مقالة منهجية

منصة تصوير خالية من العدسات قابلة للنشر الميداني لتحليل سريع خال من الملصقات لتنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية

2.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68834

⸱

أغسطس 8, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electronics and Information Engineering, Korea University, 2Department of Biotechnology and Bioinformatics, Korea University, 3Metaimmunetech Inc., 4Department of Gastroenterology and Hepatology, Guro Hospital, Korea University College of Medicine, 5Department of Laboratory Medicine, Anam Hospital, Korea University College of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة خالية من الملصقات للتحليل السريع لخلية واحدة لعدد الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) ونشاطها باستخدام تقنية تصوير الظل الخالية من العدسة. تحدد هذه الطريقة التغيرات المورفولوجية في خلايا NK الفردية عن طريق التحليل المحوسب لأنماط حيودها.

الملخص

الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) هي مؤثرات مهمة للمناعة الفطرية التي تقضي على الخلايا المصابة بالفيروسات والخلايا الخبيثة. تعد مراقبة نشاط الخلايا القاتلة الطبيعية أمرا ضروريا لتقييم وظيفة المناعة. ومع ذلك ، فإن الطرق التقليدية ، مثل قياس التدفق الخلوي ، تتطلب عمالة كثيفة وتستغرق وقتا طويلا. يصف هذا البروتوكول تقنية خالية من الملصقات للتحليل السريع لنشاط الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) باستخدام تقنية تصوير الظل الخالية من العدسات (LSIT). تم تحليل الخلايا القاتلة الطبيعية المعزولة من الدم المحيطي وتحفيزها بمنشط خاص باستخدام منصة LSIT في غضون 5 دقائق. تلتقط منصة LSIT صورا ثلاثية الأبعاد ، تعرف باسم صور الظل ، تم إنشاؤها بواسطة تداخل الضوء مع الخلايا القاتلة الطبيعية ، وتراقب حالة تنشيطها من خلال تحليل التغييرات في معلمات الظل. تعكس المعلمات الرئيسية المشتقة من صور الظل ، بما في ذلك المسافة من الذروة إلى الذروة (PPD) والانحراف المعياري لعرض الحد الأقصى الثانوي (WSM-SD) ، كمية مورفولوجيا الخلية والتعقيد الداخلي. تم دمج هذه المعلمات في معلمة الظل المدمجة (CSP) ومؤشر المناعة الفطرية (I3) لتوفير تقييم شامل وتقدير كمي لنشاط الخلايا القاتلة الطبيعية بناء على التغيرات المورفولوجية في الخلايا. أنا3 ، محسوبة على أنها النسبة المئوية للتغيير في CSP بعد التنشيط ، كانت بمثابة مقياس مباشر لنشاط الخلايا القاتلة الطبيعية. أظهرت الخلايا القاتلة الطبيعية من الأفراد الأصحاء باستمرار قيم I3 أعلى بكثير من تلك الموجودة في الأفراد الذين يعانون من نقص المناعة. تتيح منصة LSIT التنميط المناعي السريع والفعال من حيث التكلفة والمناسب للتشخيص في نقاط الرعاية.

المقدمة

يظهر مورفولوجيا الخلية كمؤشر رئيسي للآليات الجزيئية. فهو لا يوفر تمثيلا مرئيا لبنية الخلية فحسب ، بل يقدم أيضا رؤى قيمة حول العمليات والوظائف الأساسية للخلاياالفردية 1. يوفر تحليل شكل وحجم ونشاط الخلايا المناعية على مستوى الخلية المفردة رؤى مهمة حول سلوكها وعدم تجانسها وأدوارها في الصحة والمرض2،3،4،5،6.

من بين هذه الخلايا الحاسمة الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) ، والتي تعد مكونا مركزيا لجهاز المناعة الفطري7،8. إنها تقضي على الخلايا المصابة بالفيروسات والسرطانية وتنظم الاستجابة المناعية التكيفية من خلال إطلاق السيتوكين9،10،11. غالبا ما يقلل السرطان والالتهابات الفيروسية ونقص المناعة من عدد الخلايا القاتلة الطبيعية ويضعف وظائفها12،13،14. لذلك ، يعمل تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية كمؤشر حيوي مهم ويوفر معلومات حول الصحة العامة لجهاز المناعة. وبالتالي ، فإن التقييم السريع لخلية واحدة لتنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية ضروري للتشخيص والتشخيص ومراقبة المرض والتقسيم الطبقي للمريض15،16،17،18.

