يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحسين إنتاج OnePot PURE والريبوسوم الخام لتخليق البروتين الخالي من الخلايا القابل للتكرار

1.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68826

⸱

أغسطس 22, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Engineering Biology, Institute of Quantitative Biology, Biochemistry and Biotechnology, School of Biological Sciences, University of Edinburgh, 2Biophoundry Inc.

في هذه المقالة

ملخص

نقدم بروتوكولا محدثا لإنتاج نظام OnePot "تخليق البروتين باستخدام العناصر المؤتلفة" (PURE) والريبوسومات الخام لتخليق البروتين الخالي من الخلايا ، مع التركيز على التحكم في نمو الخلايا لتقليل الاختلافات من دفعة إلى أخرى.

الملخص

مكنت التطورات الحديثة من إنتاج نظام تخليق البروتين باستخدام العناصر المؤتلفة (PURE) الخالي من الخلايا في المختبرات الفردية اقتصاديا وبتقليل عبء العمل. ومع ذلك ، فإن تحضير مكونات البروتين ال 36 والريبوسوم ، التي تشكل PURE ، لا يزال مهمة معقدة ، مع وجود مجال كبير للاختلاف والخطأ. نقدم إجراء مفصلا ومحدثا لتصنيع PURE بناء على بروتوكول OnePot المنشور مؤخرا ، والذي يتضمن تنظيم عدد من الخطوات الرئيسية ، على وجه الخصوص ، تلقيح الثقافات باستخدام مخزونات الجلسرين الطبيعية بالكثافة الضوئية (OD) ، والمراقبة الدقيقة لنمو الخلايا ، والتحكم في تركيزات الجلسرين النهائية. باستخدام هذا النهج ، نبلغ عن الاستعدادات القابلة للتكرار من PURE من العديد من التكرارات البيولوجية والمستخدمين. يعمل هذا البروتوكول كمرجع ونقطة انطلاق للمختبرات الأخرى لتصنيع أنظمة PURE الخاصة بها واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، وبالتالي زيادة إضفاء الطابع الديمقراطي على العديد من التطبيقات التي تتيحها PURE ، مثل البناء من أسفل إلى أعلى للأنظمة الجزيئية الحيوية وتطوير الخلايا الاصطناعية.

المقدمة

نضج تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) كتقنية لتطبيقات متنوعة ، بما في ذلك التصنيع الحيوي ، والاستشعار الحيوي والتشخيص ، والنماذج الأولية للأجزاء والمسارات الجينية والتمثيل الغذائي ، وهندسة البروتين السريع ، والتعليم1،2. توفر أنظمة CFPS التي تستخدم مكونات منقاة ، والتي تم تطويرها في الأصل باسم "تخليق البروتين باستخدام العناصر المؤتلفة" (PURE)النظام 3 ، عددا من المزايا على البدائل القائمة على المحلل. تحتوي أنظمة PURE على تركيبة محددة ، تتكون من 36 عاملا بروتينا ، 70S E. القولونية الريبوسوم ، ومزيج محدد من الركائز الكيميائية بما في ذلك ثلاثي الفوسفات النيوكليوزيدي (NTPs) ، والأحماض الأمينية ، و tRNAs ، والتي يمكن تخصيصها حسب الرغبة للتطبيق المطلوب. وبالتالي فهي مناسبة للغاية لدراسات مثل دمج الأحماض الأمينية غير الكنسية ، والنمذجة الميكانيكية ، والبناء من أسفل إلى أعلى للأنظمة الجزيئية الحيوية والخلاياالاصطناعية 1. في حين أن PURE متاح من الموردين التجاريين ، فإن تكلفته (0.34 دولار - 1.63 دولار لكل تفاعل 1 ميكرولتر) باهظة على التجارب على نطاق واسع. وقد أعاقت الإستراتيجية البديلة لإنتاج PURE داخليا حتى الآن البروتوكولات كثيفة العمالة التي تنطوي على تنقية متوازية ل 36 بروتينا والريبوسومات4 ، والتي يصعب تنفيذها بقوة وتكرار ، خاصة للمستخدمين عديمي الخبرة.

ساعدت التطورات الأخيرة في إنتاج PURE محلي الصنع. على سبيل المثال ، Wang et al. صمم سلالات من الإشريكية القولونية لتشمل علامات سداسية الهيستيدين المتكاملة جينوما على آلية الترجمة ، مما يسهل تنقية أحاديةالخطوة 5. تم تجميع الجينات التي تشفر جميع البروتينات النقية في عدد صغير من البلازميدات ، والتي تم استخدامها بالمثل لتقليل عمل التنقية6. صمم Villareal et al. اتحادات أنيقة من سلالات PURE ، والتي توازن التعبير من أجل إنتاج البروتينات بنسبة صحيحة ، بينما تسمح في نفس الوقت بتنقية أحاديةالخطوة 7.

نظام OnePot PURE المبتكر الذي طورته Lavickova et al. يحمل وعدا كبيرا لسهولة الاستخدام 8,9. في هذا النظام ، يتم استزراع سلالات PURE الأصلية وتنقيتها عبر خطوة كروماتوغرافيا واحدة. على الرغم من أنه من غير الممكن تحديد تكوين نظام PURE الناتج بدقة ، إلا أن المؤلفين أظهروا أن دفعات متعددة من النظام قابلة للتكرار إلى حد كبير ، ويمكن تحقيق مستوى خشن من التحكم عن طريق تغيير حجم التلقيح لكل سلالة. إن مقايضة التحكم التركيبي الدقيق لسهولة الإنتاج هي مقايضة مقبولة للعديد من المستخدمين ، نظرا لأن عائد تخليق البروتين الكلي من نظام OnePot مشابه لتلك التي يتم الحصول عليها تجاريا. ومع ذلك ، على الرغم من وجود بروتوكولات مفصلة لنظام OnePot ، فقد كان من الصعب إعادة إنتاج نتائج Lavickova et al. بالكامل في مختبرات أخرى. على سبيل المثال ، لوحظ عدم استقرار ناقل التعبير ، والسلالات البطيئة النمو ، وانحلال البروتين10.

في هذا العمل ، نقدم بروتوكول OnePot PURE مفصل ومكرر ، والذي يتحكم في نمو الخلية باستخدام مخزونات الجلسرين الموحدة وتعديلات الوسائط ، ويعطي إرشادات حول مراقبة النمو وحصاد OD ، وتطبيع كمية الجلسرين في التنقية النهائية. ثانيا ، نقدم إجراء محسن لتنقية الريبوسوم الخام باستخدام الطرد المركزي الفائق التفاضلي فقط ، والذي يوازن بين المفاضلة بين نشاط الريبوسوم ، وتكلفة وتعقيد الطرق الأكثر تعقيدا.

على الرغم من أن هذا يقدم المزيد من الخطوات لبروتوكول OnePot ، إلا أنه يتيح للمستخدم فرصة متزايدة لاستكشاف أخطاء الإجراء وإصلاحها بشكل أكثر شمولا إذا لزم الأمر ، بالإضافة إلى تعديله وفقا لاحتياجاته. نثبت قابلية تكرار العملية من خلال إظهار العديد من التكرارات البيولوجية التي قام بها العديد من المستخدمين في نفس المختبر. نجد أن التحكم في كل من مكونات PURE وإعداد الريبوسوم أمر بالغ الأهمية لضمان أداء CFPS العالي للنظام.

يستغرق كل من تحضير PURE و ribosome 4 أو 5 أيام ، على التوالي ، ويمكن إجراؤه إما بالتتابع بواسطة مستخدم واحد أو بشكل متزامن بواسطة مستخدمين. يتضمن مستحضر PURE 4 × 500 مل من الثقافة السائلة ، ينتج كل منها ~ 2 جم من حبيبات الخلية و ~ 1 مل من بروتينات PURE بتركيز ~ 15 مجم / مل. يتضمن تحضير الريبوسوم 4 × 500 مل = 2 لتر من الثقافة السائلة ، مما يؤدي إلى إجمالي ~ 3 جم من حبيبات الخلية وينتج ~ 1 مل من الريبوسومات الخام بتركيز ~ 17 ميكرومتر. ينتج البروتوكول الحالي أنظمة PURE مع عوائد توليف تصل إلى ~ 100 ميكروغرام / مل GFP أو ~ 130 ميكروغرام / مل من mCherry على مدار ساعتين من تفاعل الدفعات11 ، والذي يقارن بشكل إيجابي مع OnePot الأصلي وكذلك الأنظمة التجارية (~ 140-160 ميكروغرام / مل) 8،12. وبالتالي ، فهي نقطة انطلاق مناسبة لمزيد من التحسين من خلال مكملات أو تعديل المكونات الحساسة مثل الأملاح وعوامل الازدحام وعوامل البروتين الفردية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ينقسم البروتوكول إلى ثلاثة أجزاء. من أجل الإيجاز والوضوح ، نؤكد على التغييرات المهمة الخاصة بهذا العمل ، وبالتالي ، يتم الرجوع إلى التفاصيل التي هي نفسها تلك الموجودة في المنشورات الأخرى.

