يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تصوير كيميائي عالي المحتوى بالمعلومات مع رامان مضاد للستوكس متماسك عريض النطاق ومجهر مضان ثنائي الفوتون مدى الحياة

1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68845

⸱

أكتوبر 7, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology, 3School of Electrical and Computer Engineering, Georgia Institute of Technology

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

توضح هذه المقالة منصة تصوير متعددة الوسائط تجمع بين تشتت رامان المضاد للستوكس المتماسك عريض النطاق (BCARS) ، وتألق الإثارة ثنائي الفوتون (TPEF) ، والفحص المجهري للتصوير الفلوري ثنائي الفوتون (2p-FLIM) ، مما يتيح التصوير الحيوي الكيميائي عالي المحتوى للمعلومات.

الملخص

يعد التحليل الطيفي لبصمات الأصابع رامان والتصوير الفلوري مدى الحياة من الأدوات الناشئة لدراسة الملامح الأيضية للعينات البيولوجية. بينما يكتشف التحليل الطيفي لبصمات الأصابع رامان الاهتزازات الجزيئية الجوهرية التي تعكس التركيب الجزيئي والبيئة الكيميائية للعينة ، فإن التصوير الفلوري يقيس التغيرات في عمر الحالة المثيرة للفلوروفورات الحساسة لبيئاتها الدقيقة. هنا ، نقدم منصة تصوير متعددة الوسائط تجمع بين النطاق العريض المتماسك المضاد لتشتت رامان (BCARS) والتصوير المجهري مدى الحياة للفوتون ثنائي الفوتون (2p-FLIM) الذي يمكنه الحصول على أطياف بصمات أصابع رامان ذات الصلة بيولوجيا وإشارات عمر التألق في الجسم الحي وفي وقت واحد. تسمح لنا المعلومات الكيميائية الهائلة التي تم الحصول عليها من صور BCARS و 2p-FLIM المسجلة مكانيا بتوصيف الاختلافات الدقيقة بين المقصورات الخلوية الفرعية والتحقق من النتائج الإيجابية الكاذبة المحتملة الناتجة عن التصوير الفلوري وحده. يتضح ذلك من خلال المقارنة المباشرة بين إشارات مضان الإثارة BCARS و 2p-FLIM و 2-FLIM (TPEF) التي تم الحصول عليها في وقت واحد من نفس العضية الملطخة بالصبغة في C. ايليجانس الحية السليمة التي تعبر عن علامة بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP). في هذا العمل ، نقدم مخطط إعداد BCARS / 2p-FLIM / TPEF ، وخطوات الحصول على الصور ، ومعالجة البيانات ، والنتائج التمثيلية التي تظهر أن طريقة التصوير عبر الوسائط تتيح التوصيف الدقيق والكشف في الجسم الحي بدقة خلوية شبه خلوية. يوفر هذا البروتوكول إطارا للتصوير الكيميائي والفلوري المتزامن مدى الحياة لتحسين دقة التفسير البيولوجي في الأنظمة الحية المعقدة.

المقدمة

يتمثل أحد التحديات في الدراسات البيولوجية في الكشف بدقة عن مواد البناء البيولوجية في حالاتها الأصلية وضمن البنية السليمة للخلايا والأنسجة. يظهر التحليل الطيفي رامان إمكانات غير مسبوقة للكشف عن المستقلبات الجوهرية والأنواع الكيميائية داخل العينات البيولوجية وقد تم الاعتراف به مؤخرا كأداة ناشئة للتنميط الأيضي للعينات البيولوجية1. من خلال تحليل قمم مجموعات التمثيل الغذائي المختلفة الموضحة في أطياف بصمات الأصابع رامان ، تظهر الأدلة المتزايدة أنه يمكن استخدام ميزات بصمات الأصابع للكشف عن المراحل المبكرة من الأمراض مثل السرطان2،3،4 واضطرابات القلب5،6 والأمراض التنكسيةالعصبية 7،8 وهي مفيدة بشكل خاص لمعالجة المشكلات البيولوجية الأساسية9،10 بما في ذلك تصوير الهياكل داخل الخلايا دون أي اضطراب في الملصقات11 ، والتمييز بين حالات الخلية المختلفة12،13 ، وتصنيف نوع الخلية14،15،16. معظم المعلومات الكيميائية (> 90٪) المشفرة في أطياف رامان موجودة في منطقة بصمات الأصابع (500 إلى 1800 سم -1) ، مما يجعل هذه المنطقة الأكثر فائدة إلى حد بعيد لتمييز التركيبات الكيميائية في العينات البيولوجية17. ومع ذلك ، فإن إشارة رامان الضعيفة في نطاق التردد هذا تجعل تطبيقات التحليل الطيفي لبصمات الأصابع رامان على الدراسات البيولوجية صعبة ، خاصة بالنسبة للعينات البيولوجية الحية السليمة1.

تعمل مناهج تصوير رامان المتماسكة (CRI) على تقصير وقت اكتساب إشارات رامان بشكل كبير ، ولكن معظمها يكتسب قطاعات طيفية ضيقة نسبيا ويتم تحسينها لإشارات تمدد CH القوية بين 2800 - 3100 سم -1. تستخدم CARS ضيقة النطاق وتشتت رامان المحفز (SRS) (الشكل 1 أ ، ب) نبضتين بيكو ثانية ، عادة للحصول على جزء ضيق من إشارة CH القوية 18،19،20،21،22،23. تستخدم مناهج CRI المتعددة ، مثل CARS المتعددة (الشكل 1 ج) ، مزيجا من نبضات بيكو ثانية و ~ 100 fs للحصول على نطاق طيفي معتدل (عادة ≤ 400 سم -1) عادة في منطقة CH24،25،26،27،28،29،30. عادة ما يكون الحصول على طيف رامان كامل ذي صلة بيولوجية (من 600 إلى 3200 سم -1) لكل بكسل باستخدام أساليب التصوير هذه باهظا لأن معظم إشارات بصمات الأصابع أضعف بمقدار 10-100 مرة من إشارات CH-stretch31. على عكس معظم أساليب CRI ، تم تحسين تشتت رامان المتماسك المضاد لستوكس رامان (BCARS) للنطاق العريض للحصول على النطاق العريض أحادي اللقطة الذي يغطي بصمات الأصابع ومناطق تمتد CH31،32،33. يستخدم BCARS تفاعلات داخل النبضة لنبضة ~ 10 fs لإثارة اهتزازات التردد المنخفض (بصمة الإصبع) بكفاءة (الشكل 1D) ، ويستخدم نفس آلية تعدد الإرسال CARS ، وهو مزيج من نبضة fs مع نبضة ps لتوليد تماسك اهتزازي في منطقة تمدد CH (الشكل 1 ج) 32،33. علاوة على ذلك ، تتم معايرة إشارات BCARS جوهريا بسبب تفاعلها مع الخلفية غير الرنانة (NRB) ، مما ينتج عنه طيف رامان كامل كمي وثابت للأداة لكل نبضة ليزر عند كل بكسل31 ، مع القدرة على الحصول بسرعة على بيانات عالية المحتوى من المعلومات من الخلايا والأنسجة السليمة والكائنات البيولوجية الحية32،34،35،36،37 ،38,39.

تحتوي أطياف BCARS الخام المكتسبة على ما يسمى ب "الخلفية غير الرنانة" القوية (NRB). NRB هي مساهمة من الاستجابة الإلكترونية لنبضات الليزر غير المحددة كيميائيا. يتداخل NRB بشكل متماسك مع إشارة الرنين الاهتزازي ، حيث يعمل كمضخم غير متجانس32. يشوه NRB أيضا طيف رامان الأساسي (الشكل 2 أ) ، ولكن يمكن استرداد طيف رامان طالما تم الحصول على مقاطع طيفية متجاورة مهمة. حاليا ، لا توجد طريقة معالجة لاحقة متاحة لفصل إشارة CARS الرنانة عن المكون غير الرنان باستخدام نهج CARS ضيق النطاق. يمكن تحقيق استرداد إشارة رامان من إشارة CARS ذات النطاق العريض من خلال استخدام علاقة المجال الزمني Kramers-Kronig (أو تحويل هيلبرت) 33،40 (الشكل 2 ب) ، أو الحد الأقصى للإنتروبيا41،42 ، أو التعلم الآلي43،44،45،46،47،48 النهج. لاحظ أن الطريقتين الأوليين تسترجعان الطور تحليليا (إشارة رامان الرنين) من أطياف BCARS الخام ، ويمكن أن تعتمد مناهج التعلم الآلي بشكل كبير على الأجهزة ونماذج التدريب.