حاليا ، يتم تقييم نشاط الخلايا القاتلة الطبيعية بناء على قدرتها السامة للخلايا (القدرة على قتل الخلايا المستهدفة) وإنتاج السيتوكين19،20،21،22. الطرق التقليدية لقياس السمية الخلوية بوساطة الخلية23 ، مثل فحوصات إطلاق الكروم -51 (51Cr)24،25 ، ومقايسات قياس التدفقالخلوي 26،27 ، وفحوصات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لتحديد كمية الإنترفيرون جاما (IFN-γ) التي تفرزها الخلايا القاتلة الطبيعية بعد التحفيز28،29،30 لها العديد من القيود. وتشمل هذه الافتقار إلى التوحيد القياسي ، والبروتوكولات الطويلة (على سبيل المثال ، حضانة ELISA بين عشية وضحاها) ، والاعتماد على وضع العلامات على الخلايا ، وتكاليف المعدات العالية31،32،33. تسلط هذه التحديات الضوء على الحاجة إلى أساليب مبتكرة تقدم نتائج سريعة وفعالية من حيث التكلفة وتحليلا خاليا من الملصقات وإنتاجية عالية. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر تقييم تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية على مستوى الخلية المفردة رؤى مفصلة حول عدم تجانس السكان والاستجابات الخلوية الفردية للتحفيز.

من بين التقنيات الناشئة التي تهدف إلى التغلب على هذه القيود ، تعد تقنية تصوير الظل الخالية من العدسات (LSIT) حلا فعالا بشكل خاص34،35،36. يتيح LSIT ، وهو التصوير المجسم الرقمي المبسط (DIH) ، تحليلا سريعا وخاليا من الملصقات وعالي الإنتاجية لتنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية بدقة خلية واحدة37،38،39. يلتقط DIH أنماط التداخل بين ضوء الليزر المتناثر والحزمة المرجعية الخطية على جهاز استشعار رقمي لإعادة بناء معلومات ثلاثية الأبعاد (3D) حول الأجسامالمجهرية 40،41. يبسط LSIT هذا النهج باستخدام مستشعر LED متماسك جزئيا ، والثقب الدقيق ، و CMOS لالتقاط أنماط الحيود (أي صور الظل) للخلايا42،43،44،45. يعتمد الأساس المنطقي لهذه التقنية على ملاحظة أن تنشيط الخلايا المناعية غالبا ما يسبب تغيرات مورفولوجية ، بما في ذلك الاختلافات في حجم الخلية وشكلها وتحبيباتها السيتوبلازمية والبنية النووية46،47،48،49،50. LSIT حساس للغاية لهذه التغييرات ، والتي لها تأثير مباشر على أنماط الحيود51،52،53.

بناء على حساسية LSIT لهذه التغييرات المورفولوجية وتأثيراتها على أنماط الحيود ، يقدم هذا البروتوكول طريقة جديدة للقياس الكمي السريع والدقيق لعدد الخلايا القاتلة الطبيعية والنشاط الوظيفي على مستوى الخلية المفردة باستخدام منصة Cellytics NK ، المشار إليها فيما يلي باسم منصة LSIT54. كما هو موضح في الشكل 1 أ ، تدمج منصة LSIT معالجة العينات وتنشيطها وتصوير الظل في سير عمل مضغوط متعدد القنوات. تم عزل الخلايا القاتلة الطبيعية من الدم الكامل ، وتحفيزها باستخدام كوكتيل محفز تنشيط مصمم خصيصا (ASC) ، وتحميلها على شريحة فحص مخصصة. يؤدي ASC إلى حدوث تغييرات مورفولوجية في الخلايا القاتلة الطبيعية في غضون ساعة واحدة من التعرض ، مثل زيادة حجم الخلية والتعقيد الداخلي ، والتي يمكن اكتشافها بدقة باستخدام منصة LSIT55،56.

تستخدم منصة LSIT مصدر ضوء LED ومستشعر CMOS لالتقاط أنماط DIH (الظلال) للخلايا الفردية (الشكل 1 ب). تقوم خوارزمية خاصة بعد ذلك بتحليل أنماط الظل هذه واستخراج المعلمات الرئيسية ، مثل المسافة من الذروة إلى الذروة (PPD) ، والتي ترتبط بحجم الخلية ، والانحراف المعياري لعرض الحد الأقصى الثانوي (WSM-SD) ، والذي يرتبط بتعقيد وعدم انتظام السيتوبلازم (الشكل 1C ، D). من خلال مقارنة القيم قبل التحفيز وبعده ، تحسب المنصة المؤشرات المركبة: معلمة الظل المجمعة (CSP = PPD × WSM-SD) ومؤشر المناعة الفطرية (I³) ، والتي تعكس النسبة المئوية للتغيير في CSP بعد التنشيط. سبب إدخال CSP هو أن التنشيط المناعي ينطوي على تضخم الخلايا وزيادة التعقيد السيتوبلازمي. يمكن أن يؤدي الاعتماد على معيار واحد فقط إلى تفويت التنشيط الحدودي أو أن تتأثر بالضوضاء، مثل الحطام أو الإضاءة غير المنتظمة. يعمل CSP على تحسين التصنيف من خلال طلب تحولات متسقة في كلا المقياسين. تصنف هذه المؤشرات حالات تنشيط مجموعات الخلايا المختلفة دون وضع العلامات الفلورية أو معالجة العينات المعقدة.