يجب تنفيذ العمل الأولي مرة واحدة فقط. تتضمن الأقسام الأربعة تحضير مخزونات الجلسرين وألواح البداية للبروتينات النقية ، بالإضافة إلى التحقق من أوقات التعبير عن السلالات وقياسها. يزيل استخدام ألواح البداية التباين المرتبط بالتلقيح المباشر من مخزونات الجلسرين المقشورة. من الأهمية بمكان التأكد من أن هذا العمل يتم بدقة قبل الانتقال إلى مرحلة التصنيع. نظرا للعدد الكبير من مخزونات الجلسرين المختلفة المشاركة في تحضير PURE ، من الضروري التحقق من سلامة البلازميد والتعبير عن كل سلالة قبل محاولة إنتاج النظام.

ويرد في الشكل 1 مخطط لسير العمل، وجدول زمني موصى به في الجدول 1. يتم تقديم المواد المطلوبة والخطوات التي يتم استخدامها فيها في جدول المواد ، ويتم تلخيص الخطوط العريضة للمخازن المؤقتة والوسائط المطلوبة في كل مرحلة في الشكل التكميلي S1.

1. العمل التمهيدي

  1. توليد مخزونات الجلسرين
    ملاحظة: جميع البلازميدات متوفرة من Addgene.
    1. قم بتوليد 25٪ وزن / حجم مخزون من الجلسرين من جميع السلالات المدرجة في الجدول 2 ، باتباع الإجراءات القياسية9 ، وتخزينها في المبردات عند -80 درجة مئوية.
  2. تحضير لوحات البداية PURE (بين عشية وضحاها)
    1. تحضير 20 مل من وسائط LB مكملة ب 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين (LB + AMP).
    2. تسمية 36x معقمة 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة من # 1- # 36.
    3. أضف 500 ميكرولتر من LB + AMP في كل أنبوب. قم بتلقيح كل أنبوب بالسلالة المقابلة باستخدام طرف ماصة لكشط كمية صغيرة من مخزون الجلسرين الأصلي. تأكد من عدم ذوبان مخزون الجلسرين. دوامة للخلط جيدا.
    4. Aliquot 300 ميكرولتر من كل أنبوب ملقح في البئر المقابل للوحة بئر عميقة معقمة 1 مل 96 باتباع التخطيط الموضح في الشكل 2.
      ملاحظة: في جميع الخطوات اللاحقة التي تتضمن الألواح، حافظ على نفس تخطيط اللوحة طوال الوقت.
    5. احتضان اللوحة طوال الليل في شاكر لوحة عند 37 درجة مئوية ، 1,000 دورة في الدقيقة لمدة 15 ساعة.
    6. في اليوم التالي ، قم بإعداد 25 مل من وسائط LB مكملة ب 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين (LB + AMP) و 15 مل من الجلسرين المعقم بنسبة 50٪ (حجم / حجم).
    7. انقل 30 ميكرولتر من كل مزرعة من لوحة البئر العميقة إلى قاع صفيحة بصرية ذات 96 بئرا باستخدام ماصة متعددة القنوات. أضف 270 ميكرولتر من وسائط LB + AMP إلى كل بئر يحتوي على مزارع ، لتحقيق تخفيف 10x لكل ثقافة.
    8. قم بقياس OD600 لكل ثقافة باستخدام قارئ لوحة. احسب حجم كل مزرعة مطلوبة لتلقيح 650 ميكرولتر من LB+AMP الطازج إلى OD600 ابتدائي قدره 0.2. يتم توفير جدول بيانات للمساعدة في العمليات الحسابية كجدول تكميلي S1.
    9. قم بإعداد ثلاث ألواح جديدة معقمة سعة 1 مل 96 بئر عميق. في صفيحة واحدة ، أضف 650 ميكرولتر من LB + AMP إلى 36 بئرا ، وقم بتلقيح كل بئر بالحجم المحسوب للاستزراع الليلي للحصول على OD600 = 0.2.
    10. انقل 300 ميكرولتر من المزرعة الملقحة إلى كل من اللوحين الآخرين. ستكون إحدى اللوحات هي الثقافة ، والأخرى سيتم استخدامها لمراقبة التطوير التنظيمي. احتضان اللوحتين في شاكر لوحة عند 37 درجة مئوية ، 1000 دورة في الدقيقة ، حتى تصل الثقافات إلى OD600 ~ 1 (~ 1.5-2 ساعة). راقب OD عند ساعة واحدة ، ثم مرة أخرى حسب الحاجة ، عن طريق إزالة عينات 30 ميكرولتر من اللوحة الثانية وإضافة إلى 270 ميكرولتر من LB + AMP لتخفيف 10x.
    11. عندما تصل الآبار الفردية إلىOD 600 ~ 1 ، قم بإزالتها من شاكر. أضف حجما متساويا من الجلسرين المعقم بنسبة 50٪ (v / v) لكل مزرعة لتحقيق تركيز نهائي من OD600 = 0.5 في 25٪ جلسرين. تخلط جيدا وتخزن هذه الأنابيب على الثلج. هذه هي مخزونات العمل الرئيسية.
    12. قم بنقل 40 ميكرولتر كحد أقصى من كل مخزون رئيسي في ألواح PCR سعة 96 بئرا ، مع الحفاظ على نمط البئر الأصلي. وزعه في أكبر عدد ممكن من الأطباق بناء على سعة التخزين. أغلق بأختام لوحة القصدير وقم بتخزين ألواح البداية PURE هذه عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب إذابة لوحات بدء التشغيل هذه بحد أقصى 3 أضعاف. استبدلها بألواح جديدة إذا تجاوزت هذا الحد للحفاظ على سلامة الإجهاد وقابلية التكاثر.
  3. تحديد أوقات نمو ثقافة المبتدئين (بين عشية وضحاها)
    1. قم بإذابة طبق بداية PURE على الثلج.
    2. أضف 50 ميكرولتر من 100 ملغم/مل أمبيسلين إلى 50 مل من وسائط LB المعقمة في أنبوب مخروطي معقم (LB + AMP).
    3. قم بتسمية 36 × 1.5 مل من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة من # 1- # 36 ، وأضف 1 مل من LB + AMP إلى كل أنبوب.
    4. أضف 10 ميكرولتر من كل مخزون من مخزون الجلسرين إلى الأنبوب المسمى المقابل واخلطه جيدا عن طريق الدوامة.
    5. أضف 300 ميكرولتر من الثقافة الملقحة من كل أنبوب إلى البئر المقابل للوحة بئر معقمة 1 مل 96. أغلق الألواح بختم لوحة مسامي واحتضان لوحة الثقافة في شاكر لوحة عند 1000 دورة في الدقيقة ، 37 درجة مئوية. تحديد وتسجيل الوقت الذي تستغرقه الثقافات للوصول إلىOD 600 ~ 2-3 دون تجاوزOD 600 = 3. قم بإنشاء هذه المعلمة قبل المتابعة.
      ملاحظة: في مختبرنا ، يستغرق هذا 15 ساعة.
  4. تجربة التعبير عن سلالات PURE
    1. تحضير 38 مل من وسائط LB مكملة ب 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين (LB + AMP) ، و 10 ملي مولار من مخزون IPTG ، و 1x كاشف استخلاص البروتين.
    2. قم بإذابة طبق بداية PURE على الثلج.
    3. أضف 1 مل من LB + AMP إلى كل من 36 بئرا من صفيحة بئر عميقة معقمة سعة 2 مل 96. تلقيح كل بئر ب 20 ميكرولتر من ثقافة البداية المقابلة. احتضان اللوحة في شاكر لوحة عند 1000 دورة في الدقيقة ، 37 درجة مئوية ، لمدة 1 ساعة تقريبا ، أو حتى يتم الوصول إلى OD600 = 2.
    4. تحفيز التعبير عن البروتين عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من 10 ملي مولار IPTG إلى كل بئر ، للحصول على تركيز IPTG نهائي يبلغ 0.1 ملي. استمر في الحضانة لمدة 3 ساعات عند 1000 دورة في الدقيقة ، 37 درجة مئوية.
    5. في نهاية فترة التعبير التي تبلغ 3 ساعات ، قم بنقل 700 ميكرولتر من كل مزرعة إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة 36 × 1.5 مل. جهاز طرد مركزي عند 20,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص بعناية من المادة الطافية
    6. أعد تعليق كل حبيبات في 70 ميكرولتر من كاشف استخراج البروتين 1x. احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت تحريض لطيف للسماح بتحلل الخلايا.
    7. تعمل أجهزة الطرد المركزي على تحلل 20,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لحبيبات الجزء غير القابل للذوبان.
    8. قم بإجراء تنقية على نطاق صغير لكل بروتين باستخدام الخرز المغناطيسي Ni-NTA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    9. تحليل البروتينات المنقاة باستخدام SDS-PAGE لتأكيد التعبير عن كل بروتين و / أو التلوث المتبادل بين السلالات9.
      ملاحظة: ستظهر السلالات التي تعبر عن البروتين نطاقات مميزة على SDS-PAGE تتوافق مع الوزن الجزيئي المتوقع للبروتين المستهدف. إذا لم يتم الكشف عن أي نطاقات ، فقد لا تعبر السلالة عن البروتين. في مثل هذه الحالات ، قم بعزل البلازميد وتسلسله لتأكيد هوية التسلسل وسلامته ، واستبدال البلازميد إذا لزم الأمر.

2. تنقية البروتين OnePot PURE (4 أيام)

ملاحظة: يتطلب إعداد نظام PURE الفردي معالجة 500 مل من الاستزراع السائل. ينصح بإنتاج 4 × 500 مل من الاستعدادات في وقت واحد لإنتاج أربع دفعات PURE مستقلة في تشغيل واحد. يمكن بعد ذلك تحديد هذه الدفعات بشكل مستقل أو دمجها إذا كان ذلك مناسبا. يمكن تقصير بروتوكول 4 أيام إلى 3 أيام عن طريق تنفيذ خطوة حضانة الراتنج بين عشية وضحاها ، ولكن هذا ينطوي على يوم ثالث طويل. كلا الخيارين مفصلان أدناه.

  1. اليوم 1: تحضير المواد ونمو الثقافات البادئة
    1. قم بإعداد محاليل المخزون والمخازن المؤقتة لتحضير PURE كما هو موضح في الجدول التكميلي S2 والشكل التكميلي S1.
      ملاحظة: قم بإعداد الوسائط والمخازن المؤقتة ذات الصلة المطلوبة مباشرة قبل تنفيذ كل جزء من البروتوكول وقم بتخزينها فقط لعدد الأيام القصوى قبل الاستخدام كما هو موضح.
    2. قم بإذابة طبق بداية PURE على الثلج.
    3. أضف 50 ميكرولتر من 100 ملغم/مل أمبيسلين إلى 50 مل من وسائط LB المعقمة في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل (LB + AMP).
    4. قم بتسمية 36 × 1.5 مل من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة من # 1- # 36 ، وأضف 1 مل LB + AMP إلى كل أنبوب.
    5. أضف 10 ميكرولتر من كل مخزون من مخزون الجلسرين إلى الأنبوب الملصق المقابل ، واخلطه جيدا عن طريق الدوامة.
      ملاحظة: لتتبع تلقيح كل سلالة بسهولة، بعد إضافة السلالة إلى كل أنبوب، اخرج طرف الماصة في البئر المقابل للوحة بادئ PURE كرر هذه العملية لجميع السلالات. بمجرد الانتهاء، قم بإزالة أطراف الماصة بعناية من اللوحة قبل إعادة إغلاقها بورق الألمنيوم وشريط الأوتوكلاف، وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
    6. أضف 300 ميكرولتر من الثقافة الملقحة من كل أنبوب إلى البئر المقابل لصفيحة بئر عميقة معقمة 1 مل 96 ، باستثناء السلالة # 25 (EF-Tu). ختم الألواح بختم لوحة قابلة للتنفس. احتضان لوحة الثقافة في شاكر لوحة عند 1,000 دورة في الدقيقة ، 37 درجة مئوية ، لمدة 14 ساعة.
    7. أضف 1 مل من المزرعة الملقحة من الأنبوب # 25 إلى 10 مل من LB في أنبوب مخروطي سعة 50 مل لتحضير مزرعة بداية EF-Tu. احتضان الأنبوب في حاضنة عند 260 دورة في الدقيقة ، 37 درجة مئوية لمدة 14 ساعة.
      ملاحظة: السلالة # 25 ، EF-Tu ، مطلوبة بتركيز أعلى بكثير من المكونات الأخرى ، وبالتالي تتم معالجتها بشكل منفصل ، كما هو موضح في البروتوكولالأصلي 8.
    8. ضع 2 لتر من وسائط YTP المعقمة 2x في زجاجة زجاجية سعة 2 لتر وضعها في حاضنة ثابتة عند 37 درجة مئوية للتدفئة طوال الليل.
  2. يوم 2: النمو والتكوير
    1. تحضير الكواشف المطلوبة:
      1. 2 لتر من وسائط YTP المعقمة 2x الدافئة مسبقا (من اليوم 1)
      2. 2 مل من 100 ملغم/مل أمبيسلين
      3. 100 ملي IPTG ، معقم
      4. 100 مل PBS ، معقم ، مثلج بارد
      5. 10 مل LB الوسائط
    2. انقل 30 ميكرولتر من كل ثقافة بادئ من لوحة البئر العميقة للبادئ وأنبوب بدء التشغيل EF-Tu إلى قاع لوحة بئر بصرية 96 باستخدام ماصة متعددة القنوات.
    3. أضف 270 ميكرولتر من وسائط LB إلى كل بئر يحتوي على مزارع ، لتحقيق تخفيف 10x لكل ثقافة.
    4. قم بقياس OD600 لكل ثقافة باستخدام قارئ لوحة. يجب أن تكون جميع السلالات عند OD600 = 2-3.
      ملاحظة: إذا كانت المزرعة قد تجاوزت OD600 = 3 ، فقم بتخفيفها إلى OD600 = 3 باستخدام 2x YTP + AMP (الجدول التكميلي S1). يمكن أن يكون تخفيف المبتدئين المتضخمين مضيعة للوقت وعرضة للخطأ. وعلى هذا النحو، من المستحسن تحديد وقت الحضانة الدقيق المطلوب للوصول إلى التوجيه التنفيذي600 2-3 على النحو الموصوف في القسم 3.1 من العمل التمهيدي.
    5. نقل 500 مل من وسائط YTP 2x المسخنة مسبقا و 500 ميكرولتر من 100 مجم / مل أمبيسلين إلى قارورة معقمة 2.5 لتر محيرة (2x YTP + AMP).
    6. في أنبوب مخروطي واحد معقم سعة 15 مل ، أضف 55 ميكرولتر من كل مزرعة من لوحة ثقافة البداية و 1675 ميكرولتر من ثقافة EF-Tu. تخلط جيدا عن طريق الدوامة.
      ملاحظة: هذه هي ثقافة OnePot التي تجمع بين جميع سلالات PURE معا. في هذه المرحلة يمكن إنشاء أنظمة خروج المغلوب (ΔPURE) عن طريق استبعاد بعض السلالات ، أو يمكن إضافة مكونات أخرى تتطلب تنقية مشتركة.
    7. أضف محتويات هذا الأنبوب إلى القارورة المحيرة سعة 2.5 لتر التي تحتوي على 500 مل من 2x YTP + AMP. كرر الخطوات من 5 إلى 7 للحصول على 4x ثقافات مستقلة.
    8. احتضان القوارير عند 260 دورة في الدقيقة ، 37 درجة مئوية ، لمدة 1.5-2 ساعة ، حتى OD600 = 0.2-0.3.
    9. بمجرد الوصول إلى OD600 = 0.2-0.3 ، قم بتلقيح كل قارورة ب 500 ميكرولتر من 100 ملي مولار IPTG ، للحصول على تركيز تعريفي نهائي يبلغ 0.1 ملي مولار IPTG.
    10. احتضان الثقافات لمدة 3 ساعات أخرى عند 260 دورة في الدقيقة ، 37 درجة مئوية.
    11. أثناء الحضانة ، قم بوزن ووضع ملصقات على أربعة أنابيب مخروطية معقمة سعة 50 مل.
    12. قم بتبريد أجهزة الطرد المركزي مسبقا إلى 4 درجات مئوية حسب الحاجة ، وقم بتسمية وتبريد أربع زجاجات طرد مركزي من البولي بروبلين كوبوليمر.
    13. ضع أربع زجاجات زجاجية سعة 500 مل في حمام ماء مثلج.
    14. في نهاية الحضانة لمدة 3 ساعات ، قم بصب كل ثقافة بعناية في زجاجة زجاجية على الجليد لإنهاء النمو.
      ملاحظة: يعد نقل الثقافات إلى زجاجات مبردة أمرا ضروريا لإيقاف النمو بسرعة: لن يؤدي وضع القوارير الساخنة مباشرة في حمام الماء المثلج إلى إنهاء النمو بكفاءة. تتم جميع الخطوات اللاحقة على الجليد ما لم ينص على خلاف ذلك.
    15. أضف 250 مل من كل مزرعة إلى زجاجات أجهزة الطرد المركزي المقابلة ، وجهاز الطرد المركزي عند 3,220 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 10 دقائق ، مع الاحتفاظ ب 250 مل الأخرى في حمام الماء المثلج.
    16. صب المادة الطافية بعناية وجففها على مناشف ورقية.
    17. أضف 250 مل المتبقية من كل مزرعة إلى زجاجات أجهزة الطرد المركزي المقابلة ، وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 3,220 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 10 دقائق.
    18. صب المادة الطافية بعناية وجففها على مناشف ورقية.
    19. أضف 20 مل من PBS المعقم المثلج في كل زجاجة طرد مركزي وأعد تعليق حبيبات الخلية جيدا.
    20. انقل كل إعادة تعليق إلى الأنابيب المخروطية المعدة سعة 50 مل.
    21. جهاز الطرد المركزي للأنابيب عند 2,000 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 8 دقائق.
    22. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الصب بعناية.
    23. الطرد المركزي الأنابيب مرة أخرى عند 2,000 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة دقيقتين.
    24. قم بإزالة المادة الطافية المتبقية عن طريق سحب العينة ، واحتفظ بحبيبات الخلية على الجليد.
    25. يحتوي كل أنبوب الآن على حبيبات الخلية من ثقافة واحدة 500 مل. قم بوزن كل أنبوب, احسب كتلة الحبيبات الخلية (عادة, ~ 2 جم) عن طريق طرح الوزن الفارغ لكل أنبوب, وسجل.
    26. قم بتجميد كريات الخلايا وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى التحلل.
      ملاحظة: اختياريا ، يمكن إكمال البروتوكول في غضون 3 أيام ، من خلال المتابعة مباشرة إلى خطوة التحلل في هذه المرحلة.
  3. اليوم 3: التحلل والتنقية وغسيل الكلى
    1. تحضير الكواشف المطلوبة:
      1. تحضير 50 مل من المخزن المؤقت لإعادة التعليق.
      2. تحضير 0.5 م TCEP.
    2. قم بإذابة كريات الخلايا على الجليد.
    3. Aliquot 50 مل من Resuspension Buffer في أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، وأضف 100 ميكرولتر من 0.5 M TCEP. تخلط جيدا عن طريق الدوامة.
    4. قم بتعليق كريات الخلايا في Resuspension Buffer + TCEP بنسبة 2 مل لكل 1 جم من حبيبات الخلية. دوامة تماما للتعليق.
    5. قم بتوزيع إعادة تعليق الخلية في أنابيب مخروطية سعة 50 مل بحيث يحتوي كل أنبوب على 5 مل من التعليق. قم بتسمية الأنابيب كما هو مطلوب لتتبع 4 ثقافات مستقلة. تخزينها على الثلج.
    6. خلايا Lyse عن طريق صوتنة في سعة 30٪ ، 20 ثانية ، 20 ثانية ، لمدة 10 دورات في حمام ماء مثلج باستخدام مسبار صوتنة مبرد (الشكل 3 أ ، ب).
      ملاحظة: يجب نقل ما يقرب من 1000 جول من الطاقة إلى كل أنبوب أثناء الصوتنة. استخدم حاملا آمنا للحفاظ على الأنبوب في مكانه أثناء الصوتنة لضمان اتساق نقل الطاقة.
    7. قم بتوزيع المحللة في أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة سعة 2 مل ، بحيث يحتوي كل أنبوب على 1 مل من المحلل. كرر الخطوتين 2.3.6 و 2.3.7 لتحليل جميع الثقافات الأربع. يتم تنفيذ الخطوات التالية ل 4 محللات بالتوازي.
    8. جهاز طرد مركزي عند 15،923 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 20 دقيقة.
    9. أثناء الطرد المركزي ، اغسل وقم بموازنة 5 مل من راتنج تنقية البروتين (قم بإعداد أربعة أعمدة للمحللات الأربعة):
      1. أضف 2 مل من راتنج تنقية البروتين الطازج إلى عمود كروماتوغرافيا تدفق الجاذبية.
      2. اغسل العمود ب 30 مل من الماء المقطر المعقم مرتين لإزالة الإيثانول التخزيني.
      3. ملحق 30 مل من مخزن مؤقت لإعادة التعليق مع 60 ميكرولتر من 0.5 M TCEP إلى تركيز نهائي قدره 1 ملليمتر.
      4. نظرا لأن العمود يحتوي على حجم 30 مل ، اسكب المخازن المؤقتة مباشرة في العمود لملئه. تأكد من إغلاق الصمام ، قم بموازنة العمود بإضافة 30 مل من المخزن المؤقت لإعادة التعليق + TCEP.
      5. افتح الصمام للسماح ~ 25 مل من المخزن المؤقت بالتدفق ، قبل إغلاق صمام العمود ، وترك ~ 5 مل من المخزن المؤقت فوق طبقة الراتنج لمنع الجفاف. العمود جاهز الآن للاستخدام.
    10. بعد الطرد المركزي ، امزج جميع المواد الطافية المصفاة الخالية من الحبيبات من كل مزرعة في 4 أنابيب مخروطية جديدة سعة 50 مل على الجليد.
    11. أعد تعليق الراتنج في 5 مل المتبقية من Resuspension Buffer + TCEP داخل كل عمود ، وأضف المخزن المؤقت والراتنج في كل من الأنابيب المخروطية التي تحتوي على المادة الطافية المحللة.
    12. أغلق الغطاء وأغلقه باستخدام Parafilm ، واحتضنه في شاكر المشواة عند 4 درجات مئوية لمدة 5 ساعات.
      ملاحظة: إذا تم إجراء التحلل مباشرة بعد النمو ، فيمكن تحضين هذا المحلل بالراتنج طوال الليل.
    13. تحضير الكواشف المطلوبة:
      1. أضف TCEP بتركيز نهائي قدره 1 ملي مولار إلى مخازن الغسيل والشطف واحفظها في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
      2. احتفظ ب 20٪ (حجم / حجم) من الإيثانول جاهزا.
    14. بعد الحضانة ، قم بعمل نبض الأنابيب لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي لجمع الراتنج إلى قاع الأنبوب.
    15. أعد تعليق الراتنج باستخدام ماصة ، وأضف الراتنج مرة أخرى إلى عمود تنقية البروتين.
    16. بمجرد أن يستقر الراتنج في سرير في الجزء السفلي من العمود ، اترك المخزن المؤقت يمر.
      ملاحظة: اختياريا جمع التدفق من خلال تنقية البروتين وغسله أثناء تحليله عبر SDS-PAGE لاستكشاف أخطاء إجراء التنقية وإصلاحها
    17. اغسل العمود بحجم عمود واحد من Wash Buffer + TCEP.
    18. أضف 5 مل Elution Buffer + TCEP إلى العمود ، وأعد تعليق الراتنج عدة مرات باستخدام ماصة ، واحتضنه لمدة 10 دقائق.
    19. بعد الحضانة ، اجمع الشطف في أنبوب بيجو سعة 5 مل وقم بتخزينه على الثلج.
    20. تنظيف وتخزين راتنج تنقية البروتين:
      1. بعد اكتمال الشطف ، اغسل العمود ب 30 مل من Elution Buffer لإزالة أي بروتينات مرتبطة متبقية.
      2. اشطف الراتنج ب 30 مل من الماء المقطر المعقم ، وكرر 3 مرات.
      3. مرر 30 مل من الإيثانول بنسبة 20٪ (حجم / حجم) عبر العمود مرة واحدة.
      4. املأ العمود بنسبة 20٪ من الإيثانول وأغلقه بغطاء أو بارافيلم. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام التالي.
        ملاحظة: مطلوب التنظيف فقط - لا تحاول تجريد النيكل من الراتنج. الراتنج النظيف مناسب لإعادة الاستخدام في مستحضرات نظام PURE القياسية ؛ ومع ذلك ، بالنسبة لمتغيرات النظام ΔPURE ، استخدم دائما الراتنج الطازج لتجنب التلوث المتبادل.
    21. انقع كاسيت غسيل الكلى سعة 15 مل 2 كيلو دالتون في Buffer HT (بدون TCEP) لمدة 10 دقائق.
    22. أضف 5 مل من محلول البروتين الملطوع إلى كاسيت غسيل الكلى.
    23. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الهواء من الكاسيت قبل إعادة وضع الغطاء.
    24. غسيل 5 مل من البروتين المائل مقابل 1 لتر من Buffer HT (بدون TCEP) لمدة ساعتين ، متبوعا ب 1 لتر إضافي من Buffer HT الطازج طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع التحريك اللطيف.
      ملاحظة: في حالة الجمع بين عمليات التنقية المتعددة ، يمكن تحليل ما يصل إلى 10 مل من الشطف مقابل 2 لتر من Buffer HT لمدة ساعتين ، متبوعا ب 2 لتر إضافي من Buffer HT طوال الليل عند 4 درجات مئوية. إذا تم إجراء حضانة الراتنج بين عشية وضحاها ، فيمكن إجراء غسيل الكلى خلال النهار باستخدام بروتوكول مدته ساعتان متبوعا ب 4 ساعات ، متبوعا على الفور بخطوات تركيز البروتين أدناه.
  4. اليوم 4: التركيز والتخزين
    1. تحضير الكواشف المطلوبة:
      1. قم بإعداد تحديث HT Buffer + TCEP.
      2. تحضير Stock-60 + TCEP.
    2. بعد الانتهاء من غسيل الكلى ، قم بإزالة 5 مل من العينة المحللة من الكاسيت ووزع 500 ميكرولتر من الحصص في أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة 5 × 2 مل.
    3. تدور إلى حبيبات أي بروتينات مترسبة عند 14,000 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 10 دقائق.
    4. أعد تجميع المادة الطافية الخالية من الحبيبات وأضفها إلى وحدة مرشح الطرد المركزي MWCO 3 كيلو دالتون ، وقم بتعبئة الحجم ب 10 مل من Buffer HT Refresh + TCEP.
    5. جهاز طرد مركزي عند 3,220 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 30 دقيقة أو حتى ينخفض حجم العينة إلى 1.5 مل.
      ملاحظة: يمكن أن يقلل ترسيب البروتين أثناء خطوات التركيز بشكل كبير من الأداء العام لمركبات الكربون الكلية. بعد كل دورة طرد مركزي مدتها 30 دقيقة، استخدم ماصة سعة 1 مل لإعادة تعليق العينة في أنبوب مرشح الطرد المركزي لإخراج أي بروتينات مترسبة من أسفل المرشح.
    6. قم بإزالة العينة من وحدة الطرد المركزي وتوزيع 500 ميكرولتر في أنابيب طرد مركزي معقمة 3 × 2 مل.
    7. تدور إلى حبيبات أي بروتينات مترسبة عند 14,000 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 10 دقائق.
    8. أعد تجميع المادة الطافية الخالية من الحبيبات في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم جديد على الثلج.
    9. حدد تركيز البروتينات في المحلول باستخدام اختبار برادفورد ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    10. قم بتركيز محلول البروتين عن طريق إضافته إلى مرشح MWCO جديد 3 كيلو دالتون ، والطرد المركزي عند 14،862 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 15 دقيقة أو حتى يتم الوصول إلى حجم العينة للحصول على تركيز نهائي من 25-30 مجم / مل.
    11. قم بإزالة العينة من وحدة الطرد المركزي وتوزيع 500 ميكرولتر في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المعقمة سعة 2 مل.
    12. تدور إلى حبيبات أي بروتينات مترسبة عند 14,000 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 10 دقائق.
    13. حدد تركيز البروتين باستخدام اختبار برادفورد. انتقل إلى الخطوة التالية فقط إذا كان التركيز بين 25 و 30 مجم / مل.
    14. أعد تجميع المادة الطافية الخالية من الحبيبات في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد على الجليد.
    15. أضف كمية متساوية من Stock-60 + TCEP إلى محلول البروتين المركز ، واخلطها عن طريق سحب العينة اللطيف.
    16. حدد تركيز البروتين النهائي باستخدام اختبار برادفورد.
      ملاحظة: البروتين موجود الآن في Buffer HT + 30٪ جلسرين ، وأي تخفيف إضافي مع Stock-30 لا يغير تركيز الجلسرين.
    17. إذا لزم الأمر ، قم بتخفيف العينة باستخدام Stock-30 + TCEP لتحقيق تركيز نهائي يبلغ حوالي 12.5 مجم / مل.
    18. Aliquot محلول البروتين PURE في أنابيب PCR عند 20 ميكرولتر ، والتجميد المفاجئ في النيتروجين السائل ، وتخزينه في -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: من الأهمية بمكان تحديد تركيز البروتين بدقة قبل إضافة Stock-60 ، حيث يمكن أن يؤدي تركيز المحاليل البروتينية التي تحتوي على الجلسرين إلى أداء CFPS غير متسق ، بسبب الكميات المتغيرة من الجلسرين في تفاعل CFPS النهائي. لذلك يجب إضافة Stock-60 فقط بعد التأكد من أن تركيز البروتين ضمن النطاق الأمثل من 25-30 مجم / مل.

3. تحضير الريبوسوم الخام (5 أيام)

ملاحظة: تم تحسين بروتوكول تنقية الريبوسوم لمعالجة 2 لتر (4 × 500 مل من قوارير) من الثقافة السائلة ، مما يؤدي إلى إجمالي ~ 3 جم من حبيبات الخلية وينتج ~ 1 مل من الريبوسومات الخام بتركيز 15-24 ميكرومتر.

  1. اليوم 1: تحضير ونمو ثقافات المبتدئين
    1. قم بإعداد محاليل المخزون والمخازن المؤقتة لتحضير الريبوسوم كما هو موضح في الجدول التكميلي S2 والشكل التكميلي S1.
      ملاحظة: قم بإعداد الوسائط والمخازن المؤقتة ذات الصلة المطلوبة مباشرة قبل تنفيذ كل جزء من البروتوكول وتخزينها فقط لعدد الأيام القصوى قبل الاستخدام كما هو موضح.
    2. قم بإعداد أنبوبين مخروطيين سعة 50 مل: أضف 10 مل من وسائط LB إلى أنبوب واحد ، و 5 مل من وسائط LB إلى الأنبوب الآخر.
    3. قم بإزالة مخزون الجلسرين من BL21 (DE3) من الفريزر -80 درجة مئوية وضعه على الثلج ، مع التأكد من اكتمال الخطوات التالية قبل ذوبان المخزون.
    4. قم بتلقيح 10 مل من وسائط LB بكشط الخلايا من مخزون الجلسرين ، لإنشاء "ثقافة مصغرة" LB. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 220 دورة في الدقيقة ، جنبا إلى جنب مع الأنبوب الآخر (غير الملقح) للتحقق من تلوث الوسائط حيث تتم جميع الزوائد بدون مضاد حيوي.
    5. استبدل مخزون الجلسرين في الفريزر -80 درجة مئوية.
    6. ضع 2.2 لتر من المرق الرائع المعقم (TB) في عبوات زجاجية معقمة ، واحفظه في حاضنة ثابتة على حرارة 37 درجة مئوية للتدفئة طوال الليل.
  2. يوم 2: النمو والتكوير
    1. قم بإزالة المزارع من الحاضنة ، وتأكد من عدم وجود تلوث في الأنبوب غير الملقح أو زجاجة الوسائط الدافئة مسبقا قبل المتابعة.
    2. قم بإعداد تخفيف 10x عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من ثقافة الثقافة المصغرة إلى 900 ميكرولتر من LB في كوفيت 1 سم ، وقم بقياس OD600 باستخدام مقياس الطيف الضوئي (تأكد من أنه ~ 4-6).
    3. يضاف 200 مل من السل المسخن مسبقا إلى قارورة مخروطية معقمة سعة 500 مل، وتلقيح بحجم مناسب من المزرعة المصغرة للحصول على OD600 = 0.05 (الجدول التكميلي S1). هذه هي "ثقافة ميدي".
    4. احتضان المزرعة المتوسطة عند 37 درجة مئوية ، 220 دورة في الدقيقة حتى OD600 = 1 ، والتي يجب أن تستغرق حوالي 1.5-2 ساعة.
    5. أضف 500 مل من السل إلى كل من 4 قوارير معقمة 2.5 لتر محيرة. تلقيح كل واحدة بحجم مناسب من المزرعة المتوسطة للحصول على OD600 = 0.05 (الجدول التكميلي S1). هذه هي 4 "ثقافات ماكسي".
    6. احتضان المزارع القصوى عند 37 درجة مئوية ، 220 دورة في الدقيقة حتى OD600 = 0.7-0.8 ، والتي يجب أن تستغرق حوالي 1.5-2 ساعة.
    7. في غضون ذلك ، قم بتسمية ووضع أربع زجاجات طرد مركزي نظيفة من البولي بروبلين كوبوليمر ، و 4 زجاجات زجاجية نظيفة سعة 500 مل ، على الثلج لتبرد.
      ملاحظة: قم بقياس كثافة الثقافة القصوى كل 15 دقيقة بعد 1 ساعة من النمو لتجنب تجاوز OD600 = 0.7.
    8. بمجرد الوصول إلى OD600 = 0.7 ، انقل الثقافات بسرعة إلى زجاجات زجاجية مبردة وضعها في حمام ماء مثلج لمدة 20 دقيقة لإنهاء النمو.
      ملاحظة: يعد نقل الثقافات إلى زجاجات مبردة أمرا ضروريا لإيقاف النمو بسرعة: لن يؤدي وضع القوارير مباشرة في حمام الماء المثلج إلى إنهاء النمو بكفاءة. تتم جميع الخطوات اللاحقة على الجليد ما لم ينص على خلاف ذلك.
    9. أثناء تبريد المزارع في حمام الماء المثلج ، قم بتبريد جهاز الطرد المركزي مسبقا لتكوير الخلايا وضع 500 مل من محلول PBS على الجليد ليبرد.
    10. بعد 20 دقيقة ، انقل 250 مل من كل مزرعة إلى زجاجة الطرد المركزي المبردة مسبقا المقابلة ، وجهاز الطرد المركزي عند 3,220 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 10 دقائق ، مع الاحتفاظ ب 250 مل الأخرى على الجليد.
    11. صب المادة الطافية بعناية وجففها على مناشف ورقية.
    12. أضف 250 مل المتبقية من كل مزرعة إلى زجاجة أجهزة الطرد المركزي المقابلة ، وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 3,220 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 10 دقائق.
    13. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الصب ، وامسح الزجاجات حتى تجف على مناشف ورقية قبل وضع كريات الخلية مرة أخرى على الجليد.
    14. أضف 30 مل من PBS المعقم المثلج في كل زجاجة طرد مركزي وأعد تعليق حبيبات الخلية جيدا.
    15. قم بوزن ولصق 4 أضعاف أنابيب مخروطية نظيفة سعة 50 مل.
    16. انقل تعليق الخلية إلى الأنابيب المخروطية 4 × 50 مل.
    17. جهاز طرد مركزي مرة أخرى عند 3,220 × جم ، 4 درجة مئوية ، لمدة 10 دقائق.
    18. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الصب ، وجفف الأنابيب على مناشف ورقية قبل وضع كريات الخلية مرة أخرى على الجليد.
    19. أضف 30 مل من PBS المعقم المثلج البارد في كل أنبوب مخروطي وأعد تعليق حبيبات الخلية جيدا عن طريق الدوامة.
    20. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 3,220 × جم ، 4 درجة مئوية ، لمدة 10 دقائق.
    21. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الصب ، وجفف الأنابيب على مناشف ورقية قبل وضع كريات الخلية مرة أخرى على الجليد.
    22. أضف 30 مل من PBS المعقم المثلج البارد في كل أنبوب مخروطي وأعد تعليق حبيبات الخلية جيدا عن طريق الدوامة.
    23. جهاز طرد مركزي مرة أخرى عند 3,220 × جم ، 4 درجة مئوية ، لمدة 10 دقائق.
    24. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الصب ، وامسح الزجاجات حتى تجف على مناشف ورقية قبل وضع كريات الخلية مرة أخرى على الجليد.
    25. جهاز طرد مركزي مرة أخيرة عند 3,220 × جم ، 4 درجة مئوية ، لمدة دقيقتين.
    26. قم بإزالة أي مادة طافية زائدة عن طريق سحب العينات.
    27. قم بوزن وتسجيل كتلة كل أنبوب مخروطي. كتلة بيليه الخلية هي الفرق بين هذه القيم والوزن الفارغ للأنابيب (يجب أن يكون ~ 1 جم).
    28. قم بتجميد كريات الخلايا باستخدام النيتروجين السائل ، وخزنها في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
  3. اليوم 3: التحلل ، الطرد المركزي الفائق ، ونقع العازلة B
    1. قم بإذابة كريات الخلايا على الجليد.
    2. أضف 50 مل من الريبوسوم العازلة A في أنبوب مخروطي نظيف.
    3. خذ 100 ميكرولتر من محلول الريبوسوم A من الأنبوب المخروطي وأضفه إلى قارورة DTT بدون وزن. قم بإذابة حبيبات DTT تماما للحصول على مخزون 0.5 M DTT.
      ملاحظة: قم بإعداد مخزون DTT لاحق بمقدار 0.5 مليون كما هو موضح هنا ولكن باستخدام المخزن المؤقت المناسب لكل خطوة.
    4. أضف 100 ميكرولتر من 0.5 M DTT مرة أخرى إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 مل للحصول على تركيز نهائي قدره 1 ملي مولار DTT في 50 مل من محلول الريبوسوم أ. احتفظ بالمحلول على الجليد.
    5. أعد تعليق كل حبيبات خلية في Rebosome Buffer A + DTT ، بنسبة 2 مل لكل 1 جم من حبيبات الخلية ، عن طريق الدوامة الشاملة. اجمع جميع الخلايا المعلقة في أنبوب مخروطي واحد للتحقق من إجمالي حجم الملاط المعلق ، والذي يجب أن يكون 10 مل من 2 لتر من المزرعة. إذا لزم الأمر ، قم بتعبئة مستوى الصوت إلى 10 مل باستخدام Rebosome Buffer A + DTT الإضافي.
    6. قسم الملاط إلى عينات 2 × 5 مل في أنابيب مخروطية منفصلة.
    7. Lyse الخلايا في كل أنبوب عن طريق صوتنة في 30٪ سعة ، 20 ثانية ، 20 ثانية لمدة 10 دورات (3 دقائق 20 ثانية طول البرنامج الإجمالي) ، في حمام ماء مثلج ، باستخدام مسبار صوتنة مبرد (الشكل 3 أ ، 3 ج).
      ملاحظة: يجب نقل ما يقرب من 1,000 جول من الطاقة لكل أنبوب أثناء الصوتنة. استخدم حاملا آمنا للحفاظ على الأنبوب في مكانه أثناء الصوتنة لضمان اتساق نقل الطاقة.
    8. قم بتعبئة حجم كل عينة محللة إلى 25 مل باستخدام Ribosome Buffer A + DTT ، والدوامة لفترة وجيزة للخلط.
    9. نقل المحتويات إلى 2x أنابيب الطرد المركزي S30 المبردة.
    10. جهاز الطرد المركزي عند 30,000 × جم لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية (الشكل 3E).
    11. استرجع بحد أقصى 75٪ من المادة الطافية الخالية من الحبيبات (لتجنب تلوث الغشاء من الحبيبات) من كل أنبوب S30 إلى أنبوبين S30 نظيفين مبردين مسبقا.
    12. جهاز طرد مركزي عند 30,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    13. استرجع 75٪ كحد أقصى من المادة الطافية الخالية من الحبيبات في أنبوبين مخروطيين نظيفين سعة 50 مل ، وقم بتعبئة حجم كل منهما إلى 25 مل باستخدام Ribosome Buffer A + DTT.
    14. انقل العينة إلى أنبوبين S100 نظيفين مسبقا.
      ملاحظة: تأكد من أن الأنابيب متوازنة بدقة (بحد أقصى 0.01 جم فرق بين الأنابيب المتعارضة) قبل الطرد المركزي الفائق ويتم تعبئتها بحجم 25 مل (السعة القصوى لأنبوب S100).
    15. جهاز الطرد المركزي عند 100,000 × جم لمدة 4 ساعات عند 4 درجات مئوية (الشكل 3F).
    16. قبل ثلاثين دقيقة من نهاية تشغيل S100 ، قم بإعداد مخزون DTT بسعة 0.5 مليون باستخدام محلول الريبوسوم البارد B وفقا للتعليمات المذكورة أعلاه ، وقم بإنشاء محلول نهائي يبلغ 1 ملي مولار DTT في 50 مل من محلول الريبوسوم العازلة B.
    17. قم بإزالة المادة الطافية من أنابيب الطرد المركزي الفائق عن طريق الصب. أضف 5 مل من العازلة الريبوسوم المثلجة B + DTT في كل أنبوب S100 يحتوي على حبيبات الريبوسومي. قم بتخزين ما تبقى من الريبوسوم Buffer B + DTT عند 4 درجات مئوية لاستخدامه في اليوم التالي.
    18. احتضن الأنابيب على الثلج في غرفة باردة للسماح لحبيبات الريبوسوم بالنقع في Ribosome Buffer B + DTT طوال الليل.
      ملاحظة: تأكد من غمر حبيبات الريبوسوم بالكامل في مخزن الريبوسوم Buffer B + DTT. يمكن تحقيق ذلك عن طريق وضع أنابيب في الجليد بزاوية (الشكل 3D).
  4. اليوم 4: الطرد المركزي الفائق ونقع Buffer C
    1. في اليوم التالي ، أضف 5 مل أخرى من الريبوسوم المثلج Buffer B + DTT في كل أنبوب S100 يحتوي على حبيبات الريبوسوم المنقوعة طوال الليل.
    2. حاول برفق إعادة تعليق الحبيبات عن طريق سحب العينات. استخدم طرف الماصة لكشط الحبيبات من جدار الأنبوب وإعادة تعليقها بهذه الطريقة. انقل المحتويات إلى أنبوبين نظيفين من S30 المبردين مسبقا.
    3. أضف 10 مل أخرى من محلول الريبوسوم المثلج B + DTT في كل أنبوب S100 يحتوي على حبيبات الريبوسوم ، وكرر خطوات إعادة التعليق على النحو الوارد أعلاه.
    4. قم بتجميع إعادة التعليق في نفس أنبوب S30 كما كان من قبل.
    5. جهاز طرد مركزي عند 30,000 × جم لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية (الشكل 3G).
    6. استرجع ما يصل إلى 75٪ كحد أقصى من المادة الطافية الخالية من الحبيبات في أنبوبين مخروطيين نظيفين سعة 50 مل ، وقم بتعبئة الحجم إلى 25 مل باستخدام Ribosome Buffer B + DTT.
    7. انقل هذه العينة إلى أنبوبين نظيفين من S100 المبردين.
      ملاحظة: تأكد من أن الأنابيب متوازنة بدقة قبل الطرد المركزي الفائق وتعبئتها بحجم 25 مل (السعة القصوى لأنبوب S100).
    8. جهاز طرد مركزي عند 100,000 × جم لمدة 4 ساعات عند 4 درجات مئوية (الشكل 3H).
    9. قبل ثلاثين دقيقة من نهاية تشغيل S100 ، قم بإعداد مخزون DTT بحجم 0.5 M باستخدام Rebosome Buffer C المثلج وفقا للتعليمات أعلاه ، وقم بإنشاء محلول نهائي من 1 ملي مولار DTT في 5 مل من Ribosome Buffer C. احتفظ بهذا المخزن المؤقت على الجليد.
    10. بعد الطرد المركزي الفائق، تخلص من المادة الطافية وقم بإزالة أي عازلة متبقية عن طريق سحب العينات. اعمل بسرعة لتجنب ترك الحبيبات مكشوفة بواسطة المخزن المؤقت لفترة طويلة.
    11. أضف 400 ميكرولتر من محلول الريبوسوم المثلج C + DTT في كل أنبوب طرد مركزي فائق يحتوي على حبيبات الريبوزوم.
    12. احتضان الأنابيب على الجليد في غرفة باردة للسماح لحبيبات الريبوسوم بالنقع في Ribosome Buffer C + DTT طوال الليل.
      ملاحظة: تأكد من غمر حبيبات الريبوسوم بالكامل في Rebosome Buffer C + DTT. يمكن تحقيق ذلك عن طريق وضع الأنابيب في الجليد بزاوية.
  5. اليوم 5: الجمع
    1. في اليوم التالي ، أعد تعليق حبيبات الريبوسوم برفق باستخدام ماصة سعة 1 مل وعن طريق الدوران اللطيف لإذابة حبيبات هالة الريبوسوم الشفافة تماما.
      ملاحظة: يجب أن تذوب حبيبات الريبوسوم تماما في المخزن المؤقت في هذه المرحلة: يجب ألا يكون هناك حبيبات غير قابلة للذوبان في هذه المرحلة ، ولكن إذا بقيت حبيبات صفراء غير قابلة للذوبان ، فلا تحاول إعادة تعليقها: قم فقط بإعادة تعليق حبيبات ريبوسوم الهالة الصافية.
    2. انقل محلول الريبوسوم إلى أنبوبين معقمين للطرد المركزي 2 مل ، وجهاز طرد مركزي عند 20,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لحبيبات أي مادة غير قابلة للذوبان متبقية.
    3. اجمع المادة الطافية الخالية من الحبيبات في أنبوب نظيف وخزنها على الثلج (الشكل 3I).
    4. قم بإنشاء تخفيف 100x لمحلول الريبوسوم عن طريق إضافة 2 ميكرولتر إلى 198 ميكرولتر من محلول الريبوسوم C ، في ثلاث نسخ.
    5. قياس تركيز الحمض النووي الريبي عند 260 نانومتر ؛ 10 وحدات امتصاص من العينة المخففة تعادل 24 ميكرومتر من الريبوسومات13.
    6. محاليل الريبوسوم Aliquot (على سبيل المثال ، في 50 ميكرولتر ، حسب احتياجات المستخدم) ، التجميد المفاجئ في النيتروجين السائل بتركيز أقصى يبلغ 24 ميكرومتر ، وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: يجب أن يؤدي البروتوكول إلى ما يقرب من 1 مل من الريبوسومات بتركيز 12-18 ميكرومتر. إذا كانت الريبوسومات مخففة جدا ، فيمكن تحقيق التركيز باستخدام مرشح MWCO 3 كيلو دالتون8.

4. إعداد تجارب CFPS

  1. العمل التمهيدي
    1. قم بإعداد قالب الحمض النووي (خطي أو بلازميد) وفقا للبروتوكولات المعمولبها 9.
      ملاحظة: في مختبرنا ، نستخدم قوالب الحمض النووي بناء على نظام التعبير T7p14 المحسن للتعبير الخالي من الخلايا14. يمكن استخدام منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقاة كقوالب خطية. من المهم ملاحظة أنه يجب تنظيف البلازميدات بعد التحضير المصغر ، وأن المجموعات التجارية المختلفة تعطي نتائج متفاوتة15.
    2. قم بإعداد محلول طاقة 5x كما هو موضح في الجدول 3.
    3. قم بإعداد محلول مصفوفة 6x كما هو موضح في الجدول 4.
  2. إعداد تفاعل PURE ومراقبته
    ملاحظة: يصف هذا البروتوكول إعداد قياس ثلاثي باستخدام مزيج رئيسي. يمكن زيادة عدد التفاعلات أو تقليلها حسب الحاجة ، باستخدام جدول البيانات الوارد في الجدول التكميلي S3 ، لكننا نوصي بتكرار ثلاث مرات على الأقل لحالة تجريبية واحدة.
    1. ذوبان الجليد المطلوب من النقاء والريبوسومات ومحلول الطاقة ومحلول المصفوفة على الجليد.
    2. قم بإعداد مزيج رئيسي لمجموعة واحدة من التفاعلات الثلاثية في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل ، بإجمالي 17 ميكرولتر ، كما هو موضح في الجدول 5 ، عن طريق تجميع المكونات بالترتيب التالي: محلول الطاقة ، البروتينات النقية ، الريبوسومات ، محلول المصفوفة ، الماء الخالي من النوكلياز إلى 17 ميكرولتر.
    3. اضبط الماصة على 5.1 ميكرولتر وشفط المحلول برفق 5-6 مرات للخلط، مما يضمن التجانس.
    4. باستخدام نفس إعداد الماصة (5.1 ميكرولتر)، قم بتحميل المزيج الرئيسي في ثلاثة آبار فردية من صفيحة بصرية سعة 384 بئرا. تجنب دفع الماصة إلى ما بعد المحطة الأولى لمنع تكون الفقاعة. اترك مسافة بئر واحدة بين كل تكرار لتقليل الحديث المتبادل الفلوري.
    5. أغلق اللوحة باستخدام ختم لوحة لاصقة.
    6. تابع قياسات الحضانة النهائية أو قارئ اللوحة حسب الحاجة.
      ملاحظة: عند دمج مكونات إضافية تحتوي على الجلسرين (على سبيل المثال ، بروتينات المحسن) ، تأكد من أن الحجم النهائي لهذه المكونات لا يتجاوز 10٪ من حجم التفاعل. على سبيل المثال ، يجب أن يقتصر المكون الذي يحتوي على 30٪ من الجلسرين على 1.7 ميكرولتر لكل مزيج رئيسي سعة 17 ميكرولتر.
      لا تقم بالطرد المركزي للوحة 384 بئرا بعد التحميل. قد يتسبب الطرد المركزي في فصل المكونات الغنية بالجلسرين (على سبيل المثال ، نظام PURE ) ، مما يؤدي إلى مستويات تعبير غير متسقة. يدعم تصميم اللوحة تفاعلات صغيرة الحجم ، ويضمن سحب العينات الدقيق الترسيب الكافي دون الطرد المركزي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يظهر سير العمل لمستحضرات PURE والريبوسوم في الشكل 1 ، ويبين الجدول الزمني الموصى به للعمل في الجدول 1. عادة ، تتم مراقبة التفاعلات من خلال إنتاج بروتينات الفلورسنت مثل GFP أو mCherry ، ويمكن تحويل قراءات RFU إلى تركيزات عن طريق المعايرة11. ومع ذلك ، تعتمد غلة CFPS على البروتين المحدد الذي يتم إنتاجه ، ولذلك من المهم تحسين النظام لإنتاج البروتين المطلوب ذي الأهمية كما هو موضح من قبل Tho...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لقد قدمنا إجراء مفصلا سمح لنا بالحصول على أنظمة PURE قابلة للتكرار على دفعات متعددة ومستخدمين في نفس المختبر. هناك عدد من الخطوات الحاسمة المطلوبة لتحقيق ذلك.

تتمثل الخطوة الأولى المهمة في ضمان سلامة 36 سلالة نقية: بالإضافة إلى تسلسل جميع البلازميدات ، من الضروري إجراء تجربة تعبير للتحقق من أن جميع السلالات تفرط في التعبير بشكل صحيح ، حيث يمكن أن يؤدي فقدان سلالة واحدة إلى إلغاء نشاط CFPS. لقد لاحظنا فقدان التعبير بسبب الطفرة ، وكذلك التلوث حيث توجد سلالات متع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

SL هو المؤسس المشارك وكبير مسؤولي التكنولوجيا في شركة Biophoundry Inc. ، التي تطور تقنية خالية من الخلايا لهندسة العاثيات.

شكر وتقدير

يتم دعم NL و SL و AB و NZ من قبل زمالة قادة المستقبل UKRI من NL (MR / V027107/1). بالإضافة إلى ذلك ، يتم دعم SL من قبل شركة Biophoundry Inc. يتم دعم SY من قبل منحة الدكتوراه في Darwin Trust من جامعة إدنبرة. يتم دعم CW من قبل طالب دكتوراه في BBSRC Eastbio. يشكر المؤلفون A. Pompa على المساعدة في استخدام جهاز الطرد المركزي الفائق ، والذي تم دعمه بتمويل من منصة Wellcome Discovery Research Platform لبيولوجيا الخلايا الخفية [226791]. بالإضافة إلى ذلك ، نشكر B. Lavickova و S.J. Maerkl على المساعدة في إعداد بروتوكول OnePot الأصلي. لغرض الوصول المفتوح ، طبق المؤلف ترخيص Creative Commons Attribution (CC BY) على أي نسخة مخطوطة مقبولة من قبل المؤلف تنشأ عن هذا التقديم. تم إنشاء الشكل 1 جزئيا في BioRender. لاوهاكوناكورن ، ن. (2025) [https://BioRender.com/wj65i81].

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2x يوتيوبسيغماY2377-250G
الأحماض الأمينيةسيغماLAA21-1KT
خال من RNAse من أسيتات الأمونيومثيرمو ساينتفيكAM9070G
كلوريد الأمونيومسيغما09718-1KG
الأمبيسيلينسيغماA8351-5G
الإشريكية القولونية المعتمدة BL21(DE3)NEBC2527H
زجاجة، جهاز طرد مركزي (نالجين)ثيرمو ساينتفيك3120-9500زجاجة البولي بروبيلين المشتركة
زجاجة، زجاج (دوران) 250 مل، 500 مل، 1 لتر، 2 لترVWR215-1593, 215-1594, 215-1595, 215-1596
اختبار برادفورد، البداية السريعة 1x كاشف الصبغةبيو-راد5000205
الطرد المركزيثيرمو ساينتفيكهيرايوس ميغافوج 16R
جهاز طرد مركزي، ميكروإبندورف5424R 
عمود الكروماتوغرافيابيو-راد7321010
الكرياتين فوسفاتسيغما27920
كوفيت، نصف ميكرو 1.6 ملفيشربراندFB55147
ديهيدرات أورثوفوسفات الهيدروجين ثنائي الصوديومفيشر كيميكالS/4450/60
شريط غسيل الكلى، Slide-A-Lyzer G3، 2 كيلو دالتون MWCO، 15 ملثيرمو ساينتفيكA52962
أورثوفوسفات الهيدروجين ثنائي البوتاسيوم لا مائيفيشر كيميكالP/5240/60
DTT بدون وزنثيرمو ساينتفيكA39255
وحدة الفلتر، وحدة طرد مركزي 3kDa MWCO Amicon Ultra 15إي إم دي ميليبورUFC900324
قارورة، 500 ملVWR214-1133
قارورة، محتار 2.5 لتر تونيرSS-5013
حمض الفولينيكسيغماF7878-100MG
الجلسرينسيغماG5516-1L
HCiفيشربراندH/1200/PB17
مخزن HEPES، محلول 1 ميغاطين، درجة حموضة 7.3ثيرمو ساينتفيكBP299
إيميدازولسيغماI2399-500G
حاضنهإبندورفنيو برونزويك إنوفا وريج؛ 42
IPTGثيرمو ساينتفيكR0392
حبيبات KOHثيرمو ساينتفيكP1767-500G
حمض L-جلوتاميك وملح هيميمغنيسيوم رباعي الهيدراتسيغما49605-250G
حمض L-جلوتاميك أحادي البوتاسيوم وملح أحادي الهيدراتسيغما49601-500G
أسيتات المغنيسيوم رباعي الهيدراتسيغماM5661-50G
كلوريد المغنيسيومفلوكا63020-1L
إعداد التحريك المغناطيسيستيوارتUS152
نانودروبثيرمو ساينتفيكنانودروب 2000
خرز المغني NEBExpress Ni-NTANEBS1423S
بارافيلمسيغماP7543-1EA
مبابة، أبحاث إبندورف متعددة القنوات بلس 30-300 وميكرو؛ Lإبندورف3125000052
ختم لاصق الألواح لقارئ الألواحإكسل ساينتفيكSTR-SEAL-PLT (معقم)
ختم التنفس على اللوحةستارلابE2796-3005
ختم ورق الألمنيومإكسل ساينتفيكFCS-25
قارئ الألواحBioTekالتآزر H1
هز الألواحألشينغMBI100-4A
اللوحة، 384 بئرثيرمو ساينتفيك242764
صفيحة، بئر عميق 96 بعمق 1 ملثيرمو ساينتفيك736-0601
صفيحة، بئر عميق 96 بعمق 2 ملسارستيدت82.1972.002
اللوحة، 96 بئر PCRسارستيدت721,978
اللوحة، بئر بصري 96ثيرمو ساينتفيك10057581
كلوريد البوتاسيومسيغماP5405-500G
أورثوفوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيومفيشر كيميكالP/4800/53
كاشف استخراج البروتين (BugBuster)إي إم دي ميليبور70584-3
راتنج تنقية البروتين (cOmplete)روش5893682001
هزة الشوايةستارلابRM-Multi 1
كلوريد الصوديومفيشر كيميكالS/3105/70
مسبار الصوت، فيشر براند 15-50 ملثيرمو ساينتفيك12931181
سونيكيتورفيشر ساينتيفكFB120
مقياس الطيف الفوتونيجينوايجينوفا بلس
سبيرميدينسيغماS2626-1G
TCEP 0.5 مسوبيلكو646547
Thermo Fisher NTP، تريس مخزن مؤقتثيرمو ساينتفيكR1481
tRNA من إشريكية قولونية MRE600روش10109541001
التريبتونفورميديومTRP02
الأنبوب، درجة PCR بسعة 0.2 ملسارستيدت72,737,002
أنبوب، بيجو ستيريلين 7 مل بوليسترينثيرمو ساينتفيك129A
أنبوب، مخروطي (فالكون) 15 ملسارستيدت62.554.502
أنبوب، مخروطي (فالكون) 50 ملسارستيدت62.547.254
الأنبوب، جهاز الطرد المركزي الدقيق (إيبندورف) 1.5 ملسارستيدت72.690.001
أنبوب، جهاز الطرد المركزي الدقيق (إيبندورف) 2 ملسارستيدت72.695.700
الأنبوب، الطرد المركزي S100  بيكمان-كولتر355619
الأنبوب، الطرد المركزي S30  ثيرمو ساينتفيك3118-0050
الطرد المركزي فوق الفائقبيكمان-كولترأوبتيما XPN-100
دوار الطرد المركزي فوق الفائقبيكمان-كولتردوار 70Ti بزاوية ثابتة
ماء مقطر ألترا بيور DNase/RNase الخالي من النيازثيرمو ساينتفيك10977049
فورتكسرVWR444-2791
مستخلص الخميرةأكسويدLP0021T

المراجع

  1. Laohakunakorn, N., et al. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Front Bioeng Biotechnol. 8 (213), 1-26 (2020).
  2. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat Rev Genet. 21 (3), 151-170 (2019).
  3. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol. 19 (8), 751-755 (2001).
  4. Shimizu, Y., Ueda, T. Pure technology. Methods Mol Biol. 607, 11-21 (2010).
  5. Wang, H. H., et al. Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis. ACS Synth Biol. 1 (2), 43-52 (2012).
  6. Shepherd, T. R., et al. De novo design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module. Nucleic Acids Res. 45 (18), 10895-10905 (2017).
  7. Villarreal, F., et al. Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery. Nat Chem Biol. 14 (1), 29-35 (2018).
  8. Lavickova, B., Maerkl, S. J. A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system. ACS Synth Biol. 8 (2), 455-462 (2019).
  9. Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo, C. OnePot PURE cell-free system. J Vis Exp. (172), e62625(2021).
  10. Zhang, Y., et al. Optimizing protein expression in the One-Pot PURE system: insights into reaction composition and translation efficiency. ACS Synth Biol. 14 (5), 1496-1508 (2025).
  11. Yadav, S., Perkins, A. J. P., Liyanagedera, S. B. W., Bougas, A., Laohakunakorn, N. ATP regeneration from pyruvate in the PURE system. ACS Synth Biol. 14 (1), 247-256 (2025).
  12. Doerr, A., et al. Modelling cell-free RNA and protein synthesis with minimal systems. Phys Biol. 16 (2), 025001(2019).
  13. Christodoulou, J., et al. Heteronuclear NMR investigations of dynamic regions of intact Escherichia coli ribosomes. PNAS. 101 (30), 10949-10954 (2004).
  14. Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. The all-E coli TXTL toolbox 3.0: new capabilities of a cell-free synthetic biology platform. Synth Biol. 6 (1), 1-8 (2021).
  15. Romantseva, E., Alperovich, N., Ross, D., Lund, S. P., Strychalski, E. A. Effects of DNA template preparation on variability in cell-free protein production. Synth Biol. 7 (1), 1-17 (2022).
  16. Thornton, E. L., Boyle, J. T., Laohakunakorn, N., Regan, L. Cell-free protein synthesis as a method to rapidly screen machine learning-generated protease variants. ACS Synth Biol. 14 (5), 1710-1718 (2025).
  17. Laohakunakorn, N. Cell-free 3PGA energy solution. , Protocols.io. (2020).
  18. Kalpaxis, D. L., Theocharis, D. A., Coutsogeorgopoulos, C. Kinetic studies on ribosomal peptidyltransferase: the behaviour of the inhibitor blasticidin S. Eur J Biochem. 154 (2), 267-271 (1986).
  19. Blaha, G., et al. Preparation of functional ribosomal complexes and effect of buffer conditions on tRNA positions observed by cryoelectron microscopy. Methods Enzymol. 317, 292-309 (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

نظام PUREتحضير الريبوسوماتالبيولوجيا التركيبيةالطرد المركزي الفائقفلورية GFPتسوية الكثافة الضوئيةتركيز الجلسرولتعبير البروتين
تحسين إنتاج OnePot PURE والريبوسوم الخام لتخليق البروتين الخالي من الخلايا القابل للتكرار
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.