بينما يسمح الفحص المجهري BCARS بالتوصيف الخالي من الملصقات للتنميط الأيضي للعينات البيولوجية ، فإن نفس الليزر الفائق (950 - 1200 نانومتر لإعداد BCARS المقدم في هذا العمل) المستخدم لتوليد إشارة BCARS يمكن أن يثير أيضا مجموعة واسعة من الأصباغ ، مثل الأصباغ القائمة على الرودامين ، والأصباغ القائمة على البوديبي ، والأصباغ القائمة على Alexa Fluor ، والسيانين ، وبروتينات الفلورسنت المختلفة ، بما في ذلك GFP و mCherry49 ، 50. بالمقارنة مع الإثارة أحادية الفوتون باستخدام ليزر الموجة المستمرة المرئية (CW) ، فإن الفحص المجهري الفلوري متعدد الفوتون ، مثل الفحص المجهري للتصوير الفلوري ثنائي الفوتون (2p-FLIM) والفحص المجهري الفلوري ثنائي الفوتون (TPEF) ، يوفر استخدام ضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR) عمقا أعمق لاختراق العينة ، وقدرة تقسيم ثلاثية الأبعاد جوهرية ، وصور عالية التباين ، ودقة جيدة يمكن مقارنتها بالفحص المجهري متحد البؤر الحديثة ، مما يجعله أداة جذابة للبيولوجيا البحث51،52. يكتشف الفحص المجهري للتصوير الفلوري (FLIM) باستخدام نهج عد الفوتون الفردي المرتبط بالوقت (TCSPC) إشارات اضمحلال التألق التي يتم تحفيزها بشكل متكرر بواسطة مصدر ليزر معدل بمرور الوقت53،54. قد يتغير طيف التألق لفلوروفور معين مع العوامل البيئية مثل قطبية المذيبات ، ولكن هذه التغييرات عادة ما تكون دقيقة. من ناحية أخرى ، غالبا ما تختلف أعمار التألق حسب عوامل اثنين أو أكثر مع التغيرات البيئية مثل قيم الأس الهيدروجيني55 ، واللزوجة56 ، والقطبية57 ، وتركيز الأنواع الأيونية58،59 ، أو تفاعلات الربط ، أو وجود المرويات ، أو التغيرات الهيكلية53،54. توفر هذه الخاصية الفريدة لعمر التألق تباينا إضافيا للإشارة في التصوير الفلوري وقد نجحت في معالجة قضايا تداخل التألق الذاتي في تصوير الخلاياوالأنسجة 60 ، وخلط العديد من الفلوروفورات باستخدام نهج FLIM61 الذي تم حله طيفيا ، وتشخيص السرطان ومراقبته62 ، والكشف الخالي من الملصقات عن عدم التجانس الخلوي63 ، والتغيرات الأيضية64،65.

في هذا العمل ، نقدم منصة تصوير متعددة الوسائط تجمع بين BCARS و 2p-FLIM و TPEF. على حد علمنا ، هذه هي المرة الأولى التي نقدم فيها منصة تصوير تسمح بالتصوير المتزامن BCARS و 2p-FLIM / TPEF. نوضح قدرات التصوير في الجسم الحي لهذه الأداة باستخدام كائن حي نموذجي قابل للتتبع وراثيا يستخدم على نطاق واسع ، Caenorhabditis elegans (C. elegans). نوضح أن أطياف BCARS ، واضمحلال 2p-FLIM للنيل الأحمر (صبغة دهنية حيوية) ، وإشارات GFP الفلورية ثنائية الفوتون لعلامة الدهون المبلغ عنها (DHS-3:: GFP) يمكن الحصول عليها في وقت واحد في الجسم الحي من الديدان الملطخة باللون الأحمر النيلي. يتضمن الدليل العملي لنهج التصوير المقدم هنا ما يلي: (أنا) يجب أن تكون العينة شفافة بصريا وبسماكة أقل من 100 ميكرومتر ؛ (ثانيا) يمكن أن تختلف حالة التلوين اعتمادا على الأصباغ والعينات. في تلطيخ النيل الأحمر ل C. ايليجانس النتائج الموضحة هنا ، يكون تركيز النيل الأحمر عند مستوى ~ ميكرومتر ، ويمكن أن يتراوح وقت التلوين من بضع ساعات إلى66 بين عشية وضحاها. (3) مطلوب بيئة عينة مظلمة لتجنب تسرب الضوء المرئي إلى كاشفات 2p-FLIM / TPEF. تتطابق ظروف التصوير هذه مع ظروف التصوير لمعظم الفحص المجهري البصري والفلوري غير الخطي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيق نظامنا الموضح هنا بشكل أكبر للكشف عن الأصباغ الأخرى ومراسلي الفلورسنت بالإضافة إلى Nile Red و GFP من خلال إدخال ليزر Ti: Sapphire fs إضافي يغطي نطاق 700-950 نانومتر لإثارة التألق ثنائي الفوتون. وبالتالي ، في حين أن النتائج التمثيلية الموضحة في هذا البروتوكول هي التصوير في الجسم الحي ل C. elegans الملطخة بالصبغة التي تعبر عن GFP ، فإن منصة التصوير الحيوي الكيميائي ذات المحتوى العالي للمعلومات لها تطبيقات واسعة وبعيدة المدى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. ج . تحضير عينة elegans وتلوين النيل الأحمر الحيوي

ملاحظة: C. elegans تم استخدامه بكثرة في تقنيات التصوير المتعددة نظرا لشفافيته في الجسم بالكامل. يمكن تصوير الأعضاء والأنسجة الداخلية بسهولة في السليم دون تشريح. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الموافقة الأخلاقية ليست مطلوبة للأبحاث التي تنطوي على C. ايليجانس ، لأنها لا تعتبر فقاريات ولا تخضع لنفس اللوائح الأخلاقية مثل العليا مثل القوارض. يصف هذا القسم تزامن C. ايليجانس الديدان وتحضير عينات ملطخة باللون الأحمر النيلي للتصوير الفلوري. يتم الحصول على الديدان البالغة المتزامنة ليوم واحد عبر بروتوكول وضع البيض من جيلين ويتم تلطيخها باستخدام ألواح Nile Red-OP50 المعدة حديثا.

  1. حافظ على سلالات C. ايليجانس (على سبيل المثال ، N2 ، LIU1 ldrIs1 [dhs-3p: :d hs-3:: GFP + unc-76 (+)]) على ألواح متوسطة نمو الديدان الخيطية القياسية (NGM) المصنفة ببكتيريا OP50 عند 20 درجة مئوية.
  2. مزامنة الديدان
    1. اختر 10-20 ديدان بالغة على طبق NGM طازج من بذور OP50.
    2. احتضن الطبق عند 20 درجة مئوية لمدة 1-3 ساعات للسماح بوضع البيض.
    3. قم بإزالة جميع الديدان البالغة ، مع ترك البيض الطازج فقط على الطبق.
    4. احتضن الطبق عند 20 درجة مئوية حتى تصل الديدان إلى مرحلة البلوغ ليوم واحد.
    5. كرر الخطوات المذكورة أعلاه للحصول على جيل إضافي لتحسين دقة المزامنة.
  3. تحضير محلول مخزون النيل الأحمر
    1. قم بإذابة 15.92 ملغ من النيل الأحمر في 10 مل من DMSO إلى تركيز نهائي قدره 5 ملليمتر.
    2. صونيكات لمدة 10-30 دقيقة إذا لزم الأمر للمساعدة في الذوبان.
  4. تحضير ألواح تلطيخ Nile Red-OP50.
    1. امزج الملاط البكتيري OP50 جيدا مع مخزون النيل الأحمر لتحقيق تركيز نهائي من نيل ريد يبلغ 5 ميكرومتر لكل لوحة NGM. على سبيل المثال ، امزج 10 ميكرولتر من مخزون النيل الأحمر مع 20 ميكرولتر من الملاط البكتيري OP50 ، ثم ضع الخليط بالكامل على الفور على صفيحة أجار NGM غير مصنفة مقاس 6 سم (بحجم ~ 10 مل) لعمل تركيز نهائي من نيل ريد يبلغ 5 ميكرومتر لكل لوحة NGM.
    2. انشر الخليط بالتساوي على أطباق NGM غير مزروعة بذرعة 6 سم.
    3. قم بتخزين الأطباق في الظلام في درجة حرارة الغرفة طوال الليل للسماح بنمو البكتيريا وامتصاص الصبغة.
  5. بقع الديدان المتزامنة
    1. انقل 30-50 ديدان بالغة متزامنة ليوم واحد على كل صفيحة نيل ريد-OP50 محضرة.
    2. احتضن الديدان في الظلام عند 20 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة قبل التصوير.
  6. شل حركة الديدان للتصوير
    1. ضع قطرة من 100 ملي أزيد الصوديوم على وسادة أغاروز 2٪ على شريحة مجهرية (حوالي 10-15 ميكرولتر ل 20 ديدان)
    2. انقل الديدان الملطخة إلى عامل التخدير (أزيد الصوديوم) وقم بتغطية الديدان بغطاء قبل الفحص المجهري.
      ملاحظة: عند اختيار 10-20 من البالغين على طبق NGM OP50 الطازج في الخطوة الأولى من مزامنة وضع البيض ، اختر البالغين فقط ، ولكن ليس أي بيض أو يرقات طائشة. هذا للتأكد من أن جميع البيض المتبقي على الألواح يتم إنتاجه بواسطة الديدان المقطوفة خلال نافذة وقت وضع البيض التي تبلغ 1-3 ساعات. بالإضافة إلى ذلك ، يصنف أزيد الصوديوم على أنه مادة خطرة ، على الرغم من أنه يتطلب كمية صغيرة جدا لتخدير الديدان الخيطية. يجب أن يتبع استخدام نفايات أزيد الصوديوم والتخلص منها إرشادات إدارة الصحة والسلامة البيئية المؤسسية.

2. توليد شعاع المسبار

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول توليد شعاع مسبار بيكو ثانية (ps) باستخدام مذبذب بارامتري بصري محلي الصنع (OPO) متبوعا بالتوليد التوافقي الثاني (SHG) مع نظام حلقة تغذية مرتدة للإشارة محلي الصنع لتثبيت طاقة خرج حزمة المسبار.

  1. قم بتشغيل ليزر مضخة OPO 1030 نانومتر (الشكل 3 أ أو ليزر مضخة OPO القريب من 1 ثانية ، ~ 3 واط موضح في الشكل 4) واسمح بساعتين على الأقل للتوازن الحراري. الإخراج المستقر أمر بالغ الأهمية لتشغيل OPO.
  2. توجيه الإخراج إلى تجويف OPO
    1. حدد فترة الاقتباس المناسبة على بلورة OPO PPLN (الشكل 3 أ) لمطابقة الطول الموجي للإشارة المستهدفة.
    2. قم بتوجيه الحزمة إلى المرآة المنحنية الأولى (CM) (الشكل 3 أ) ، مما يشكل جزءا من تجويف خطي.
    3. تأكد من أن الحزمة تمر عبر بلورة الليثيوم نيوبات (PPLN) ذات القطب الدوري OPO (الشكل 3 أ) لتسهيل التحويل البصري لأسفل البارامتري (الشكل 3 ب).
    4. تأكد من أن الشعاع ينعكس من مرآة منحنية ثانية (CM) ثم خارج المرآة الطرفية (EM) (الشكل 3 أ) لتشكيل حلقة التجويف.
    5. قم بتكوين مقرنة الإخراج (OC) (الشكل 3 أ) لاستخراج حزمة الإشارة المتولدة من التجويف.
  3. اضبط درجة حرارة بلورة OPO PPLN باستخدام وحدة التحكم في درجة الحرارة (TC) (الشكل 3 أ) لتحديد الطول الموجي للإشارة. يبلغ الطول الموجي النموذجي للإشارة 1530 نانومتر ، وهو ما يعادل طاقة خرج تبلغ حوالي 0.8 واط عند ضخه بقوة 3 واط عند 1064 نانومتر.
  4. تحسين محاذاة OPO
    1. اضبط موضع وإمالة اثنين من CMs و EM لزيادة طاقة الخرج وجودة الشعاع إلى أقصى حد.
    2. اضبط طول التجويف لتحويل طيف الإشارة إلى التردد المطلوب.
  5. قم بتوجيه حزمة إشارة OPO من خلال مجموعة من بصريات الموازاة والتركيز وتوجيهها إلى مرحلة SHG.
    1. حدد فترة الاستنباط المناسبة على بلورة SHG PPLN (الشكل 3A) لمطابقة الطول الموجي للإشارة المستهدفة.
    2. تحكم بدقة في درجة حرارة الكريستال باستخدام وحدة التحكم في درجة الحرارة لزيادة كفاءة SHG.
    3. قم بتوجيه الحزمة إلى بلورة SHG PPLN للجيل التوافقي الثاني ، وتحويل إشارة OPO 1530 نانومتر إلى 765 نانومتر (الشكل 3 ج). تبلغ كفاءة تحويل SHG النموذجية حوالي 30٪ في ظل ظروف المحاذاة المثلى.
    4. أدخل مرشح ممر قصير 1300 نانومتر (SPF في الشكل 3 أ ، المواصفات في جدول المواد) بعد SHG PPLN لإزالة الضوء الأساسي المتبقي 1530 نانومتر.
    5. قم بموازية شعاع 765 نانومتر الناتج باستخدام عدسة مناسبة (مثل L في الشكل 3 أ).
  6. تنفيذ تثبيت الطاقة
    1. استخدم نافذة إسفين (WW) لأخذ عينات من شعاع SHG وتوجيهه إلى الصمام الثنائي الضوئي (PD).
    2. تأكد من أن حلقة التغذية الراجعة تقارن إشارة الصمام الثنائي الضوئي (PD في الشكل 3 أ) بقيمة مرجعية وتقوم بتشغيل Picomotor على المرآة الطرفية (EM) لضبط طول تجويف OPO في الوقت الفعلي ، وبالتالي تثبيت طاقة خرج SHG.
      ملاحظة: لتحديد القيمة المرجعية، قم أولا بمسح موضع EM باستخدام Picomotor أثناء تسجيل طاقة خرج SHG. حدد شدة الذروة في ملف التعريف هذا، ثم قم بتعيين القيمة المرجعية إلى 90٪ من الذروة. يضمن هذا الاختيار اتجاها واضحا لتصحيح التغذية المرتدة ، مما يمكن النظام من التعويض عن الاتجاهات المتزايدة والتناقصة في الطاقة وتحقيق الاستقرار الفعال لطاقة الخرج بمرور الوقت.

3. جيل Supercontinuum (SC) ل BCARS

ملاحظة: يظهر المخطط المبسط للنظام متعدد الوسائط المستند إلى BCARS في الشكل 4. يصف هذا البروتوكول توليد حزمة SC.

  1. اضبط الغرد المسبق (تشتت تأخير المجموعة ، GDD) على خرج نبضة الفيمتو ثانية (fs) (1030 نانومتر ، 150 fs ، ~ 1 واط) للحصول على عرض نطاق ترددي SC واسع بما يكفي يغطي إشارات منطقة بصمة الإصبع (عرض النطاق الترددي SC ≥ 1800 سم −1). حقق ذلك عن طريق ضبط فصل زوج صريف (انظر الشكل 4) ، مما يسمح بالتحكم الدقيق في التشتت.
    ملاحظة: يعد تطبيق GDD المعوض مسبقا أمرا بالغ الأهمية لتوليد النبضة المطلوبة وتحسين توليد SC. قد تختلف قيمة GDD المطلوبة اعتمادا على الخصائص المحددة لنظام الليزر المستخدم.
  2. قم بدمج تلسكوب شعاعي يتكون من عدستين لهما نفس الأطوال البؤرية لضبط تباعد شعاع المضخة.
    ملاحظة: عندما ينتقل الشعاع أكثر من الأمتار قبل دخول الألياف المتسعة ، يصبح التحكم الدقيق في تباعد الحزمة ضروريا. يعد الحفاظ على شعاع موازي خلال هذه المسافة أمرا بالغ الأهمية لضمان توليد SC بكفاءة.
  3. قم بإعداد المحاذاة التلقائية (الشكل 4) باستخدام حوامل المرآة الحركية المزودة بمشغلات بيزو لتوجيه الشعاع. اجمعها مع الأوتاد الضوئية وكاشف استشعار الموضع (PSD) لمراقبة محاذاة الحزمة وتصحيحها بنشاط.
  4. ضع المكونات بحيث تكون المسافة من الإسفين إلى المرآة الأولى مساوية للمسافة من الإسفين إلى PSD الأول. يضمن هذا التكوين المتماثل استقرار توجيه الشعاع في الألياف المتوسعة.
    ملاحظة: تعد المحاذاة النشطة ضرورية لزيادة كفاءة التوسيع الطيفي إلى أقصى حد وتقليل مخاطر تلف مدخلات الألياف.
  5. استخدم لوحة نصف موجة (HWP) ومقسم شعاع مستقطب (PBS) للتحكم في طاقة الليزر قبل الاقتران باللياف. قم بتدوير HWP لضبط زاوية الاستقطاب بالنسبة إلى PBS ، وبالتالي ضبط الطاقة المرسلة. على الرغم من أن هذه المكونات غير موضحة في الشكل 4 ، إلا أنها ضرورية للمحاذاة الآمنة والتحكم في الطاقة.
  6. قم بإقران ما يقرب من 1 واط من طاقة الليزر في ألياف بلورية ضوئية (PCF) بطول 10 سم للحفاظ على الاستقطاب بمنطقة كبيرة (LMA-PM-5) باستخدام مقرنة الألياف. إجراء الاقتران هو كما يلي:
    1. أولا ، قلل طاقة الليزر إلى ~ 20-50 ميجاوات أثناء المحاذاة الأولية لتجنب تلف الألياف.
    2. قم بتوجيه الشعاع الموازي إلى الألياف ، مما يضمن خروج بعض الضوء من الجانب الآخر. قم بتحسين مسار الحزمة عن طريق ضبط موضعه لزيادة طاقة الإخراج إلى أقصى حد.
    3. أدخل العدسة شبه الكروية (الشكل 4) ، واضبط الشعاع مرة أخرى لزيادة طاقة الإخراج إلى أقصى حد.
    4. اضبط موضع z للعدسة شبه الكروية لضمان التركيز الدقيق على وجه الألياف.
    5. كرر تعديلات المحاذاة والتركيز البؤري بشكل متكرر لزيادة كفاءة التوصيل.
    6. قم بزيادة طاقة الليزر إلى 1 واط للتشغيل.
  7. قم بموازاة ناتج الاستمرارية الفائقة للنطاق العريض (SC) الناتج من PCF باستخدام مرآة مكافئة خارج المحور (OAP) بطول بؤري f = 15 مم ، كما هو موضح في الشكل 4.
    ملاحظة: يفضل استخدام البصريات العاكسة ، مثل مرآة OAP ، لحزم النطاق العريض لتقليل الانحراف اللوني الذي تحدثه العناصر الانكسارية.
  8. قم بتوجيه إخراج الاستمرارية الفائقة ذات النطاق العريض (SC) الموازاة إلى ضاغط منشور (الشكل 4) يتكون من زوج من مناشير Schott Flint (SF10).
    1. قم بتوجيه حزمة SC إلى قمة المنشور الأول لبدء التشتت الطيفي.
    2. ضع المنشور الثاني بحيث يدخل الشعاع المشتت من خلال قمته.
    3. قم بتركيب كلا المنشورين على نظام السكك الحديدية لتمكين الضبط الخشن لفصل المنشور. ترجم المنشور الثاني على طول السكة لضبط طول المسار البصري والضغط الكلي. الفصل لهذا النظام 44 سم.
    4. قم بتركيب المنشور الأول على مرحلة ترجمة خطية دقيقة. اضبط عمق الإدخال للمنشور الأول لضبط تعويض التشتت.
    5. اضبط بشكل متكرر كل من فصل المنشور وطول إدخال المنشور الثاني لتحقيق الضغط الزمني الأمثل لنبضة SC. حدد الضغط الزمني الأمثل عن طريق مطابقة إشارة الخلط الرباعي الموجات المتدهورة التي لوحظت تجريبيا (DFWM) مع نتائج محاكاة تفسر تأخير المجموعة (GDD) وتشتت الدرجة الثالثة (TOD). يتضمن هذا النهج إجراء محاكاة لعملية توليد الاستمرارية الفائقة ، بما في ذلك تأثيرات GDD و TOD ، والتي توفر مرجعا للخصائص الزمنية والطيفية المتوقعة لنبضات SC المضغوطة على النحو الأمثل. بعد ذلك ، اضبط معلمات ضاغط المنشور بشكل متكرر للتعويض عن GDD و TOD الموجودين في النظام حتى تتطابق إشارة DFWM التجريبية مع تنبؤات المحاكاة. تظهر النتيجة النموذجية للمظهر الطيفي للمدرجات الكهروفية في الشكل 5.
      ملاحظة: يعزز تعويض التشتت المناسب التماسك الطيفي للمدن المتروعة. في ظل المحاذاة المثلى ، تبلغ قوة خرج SC حوالي 150 ميجاوات ، وطول موجي مركزي حوالي 1060 نانومتر ، ويمتد على نطاق طيفي من 950 إلى 1200 نانومتر (يتوافق مع 1800 سم −1). قد تختلف هذه القيم قليلا اعتمادا على المحاذاة وكفاءة اقتران الألياف.
  9. اجمع بين المسبار وحزم الاستمرارية الفائقة باستخدام مرآة ثنائية اللون (انظر DM في الشكل 4). قم بمحاذاة زوج من الثقوب للتأكد من أن كلا الحزمتين متداخلتان. ركز الحزم المدمجة على صمام ثنائي ضوئي عالي التردد (عرض نطاق ترددي 1 جيجاهرتز). وللحصول على جودة الإشارة المثلى، يجب أن تتداخل كلتا الحزمتين في المجالين المكاني والزماني على حد سواء. العملية هي كما يلي:
    1. قم بتوجيه الإخراج من الصمام الثنائي الضوئي إلى راسم الذبذبات عالي التردد (عرض النطاق الترددي 500 ميجاهرتز). استخدم مشغل الليزر كساعة مرجعية.
    2. سد شعاع المسبار وقياس نبضات SC. سجل الاختلافات الزمنية بين نبضات SC ومرجع الليزر.
    3. قم بحجب شعاع SC وقياس نبضات المسبار. اضبط خط التأخير الميكانيكي (كما هو موضح في الشكل 4) بحيث تتداخل نبضات المسبار مع نبضات SC في الوقت المناسب. تأكد من وصول الحزمتين إلى الحد الأقصى لهما في وقت واحد.
    4. قم بإزالة الصمام الثنائي الضوئي ، واترك الشعاع يمضي قدما في المجهر.
      ملاحظة: تصف الخطوات المذكورة أعلاه ضبطا تقريبيا لتداخل الحزمة. يتم تغطية المزيد من التحسين لمحاذاة أكثر دقة في الخطوات من 6.1 إلى 6.9.

4. إعداد الكشف عن التألق ل 2p-FLIM و TPEF وإدخال ليزر Ti: Sapphire fs إضافي

  1. قم بتشغيل ليزر Ti: Sapphire واسمح له بالوصول إلى التوازن الحراري. انتظر حوالي 2 ساعة لضمان استقرار طاقة الخرج وتوجيه الشعاع.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم إجراء تصوير TPEF و FLIM باستخدام مصدر SC ، والذي يوفر تغطية طيفية واسعة وطاقة كافية للفلوروفورات مثل GFP و Nile Red. يتم تضمين ليزر Ti: Sapphire في النظام كمصدر إثارة اختياري للفلوروفورات ذات قمم امتصاص ثنائي الفوتون أقل من 950 نانومتر ، والتي قد لا تكون متحمسة بكفاءة من قبل SC.
  2. قم بتنشيط آلية قفل الوضع على ليزر Ti:Sapphire. قم بتأكيد قفل الوضع المستقر عبر الشاشة المدمجة.
  3. قم بغرد نبضات Ti: Sapphire مسبقا للضغط الزمني الأمثل في العينة باستخدام ضاغط المنشور. رتب المنشورات في تكوين مشابه لتلك الموضحة في الخطوة 3.8 واضبط طول إدخال المنشور الثاني لضبط مدة النبضة.
    ملاحظة: يضمن الضغط الزمني المناسب كثافة القصوى والإثارة الفعالة ثنائية الفوتون في مستوى العينة.
  4. (اختياري) قم بإقران شعاع Ti: Sapphire في ألياف أحادية الوضع تحافظ على الاستقطاب إذا كان الليزر موجودا على طاولة بصرية منفصلة. اضبط بصريات اقتران الإدخال وراقب إخراج الألياف لتقليل خسائر التوصيل.
  5. اجمع بين Ti: شعاع الياقوت مع السلسلة الفائقة (SC) وأشعة المسبار باستخدام مرآة ثنائية اللون (انظر نقطة الجمع في PBS الموضحة في الشكل 3). قم بمحاذاة الحزم بعناية لضمان التداخل المكاني في ثنائي اللون والانتشار المشترك نحو المجهر.
  6. قم بتوجيه الحزم المدمجة إلى المجهر وضبط تداخلها المكاني. استخدم عينة فلورية (على سبيل المثال ، شريحة بها حبات البوليسترين الفلورية 1 ميكرومتر) للتحقق من محاذاة شعاع Ti: Sapphire بالنسبة لمسار الإثارة BCARS. اضبط مرايا محاذاة Ti:Sapphire للتأكد من أن انبعاث التألق مشترك مع النقطة المحورية BCARS داخل نفس مجال التصوير. قم بتأكيد التحديد المشترك من خلال تصور التداخل بين صور BCARS و TPEF التي يتم الحصول عليها في وقت واحد ، حيث يجب أن يكون الإزاحة المكانية أقل من بكسل واحد.
    ملاحظة: يعد تحقيق التداخل المكاني بين إشارات التألق و BCARS أمرا ضروريا لتسجيل الصور متعددة الوسائط.
  7. أدخل مرآة ثنائية اللون قبل إدخال المجهر لتعكس التألق المتناثر للخلف نحو مسار الكشف. حدد ثنائي اللون بطول موجي مناسب لفصل التألق بكفاءة عن حزم الإثارة.
  8. أدخل مرآة ثانية ثنائية اللون في اتجاه مجرى النهر في مسار الانبعاث لتقسيم إشارة التألق إلى فرعين للكشف:
    1. إرسال الأطوال الموجية ≥ 550 نانومتر إلى كاشف FLIM.
    2. تعكس الأطوال الموجية ≤ 550 نانومتر باتجاه أنبوب مضاعف ضوئي (PMT) للكشف عن التألق المثار ثنائي الفوتون التناظري (TPEF).
      ملاحظة: قم بتثبيت مرشحات ممر النطاق الترددي في كل فرع كشف لمنع ضوء الإثارة المتبقي وعزل نطاقات انبعاث معينة.
  9. قم بتوصيل خرج PMT بمكبر للصوت المسبق وقم بتغذية الإشارة التناظرية المضخمة في جهاز الحصول على البيانات (DAQ). شارك مشغل المزامنة العالمي من مصفوفة البوابة القابلة للبرمجة الميدانية (FPGA) مع DAQ لضمان المحاذاة الزمنية عبر طرائق التصوير (الشكل 7).
  10. قم بتوصيل خرج كاشف FLIM بوحدة عد أحادية الفوتون (TCSPC) مرتبطة بالوقت.
    1. قم بتوصيل إشارة كاشف FLIM بإدخال بدء وحدة TCSPC.
    2. قم بتوصيل إخراج مزامنة Ti:Sapphire laser (أو BCARS SC) بالإدخال المرجعي لوحدة TCSPC.
    3. قم بتوصيل مشغل الكاميرا العمومي (الذي تم إنشاؤه بواسطة FPGA) بإدخال مزامنة الإطار لوحدة TCSPC للمزامنة مع الحصول على الصور الممسوحة ضوئيا بالخط.

5. إعداد مسار الكشف عن BCARS

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول إعداد مسار كشف تم فك ضوئيه للتصوير الفائق الطيفي لمسح الخط. تقوم مرآة galvo 1D بمسح شعاع الإثارة على طول المحور y بوقت بقاء 2-4 مللي ثانية لكل بكسل لتكامل إشارة كاف. بعد كل مسح خطي ، تتقدم مرحلة العينة خطوة واحدة على طول المحور x. يعد فك المسح باستخدام مرآة galvo الثانوية المتزامنة أمرا ضروريا للحفاظ على التسجيل المكاني المتسق للإشارة الطيفية على الكاميرا أثناء مسح الحزمة السريعة ، والقضاء على الحديث المتبادل للإشارة بين وحدات البكسل المجاورة والحفاظ على الدقة المكانية الطيفية39.

  1. أدخل الاستمرارية الفائقة (SC) وحزم المسبار في ماسح ضوئي جالفو أحادي البعد (1D) (كما هو موضح في الشكل 4 ومزيد من التفاصيل في المرجع39). ضع مرآة galvo المقترنة بفتحة العدسة الخلفية لهدف التركيز البؤري لتمكين مسح شعاع دقيق عبر مجال الرؤية.
  2. قم بتوسيع كل حزمة باستخدام موسع شعاع عاكس (كما هو موضح في الشكل 4) لمطابقة الفتحة الخلفية لهدف الإثارة. هذا يضمن التركيز الأمثل والدقة المكانية القصوى على مستوى العينة.
    ملاحظة: استخدم البصريات العاكسة لتقليل الانحراف اللوني والحفاظ على المحتوى الطيفي عريض النطاق لحزمة SC.
  3. ضع هدف محاذاة على مستوى الفتحة الخلفية لهدف الإثارة. اضبط حزم SC والمسبار بحيث يمر كلاهما عبر مركز الهدف ، مما يضمن المحاذاة المشتركة على طول المحور البصري.
    ملاحظة: يعمل التداخل المكاني الدقيق على زيادة قوة إشارة BCARS إلى الحد الأقصى ويضمن أقصى دقة مكانية عند النقطة المحورية.
  4. ركز الحزم على العينة باستخدام هدف إثارة عالي الحمض النووي (على سبيل المثال ، 1.2 NA ، هدف الغمر في الماء 60x) مثبت على مجهر مقلوب.
  5. قم بإعداد عينة محاذاة عن طريق وضع قطرة ماء بين غطاءين لإنشاء شريحة مجهر محكمة الغلق. ضع الشريحة المعدة على مرحلة المجهر واضبط التركيز لعرض العينة.
  6. اجمع إشارة مكافحة ستوكس المتولدة أثناء الإرسال باستخدام هدف التجميع الموجود مقابل مسار الإثارة.
  7. قم بتنفيذ نظام إزالة المسح الضوئي 4f (كما هو موضح في الشكل 4) للحفاظ على رسم الخرائط المكاني للإشارة المضادة لستوكس على صفوف ثابتة من الكاشف.
    1. قم بترحيل المستوى البؤري الخلفي (BFP) لهدف التجميع على محور مرآة galvo لإزالة المسح الضوئي باستخدام نظام بصري 4f. يتكون هذا من عدستين أنبوبيتين دقيقتين (انظر جدول المواد) ، مرتبة على النحو التالي:
      1. يتم وضع العدسة الأولى بعد بؤري واحد (200 مم) بعد BFP لهدف المجموعة.
      2. يتم وضع العدسة الثانية على بعد بؤري واحد قبل مرآة galvo.
    2. قم بمزامنة galvo devis مع galvo المسح باستخدام مولد شكل الموجي الذي يتم التحكم فيه بواسطة FPGA.
    3. قم بدمج مقياس جهد رقمي 7 بت في نظام التحكم FPGA للسماح بضبط سعة galvo descan.
      ملاحظة: تعوض مرآة galvo descanly عن الانحرافات الزاوية التي أدخلها galvo المسح الأساسي. من خلال ضبط زاويته ديناميكيا بشكل متزامن ، فإنه يقاوم حركة الحزمة ، مما يضمن بقاء الإشارة المضادة للستوكس محاذاة على طول المحور البصري المؤدي إلى مطياف. هذا التثبيت ضروري للحفاظ على التسجيل المكاني على الكاشف ومنع الإزاحة الجانبية للصورة الطيفية أثناء المسح.
  8. قم بتكوين نظام FPGA (راجع جدول المواد) لمزامنة مسح galvo وتشغيل الكاميرا.
    1. قم بإنشاء مخرجات تناظرية للمسح الضوئي وإلغاء مسح galvos.
    2. اقبل مشغل مرحلة الإدخال لتحديد بداية كل مسح ضوئي للسطر.
    3. يلتقط إطار الإخراج إشارات الزناد إلى الكاميرا العلمية التكميلية لأكسيد المعادن وأشباه الموصلات (sCMOS) في كل موضع مسح.
    4. تحكم بشكل مستقل في سعة فك المسح لاستيعاب أهداف التجميع المختلفة.
      ملاحظة: يشتمل قطار نبضات FPGA النموذجي على إشارة محرك galvo للمسح الضوئي ، وإشارة محرك galvo لإلغاء المسح ، وإدخال مشغل المرحلة ، وساعة بكسل لتوقيت الإطار المتزامن.
  9. قم بتمرير إشارة مضادة للستوكس الموازاة من خلال مرشحين للتمرير القصير لمنع المضخة المتبقية وضوء الإثارة SC.
  10. ركز إشارة مضادة ستوكس المفلترة من خلال شق مدخل مقياس الطيف وعلى كاشف sCMOS. اضبط زوايا كل من galvos المسح الضوئي وإلغاء المسح الضوئي للتأكد من مسح الشعاع بالتوازي مع المحور الطويل للشق ، ومحاذاة مستوى الصورة البصرية مع الشق. تعمل هذه المحاذاة الدقيقة على زيادة الدقة الطيفية وتقليل الحديث المتبادل للإشارة الجانبية عبر صفوف الكاشف.
  11. قم بتكوين مقياس الطيف لتفريق مضادات ستوكس عموديا على طول صفوف الكاميرا. حدد شبكة مناسبة (على سبيل المثال ، 300 خط / مم ، مشتعلة عند 700 نانومتر) للحصول على تغطية طيفية مثالية.

6. تحسين الإشارة ومعايرة الدقة الطيفية

  1. قم بتشغيل برنامج الاستحواذ المصمم محليا وابدأ مراقبة الإشارة في الوقت الفعلي من كاميرا sCMOS. برنامج الاستحواذ مصمم منزليا في Python 3.8+ (Windows 10) مع تبعيات بما في ذلك برامج تشغيل Hamamatsu DCAM-API و Measurement Computing Universal Library ، وإخراج البيانات بتنسيق HDF5. البرنامج متاح بناء على طلب معقول من المؤلف المقابل.
  2. قم بإعداد عينة معايرة الطيفية عن طريق وضع قطرة من البنزونيتريل بين غطاءين لتشكيل شريحة محكمة الغلق. ضع الشريحة على مرحلة المجهر واجعلها موضع تركيز باستخدام هدف الإثارة.
  3. حدد موقع إشارة BCARS على كاميرا sCMOS. اضبط الموضع z لهدف المجموعة لزيادة شدة إشارة مضادة Stokes إلى أقصى حد.
  4. اضبط الموضع الجانبي لهدف المجموعة للتأكد من تركيز الضوء المضاد لستاكس بشكل صحيح من خلال شق مدخل مطياف. تضمن هذه المحاذاة الاقتران الأمثل في مقياس الطيف وتحسين الدقة الطيفية.
  5. تحسين التداخل المكاني بين الاستمرارية الفائقة (SC) وحزم المسبار في مستوى العينة. استخدم المرايا في مسار شعاع المسبار لضبط موضعه الجانبي وزاوية السقوط بدقة.
  6. ترجمة خط التأخير البصري في مسار شعاع المسبار لضمان التداخل الزمني مع نبضات SC. راقب شدة الإشارة واضبط حتى يتم تعظيم إشارة مضاد Stokes ، مما يؤكد المزامنة الزمنية المناسبة.
  7. حدد ذروة رامان قوية وحادة في البنزونيتريل (على سبيل المثال ، 1002 سم -1) في صورة sCMOS.
  8. سجل الطول الموجي للمسبار وموضع البكسل المقابل له على الكاميرا. استخدم خط رايلي (0 سم -1 عند الطول الموجي للمسبار) ويبلغ ذروة رامان البنزونيتريل المعروفة عند 1002 سم -1 و 3073 سم -1 لإنشاء تعيين خطي من بكسل إلى رقم موجي عبر كاشف sCMOS. يوفر خط رايلي مرجع الرقم الموجي الصفري ، بينما تحدد قمم البنزونيتريل زيادة الرقم الموجي لكل بكسل.
    ملاحظة: نظرا لأن التحليل لا يتطلب سوى معلومات الرقم الموجي النسبي (التعيين بين موضع البكسل وإزاحة رامان)، فإن معايرة الطول الموجي المطلق باستخدام مصابيح البث ليست ضرورية.
  9. أدخل تعيين رقم موجة البكسل في برنامج الاستحواذ. يجب أن تظل هذه المعايرة صالحة ما لم يتم إجراء تغييرات على المسار البصري أو إعداد الشبكة في مقياس الطيف أو المحاذاة.

7. اكتساب الإشارة

  1. قم بتحميل عينة C. elegans المحضرة في الخطوات 1.1 إلى 1.6 على مرحلة المجهر. حدد منطقة الاهتمام وقم بتركيزها باستخدام هدف الإثارة.
  2. حدد منطقة على الشريحة تفتقر إلى إشارة رامان النشطة (خلفية مائية أو غطاء زجاجي مكشوف) لتكون بمثابة مرجع للخلفية غير الرنانة (NRB).
  3. حدد موقع إشارة BCARS على كاشف sCMOS. قم بضبط الموضع z لهدف المجموعة لزيادة شدة إشارة مضادة ل Stokes.
  4. اضبط الموضع الجانبي لهدف المجموعة للتأكد من محاذاة الضوء المضاد ل Stokes بشكل صحيح من خلال شق مدخل مطياف.
  5. ابدأ المسح المتزامن وإلغاء مسح مرايا galvo باستخدام FPGA. اضبط سعة galvo descanning باستخدام مقياس الجهد الرقمي حتى يتم تعويض الانحراف الزاوي عن المسح الأساسي بالكامل. يجب أن تظل إشارة مضادة ستوكس محصورة داخل ~12 صفا على الكاميرا عبر نطاق المسح بأكمله.
  6. تحديد تسلسل اكتساب زمني
    1. احصل على إشارة ارتباط متقاطع بين نبضات SC والمسبار عن طريق تأخير نبضة المسبار. للحصول على هذا ، ارسم إشارة BCARS المدمجة ثلاثية الألوان مقابل التأخير الزمني لنبضة المسبار. ستظهر أقوى إشارة في الوقت 0 عندما تتداخل نبضات SC والمسبار مؤقتا.
      ملاحظة: نظرا لأن أنظمة الكشف FLIM و TPEF تشتركان في نفس الزناد مثل BCARS ، يتم الحصول على إشاراتهما في وقت واحد خلال هذه النقطة الزمنية.
    2. سجل في تأخير لاحق لحزمة المسبار (على سبيل المثال ، 1-2 حصان) ل BCARS وتأخير لاحق لحزمة SC للخلفية غير الرنانة (أطياف NRB في الشكل 6 أ). عندما يتم تطبيق تأخير زمني على نبضة النطاق الضيق (المسبار) ، يمكن قمع NRB في إشارة CARS ثلاثية الألوان بشكل فعال ، وبالتالي يمكن تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء67.
    3. احصل على صورة داكنة بدون تداخل زمني بين SC والمسبار لالتقاط ضوضاء كاشف خط الأساس (مرجع مظلم).
    4. احفظ جميع الصور BCARS و NRB والصور الداكنة ، بما في ذلك البيانات الوصفية داخل ملف h5 واحد.
  7. بروتوكول معالجة إشارة BCARS
    1. افتح برنامج CRIkit268.
    2. قم بتحميل جميع مجموعات البيانات الضرورية باستخدام أداة Open HDF كما هو موضح في الشكل 6 ب: تحميل بيانات BCARS فائقة الطيف ومرجع NRB والمرجع المظلم. حدد منطقة التردد ضمن عرض النطاق الترددي لتوليد إشارة BCARS باستخدام أداة Freq Window (من 400 سم إلى 1 إلى ≥ 3200 سم-1 لنظام BCARS الموضح هنا).
    3. قم بتنفيذ خطوات المعالجة المسبقة:
      1. استخدم أداة Anscombe (كما هو موضح في الشكل 6 ب) لتثبيت التباين في مجموعات بيانات BCARS و NRB.
      2. استخدم أداة إزالة الضوضاء لإجراء تحلل القيمة المفردة (SVD): احتفظ بالمكونات الرئيسية بناء على الفحص البصري. احتفظ بالمكونات التي تعرض توزيعات مكانية مطابقة لمورفولوجيا العينة وتجاهل المكونات التي تهيمن عليها الضوضاء غير المهيكلة أو البقع. تعمل خطوة تقليل الضوضاء هذه على تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) ، خاصة بالنسبة للميزات الطيفية منخفضة الكثافة.
      3. استخدم أداة Inverse Anscombe لاستعادة البيانات إلى مجالها الأصلي.
        ملاحظة: قد يتم تخطي هذه الخطوات في حالة إجراء المعالجة في الوقت الفعلي عند الاستحواذ.
    4. استرجع الأطياف الشبيهة ب Raman باستخدام تحويل Kramers-Kronig (KK):
      1. افتح أداة KK (كما هو موضح في الشكل 6 ب).
      2. تمكين المعيار إلى NRB لضمان تطبيع المرجع الطيفي المناسب.
      3. قم بتعيين المعلمات بما في ذلك تحيز NRB وعامل اللوحة ومتوسط بكسل الحافة.
      4. قم بتنفيذ تحويل KK للحصول على أطياف رامان المستردة.
    5. إجراء تصحيحات أخطاء ما بعد KK
      1. تصحيح أخطاء الطور باستخدام تنعيم Savitzky-Golay: افتح أداة تصحيح خطأ الطور (الشكل 6 ب). اضبط حجم نافذة التنعيم وترتيب متعدد الحدود. افحص الأطياف الأصلية مقابل الأطياف المصححة باستخدام لوحة المعاينة .
      2. تصحيح أخطاء المقياس: افتح أداة تصحيح خطأ المقياس (الشكل 6 ب). تطبيع الأطياف لتصحيح قياس الكثافة النسبية عبر مجموعة البيانات. ضمان الاتساق عبر الأبعاد المكانية والطيفية.
    6. معايرة المحور الطيفي (اختياري ، إذا كان غير محاذا): افتح أداة المعايرة (الشكل 6 ب). قارن الأرقام الموجية المقاسة بالقمم المرجعية المعروفة. قم بتطبيق المنحدر/الاعتراض المصحح لإعادة محاذاة المحور الطيفي.
    7. تحديد البيانات واستخراجها من مناطق الاهتمام (ROIs)
      1. استخدم ROI Spect. أو Pt Spect. (الشكل 6 ب) لتمييز المناطق المكانية ذات الأهمية أو نقاط الاهتمام في صورة BCARS.
      2. تصور ومقارنة المحتوى الطيفي لعائد الاستثمار المختلف.
      3. تصدير الأطياف المستردة لمزيد من التحليل الكمي أو الكيميائي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يوضح الشكل 5 الأطياف المقاسة لمسبار النطاق الضيق ونبضات النطاق العريض (SC) المستخدمة في إثارة BCARS. نبضة المسبار ، التي تم إنشاؤها عبر الجيل التوافقي الثاني لإشارة ~ 1530 نانومتر من مذبذب بارامتري بصري محلي الصنع (OPO ، الشكل 3) ، تتمركز عند 764.2 نانومتر بعرض كامل بنصف الحد الأقصى (FWHM) 0.2 نانومتر ، مما يوفر الدقة الطيفية عند ~ 6.8 سم -1 في أطياف رامان الناتجة. تمتد نبضة SC ، التي يتم إنتاجها عن طريق اقتران نبضة ليزر فيمتو ثانية 1030 نانو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوضح هذا العمل بنية BCARS ومنصة التصوير 2p-flim / TPEF بالتفصيل. بينما يتم استخدام ليزر مزدوج الإخراج 1030 نانومتر في إعدادنا الحالي ، يمكن استخدام معظم ليزر الألياف fs 1030 نانومتر عالي الطاقة كمصدر ليزر رئيسي لبناء مجهر BCARS. من خلال الاختيار بعناية لطول وفترة بلورات OPO / SHG PPLN ، يمكن إنشاء نبضة مسبار قليلة من الثانية باستخدام مضخة OPO 1030 نانومتر فرعية ps. على الرغم من أن معدل تكرار الليزر المرتفع نسبيا (100 ميجاهرتز) أو قوة ذروة النبضة المنخفضة نسبيا موضحة هنا ، إلا أنه لا يزال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه وليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

WC تقر بالدعم المقدم من المعاهد الوطنية للصحة (R21AG086974). تعترف MTC بالدعم المقدم من وزارة الطاقة الأمريكية (DOE BERDE-SC0022121).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كاميراهاماماتسوأوركا فيوجنsCMOS ، 2304 × ؛ 2304 بكسل
هدف التحصيل  أوليمبوس  LUMPLFLN60XW  الغمر في الماء ، 1.0 NA
داك  مجتهد  MCC USB-1208HS  بطاقة الحصول على البيانات
خط التأخير  نيوبورت  دي إل 225  التأخير الميكانيكي لنبض المسبار
ثنائي اللون  سيمروك  إف 925-دي01  الجمع بين المسبار و SC
ثنائي اللون  سيمروك  إف 705-دي01  الكشف عن مضان وضع epi
ثنائي اللون  Thorlabs  DMLP550R  فصل إشارة FLIM وإشارة TPEF
هدف الإثارة  أوليمبوس  UPLSAPO60XWIR  الغمر في الماء ، 1.2 NA
راووق  سيمروك  FF01-1326 / SP-25  رفض الليزر الأساسي بعد SHG
راووق  سيمروك  FF01-758 / SP  رفض الليزر الأساسي قبل كاميرا BCARS
راووق  Thorlabs  FESH0650  رفض الليزر الأساسي قبل طريقة التألق
فليم PMT  بيكوكوانت  PMA الهجين  كاشف فوتون أحادي FLIM
FPGA  ريدبيتايا  مختبر العلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضية 125-14  مزامنة المسح الضوئي وتشغيلها
جالفو  Thorlabs  جي في إس 101  للمسح الضوئي وإلغاء المسح الضوئي
صريف  متماسك  لايت سميث 1040 نانومتر  1000 بسات/مم، غرد مسبق ل SC
لوحة نصف موجة  Thorlabs  AHWP05M-980  التحكم في الاستقطاب
مكعب K  Thorlabs  KPA101 برنامج تشغيل PSD للتقويم التلقائي
ليزر  الأدوات المحتملة  FSX-مزدوج  ليزر فيمتو ثانية مزدوج الإخراج
ليزر  متماسك  ميرا -900  ليزر الفيمتو ثانية لإثارة التألق
برنامج تلفزيوني  Thorlabs  برنامج تلفزيوني 255  مجموعة شعاع ل SC والمسبار
PCF  Thorlabs  إل إم إيه-PM-5  ألياف بلورية ضوئية 10 سم لجيل SC
شرطه  Thorlabs  PDA100A2  حلقة ردود الفعل OPO
جبل مرآة بيزو  Thorlabs  بولاريس-K1S2P  الضابط الكهروإجهادي للتقويم التلقائي
ما قبل مكبر الصوت  إدموند أوبتكس  59-179  مكبر للصوت المسبق TPEF
موشور  بصريات Lambda Research  EQP-30SF10  ضغط SC
مديرية الأمن العام  Thorlabs  PDQ80A  كاشف حساس للموضع للتقويم التلقائي
مطياف  آلات Teledyne برينستون  جهاز IsoPlane 160  شبكة 300 جم / مم ، متمركزة عند 700 نانومتر
مرحلة  عاصي  إم إس 2000  مرحلة 3 محاور آلية
TCSPC  بيكوكوانت  ملتي هارب 150  جهاز عد الفوتون ل FLIM
TPEF PMT  هاماماتسو  [إتش] 9305-03  كاشف TPEF
عدسة الأنبوب  Thorlabs  TL200-2P2  تستخدم في نظام فك المسح الضوئي

المراجع

  1. Cutshaw, G., et al. The emerging role of Raman spectroscopy as an omics approach for metabolic profiling and biomarker detection toward precision medicine. Chem Rev. 123 (13), 8297-8346 (2023).
  2. Kong, K., Kendall, C., Stone, N., Notingher, I. Raman spectroscopy for medical diagnostics - from in vitro biofluid assays to in vivo cancer detection. Adv Drug Deliv Rev. 89, 121-134 (2015).
  3. Abramczyk, H., et al. Aberrant protein phosphorylation in cancer by using Raman biomarkers. Cancers (Basel). 11 (12), 2017(2019).
  4. Contorno, S., Darienzo, R. E., Tannenbaum, R. Evaluation of aromatic amino acids as potential biomarkers in breast cancer by Raman spectroscopy analysis. Sci Rep. 11 (1), 1698(2021).
  5. John, R. V., et al. Micro-Raman spectroscopy study of blood samples from myocardial infarction patients. Lasers Med Sci. 37 (9), 3451-3460 (2022).
  6. You, A. Y. F., et al. Raman spectroscopy imaging reveals interplay between atherosclerosis and medial calcification in the human aorta. Sci Adv. 3 (12), e1701156(2017).
  7. Carlomagno, C. Human salivary Raman fingerprint as biomarker for the diagnosis of amyotrophic lateral sclerosis. Sci Rep. 10 (1), 10175(2020).
  8. Morasso, C. F., et al. Raman spectroscopy reveals biochemical differences in plasma derived extracellular vesicles from sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Nanomedicine. 29, 102249(2020).
  9. Pezzotti, G. Raman spectroscopy in cell biology and microbiology. J Raman Spectrosc. 52 (12), 2348-2443 (2021).
  10. Dodo, K., Fujita, K., Sodeoka, M. Raman spectroscopy for chemical biology research. J Am Chem Soc. 144 (43), 19651-19667 (2022).
  11. Hamada, K., et al. Raman microscopy for dynamic molecular imaging of living cells. J Biomed Opt. 13 (4), 044027(2008).
  12. Ichimura, T., et al. Non-label immune cell state prediction using Raman spectroscopy. Sci Rep. 6 (1), 37562(2016).
  13. Germond, A., Panina, Y., Shiga, M., Niioka, H., Watanabe, T. M. Following embryonic stem cells, their differentiated progeny, and cell-state changes during IPS reprogramming by Raman spectroscopy. Anal Chem. 92 (22), 14915-14923 (2020).
  14. Zahn, J., Germond, A., Lundgren, A. Y., Cicerone, M. T. Discriminating cell line specific features of antibiotic-resistant strains of Escherichia coli from Raman spectra via machine learning analysis. J Biophotonics. 15 (7), e202100274(2022).
  15. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  16. Nitta, N., et al. Raman image-activated cell sorting. Nat Commun. 11 (1), 3452(2020).
  17. Shipp, D. W., Sinjab, F., Notingher, I. Raman spectroscopy: techniques and applications in the life sciences. Adv Opt Photon. 9 (2), 315-428 (2017).
  18. Kong, C., et al. High-contrast, fast chemical imaging by coherent Raman scattering using a self-synchronized two-colour fibre laser. Light Sci Appl. 9 (1), 25(2020).
  19. Mutlu, A. S., Duffy, J., Wang, M. C. Lipid metabolism and lipid signals in aging and longevity. Dev Cell. 56 (10), 1394-1407 (2021).
  20. Fueser, H., Pilger, C., Kong, C., Huser, T., Traunspurger, W. Polystyrene microbeads influence lipid storage distribution in C. elegans as revealed by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Environ Pollut. , 294-118662 (2022).
  21. Lee, J., et al. Label-free multiphoton imaging of microbes in root, mineral, and soil matrices with time-gated coherent Raman and fluorescence lifetime imaging. Environ Sci Technol. 56 (3), 1994-2008 (2022).
  22. Sheng, M., et al. Single source CARS-based multimodal microscopy system for biological tissue imaging. Biomed Opt Express. 15 (1), 131-141 (2024).
  23. Zeng, Q., et al. Label-free Raman imaging for screening of anti-inflammatory function food. Food Chem X. 22, 101297(2024).
  24. Zhang, J., et al. High-throughput single-cell sorting by stimulated Raman-activated cell ejection. Sci Adv. 10 (50), eadn6373(2024).
  25. Yang, L., Iyer, R. R., Sorrells, J. E., Renteria, C. A., Boppart, S. A. Temporally optimized and spectrally shaped hyperspectral coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Opt Express. 32 (7), 11474-11490 (2024).
  26. Pegoraro, A. F., Stolow, A. Chirp modulation stimulated Raman scattering microscopy. Opt Express. 32 (18), 31297-31310 (2024).
  27. Zhang, Y., et al. Rapid coherent Raman hyperspectral imaging based on delay-spectral focusing dual-comb method and deep learning algorithm. Opt Lett. 48 (3), 550-553 (2023).
  28. Sorrells, J. E., et al. Programmable hyperspectral coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Opt Lett. 49 (9), 2513-2516 (2024).
  29. De la Cadena, A. Multiplex chemical imaging based on broadband stimulated Raman scattering microscopy. J Vis Exp. (185), e63709(2022).
  30. Zhang, S., He, Y., Yue, S. Coherent Raman scattering imaging of lipid metabolism in cancer. J Innov Opt Health Sci. 16 (3), 2230015(2023).
  31. Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nat Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
  32. Camp, C. H. High-speed coherent Raman fingerprint imaging of biological tissues. Nat Photonics. 8 (8), 627-634 (2014).
  33. Camp, C. H., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Quantitative comparable coherent anti-Stokes Raman scattering spectroscopy: correcting errors in phase retrieval. J Raman Spectrosc. 47 (4), 408-415 (2015).
  34. Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nat Chem Biol. 16 (10), 1087-1095 (2020).
  35. Poorna, R., Chen, W. W., Qiu, P., Cicerone, M. T. Toward gene-correlated spatially resolved metabolomics with fingerprint coherent Raman imaging. J Phys Chem B. 127 (25), 5576-5587 (2023).
  36. Vernuccio, F., et al. Full-spectrum CARS microscopy of cells and tissues with ultrashort white-light continuum pulses. J Phys Chem B. 127 (21), 4733-4745 (2023).
  37. Murakami, Y., et al. Molecular fingerprinting of mouse brain using ultrabroadband coherent anti-stokes Raman scattering microspectroscopy empowered by multivariate curve resolution-alternating least squares. Chem Biomed Imaging. 2 (10), 689-697 (2024).
  38. Muddiman, R., Harkin, S., Butler, M., Hennelly, B. Broadband CARS hyperspectral classification of single immune cells. J Biophotonics. 18 (3), e202400382(2025).
  39. Dixon, J. Z., Chen, W. W., Xu, H., Audier, X., Cicerone, M. T. Broadband coherent anti-stokes Raman scattering microscopy for rapid, label-free biological imaging. Rev Sci Instrum. 96 (4), 043706(2025).
  40. Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Opt Lett. 34 (9), 1363-1365 (2009).
  41. Rinia, H. A., Bonn, M., Müller, M., Vartiainen, E. M. Quantitative CARS spectroscopy using the maximum entropy method: The main lipid phase transition. Chemphyschem. 8 (2), 279-287 (2007).
  42. Cicerone, M. T., Aamer, K. A., Lee, Y. J., Vartiainen, E. Maximum entropy and time-domain Kramers-Kronig phase retrieval approaches are functionally equivalent for CARS microspectroscopy. J Raman Spectrosc. 43 (5), 637-643 (2012).
  43. Houhou, R., et al. Deep learning as phase retrieval tool for CARS spectra. Opt Express. 28 (14), 21002-21024 (2020).
  44. Wang, Z., et al. Vector: Very deep convolutional autoencoders for non-resonant background removal in broadband coherent anti-stokes Raman scattering. J Raman Spectrosc. 53 (6), 1081-1093 (2022).
  45. Camp, C. H. Raman signal extraction from CARS spectra using a learned-matrix representation of the discrete Hilbert transform. Opt Express. 30 (15), 26057-26071 (2022).
  46. Junjuri, R., Saghi, A., Lensu, L., Vartiainen, E. M. Evaluating different deep learning models for efficient extraction of Raman signals from CARS spectra. Phys Chem Chem Phys. 25, 16340-16353 (2023).
  47. Vernuccio, F., et al. Non-resonant background removal in broadband CARS microscopy using deep-learning algorithms. Sci Rep. 14 (1), 23903(2024).
  48. Yao, B., et al. Recent progress in deep learning for improving coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Laser Photonics Rev. 18 (11), 2400562(2024).
  49. Bestvater, F., et al. Two-photon fluorescence absorption and emission spectra of dyes relevant for cell imaging. J Microsc. 208 (2), 108-115 (2002).
  50. Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nat Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
  51. Zhu, H., Fan, J., Du, J., Peng, X. Fluorescent probes for sensing and imaging within specific cellular organelles. Acc Chem Res. 49 (10), 2115-2126 (2016).
  52. Wu, L., Liu, J., Li, P., Tang, B., James, T. D. Two-photon small-molecule fluorescence-based agents for sensing, imaging, and therapy within biological systems. Chem Soc Rev. 50, 702-734 (2021).
  53. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chem Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
  54. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications. J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).
  55. Lin, H. J., Herman, P., Lakowicz, J. R. Fluorescence lifetime-resolved pH imaging of living cells. Cytometry A. 52 (2), 77-89 (2003).
  56. Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. Molecular rotor measures viscosity of live cells via fluorescence lifetime imaging. J Am Chem Soc. 130 (21), 6672-6673 (2008).
  57. Wang, B., et al. Bipolar and fixable probe targeting mitochondria to trace local depolarization via two-photon fluorescence lifetime imaging. Analyst. 140, 5488-5494 (2015).
  58. Despa, S., Vecer, J., Steels, P., Ameloot, M. Fluorescence lifetime microscopy of the Na+ indicator sodium green in HeLa cells. Anal Biochem. 281 (2), 159-175 (2000).
  59. Wilms, C. D., Eilers, J. Photophysical properties of Ca2+-indicator dyes suitable for two-photon fluorescence-lifetime recordings. J Microsc. 225 (3), 209-213 (2007).
  60. König, K. Review: Clinical in vivo multiphoton FLIM tomography. Methods Appl Fluoresc. 8 (3), 034002(2020).
  61. Scipioni, L., Rossetta, A., Tedeschi, G., Gratton, E. Phasor s-FLIM: a new paradigm for fast and robust spectral fluorescence lifetime imaging. Nat Methods. 18 (5), 542-550 (2021).
  62. Ouyang, Y., Liu, J., Wang, Z. M., Liu, Z., Wu, M. FLIM as a promising tool for cancer diagnosis and treatment monitoring. Nano Micro Lett. 13 (1), 133(2021).
  63. Shirshin, E. A., et al. Label-free sensing of cells with fluorescence lifetime imaging: The quest for metabolic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (9), e2118241119(2022).
  64. Liu, Z. Mapping metabolic changes by noninvasive, multiparametric, high-resolution imaging using endogenous contrast. Sci Adv. 4 (3), eaap9302(2018).
  65. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Label-free optical metabolic imaging in cells and tissues. Annu Rev Biomed Eng. 25, 413-443 (2023).
  66. Chen, W. W., et al. Identifying lipid particle sub-types in live Caenorhabditis elegans with two-photon fluorescence lifetime imaging. Front Chem. 11, 1161775(2023).
  67. Littleton, B., Shah, P., Kavanagh, T., Richards, D. Three-color coherent anti-stokes Raman scattering with optical nonresonant background removal. J Raman Spectrosc. 50 (9), 1303-1310 (2019).
  68. Crikit2 software for BCARS data processing. , https://github.com/ccampjr/crikit2 (2025).
  69. Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol Cell Proteomics. 11 (8), 317-328 (2012).
  70. Hulsey-Vincent, H. J., Cameron, E. A., Dahlberg, C. L., Galati, D. F. Spectral scanning and fluorescence lifetime imaging microscopy enable separation and characterization of C. elegans autofluorescence in the cuticle and gut. Biol Open. 13 (12), bio060613(2024).
  71. Gottlieb, D., Asadipour, B., Kostina, P., Ung, T. P. L., Stringari, C. FLUTE: A Python GUI for interactive phasor analysis of FLIM data. Biol Imaging. 3, e21(2023).
  72. Weber, G. Resolution of the fluorescence lifetimes in a heterogeneous system by phase and modulation measurements. J Phys Chem. 85 (8), 949-953 (1981).
  73. Ranjit, S., Malacrida, L., Jameson, D. M., Gratton, E. Fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging data using the phasor approach. Nat Protoc. 13 (9), 1979-2004 (2018).
  74. Smolen, J. A., Wooley, K. L. Fluorescence lifetime image microscopy prediction with convolutional neural networks for cell detection and classification in tissues. PNAS Nexus. 1 (5), pgac235(2022).
  75. Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nat Biomed Eng. 5 (1), 77-88 (2021).
  76. Vu, T., et al. Spatial transcriptomics using combinatorial fluorescence spectral and lifetime encoding, imaging and analysis. Nat Commun. 13 (1), 169(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تصوير عمر الفلورةمطيافية بصمة رامانمجهر الفوتونينالتنميط الأيضيدقة تحت خلويةالتصوير الحيC. elegansالبروتين الفلوري الأخضر
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.