هذا البروتوكول مفيد بشكل خاص للباحثين والأطباء الذين يحتاجون إلى طريقة سريعة وكمية وخالية من الملصقات لمراقبة التغيرات المورفولوجية الناجمة عن التنشيط في الخلايا المناعية. إنه مناسب للأبحاث المناعية الأساسية ، وفحص الأدوية قبل السريرية ، وتقييم العلاجات المناعية ، ويمكن استخدامه كأداة تشخيصية أو تنبؤية في البيئات السريرية حيث يكون التقييم السريع للحالة المناعية ضروريا. تتطلب هذه الطريقة مجموعات خلايا معزولة ، والوصول إلى منصة LSIT ، وكوكتيل تنشيط خلية NK محدد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

اتبعت جميع الأبحاث الإرشادات المؤسسية وتمت الموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمستشفى أنام بالجامعة الكورية (رقم الموافقة: 2021AN0040). الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. جمع العينات والتعامل معها

ملاحظة: التعامل مع جميع عينات الدم البشري باستخدام احتياطات السلامة البيولوجية القياسية ومعدات الحماية الشخصية المناسبة.

  1. جمع الدم الكامل المحيطي من المريض في أنبوب هيبارين معقم بشكل معقم.
  2. اقلب الأنبوب برفق 8-10 مرات لخلط مضاد التخثر مع الدم.
  3. قم بتحليل عينة الدم مباشرة بعد جمعها. إذا تأخر التحليل ، قم بتخزين العينة في أنبوب هيبارين عند 2-8 درجة مئوية واستخدمها في غضون 48 ساعة.
    ملاحظة: لا تجمد الدم الكامل. استخدم عينات جديدة للحفاظ على سلامة الخلية.

2. عزل الخلايا القاتلة الطبيعية وتنشيطها

ملاحظة: يقدم هذا البروتوكول سير عمل محسنا وشاملا لعزل وتنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية مباشرة من الدم البشري الكامل باستخدام مجموعة NK Prep Kit ، والتي تتكون من NK Sep Kit لعزل الخلايا ومجموعة تنشيط NK للتحفيز. تدمج هذه المجموعة الاختيار والتحفيز السلبي القائم على الخرزة المغناطيسية لتمكين التقييم السريع للنمط الظاهري عبر منصة قياس الخلايا للتصوير الخالية من العدسات.

  1. إعداد ما قبل الاختبار
    1. أخرج المجموعات من الثلاجة وأحضرها إلى درجة حرارة الغرفة (15-28 درجة مئوية).
      ملاحظة: تشتمل مجموعة NK Sep على المكونات التالية:
      (أ) الغطاء الأخضر: أنبوب التفاعل الذي يحتوي على كوكتيل الأجسام المضادة.
      (ب) الغطاء الأحمر: أنبوب الفصل 1 الذي يحتوي على جزيئات مغناطيسية في وسائط التخفيف (1.5 مل).
      (ج) الغطاء الأرجواني: أنبوب الفصل 2 الذي يحتوي على الجسيمات المغناطيسية.
      (د) الغطاء الرمادي: أنبوب الاسترداد (نظيف وفارغ).
      تتضمن مجموعة تنشيط NK المكونات التالية:
      (أ) السيارة: ثمانية أنابيب شفافة في كيس من الألومنيوم محكم الغلق.
      (ب) ASC: ثمانية أنابيب صفراء في كيس من الألومنيوم محكم الغلق.
      قم بإزالة الأنابيب المطلوبة فقط من الأكياس محكمة الغلق. أعد إغلاق أي مكونات غير مستخدمة وتبريدها.
    2. قم بتجهيز المعدات اللازمة: فاصل مغناطيسي ، ماصات ذات أطراف معقمة ، وحاضنة معايرة أو كتلة تسخين مثبتة عند 37 درجة مئوية.
  2. إجراء عزل الخلايا القاتلة الطبيعية
    1. أضف 0.5 مل من الدم الكامل إلى أنبوب التفاعل مع الغطاء الأخضر الذي يحتوي على كوكتيل الجسم المضاد. تخلط برفق عن طريق قلب الأنبوب 2-3 مرات وتحتضن لمدة 5 دقائق.
    2. انقل المحتويات بالكامل إلى أنبوب الفصل 1 بغطاء أحمر. تخلط بلطف 2-3 مرات.
    3. ضع الأنبوب على فاصل مغناطيسي واحتضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. مع وضع المغناطيس في مكانه ، انقل ما يقرب من 1.5 مل من المادة الطافية إلى أنبوب الفاصل ذو الغطاء الأرجواني 2. تخلط بلطف 2-3 مرات.
    5. ضع أنبوب الفصل الثاني على الحامل المغناطيسي واحتضنه لمدة 10 دقائق.
    6. مع استمرار توصيل المغناطيس ، انقل ما يقرب من 1.0 مل من المادة الطافية إلى أنبوب استرداد بغطاء رمادي. تخلط بعناية.
  3. تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية
    1. أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية القاتلة الطبيعية المعزولة إلى أنبوب السيارة و 100 ميكرولتر أخرى إلى أنبوب ASC
    2. امزج محتويات الأنبوبين بعناية.
    3. احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: استخدم كتلة تسخين معايرة للحفاظ على درجة حرارة حضانة ثابتة.

3. التصوير والتحليل باستخدام منصة LSIT

ملاحظة: يجب تحليل الخلايا مباشرة بعد الحضانة. إذا لم يكن التحليل الفوري ممكنا ، فقم بتخزين الخلايا المحتضنة عند 2-8 درجات مئوية وتحليلها في غضون 6 ساعات. تقوم منصة LSIT بتقييم مورفولوجيا الخلايا وعددها في عينات الدم البشري باستخدام DIH. لتحليل النشاط المناعي ، تم تحميل كل من الخلايا الطبيعية غير المحفزة والمحفزة ب ASC على شريحة خاصة ، وإدخالها في الجهاز ، وتصويرها تلقائيا.

  1. إعداد الجهاز ومعايرته
    ملاحظة: قم دائما بإجراء معايرة الخلفية قبل تحليل العينة.
    1. قم بتشغيل منصة LSIT. تأكد من أن مؤشر LED والمروحة والكاميرا تعمل.
    2. ابدأ تشغيل برنامج LSIT Capture . قم بتسجيل الدخول عن طريق إدخال المعرف وكلمة المرور.
    3. انتقل إلى الإعدادات وحدد معايرة.
    4. اضغط على زر الفتح على شاشة اللمس أو استخدم زر الباب المنزلق الفعلي لفتح الباب. عندما يفتح الدرج ، قم بإزالة شريحة المعايرة وتخزينها.
    5. تأكد من عدم وجود شريحة اختبار. أغلق الدرج.
      ملاحظة: استخدم المناديل الضوئية فقط لتنظيف أسطح الشرائح.
    6. انقر فوق تعيين الخلفية لمعايرة الكثافة البصرية.
    7. استبدل شريحة المعايرة وأغلق الدرج.
    8. انقر فوق بدء المعايرة.
      ملاحظة: في حالة انسكاب السائل على الجهاز ، قم بإيقاف تشغيله على الفور. امسحها نظيفة. لا تقم بتفكيك الجهاز.
  2. إعداد شريحة الفحص وتحميلها
    1. قم بإزالة شريحة الفحص من الحقيبة الخاصة بها ، وقم بتسميتها ببيانات العينة ، وضعها على سطح نظيف ومستو.
    2. الماصة 10 ميكرولتر من عينة المركبة (غير المحفزة) في القناتين A وB.
    3. الماصة 10 ميكرولتر من العينة المحفزة ب ASC في القناتين C و D.
      ملاحظة: تجنب تكوين الفقاعات والإفراط في التعبئة.
    4. اضغط على فتح لإخراج الدرج ، وإزالة شريحة المعايرة ، ووضعها في صندوق تخزين.
    5. أدخل شريحة الفحص المعدة واضغط على إغلاق.
  3. الحصول على الصور: قائمة الاختبار 1 - نشاط الخلايا القاتلة الطبيعية
    ملاحظة: إذا فشل الحصول على الصورة، فتحقق من الإضاءة وحجم العينة. أعد المعايرة إذا لزم الأمر.
    1. قم بتسجيل الدخول إلى نظام LSIT وحدد اختبار نشاط خلية NK على الشاشة الرئيسية.
    2. أدخل نموذج المعرف أو استخدم ماسح الباركود.
      ملاحظة: لاسترداد معرف العينة من القائمة المؤرشفة، استخدم الزر استرداد.
    3. اضغط على Capture لبدء التسجيل.
    4. بعد التقاط الصورة ، انقر فوق تحليل
    5. تحقق من نشاط الخلايا القاتلة الطبيعية (٪) وعدد الخلايا المعروضة على الشاشة.
      ملاحظة: يتم عرض النتائج الصحيحة رقميا. إذا كان I3 أقل من النطاق، عرض "≤100٪". أعلى النطاق، يتم عرض ">300٪".
    6. قم بتنزيل النتائج على USB أو اطبعها باستخدام قائمة شاشة اللمس.
  4. الحصول على الصور: قائمة الاختبار 2 - عد الخلايا
    1. حدد خيار عد الخلايا ضمن قائمة الاختبار 2 على الواجهة الرئيسية.
    2. قم بتحميل 10 ميكرولتر من العينة على قناة منزلقة فحص جديدة.
    3. أدخل الشريحة، وأغلق الدرج، وأدخل معرف العينة.
    4. أدخل عامل التخفيف إن أمكن.
    5. اضغط على العدد.
      ملاحظة: إذا كانت النتيجة ضمن نطاق الاختبار، عرض عدد خلايا NK كقيمة رقمية على شاشة النظام. بالنسبة للنتائج التي تقل عن نطاق الاختبار ، يتم عرض "≤ 10 خلايا / ميكرولتر" ، للنتائج التي تزيد عن "> 1,000 خلية / ميكرولتر".
    6. عرض النتائج كخلايا / ميكرولتر.
      ملاحظة: قم بتبديل حقل النتيجة السوداء لعرض عدد الخلايا الفعلي في الصور.
    7. راجع النتائج وقم بتنزيلها أو طباعتها.
      ملاحظة: تأكد من إدخال عامل التخفيف الصحيح للحصول على نتائج دقيقة.

4. تنظيف ما بعد التحليل

  1. افتح الدرج باستخدام الزر فتح أو مفتاح التبديل الفعلي.
  2. قم بإزالة الشريحة المستخدمة.
  3. ضع شريحة المعايرة مرة أخرى في الدرج لحماية المستشعر.
  4. أغلق الدرج.
  5. تخلص من الأنابيب والنصائح والشرائح المستخدمة وفقا للوائح النفايات المختبرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باتباع هذا البروتوكول ، تتيح منصة LSIT تقييما كميا وخاليا من الملصقات لتنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية بناء على التغيرات المورفولوجية في الخلايا. يوضح الشكل 2 أ مستحضرات السيتوبين الملطخة بالهيما -3 لخلايا القاتل القاتل الطبيعية الأولية من متبرعين أصحاء بعد حضانة لمدة ساعتين مع أو بدون ASC. يؤدي التنشيط بواسطة ASC إلى تغييرات ملحوظة ، في المقام الأول تضخم الخلايا وزيادة التعقيد الداخلي أو الدقة ، مقارنة بعناصر التحكم في السيارة (غير المحفزة). يتم التقاط هذه التغييرات في شكل أنماط حيود الظل ، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يقدم هذا البروتوكول طريقة موحدة وخالية من الملصقات لقياس تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية التي تجمع بين عزل الخلية وتنشيطها باستخدام مجموعة NK Prep Kit ، مع التحليل عبر منصة LSIT. إنه يوفر بديلا سريعا وكميلا للمقايسات التقليدية مثل إطلاق 51Cr ، وقياس التدفق الخلوي ، و ELISA. تم تطوير البروتوكول للمختبرات المجهزة بمنصة LSIT ويوفر نتائج بسيطة بناء على تحليل صورة الظل لعدد الخلايا القاتلة الطبيعية و I3. توفر دقة الخلية المفردة رؤى مفصلة غير ممكنة مع فحوصات الكتل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

تنتمي I.L. ، S.H. ، H.S.J. و SS إلى شركة Metaimmunetech Inc. ، وهي شركة تشارك في تطوير وتسويق منصة LSIT المعروضة في هذه الدراسة. على وجه التحديد ، HSJ هو المؤسس والرئيس التنفيذي ، و S.H. هو الرئيس التنفيذي ، و SS هو كبير مسؤولي التكنولوجيا في الشركة. ومع ذلك، يؤكد المؤلفون أن النتائج والتفسيرات الواردة في هذه المخطوطة يتم الإبلاغ عنها بموضوعية ولا تتأثر بالمصالح التجارية من أي نوع. يعلن جميع المؤلفين الآخرين عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذه الدراسة من قبل برامج أبحاث العلوم الأساسية التابعة للمؤسسة الوطنية للبحوث (NRF) في كوريا (Grant #: RS-2024-00353675 ، Grant #: 2021R1I1A3056109) ، وبرنامج دعم ITRC (مركز أبحاث تكنولوجيا المعلومات) الذي يشرف عليه IITP (معهد تخطيط وتقييم تكنولوجيا المعلومات والاتصالات) ووكالة ترويج التسويق لنتائج البحث والتطوير (COMPA) الممولة من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (MSIT) ، كوريا (منحة #: IITP-2025-RS-2023-00258971 (50٪) ، منحة #: 2710084652) ، برنامج دعم المعهد الكوري لتعزيز العلوم والتكنولوجيا البحرية (KIMST) الممول من وزارة المحيطات ومصايد الأسماك ، كوريا (منحة #: 20210660) ، ومنحة الجامعة الكورية. يقر المؤلفون بشركة Metaimmunetech Inc. لتعاونهم ، بناء على التكنولوجيا المنقولة من جامعة كوريا ، في تطوير جهاز Cellytics NK.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.7 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقةأكسيجنMCT-175-Cمعقم ، خالي من DNase / RNase
شريحة الفحصميتيمونتيكAS050-Gشريحة مخصصة لنظام Cellytics
50 شريحة في صندوق
نظام Cellytics مع برنامجميتيمونتيكعال 001منصة تصوير الظل الخالية من العدسات
جهاز طرد مركزي (دوار دلو متأرجح)لابوجين1580ص300 – 500 &مرات ؛ مجموعة ز
مستشعر صورة CMOSمضمنة مع جهاز Cellyticsمتكاملتستخدم لتصوير الحيود
جهاز الطرد المركزي Cytospinناسكو كورياجهاز طرد مركزي TXT3 Cytoلتلطيخ السيتوسبين
كتلة التدفئة الرقمية (37 درجة ؛ C)دايهان العلميةدرهم. WHB00349لحضانة الخلايا
مجموعة إليسا (IFN- &)آر آند نظام DDIF50CIFN البشري وجاما. طقم ELISA
مقياس التدفق الخلوي للجوافة easyCyteميليبور0500-5005لتحليل التعبير CD107a
حزمة إحصائيات هيما 3ثيرموفيشر122-911لتلطيخ السيتوسبين
IL-12 (إنسان مؤتلف)آر آند نظام Dمكون ASC
IL-2 (الإنسان المؤتلف)بيبروتك200-02مكون ASC
رف الفصل المغناطيسيميتيمونتيكطراز M13R8لفصل الخرزة
شرائح المجهرمارينفيلد1000612لمستحضرات التخيل الخلوي
طقم تنشيط NKميتيمونتيكMIT2301V ، MIT2301Aلتنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية
طقم NK SepميتيمونتيكMIT2301-500لعزل الخلايا القاتلة الطبيعية
PE ماوس مضاد للإنسان CD107a ، 100 اختبارالعلوم البيولوجية BD555801لتحليل التعبير CD107a
فتحة الثقبمضمنة مع جهاز Cellyticsمتكاملتستخدم في مسار إضاءة LSIT
الماصات (2 – 20 & L ، 20 &ndash ؛ 200 & L)أكسيجنتي 200 وايحجم قابل للتعديل
شريحة معايرة الظلميتيمونتيكAS050-Gلمعايرة الجهاز.
1 شريحة معايرة في 1 مربع شريحة الفحص
خلاط دوامةميرك   ؛SI-0246 ألإعادة التعليق

المراجع

  1. Alizadeh, E., et al. Cellular morphological features are predictive markers of cancer cell state. Comput Biol Med. 126, 104044(2020).
  2. Chen, D., Luo, Y., Cheng, G. Single cell and immunity: Better understanding immune cell heterogeneities with single cell sequencing. Clin Transl Med. 13 (1), e1159(2023).
  3. McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17253-17258 (2013).
  4. Karetin, Y. Morphometry of cellular behavior of coelomocytes from starfish Asterias amurensis. PeerJ. 9, e12514(2021).
  5. Chen, D., Luo, Y., Cheng, G. Single cell and immunity: Better understanding immune cell heterogeneities with single-cell sequencing. Clin Transl Discov. 2 (4), e162(2022).
  6. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
  7. Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
  8. Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. NK cells for cancer immunotherapy. Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).
  9. Mujal, A. M., Delconte, R. B., Sun, J. C. Natural killer cells: From innate to adaptive features. Annu Rev Immunol. 39 (1), 417-447 (2021).
  10. Paolini, R., Bernardini, G., Molfetta, R., Santoni, A. NK cells and interferons. Cytokine Growth Factor Rev. 26 (2), 113-120 (2015).
  11. Cook, K. D., Waggoner, S. N., Whitmire, J. K. NK cells and their ability to modulate T cells during virus infections. Crit Rev Immunol. 34 (5), 359-388 (2014).
  12. Kaur, G., Sandeep, F., Olayinka, O., Gupta, G. Morphologic changes in circulating blood cells of COVID-19 patients. Cureus. 13 (2), e13416(2021).
  13. Hammer, Q., Cuapio, A., Bister, J., Björkström, N. K., Ljunggren, H. G. NK cells in COVID-19-from disease to vaccination. J Leukoc Biol. 114 (5), 507-512 (2023).
  14. Frutoso, M., Mortier, E. NK cell hyporesponsiveness: More is not always better. Int J Mol Sci. 20 (18), 4514(2019).
  15. Dufva, O., et al. Single-cell functional genomics reveals determinants of sensitivity and resistance to natural killer cells in blood cancers. Immunity. 56 (12), 2816-2835.e13 (2023).
  16. Song, P., Li, W., Guo, L., Ying, J., Gao, S., He, J. Identification and validation of a novel signature based on NK cell marker genes to predict prognosis and immunotherapy response in lung adenocarcinoma by integrated analysis of single-cell and bulk RNA-sequencing. Front Immunol. 13, 850745(2022).
  17. Viel, S., et al. Monitoring NK cell activity in patients with hematological malignancies. Oncoimmunology. 2 (9), e26011(2013).
  18. Strauss-Albee, D. M., et al. Human NK cell repertoire diversity reflects immune experience and correlates with viral susceptibility. Sci Transl Med. 7 (297), 297ra115(2015).
  19. Liu, S., Galat, V., Galat, Y., Lee, Y. K. A., Wainwright, D., Wu, J. NK cell-based cancer immunotherapy: from basic biology to clinical development. J Hematol Oncol. 14 (1), 7(2021).
  20. Kim, J. M., et al. Assessment of NK cell activity based on NK cell-specific receptor synergy in peripheral blood mononuclear cells and whole blood. Int J Mol Sci. 21 (21), 8112(2020).
  21. Lorenzo-Herrero, S., Sordo-Bahamonde, C., González, S., López-Soto, A. Evaluation of NK cell cytotoxic activity against malignant cells by the calcein assay. Methods Enzymol. 631, 483-495 (2020).
  22. Nederby, L., Jakobsen, A., Hokland, M., Hansen, T. F. Quantification of NK cell activity using whole blood: Methodological aspects of a new test. J Immunol Methods. 458, 21-25 (2018).
  23. Meza Guzman, L. G., Nicholson, S. E. Determining activation status of Natural Killer cells following stimulation via cytokines and surface receptors. Methods Mol Biol. 2463, 181-194 (2022).
  24. Elsner, L., Dressel, R. 51Cr-release to monitor NK cell cytotoxicity. Methods Enzymol. 631, 497-512 (2020).
  25. Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (6), 1131-1135 (2001).
  26. Zarcone, D., Tilden, A. B., Cloud, G., Friedman, H. M., Landay, A., Grossi, C. E. Flow cytometry evaluation of cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods. 94 (1-2), 247-255 (1986).
  27. Ogino, T., Wang, X., Ferrone, S. Modified flow cytometry and cell-ELISA methodology to detect HLA class I antigen processing machinery components in cytoplasm and endoplasmic reticulum. J Immunol Methods. 278 (1-2), 33-44 (2003).
  28. Lion, E., Smits, E. L. J. M., Berneman, Z. N., Van Tendeloo, V. F. I. Quantification of IFN-gamma produced by human purified NK cells following tumor cell stimulation: comparison of three IFN-gamma assays. J Immunol Methods. 350 (1-2), 89-96 (2009).
  29. Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay. Methods. 38 (4), 274-282 (2006).
  30. Clay, T., Hobeika, A., Mosca, P., Lyerly, H., Morse, M. Assays for monitoring cellular immune responses to active immunotherapy of cancer. Clin Cancer Res. 7 (5), 1127-1135 (2001).
  31. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A novel method for assessment of natural killer cell cytotoxicity using image cytometry. PLOS ONE. 10 (10), e0141074(2015).
  32. Rico, L. G., Ward, M. D., Bradford, J. A., Petriz, J. Flow cytometric quantification of cytotoxic activity in whole blood samples. Curr Protoc. 1 (8), e215(2021).
  33. Kang, H., Choi, A. R., Ryu, J. H., Oh, E. J. Establishing a reference interval for flow cytometry-based NK activity (FC-NKA) assay in healthy Korean population. Lab Med Online. 13 (4), 349-355 (2023).
  34. Baik, M., et al. Label-free CD34+ cell identification using deep learning and lens-free shadow imaging technology. Biosensors. 13 (12), 993(2023).
  35. Cheon, H., et al. Cellytics: A digital inline holography platform for single cell analysis in biomedical and environmental applications. 2024 IEEE SENSORS. 2024, 1-4 (2024).
  36. Roy, M., Jin, G., Seo, D., Nam, M. H., Seo, S. A simple and low-cost device performing blood cell counting based on lens-free shadow imaging technique. Sens Actuators B Chem. 201, 321-328 (2014).
  37. Kim, J., Lee, S. J. Digital in-line holographic microscopy for label-free identification and tracking of biological cells. Mil Med Res. 11 (1), 38(2024).
  38. Wu, Y., Ozcan, A. Lensless digital holographic microscopy and its applications in biomedicine and environmental monitoring. Methods. 136, 4-16 (2018).
  39. Baker, M., Gollier, F., Melzer, J. E., McLeod, E. Lensfree air-quality monitoring of fine and ultrafine particulate matter using vapor-condensed nanolenses. ACS Appl Nano Mater. 6 (13), 11166-11174 (2023).
  40. Palacios, F., Ricardo, J., Palacios, D., Gonçalves, E., Valin, J. L., De Souza, R. 3D image reconstruction of transparent microscopic objects using digital holography. Opt Commun. 248 (1-3), 41-50 (2005).
  41. Xu, W., Jericho, M. H., Meinertzhagen, I. A., Kreuzer, H. J. Digital in-line holography for biological applications. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (20), 11301-11305 (2001).
  42. Shin, S., et al. Field-portable seawater toxicity monitoring platform using lens-free shadow imaging technology. Water Res. 230 (119585), 119585(2023).
  43. Su, T. W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip. Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).
  44. Mudanyali, O., Erlinger, A., Seo, S., Su, T. W., Tseng, D., Ozcan, A. Lensless on-chip imaging of cells provides a new tool for high-throughput cell-biology and medical diagnostics. J Vis Exp. (34), e1650(2009).
  45. Roy, M., Seo, D., Oh, C. H., Nam, M. H., Kim, Y. J., Seo, S. Low-cost telemedicine device performing cell and particle size measurement based on lens-free shadow imaging technology. Biosens Bioelectron. 67, 715-723 (2015).
  46. Vaghashiya, R., et al. Machine learning based lens-free shadow imaging technique for field-portable cytometry. Biosensors. 12 (3), 144(2022).
  47. Roy, M., Seo, D., Oh, C. H., Nam, M. H., Seo, S. Staining-free cell viability measurement technique using lens-free shadow imaging platform. Sens Actuators B Chem. 224, 577-583 (2016).
  48. Cheon, H., et al. Multichannel Cellytics for rapid and cost-effective monitoring of leukocyte activation. Biosensors. 15 (3), 143(2025).
  49. Lee, A., et al. Quantification of natural killer cell activation using lens-free shadow imaging technology. Proc Conf Lasers Electro-Opt Pac Rim. CMP15A_02. , (2022).
  50. Seo, D., Oh, S., Lee, M., Hwang, Y., Seo, S. A field-portable cell analyzer without a microscope and reagents. Sensors. 18 (1), 85(2017).
  51. Seo, D., et al. Field-portable leukocyte classification device based on lens-free shadow imaging technique. Biosensors. 12 (2), 47(2022).
  52. Baik, M., et al. Machine learning based CD34+ cell detection using lens-free shadow imaging technology. Proc Conf Lasers Electro-Opt Pac. 2022, 1-2 (2022).
  53. Roy, M., Seo, D., Oh, S., Chae, Y., Nam, M. H., Seo, S. Automated micro-object detection for mobile diagnostics using lens-free imaging technology. Diagnostics. 6 (2), 17(2016).
  54. Lee, I., et al. Use of a platform with lens-free shadow imaging technology to monitor natural killer cell activity. Biosens Bioelectron. 261 (116512), 116512(2024).
  55. Jang, H., et al. Investigation of NK cell activity in healthy and immunocompromised individuals using lens-free shadow imaging technology. 2024 IEEE SENSORS. 2024, 1-4 (2024).
  56. Lee, A., Lee, I., Nam, M. H., Jun, H. S., Seo, S. Single cell-based rapid natural killer cell activity measurement by using lens-free shadow imaging technology. Proc SPIE Biophotonics Immune Responses. 123800H, (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة