريرها إلى الجيل الثالث بعد الإنعاش ، وقم بتلقيحها بشكل موحد في ألواح من 6 آبار (1 × 105 خلايا / بئر). قم بترقيم كل بئر بشكل عشوائي ، وقم بتعيين الآبار للمجموعات التجريبية بناء على هذه الأرقام العشوائية. عندما تصل كثافة الخلية إلى ما يقرب من 70٪ ، استمر في تعداء البلازميد والتداخل كما هو موضح في الخطوة 3.3. بعد 24 ساعة من التعدي ، عالج الخلايا في المجموعات المعالجة ب 40 ميكروغرام / مل من β-Ele.
  2. بعد 24 ساعة من العلاج بالعقاقير ، اجمع وسط الثقافة العلوي من الخلايا وقم بطرده عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق. اجمع المادة الطافية. وفقا للتعليمات الواردة في مجموعة اختبار حمض اللاكتيك (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) ، قم بإعداد محلول التفاعل واخلطه جيدا مع المادة الطافية
  3. أضف ما مجموعه 250 ميكرولتر من العينة إلى كل بئر من صفيحة مكونة من 96 بئرا ، مع وضع خمسة آبار مكررة لكل مجموعة. رج الطبق برفق واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بقياس امتصاص كل بئر بطول موجي 530 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) ، واحسب محتوى اللاكتات باستخدام الصيغة المتوفرة في مجموعة الاختبار:
    figure-protocol-2
    هنا ، معيار C = 3 مليمول / لتر ، N = عامل التخفيف.
    ملاحظة: يجب جمع النفايات الكيميائية المتولدة أثناء الإجراءات التجريبية في حاويات نفايات خطرة مخصصة والتخلص منها من قبل خدمات إدارة النفايات الخطرة المعتمدة وفقا للسياسات المؤسسية.

8. السائبة الحمض النووي الريبي seq

  1. إنشاء نموذج قاعدة بيانات
    1. حدد خلايا A549 / DDP للتجربة وقسمها إلى المجموعات التالية: المجموعة الضابطة ، مجموعة DDP ، مجموعة β-Ele (40 ميكروغرام / مل) + مجموعة DDP (48 ميكرومتر) ، مجموعة β-Ele + DDP + OV-LINC00511 ومجموعة β-Ele + DDP + si-LINC00511. قم بتضمين 3 عينات في كل مجموعة.
    2. استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من كل مجموعة خلايا. استخدم مجموعة عزل mRNA القائمة على الخرزة المغناطيسية (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) لإثراء mRNA حقيقيات النواة ، حيث ترتبط الخرزات المطلية ب Oligo (dT) بشكل انتقائي بذيول poly (A) من mRNA عبر الاقتران الأساسي AT أضف المخزن المؤقت للتجزئة (1 ميكرولتر / ميكروغرام من الحمض النووي الريبي ، انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) واحتضانه عند 94 درجة مئوية لمدة 7 دقائق لتقسيم الرنا المرسال إلى أجزاء قصيرة.
    3. تابع تخليق (كدنا) لأول حبلا باستخدام بادئات سداسية عشوائية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لتخليق (كدنا) للخيط الثاني ، أضف كميات مناسبة من المخزن المؤقت للتفاعل و RNase H و DNA polymerase I لإكمال العملية.
    4. قم بإجراء الإصلاح النهائي والذيل A على (كدنا) مزدوج الشريطة عن طريق الحضانة عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (الإصلاح النهائي) ، متبوعا مباشرة ب 72 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (A-tailing). ربط محولات التسلسل بالأجزاء التي تم إصلاحها في النهاية.
    5. قم بتنقية المنتجات المربوطة وتحديد الحجم باستخدام حبات السيليكا المغناطيسية المعدلة بالكربوكسيل (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل). أخيرا ، قم بإنشاء مكتبة التسلسل عن طريق تضخيم PCR.
    6. بعد إعداد العينة ، قم بتحليل مكتبة التسلسل على منصة DNBSEQ-T7 (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل). قم بتحميل العينة على شريحة مصفوفة دقيقة منقوشة للتسلسل.
      ملاحظة: قام الجهاز بجمع الإشارات الضوئية وقراءتها وتحديدها باستخدام نظام تصوير عالي الدقة لتحديد معلومات تسلسل القواعد الفردية. بعد ذلك ، قم بإجراء دورات تسلسل إضافية للحصول على تسلسل القواعد التالية. بعد دورات متعددة ، تم إنشاء بيانات التسلسل الأولية.
  2. تحليل المعلوماتية الحيوية
    1. تسلسل العينات على الجهاز للحصول على البيانات الأولية ، والمعروفة أيضا باسم البيانات خارج الماكينة. علاوة على ذلك ، قم بمعالجة بيانات التسلسل باستخدام fastp (الإصدار 0.21.0). قم بإزالة القراءات التي تحتوي على تسلسلات محول 3 بوصات وتخلص من القراءات منخفضة الجودة بمتوسط درجة جودة أقل من Q20 كجزء من معايير التصفية الأساسية. إجراء جميع التحليلات النهائية بناء على البيانات النظيفة وعالية الجودة.
      ملاحظة: قم بإجراء التصفية الأولية لبيانات التسلسل باستخدام fastp. ارجع إلى الوثائق الرسمية لمجموعات البيانات النسخية (https://github.com/OpenGene/fastp#rna-seq-processing) للحصول على معلمات سطر الأوامر المحددة.
    2. استخدم FastQC (الإصدار 0.12.0) لتقييم جودة بيانات التسلسل التي تم تنظيفها. متطلبات الجودة هي كما يلي: يجب أن يكون لدى 90٪ على الأقل من القواعد درجة جودة أعلى من Q20 ، ويجب ألا تتجاوز النسبة المئوية لتسلسلات المحول المتبقية 1٪. تعتبر البيانات التي تفي بهذه المعايير مؤهلة ويمكن استخدامها للتحليل النهائي.
      ملاحظة: قم بتقييم جودة بيانات التسلسل التي تم تنظيفها باستخدام FastQC، باتباع الإرشادات الرسمية (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/).
  3. تحليل التعبير الجيني
    1. استخدم برنامج DESeq2 لإجراء تحليل التعبير التفاضلي بين مجموعتي المقارنة.
      1. أولا ، أدخل البيانات في البرنامج لإنشاء DESeq DataSet. بعد ذلك ، قم بتصفية الجينات ذات العدد الإجمالي أقل من 10 في جميع العينات.
      2. أخيرا ، قم بإجراء التحليل الجيني التفاضلي واستخرج النتائج. شروط فحص الجينات المعبر عنها تفاضليا هي كما يلي: تغيير الطية في التعبير |log2FoldChange | > 1 ، وأهمية padj ≤ 0.05.
        ملاحظة: للحصول على خطوات التشغيل التفصيلية لبرنامج DESeq2 ، يرجى الرجوع إلى الخطوات التفصيلية على الموقع الرسمي: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html.

9. الكشف عن تغيرات مستوى تعبير البروتين عن طريق اللطخة الغربية (WB) 

ملاحظة: تم إجراء جميع التجارب في ثلاثة مكررات بيولوجية مستقلة (ن = 3).

  1. قم بإجراء النشاف الغربي لتحديد مستويات التعبير عن البروتين الخلوي.
    1. حدد بشكل عشوائي خلايا A549 / DDP التي تم تمريرها إلى الجيل الثالث بعد الإنعاش ، وقم بتلقيحها بشكل موحد في ألواح مكونة من 6 آبار بكثافة 1 × 105 خلايا / بئر.
    2. قم بترقيم كل بئر بشكل عشوائي ، وقم بتعيين الآبار لإحدى المجموعات التجريبية الست بناء على هذه الأرقام العشوائية: Control و β-Ele و OV-LINC00511 و si-LINC00511 و β-Ele + OV-LINC00511 و β-Ele + si-LINC00511.
    3. عندما تصل كثافة الخلية إلى حوالي 70٪ ، قم بإجراء تعداء البلازميد والتداخل كما هو موضح في الخطوة 3.3. بعد 24 ساعة من التعدي ، قم بتعريض مجموعة المعالجة ل β-Ele (40 ميكروغرام / مل) ، مع توفير وسط جديد للمجموعة الضابطة. ثقافة كلا المجموعتين لمدة 24 ساعة إضافية.
    4. بعد ذلك ، اجمع كريات الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 1675 × جم لمدة 5 دقائق. قم بتحليل كل مجموعة من الخلايا مع 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل RIPA الذي يحتوي على 1 ملي مولار PMSF على الجليد لمدة 30 دقيقة (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل).
