يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
هنا ، نلخص تقنيات تصوير الخلايا الحية لدراسة فصل الكروموسومات في بويضات الفأر ، باستخدام H2B-RFP للكروماتين و SiR-Tubulin لتصور المغزل. نحن نفصل إعداد العينة ، والحقن المجهري ، والثقافة ، وإعداد التصوير ، والتحليل ، ونقدم دليلا عمليا لتحقيق تصوير عالي الدقة والحد الأدنى من السمية الضوئية لديناميكيات الكروموسوم الانتصافي.
يعد الفصل الدقيق للكروموسوم أثناء انقسام البويضات أمرا ضروريا لضمان التطور الجنيني السليم ومنع الاضطرابات المرتبطة باختلال الصيغة الصبغية. أصبح تصوير الخلايا الحية جنبا إلى جنب مع تقنيات وضع العلامات الفلورية نهجا قويا لدراسة ديناميكيات الكروموسوم الانتصافي بدقة زمانية مكانية عالية. في هذا البروتوكول ، نلخص المنهجيات الرئيسية لتصور فصل الكروموسوم في بويضات الفأر الحية ، مع التركيز على استخدام هيستون H2B-RFP لوضع العلامات على الكروماتين و SiR-Tubulin لتتبع المغزل. نصف إجراءات تحضير العينة ، والحقن المجهري للرنا المرسال ، وزراعة البويضات ، وإعداد غرفة تصوير الخلايا الحية ، وإعدادات الفحص المجهري متحد البؤر ، وكلها محسنة لتحقيق تصوير عالي الدقة مع تقليل السمية الضوئية. علاوة على ذلك ، نسلط الضوء على الاعتبارات التجريبية الحاسمة مثل السمية الضوئية ومعالجة الصور والتحليل الكمي للأحداث الانتصافية. من خلال توفير تقييم شامل للمنهجيات الحالية ، يعمل هذا البروتوكول كدليل عملي للباحثين الذين يسعون إلى التحقيق في ديناميكيات الكروموسومات في البويضات الحية وتحسين دقة وقابلية التكاثر للدراسات الانتصافية.
يعد التصور الدقيق لديناميكيات الكروموسومات والمغزل أثناء الانقسام الاختزالي للبويضات أمرا بالغ الأهمية لفهم الآليات التي تحكم نضوج الأمشاج الأنثوية وخطر اختلال الصيغة الصبغية1،2،3،4،5. تخضع بويضات الثدييات لسلسلة منسقة للغاية من الأحداث الانتصافية ، بما في ذلك انهيار الحويصلة الجرثومية (GVBD) ، وتكثيف الكروموسوم ، وتجميع المغزل ، والتقسيم غير المتماثل6. في حين أن التصوير الثابت للنقطة الزمنية قد قدم لقطات قيمة لهذه العمليات ، إلا أنه يفتقر إلى الدقة ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يجب إجراء جميع التجارب وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة أخلاقيات المحلية. يجب أن تلتزم الإجراءات التجريبية بشكل صارم بمبادئ 3Rs - الاستبدال والاختزال والتنقيح. يجب إيواء الفئران في منشأة حيوانية معتمدة في ظل ظروف بيئية موحدة (22 درجة مئوية ، رطوبة 60٪) مع إمكانية الوصول المجاني إلى الطعام والماء.
1. جمع البويضات وتحضيرها
ملاحظة: يجب أن تكون جميع المعدات والكواشف معقمة. قم بإجراء جميع عمليات التعامل مع البويضات باستخدام ماصة الفم تحت المجهر الفراغي (انظر جدول المواد). قم بتغطية جميع قطرات الزراعة المتوسطة بالزيت المعدني (ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
كما هو موضح في الشكل 4 أ ، ب ، يتيح هذا البروتوكول تصويرا عالي الجودة للخلايا الحية للكروموسومات (H2B-RFP) والأنابيب الدقيقة للمغزل (SiR-tubulin) في البويضات ، وبالتالي توفير معلومات زمانية مكانية شاملة طوال فترة النضج الانتصافي.
تكشف قناة H2B-RFP في الشكل 4 أ عن جميع جوانب حركة الكروموسوم من المحاذاة الأولية بعد GVBD (الشكل 4 أ ، 03:00 - 08:00) إلى الفصل عند الطور الأول (
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يحدد البروتوكول المقدم هنا طريقة قوية للحقن المجهري وتصوير الخلايا الحية لبويضات الفأر ، مما يتيح تصور ديناميكيات الكروموسوم أثناء الانقسام الاختزالي بدقة زمنية ومكانية عالية. من الأمور الحاسمة لنجاح هذا النهج التعامل الدقيق مع البويضات طوال كل مرحلة من مراحل الإجراء ، من الجمع والحقن المجهري إلى التصوير. البويضات حساسة للغاية للتقلبات البيئية ، ويمكن أن تؤدي الانحرافات في درجة الحرارة أو الأس الهيدروجيني أو الأسمولية إلى الإضرار بسلامتها الفسيولوجية وإمكاناتها التنموية.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
تم تمويل هذا العمل من قبل صندوق البروفيسور كريستوفر تشين للوقف ، وتمويل الشركات الناشئة من كلية الطب ، جامعة كوينزلاند ، ومنح مشروع المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (APP1078134 و APP1103689) لسهام.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| محاقن 1 مل | تيرومو | SS + 01T Tuberculin | محاقن لحقن PMSG دقيقة. |
| جل الاغاروز | إنفيتروجين | 16500500 | تستخدم للرحلان الكهربائي لهلام الحمض النووي والحمض النووي الريبي لفصل الأحماض النووية حسب الحجم ، لتتوافق مع تسلسل H2B-RFP |
| موقد الكحول | لابتيك | LW15557-01 | تستخدم للتعقيم وتحضير ماصة الفم. |
| وسائط الاستزراع البكتيري (مرق LB) | سيجما ألدريتش | L3022 | الوسط القياسي المستخدم لزراعة الإشريكية القولونية والثقافات البكتيرية الأخرى. |
| أطباق زراعة الخلايا (35 &مرة ؛ 10 مم و 60 × ؛ 15 مم) | سيجما ألدريتش | CLS430165 ، CLS430166 | تستخدم لزراعة البويضات. متوفر بأحجام مختلفة. |
| جهاز طرد مركزي (منضدة) | إيبندورف | 5424ص | جهاز طرد مركزي مضغوط لأحجام العينات الصغيرة التي يشيع استخدامها في مختبرات الأبحاث. |
| أنابيب الطرد المركزي (15 مل و 50 مل) | كورنينج | 352096, 352070 | أنابيب أكبر للطرد المركزي ، يشيع استخدامها لمعالجة الخلايا والبروتين. |
| كلوروفورم | سيجما ألدريتش | سي 2432 | مذيب شائع الاستخدام في بروتوكولات البيولوجيا الجزيئية ، خاصة في استخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي. |
| حاضنة CO2 | سانيو | (الموديل: MCO-18AIC) | حاضنة مصممة للحفاظ على جو ثاني أكسيد الكربون المتحكم فيه لزراعة البويضات. |
| إبر فائقة النعومة يمكن التخلص منها (27 جم &مرات ؛ 1/2 بوصة) | هانكي ساس وولف | 4710004012 | إبر دقيقة لجمع البويضات |
| DNase I (خال من RNase) | ثيرمو فيشر العلمي | طراز EN0521 | إنزيم يستخدم لإزالة الحمض النووي الملوث من مستحضرات الحمض النووي الريبي. |
| كتلة تسخين جافة | أدوات المنح | (الموديل: QBD4) | كتلة تستخدم لتسخين العينات أو التفاعلات في درجات حرارة دقيقة دون الحاجة إلى الماء. |
| الإيثانول (درجة البيولوجيا الجزيئية) | سيجما ألدريتش | إ7023 | تستخدم لترسيب الحمض النووي والحمض النووي الريبي ، وكذلك في إجراءات التعقيم. |
| مقص تشريح دقيق | Met-App الأدوات العلمية والجراحية | 2235 | تستخدم لتشريح بويضات الفأر بدقة |
| ملقط ناعم | Met-App الأدوات العلمية والجراحية | 2127 | تستخدم لتشريح بويضات الفأر بدقة |
| نظام الرحلان الكهربائي للهلام | بيو راد | 1645050 | نظام لإجراء الرحلان الكهربائي للأحماض النووية أو البروتينات في المواد الهلامية. |
| كبريتات الجنتاميسين | سيجما ألدريتش | جي 1264 | المضادات الحيوية المستخدمة لمنع التلوث البكتيري في مزارع الخلايا. |
| ماصات باستور زجاجية (230 مم) | VWR | 6121702 | الماصات الزجاجية المستخدمة في ماصة فم البويضات |
| آي بي إم إكس | سيجما ألدريتش | ط5879 | مثبط فوسفوديستراز يستخدم للوقاية من GVBD |
| مجهر مقلوب | نيكون | مجهر مصمم لمراقبة الخلايا الحية أو الكائنات الحية من تحت طبق الاستزراع. | |
| زيت معدني خفيف مناسب لزراعة أجنة الفأر | سيجما ألدريتش | م 5310 | تستخدم لتغطية البويضات في المزرعة لمنع التبخر والحفاظ على درجة الحرارة. |
| كلوريد الليثيوم | سيجما ألدريتش | ل9650 | تستخدم في طرق ترسيب الحمض النووي الريبي. |
| نظام تصوير الخلايا الحية | لايكا | لاس إكس | نظام تصوير مصمم لمراقبة الخلايا الحية في الوقت الفعلي باستخدام تقنيات الفحص المجهري المتقدمة. |
| M16 متوسط (للثقافة في المختبر) | سيجما ألدريتش | م 7292 | وسيط مصمم لثقافة بويضات الفئران والأجنة وغيرها من التطبيقات في المختبر. |
| أنابيب الطرد المركزي الدقيق (0.6 مل و 1.6 مل) | نبتون | 3735.X ، 3745.X | أنابيب صغيرة الحجم للطرد المركزي ، وغالبا ما تستخدم في بروتوكولات البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية. |
| أنابيب الطرد المركزي الدقيق (خالية من RNase) | إيبندورف / نبتون | 022431081 (إيبندورف) | تعمل الأنابيب الخالية من RNase للحمض النووي الريبي على منع تدهور الحمض النووي الريبي. |
| إبر الحقن المجهري | أدوات سوتر | P-30 ماصة مجتذب | إبر للحقن الدقيق في البويضات |
| نظام الحقن المجهري | جهاز هارفارد | فيمتو جيت ، بيكو بامب | الأنظمة المستخدمة لحقن الحمض النووي الريبي المربي في بويضات الفئران بدقة عالية. |
| طقم Miniprep | كياجين | 27106 (طقم QIAprep Spin Miniprep) | مجموعة لعزل الحمض النووي البلازميد من الثقافات البكتيرية لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية. |
| مجموعة أنبوب شفاط الفم | سيجما ألدريتش | أ 5177 | لبويضات الشفط |
| بيليه الطلاء | ميرك ميليبور | 69049-3 | منتج لتصور تكوين الحبيبات أثناء الطرد المركزي. |
| الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزوميل | ثيرمو فيشر العلمي | 15593031 | محلول يستخدم في استخراج H2B-RFP لفصل الطور. |
| تشفير البلازميد H2B-RFP | أدجين | البلازميد # 20972 ؛ | البلازميد المستخدم لوضع العلامات على الكروموسومات باستخدام بروتين التألق الأحمر (RFP) ؛ |
| PMSG | بروسبيك | هور -272 | للبيضاوي الفائق للفأر |
| البروتيناز ك | ثيرمو فيشر العلمي | طراز EO0491 | إنزيم يستخدم لهضم البروتينات ، يشيع استخدامه في إجراءات استخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي. |
| إنزيم التقييد NotI | نيو إنجلاند بيولابس (NEB) | R3189S | إنزيم تقييد يستخدم في استنساخ الحمض النووي وتطبيقات البيولوجيا الجزيئية ، لخط البلازميد H2B-RFP. |
| مثبط RNase (اختياري) | نيو إنجلاند بيولابس (NEB) | طراز M0314S | يستخدم الإنزيم لمنع تدهور الحمض النووي الريبي أثناء التجارب المتعلقة بالحمض النووي الريبي. |
| قفازات خالية من RNase | VWR / فيشر العلمية | يختلف حسب الحجم | قفازات معالجة لمنع تلوث RNase ، وتستخدم في بروتوكولات معالجة الحمض النووي الريبي. |
| أطراف الماصة الخالية من RNase | أكسيجن / ثيرمو فيشر | تي -300-آر إس | أطراف الماصة المصممة لتكون خالية من تلوث RNase للتطبيقات المتعلقة بالحمض النووي الريبي. |
| Rمياه خالية من النياز | ثيرمو فيشر العلمي | طراز AM9932 | تنقية المياه لإزالة إنزيمات RNase ، وهي ضرورية لعمل الحمض النووي الريبي لتجنب التدهور. |
| SDS (10٪) | سيجما ألدريتش | L3771 | كبريتات دوديسيل الصوديوم المستخدمة في تغيير طبيعة البروتينات في الرحلان الكهربائي وغيرها من التجارب. |
| سير توبولين | سبيروكروم | SC002 | صبغة فلورية ترتبط على وجه التحديد بالتوبولين لتصوير الخلايا الحية للمغزل |
| أسيتات الصوديوم (3 م) | سيجما ألدريتش | ط7899 | تستخدم كمخزن مؤقت ولترسيب الحمض النووي في إجراءات البيولوجيا الجزيئية. |
| مقياس الطيف الضوئي | ثيرمو فيشر (NanoDrop) | ND-ONE-W | أداة تستخدم لقياس الأحماض النووية والبروتينات والمواد الأخرى عن طريق قياس الامتصاص. |
| المجهر المجسم | لايكا مايكرو سيستمز | م 165 ج | مجهر مصمم لمراقبة العينات في ثلاثة أبعاد بتكبير منخفض ، مفيد للتشريح. |
| وحدة تصفية الحقنة (0.22- & m) | ميرك | SLGP033RS | تستخدم للترشيح المعقم للسوائل ، خاصة في تطبيقات علم الأحياء الدقيقة والبيولوجيا الجزيئية. |
| المحاقن وتجميع الإبرة | تيرومو | SS + 01T محاقن السل | تستخدم لتسليم PMSG بدقة. |
| طقم T7 mMESSAGE mMACHINE | ثيرمو فيشر العلمي | ايه ام 1344 | مجموعة لنسخ الحمض النووي الريبي في المختبر من محفز T7 لتحضير H2B-RFP cRNA. |
| حمام مائي / كتلة تدفئة | أدوات المنح | QBD4 | تستخدم للحفاظ على درجات حرارة دقيقة في التجارب التي تتطلب حرارة. |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.