تصوير كيميائي عالي المحتوى بالمعلومات مع رامان مضاد للستوكس متماسك عريض النطاق ومجهر مضان ثنائي الفوتون مدى الحياة

ملخص

توضح هذه المقالة منصة تصوير متعددة الوسائط تجمع بين تشتت رامان المضاد للستوكس المتماسك عريض النطاق (BCARS) ، وتألق الإثارة ثنائي الفوتون (TPEF) ، والفحص المجهري للتصوير الفلوري ثنائي الفوتون (2p-FLIM) ، مما يتيح التصوير الحيوي الكيميائي عالي المحتوى للمعلومات.

الملخص

يعد التحليل الطيفي لبصمات الأصابع رامان والتصوير الفلوري مدى الحياة من الأدوات الناشئة لدراسة الملامح الأيضية للعينات البيولوجية. بينما يكتشف التحليل الطيفي لبصمات الأصابع رامان الاهتزازات الجزيئية الجوهرية التي تعكس التركيب الجزيئي والبيئة الكيميائية للعينة ، فإن التصوير الفلوري يقيس التغيرات في عمر الحالة المثيرة للفلوروفورات الحساسة لبيئاتها الدقيقة. هنا ، نقدم منصة تصوير متعددة الوسائط تجمع بين النطاق العريض المتماسك المضاد لتشتت رامان (BCARS) والتصوير المجهري مدى الحياة للفوتون ثنائي الفوتون (2p-FLIM) الذي يمكنه الحصول على أطياف بصمات أصابع رامان ذات الصلة بيولوجيا وإشارات عمر التألق في الجسم الحي وفي وقت واحد. تسمح لنا المعلومات الكيميائية الهائلة التي تم الحصول عليها من صور BCARS و 2p-FLIM المسجلة مكانيا بتوصيف الاختلافات الدقيقة بين المقصورات الخلوية الفرعية والتحقق من النتائج الإيجابية الكاذبة المحتملة الناتجة عن التصوير الفلوري وحده. يتضح ذلك من خلال المقارنة المباشرة بين إشارات مضان الإثارة BCARS و 2p-FLIM و 2-FLIM (TPEF) التي تم الحصول عليها في وقت واحد من نفس العضية الملطخة بالصبغة في C. ايليجانس الحية السليمة التي تعبر عن علامة بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP). في هذا العمل ، نقدم مخطط إعداد BCARS / 2p-FLIM / TPEF ، وخطوات الحصول على الصور ، ومعالجة البيانات ، والنتائج التمثيلية التي تظهر أن طريقة التصوير عبر الوسائط تتيح التوصيف الدقيق والكشف في الجسم الحي بدقة خلوية شبه خلوية. يوفر هذا البروتوكول إطارا للتصوير الكيميائي والفلوري المتزامن مدى الحياة لتحسين دقة التفسير البيولوجي في الأنظمة الحية المعقدة.

المقدمة

يتمثل أحد التحديات في الدراسات البيولوجية في الكشف بدقة عن مواد البناء البيولوجية في حالاتها الأصلية وضمن البنية السليمة للخلايا والأنسجة. يظهر التحليل الطيفي رامان إمكانات غير مسبوقة للكشف عن المستقلبات الجوهرية والأنواع الكيميائية داخل العينات البيولوجية وقد تم الاعتراف به مؤخرا كأداة ناشئة للتنميط الأيضي للعينات البيولوجية¹. من خلال تحليل قمم مجموعات التمثيل الغذائي المختلفة الموضحة في أطياف بصمات الأصابع رامان ، تظهر الأدلة المتزايدة أنه يمكن استخدام ميزات بصمات الأصابع للكشف عن المراحل المبكرة من الأمراض مثل السرطان^2،3،....

البروتوكول

1. ج . تحضير عينة elegans وتلوين النيل الأحمر الحيوي

ملاحظة: C. elegans تم استخدامه بكثرة في تقنيات التصوير المتعددة نظرا لشفافيته في الجسم بالكامل. يمكن تصوير الأعضاء والأنسجة الداخلية بسهولة في السليم دون تشريح. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الموافقة الأخلاقية ليست مطلوبة للأبحاث التي تنطوي على C. ايليجانس ، لأنها لا تعتبر فقاريات ولا تخضع لنفس اللوائح الأخلاقية مثل العليا مثل القوارض. يصف هذا القسم تزامن C. ايليجانس الديدان وتحضير عينات ملطخة باللون الأحمر النيلي للتصوير الفلوري. يتم الحصول على الديدان البالغة المتزامنة ليوم واحد عبر بروتوكول وضع البيض....

النتائج

يوضح الشكل 5 الأطياف المقاسة لمسبار النطاق الضيق ونبضات النطاق العريض (SC) المستخدمة في إثارة BCARS. نبضة المسبار ، التي تم إنشاؤها عبر الجيل التوافقي الثاني لإشارة ~ 1530 نانومتر من مذبذب بارامتري بصري محلي الصنع (OPO ، الشكل 3) ، تتمركز عند 764.2 نانومتر بعرض كامل بنصف الحد الأقصى (FWHM) 0.2 نانومتر ، مما يوفر الدقة الطيفية عند ~ 6.8 سم ^-1 في أطياف رامان الناتجة. تمتد نبضة SC ، التي يتم إنتاجها عن طريق اقتران نبضة ليزر فيمتو ثانية 1030 نانو.......

المناقشة

يوضح هذا العمل بنية BCARS ومنصة التصوير 2p-flim / TPEF بالتفصيل. بينما يتم استخدام ليزر مزدوج الإخراج 1030 نانومتر في إعدادنا الحالي ، يمكن استخدام معظم ليزر الألياف fs 1030 نانومتر عالي الطاقة كمصدر ليزر رئيسي لبناء مجهر BCARS. من خلال الاختيار بعناية لطول وفترة بلورات OPO / SHG PPLN ، يمكن إنشاء نبضة مسبار قليلة من الثانية باستخدام مضخة OPO 1030 نانومتر فرعية ps. على الرغم من أن معدل تكرار الليزر المرتفع نسبيا (100 ميجاهرتز) أو قوة ذروة النبضة المنخفضة نسبيا موضحة هنا ، إلا أنه لا يزال.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
كاميرا	هاماماتسو	أوركا فيوجن	sCMOS ، 2304 × ؛ 2304 بكسل
هدف التحصيل	أوليمبوس	LUMPLFLN60XW	الغمر في الماء ، 1.0 NA
داك	مجتهد	MCC USB-1208HS	بطاقة الحصول على البيانات
خط التأخير	نيوبورت	دي إل 225	التأخير الميكانيكي لنبض المسبار
ثنائي اللون	سيمروك	إف 925-دي01	الجمع بين المسبار و SC
ثنائي اللون	سيمروك	إف 705-دي01	الكشف عن مضان وضع epi
ثنائي اللون	Thorlabs	DMLP550R	فصل إشارة FLIM وإشارة TPEF
هدف الإثارة	أوليمبوس	UPLSAPO60XWIR	الغمر في الماء ، 1.2 NA
راووق	سيمروك	FF01-1326 / SP-25	رفض الليزر الأساسي بعد SHG
راووق	سيمروك	FF01-758 / SP	رفض الليزر الأساسي قبل كاميرا BCARS
راووق	Thorlabs	FESH0650	رفض الليزر الأساسي قبل طريقة التألق
فليم PMT	بيكوكوانت	PMA الهجين	كاشف فوتون أحادي FLIM
FPGA	ريدبيتايا	مختبر العلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضية 125-14	مزامنة المسح الضوئي وتشغيلها
جالفو	Thorlabs	جي في إس 101	للمسح الضوئي وإلغاء المسح الضوئي
صريف	متماسك	لايت سميث 1040 نانومتر	1000 بسات/مم، غرد مسبق ل SC
لوحة نصف موجة	Thorlabs	AHWP05M-980	التحكم في الاستقطاب
مكعب K	Thorlabs	KPA101	برنامج تشغيل PSD للتقويم التلقائي
ليزر	الأدوات المحتملة	FSX-مزدوج	ليزر فيمتو ثانية مزدوج الإخراج
ليزر	متماسك	ميرا -900	ليزر الفيمتو ثانية لإثارة التألق
برنامج تلفزيوني	Thorlabs	برنامج تلفزيوني 255	مجموعة شعاع ل SC والمسبار
PCF	Thorlabs	إل إم إيه-PM-5	ألياف بلورية ضوئية 10 سم لجيل SC
شرطه	Thorlabs	PDA100A2	حلقة ردود الفعل OPO
جبل مرآة بيزو	Thorlabs	بولاريس-K1S2P	الضابط الكهروإجهادي للتقويم التلقائي
ما قبل مكبر الصوت	إدموند أوبتكس	59-179	مكبر للصوت المسبق TPEF
موشور	بصريات Lambda Research	EQP-30SF10	ضغط SC
مديرية الأمن العام	Thorlabs	PDQ80A	كاشف حساس للموضع للتقويم التلقائي
مطياف	آلات Teledyne برينستون	جهاز IsoPlane 160	شبكة 300 جم / مم ، متمركزة عند 700 نانومتر
مرحلة	عاصي	إم إس 2000	مرحلة 3 محاور آلية
TCSPC	بيكوكوانت	ملتي هارب 150	جهاز عد الفوتون ل FLIM
TPEF PMT	هاماماتسو	[إتش] 9305-03	كاشف TPEF
عدسة الأنبوب	Thorlabs	TL200-2P2	تستخدم في نظام فك المسح الضوئي