  2. جهاز الطرد المركزي تحلل الخلية عند 13,400 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وجمع المادة الطافية. قم بقياس تركيزات البروتين باستخدام مجموعة مقايسة تركيز بروتين BCA (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل). افصل كميات متساوية من عينات البروتين بنسبة 10٪ SDS-PAGE وانقلها إلى أغشية فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) عن طريق الرحلان الكهربائي.
  3. اغمر الأغشية في محلول مانع (5٪ حليب خالي الدسم / محلول ملحي مخزن ب Tris مع 0.1٪ Tween-20 (TBST)) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ضد GLUT1 و PKM2 و LDHA و β-catenin و GSK-3β (1: 1000) و β-Actin (1: 2000 ، انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل).
    1. في اليوم التالي ، اغسل الأغشية ثلاث مرات باستخدام TBST ، 5 دقائق لكل منها ، في درجة حرارة الغرفة مع رج لطيف.
  4. في اليوم التالي ، احتضن الأغشية بمحاليل الأجسام المضادة الثانوية (الماعز المضاد للأرانب المسمى HRP IgG ، 1: 2000) ورجها برفق في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  5. أخيرا ، أضف 0.1 مل / سم2 من محلول اللوني ECL المتاح تجاريا لتغطية أغشية PVDF بالكامل. احتضن لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل التعرض. تصور وتحليل النطاقات باستخدام نظام تلألؤ كيميائي محسن (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل). يرجى الرجوع إلى الشكل 4 ج والشكل 5 ب.
    ملاحظة: يجب جمع النفايات الكيميائية المتولدة أثناء الإجراءات التجريبية في حاويات نفايات خطرة مخصصة والتخلص منها من قبل خدمات إدارة النفايات الخطرة المعتمدة وفقا للسياسات المؤسسية.

10. التخدير الإحصائي 

ملاحظة: تم إجراء جميع التجارب في ثلاثة مكررات بيولوجية مستقلة (ن = 3).

  1. قم بتنظيم البيانات التجريبية حسب المجموعة وإدخالها في برنامج GraphPad Prism (الإصدار 8.0.2 ؛ انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل). إجراء تصور البيانات وتحليل الدلالة الإحصائية وفقا لإرشادات البرنامج. تم التعبير عن بيانات القياس بمتوسط ± انحراف معياري. تم تقييم الاختلافات الإحصائية بين المجموعات باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع حساب حجم تأثير η² (eta-squared) ، متبوعا باختبار Tukey للمقارناتالمتعددة 26. ضع في اعتبارك أن ** P < 0.01 له دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

β-Ele يمنع بشكل كبير تكاثر خلايا A549 / DDP

في هذه التجربة ، تم تحديد تركيزات إدارة β-Ele و DDP بناء على نتائج دراساتنا السابقة20،21. تمت معالجة خلايا A549 / DDP باستخدام β-Ele ، بمفردها أو جنبا إلى جنب مع DDP ، لتشريح تأثيرها على المقاومة الكيميائية DDP. كشف تحليل EdU (الشكل 1) أن DDP بتركيزات 24 ميكرومتر و 48 ميكرومتر تمنع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ركزت هذه الدراسة على القضية السريرية الحرجة لمقاومة السيسبلاتين في سرطان الرئة. لا يزال سرطان الرئة ، المسؤول عن أكبر عدد من وفيات السرطان على مستوى العالم ، لديه معدل بقاء لمدة خمس سنوات أقل من 20٪ 29،30. سيسبلاتين ، باعتباره حجر الزاوية في أدوية العلاج الكيميائي القائمة على البلاتين ، هو عامل فعال وواسع الطيف مضاد للسرطان يمنع تكرار الحمض النووي لممارسة آثاره المضادة للسرطان31. ومع ذلك ، فقد لوحظ أن ما ي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع المؤلفين ليس لديهم تضارب في المصالح للإعلان عنهم.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توفير تمويل هذه الدراسة من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة جيلين بموجب الجائزة رقم. YDZJ202401058ZYTS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خلايا A549 / DDPبروسيلسي إل -0519عناوين URL:https://www.procell.com.cn/p/a549-ddp--cl-0519
منضدة عمل نظيفة بشكل استثنائيسوتشو أنتاي إيرتكSW-CJ-2FDعناوين URL: http://www.sz-antai.com
مجموعة فحص تركيز البروتين BCAسولاربيوكمبيوتر شخصي 0020عناوين URL:https://www.solarbio.com
جهاز الطرد المركزي Benchtopالحراريهبيكو 17عناوين URL:https://www.thermofisher.com
غرفة زراعة الخلاياالحراريه3111عناوين URL:https://www.thermofisher.com
طبق زراعة الخلايابيوفيلTCD000100عناوين URL:http://www.biofil.com.cn
محلل التلألؤ الكيميائيأدوات تشينشيانغ   ؛4300عناوين URL:https://www.clinx.cn/about_us
سيسبلاتينعلاء الدينC295225-250 ملغعناوين URL:https://www.aladdin-e.com/
أداة تسلسل الجينات DNBSEQ-T7MGI التكنولوجيا المحدودةت7عناوين URL:https://www.mgitech.cn/
EasyPure  طقم الحمض النووي الجينومي الدقيقTransGen للتكنولوجيا الحيويةطر EE181-01عناوين URL:https://www.transgen.com/
محلول الكروموجينيك ECLسولاربيوبي0010عناوين URL:https://www.solarbio.com
طقم الكشف عن EDUبيوتايمطراز C0071Sعناوين URL:https://www.beyotime.com
أداة المسمى بالإنزيممعدات DetieHBS-1096Aعناوين URL:https://www.detiebio.cn/
مصل الأبقار الجنينية FBS)كلاركFB15015عناوين URL:https://zn.clarkbio.com/
Frag/Prime Buffer ياسين11277 إسعناوين URL:https://www.yeasen.com/products/detail/2151
GeneMapper   البرمجيات  6الحراريهالإصدار 6برنامج تحليل الأجزاء. عناوين URL:https://www.thermofisher.cn/   
منصة GenReaderبكين Yuewei جين التكنولوجيا المحدودةhttps://yyigou.com/product/detail/0000037250.htmlمحلل جيني آلي يستخدم في الرحلان الكهربائي للشعيرات الدموية
طقم اختبار الجلوكوزجيانتشنغ السيرة الذاتيةأ 154-1-1عناوين URL: http://www.njjcbio.com
GLUT1 الأجسام المضادة متعددة النسيلةمجموعة Proteintech21829-1-APعناوين URL:https://www.ptglab.com
GraphPad المنشوربرنامج GraphPadالإصدار 8.0.2عناوين URL:https://www.graphpad.com
GSK-3 &beta ؛ جسمتقاربأف5016عناوين URL:https://www.affbiotech.com
هام F-12KبروسيلPM150910عناوين URL:https://www.procell.com.cn/
حبات اختيار الحمض النووي Hieff NGSياسين12601 إسعناوين URL:https://www.yeasen.com/products/detail/939
HieffNGS mRNA العزلة الرئيسية كيتياسين12603ZHعناوين URL:https://www.yeasen.com/products/detail/1119
HRP المسمى الماعز المضادة للأرانب IgGسيرفيسبيوGB23303عناوين URL:https://www.servicebio.cn
طقم اختبار اللاكتاتجيانتشنغ السيرة الذاتيةأ019-2-1عناوين URL: http://www.njjcbio.com
الأجسام المضادة متعددة النسيلة الخاصة ب LDHAمجموعة Proteintech19987-1-APعناوين URL:https://www.ptglab.com
لايت سيكلر 96روشLC96عناوين URL:https://lifescience.roche.com
ليبوفيكتامين 2000إنفيتروجين11668-019عناوين URL:https://www.thermofisher.com/invitrogen
أوبتي ميمجيبكو31985-070عناوين URL:https://www.thermofisher.com/gibco
البنسلين - الستربتومايسين (P / S)بيوشاربBL505Aعناوين URL:https://www.biosharp.cn/
الأجسام المضادة متعددة النسيلة الخاصة ب PKM2مجموعة Proteintech15822-1-APعناوين URL:https://www.ptglab.com
PMSF بيوتايمالمعيار ST506عناوين URL:https://www.beyotime.com
طقم كاشف PrimeScript RT (الوقت الفعلي المثالي)تقراRR037 أعناوين URL:https://www.takarabio.com
محلل ريبابيوتايمص 0013 بعناوين URL:https://www.beyotime.com
منصة التسلسلبي جي آيDNBSEQ-T7عناوين URL:https://www.bgi.com/global
TB بريمكس جرين إكس تاكتقراRR420Aعناوين URL:https://www.takarabio.com
اختبار الحمض النووي التتبعأداة Aoshengنانو 100عناوين URL:http://www.hzaosheng.com
تريزون بايCanvax BiotechCW0597Sعناوين URL:https://www.canvaxbiotech.com
التربسينبيوشاربBL501Aعناوين URL:https://www.biosharp.cn/
طقم الحمض النووي الريبي عالي النقاء (DNase I)Canvax BiotechCW0597Sعناوين URL:https://www.canvaxbiotech.com
β-Actin Antibodyمجموعة Proteintech60008-1-آي جيعناوين URL:https://www.ptglab.com
β-catenin Antibody تقاربDF6794عناوين URL:https://www.affbiotech.com
β-Elemeneسيغما63965-25 ملغعناوين URL:https://www.sigmaaldrich.com

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thandra, K. C., Barsouk, A., Saginala, K., Aluru, J. S., Barsouk, A. Epidemiology of lung cancer. Contemp Oncol (Pozn). 25 (1), 45-52 (2021).
  2. Huang, J., et al. Distribution risk factors, and temporal trends for lung cancer incidence and mortality: A Global Analysis. Chest. 161 (4), 1101-1111 (2022).
  3. Wang, H., Hu, Y., Lu, H., Wu, Z., Zhang, Y. Association between SOX gene family expression, DNA methylation, and miRNA regulation in lung adenocarcinoma progression. Discov Oncol. 16 (1), 188(2025).
  4. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  5. Qin, Z., et al. Phase separation of EML4-ALK in firing downstream signaling and promoting lung tumorigenesis. Cell Discov. 7 (1), 33(2021).
  6. Wang, X., Wang, H., Jiang, H., Qiao, L., Guo, C. Circular RNAcirc_0076305 promotes cisplatin (DDP) resistance of non-small cell lung cancer cells by regulating ABCC1 through miR-186-5p. Cancer Biother Radiopharm. 38 (5), 293-304 (2023).
  7. La Montagna, M., Ginn, L., Garofalo, M. Mechanisms of drug resistance mediated by long non-coding RNAs in non-small-cell lung cancer. Cancer Gene Ther. 28 (3-4), 175-187 (2021).
  8. Wu, S. G., Shih, J. Y. Management of acquired resistance to EGFR TKI-targeted therapy in advanced non-small cell lung cancer. Mol Cancer. 17 (1), 38(2018).
  9. Altorki, N. K., et al. The lung microenvironment: an important regulator of tumour growth and metastasis. Nat Rev Cancer. 19 (1), 9-31 (2019).
  10. Zhang, H., Wang, Y., Liu, X., Li, Y. Progress of long noncoding RNAs in anti-tumor resistance. Pathol Res Pract. 216 (11), 153215(2020).
  11. Li, H. Q., Fu, X. B., Guo, H. Y., Sun, Y., Wang, D., Zhang, Z. Z. Sevoflurane reverses cisplatin resistance in neuroblastoma cells through the linc00473/miR-490-5p/AKT1 axis. Saudi Medical Journal. 43 (11), 1209-1216 (2022).
  12. Guo, F., Cao, Z., Guo, H., Li, S. The action mechanism of lncRNA-HOTAIR on the drug resistance of non-small cell lung cancer by regulating Wnt signaling pathway. Exp Ther Med. 15 (6), 4885-4889 (2018).
  13. Ren, L., et al. The DDUP protein encoded by the DNA damage-induced CTBP1-DT lncRNA confers cisplatin resistance in ovarian cancer. Cell Death Dis. 14 (8), 568(2023).
  14. Chen, L., et al. H19/miR-107/HMGB1 axis sensitizes laryngeal squamous cell carcinoma to cisplatin by suppressing autophagy in vitro and in vivo. Cell Biol Int. 45 (3), 674-685 (2021).
  15. Peng, X., Li, S., Zeng, A., Song, L. Regulatory function of glycolysis-related lncRNAs in tumor progression: Mechanism, facts, and perspectives. Biochem Pharmacol. 229, 116511(2024).
  16. Kryczka, J., Kryczka, J., Czarnecka-Chrebelska, K. H., Brzeziańska-Lasota, E. Molecular mechanisms of chemoresistance induced by cisplatin in NSCLC cancer therapy. Int J Mol Sci. 22 (16), 8885(2021).
  17. Liu, J., Zhu, Y., Wang, H., Han, C., Wang, Y., Tang, R. LINC00629, a HOXB4-downregulated long noncoding RNA, inhibits glycolysis and ovarian cancer progression by destabilizing c-Myc. Cancer Sci. 115 (3), 804-819 (2024).
  18. Liao, M., et al. Targeting the Warburg effect: A revisited perspective from molecular mechanisms to traditional and innovative therapeutic strategies in cancer. Acta Pharm Sin B. 14 (3), 953-1008 (2024).
  19. Song, Z., Luo, J., Wu, M., Zhang, Z. linc00511 knockdown inhibits lung cancer progression by regulating miR-16-5p/MMP11. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 33 (7), 17-30 (2023).
  20. Cheng, G., et al. β-elemene suppresses tumor metabolism and stem cell-like properties of non-small cell lung cancer cells by regulating PI3K/AKT/mTOR signaling. Am J Cancer Res. 12 (4), 1535-1555 (2022).
  21. Li, L., et al. β-elemene suppresses Warburg effect in NCI-H1650 non-small-cell lung cancer cells by regulating the miR-301a-3p/AMPKα axis. Biosci Rep. 40 (6), BSR20194389(2020).
  22. Yao, C., Jiang, J., Tu, Y., Ye, S., Du, H., Zhang, Y. β-elemene reverses the drug resistance of A549/DDP lung cancer cells by activating intracellular redox system, decreasing mitochondrial membrane potential and P-glycoprotein expression, and inducing apoptosis. Thorac Cancer. 5 (4), 304-312 (2014).
  23. Song, H., et al. β-elemene ameliorates cisplatin resistance of gastric cancer via regulating exosomal METTL3-m6A-ARF6 axis. Cell Biochem Biophys. 83 (2), 2047-2058 (2025).
  24. He, J., et al. β-Elemene promotes ferroptosis and reverses radioresistance in gastric cancer by inhibiting the OTUB1-GPX4 interaction. Front Pharmacol. 15, 1469180(2024).
  25. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  26. Yang, L., Tao, Y., Luo, L., Zhang, Y., Wang, X., Meng, X. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapus ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. J Ethnopharmacol. 288, 114988(2022).
  27. Zhang, Z., Zhang, Y., Qin, X., Wang, Y., Fu, J. FGF9 promotes cisplatin resistance in colorectal cancer via regulation of Wnt/β-catenin signaling pathway. Exp Ther Med. 19 (3), 1711-1718 (2020).
  28. He, J., et al. Sox2 inhibits Wnt-β-catenin signaling and metastatic potency of cisplatin-resistant lung adenocarcinoma cells. Mol Med Rep. 15 (4), 1693-1701 (2017).
  29. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).
  30. Im, J. Y., et al. CYB5R3 functions as a tumor suppressor by inducing ER stress-mediated apoptosis in lung cancer cells via the PERK-ATF4 and IRE1α-JNK pathways. Exp Mol Med. 56 (1), 235-249 (2024).
  31. Manguinhas, R., et al. Impact of the APE1 Redox Function Inhibitor E3330 in non-small cell lung cancer cells exposed to cisplatin: Increased cytotoxicity and impairment of cell migration and invasion. Antioxidants (Basel). 9 (6), 550(2020).
  32. Jiang, L., et al. HCP5 is a SMAD3-responsive long non-coding RNA that promotes lung adenocarcinoma metastasis via miR-203/SNAI axis. Theranostics. 9 (9), 2460-2474 (2019).
  33. Singh, D., Assaraf, Y. G., Gacche, R. N. Long non-coding RNA mediated drug resistance in breast cancer. Drug Resist Updat. 63, 100851(2022).
  34. Sun, W., Zu, Y., Fu, X., Deng, Y. Knockdown of lncRNA-XIST enhances the chemosensitivity of NSCLC cells via suppression of autophagy. Oncol Rep. 38 (6), 3347-3354 (2017).
  35. Lu, Y., Tian, M., Liu, J., Wang, K. LINC00511 facilitates Temozolomide resistance of glioblastoma cells via sponging miR-126-5p and activating Wnt/β-catenin signaling. J Biochem Mol Toxicol. 35 (9), e22848(2021).
  36. Kong, X. Z., et al. Regulation of aerobic glycolysis by long non-coding RNAs in cancer. Biochem Biophys Res Commun. 479 (1), 28-32 (2016).
  37. Mao, Y., Xia, Z., Xia, W., Jiang, P. Metabolic reprogramming, sensing, and cancer therapy. Cell Rep. 43 (12), 115064(2024).
  38. Vaupel, P., Schmidberger, H., Mayer, A. The Warburg effect: essential part of metabolic reprogramming and central contributor to cancer progression. Int J Radiat Biol. 95 (7), 912-919 (2019).
  39. Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic reprogramming: a cancer hallmark even warburg did not anticipate. Cancer Cell. 21 (3), 297-308 (2012).
  40. Nagao, A., Kobayashi, M., Koyasu, S., Chow, C. C. T., Harada, H. HIF-1-dependent reprogramming of glucose metabolic pathway of cancer cells and its therapeutic significance. Int J Mol Sci. 20 (2), 238(2019).
  41. Xie, Y., Wang, M., Xia, M., Guo, Y., Zu, X., Zhong, J. Ubiquitination regulation of aerobic glycolysis in cancer. Life Sci. 292, 120322(2022).
  42. Hua, G., Zeng, Z. L., Shi, Y. T., Chen, W., He, L. F., Zhao, G. F. LncRNA XIST contributes to cisplatin resistance of lung cancer cells by promoting cellular glycolysis through sponging miR-101-3p. Pharmacology. 106 (9-10), 498-508 (2021).
  43. Yin, D., Hua, L., Wang, J., Liu, Y., Li, X. Long Non-coding RNA DUXAP8 facilitates cell viability, migration, and glycolysis in non-small-cell lung cancer via regulating HK2 and LDHA by inhibition of miR-409-3p. Onco Targets Ther. 13, 7111-7123 (2020).
  44. Vallée, A. Aerobic glycolysis activation through canonical WNT/β-catenin pathway in ALS. Med Sci (Paris). 34 (4), 326-330 (2018).
  45. Rathee, M., et al. Canonical WNT/β-catenin signaling upregulates aerobic glycolysis in diverse cancer types. Mol Biol Rep. 51 (1), 788(2024).
  46. Li, R., Lv, M., Liu, J., Sun, Q. Tumor necrosis factor receptor-associated protein 1 promotes aerobic glycolysis and cisplatin resistance by regulating the Wnt/β-catenin signaling pathway in lung cancer. Histol Histopathol. , (2024).
  47. Zhao, Q., Chen, L., Zhang, X., Yang, H., Li, Y., Li, P. β-elemene promotes microglial M2-like polarization against ischemic stroke via AKT/mTOR signaling axis-mediated autophagy. Chin Med. 19 (1), 86(2024).
  48. Jiang, Z., Jacob, J. A., Loganathachetti, D. S., Nainangu, P., Chen, B. β-Elemene: mechanistic studies on cancer cell interaction and its chemosensitization effect. Front Pharmacol. 8, 105(2017).
  49. Li, J., Li, Y., Meng, F., Fu, L., Kong, C. Knockdown of long non-coding RNA linc00511 suppresses proliferation and promotes apoptosis of bladder cancer cells via suppressing Wnt/β-catenin signaling pathway. Biosci Rep. 38 (4), BSR20171701(2018).
  50. Tan, Z., et al. Small peptide LINC00511-133aa encoded by LINC00511 regulates breast cancer cell invasion and stemness through the Wnt/β-catenin pathway. Mol Cell Probes. 69, 101913(2023).
  51. Ghafouri-Fard, S., Safarzadeh, A., Hussen, B. M., Taheri, M., Ayatollahi, S. A. A review on the role of LINC00511 in cancer. Front Genet. 14, 1116445(2023).
  52. Liu, J., et al. Targeting Wnt-driven cancer through the inhibition of Porcupine by LGK974. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20224-20229 (2013).
  53. Wang, W. J., et al. Serum lncRNAs (CCAT2, LINC01133, LINC00511) with squamous cell carcinoma antigen panel as novel non-invasive biomarkers for detection of cervical squamous carcinoma. Cancer Manag Res. 12, 9495-9502 (2020).
  54. Fan, K., Liu, Z., Gao, M., Tu, K., Xu, Q., Zhang, Y. Targeting nutrient dependency in cancer treatment. Front Oncol. 12, 820173(2022).
  55. Liu, B., et al. Knockdown of LINC00511 decreased cisplatin resistance in non-small cell lung cancer by elevating miR-625 level to suppress the expression of leucine rich repeat containing eight volume-regulated anion channel subunit E. Hum Exp Toxicol. 41, 9603271221089000(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Wnt A549 DDP EdU
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة