مقالة منهجية

تصوير الخلايا الحية لفصل الكروموسومات أثناء الانقسام الاختزالي لبويضات الفأر

DOI:

10.3791/68847

⸱

أكتوبر 10, 2025

 , 
1The Christopher Chen Oocyte Biology Research Laboratory, UQ Centre for Clinical Research, The University of Queensland

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نلخص تقنيات تصوير الخلايا الحية لدراسة فصل الكروموسومات في بويضات الفأر ، باستخدام H2B-RFP للكروماتين و SiR-Tubulin لتصور المغزل. نحن نفصل إعداد العينة ، والحقن المجهري ، والثقافة ، وإعداد التصوير ، والتحليل ، ونقدم دليلا عمليا لتحقيق تصوير عالي الدقة والحد الأدنى من السمية الضوئية لديناميكيات الكروموسوم الانتصافي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد الفصل الدقيق للكروموسوم أثناء انقسام البويضات أمرا ضروريا لضمان التطور الجنيني السليم ومنع الاضطرابات المرتبطة باختلال الصيغة الصبغية. أصبح تصوير الخلايا الحية جنبا إلى جنب مع تقنيات وضع العلامات الفلورية نهجا قويا لدراسة ديناميكيات الكروموسوم الانتصافي بدقة زمانية مكانية عالية. في هذا البروتوكول ، نلخص المنهجيات الرئيسية لتصور فصل الكروموسوم في بويضات الفأر الحية ، مع التركيز على استخدام هيستون H2B-RFP لوضع العلامات على الكروماتين و SiR-Tubulin لتتبع المغزل. نصف إجراءات تحضير العينة ، والحقن المجهري للرنا المرسال ، وزراعة البويضات ، وإعداد غرفة تصوير الخلايا الحية ، وإعدادات الفحص المجهري متحد البؤر ، وكلها محسنة لتحقيق تصوير عالي الدقة مع تقليل السمية الضوئية. علاوة على ذلك ، نسلط الضوء على الاعتبارات التجريبية الحاسمة مثل السمية الضوئية ومعالجة الصور والتحليل الكمي للأحداث الانتصافية. من خلال توفير تقييم شامل للمنهجيات الحالية ، يعمل هذا البروتوكول كدليل عملي للباحثين الذين يسعون إلى التحقيق في ديناميكيات الكروموسومات في البويضات الحية وتحسين دقة وقابلية التكاثر للدراسات الانتصافية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد التصور الدقيق لديناميكيات الكروموسومات والمغزل أثناء الانقسام الاختزالي للبويضات أمرا بالغ الأهمية لفهم الآليات التي تحكم نضوج الأمشاج الأنثوية وخطر اختلال الصيغة الصبغية1،2،3،4،5. تخضع بويضات الثدييات لسلسلة منسقة للغاية من الأحداث الانتصافية ، بما في ذلك انهيار الحويصلة الجرثومية (GVBD) ، وتكثيف الكروموسوم ، وتجميع المغزل ، والتقسيم غير المتماثل6. في حين أن التصوير الثابت للنقطة الزمنية قد قدم لقطات قيمة لهذه العمليات ، إلا أنه يفتقر إلى الدقة الزمنية ولا يمكنه التقاط الأحداث العابرة أو السريعة التي تحدث بين فترات أخذ العينات. في المقابل ، يوفر تصوير الخلايا الحية للكروموسومات والأنابيب الدقيقة الفلورية نهجا قويا لمراقبة هذه العمليات الديناميكية في الوقت الفعلي2،3،7. يسمح ذلك بالمراقبة المباشرة لتوقيت ومدة وتسلسل الأحداث الانتصافية داخل البويضات الفردية ، وتمكين تحديد الأحداث العابرة التي قد يتم تفويتها في العينات الثابتة. ومع ذلك ، فإن الحفاظ على بقاء البويضات وسلامتها الفسيولوجية أثناء الحقن المجهري والتصوير يتطلب معالجة دقيقة وظروف محسنة8.

يصف هذا البروتوكول سير عمل شامل للحقن الدقيق للبويضات في مرحلة الحويصلة الجرثومية للفأر (GV) باستخدام H2B-RFP cRNA ، مما يتيح وضع العلامات الفلورية للكروماتين ، متبوعا بالتصوير متحد البؤر بفاصل زمني للكروموسومات وسلوك المغزل طوال الانقسام الاختزالي4. تدمج الطريقة الخطوات الرئيسية بما في ذلك التحضير الهرموني ، وعزل البويضات ، والحقن المجهري في ظل ظروف درجة الحرارة الخاضعة للرقابة ، والتصوير الحي باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر مع التحكم البيئي4،9. الهدف العام من هذه الورقة هو تقديم سير عمل قوي وقابل للتكرار للتصور في الوقت الفعلي لديناميكيات الكروموسومات والمغزل في بويضات الفئران الحية ، مما يوفر منصة للتحقيق في الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء التنظيم الانتصافي ومخاطر اختلال الصيغة الصبغية.

في حين أن هذا البروتوكول يوفر دقة زمنية ومكانية عالية ، إلا أنه يعتمد على تعبير المراسل الخارجي ، والذي قد لا يكرر ديناميكيات البروتين الداخلي بالكامل ويمكن أن يتداخل مع عمليات الانتصافي الأصلي إذا تم التعبير عنه بشكل مفرط. يجب على الباحثين النظر في هذه القيود والتحقق من صحة النتائج باستخدام مناهج تكميلية حيثما أمكن ذلك.

تم تصميم هذا البروتوكول لدعم الدراسات التي تبحث في آليات الانقسام الاختزالي ، وأخطاء فصل الكروموسومات ، وتأثير الاضطرابات الجينية أو البيئية على جودة البويضات. يوفر منصة قوية لكل من البحث الأساسي والتطبيقات الانتقالية في علم الأحياء الإنجابي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجب إجراء جميع التجارب وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة أخلاقيات المحلية. يجب أن تلتزم الإجراءات التجريبية بشكل صارم بمبادئ 3Rs - الاستبدال والاختزال والتنقيح. يجب إيواء الفئران في منشأة حيوانية معتمدة في ظل ظروف بيئية موحدة (22 درجة مئوية ، رطوبة 60٪) مع إمكانية الوصول المجاني إلى الطعام والماء.

1. جمع البويضات وتحضيرها

ملاحظة: يجب أن تكون جميع المعدات والكواشف معقمة. قم بإجراء جميع عمليات التعامل مع البويضات باستخدام ماصة الفم تحت المجهر الفراغي (انظر جدول المواد). قم بتغطية جميع قطرات الزراعة المتوسطة بالزيت المعدني (الشكل 1A-E).

  1. التحفيز الهرموني
    1. حقن إناث الفئران البالغة من العمر 3-4 أسابيع داخل الصفاق مع 5 وحدات دولية (IU) من موجهة الغدد التناسلية لمصل الفرس الحامل (PMSG؛ انظر جدول المواد) قبل 46-48 ساعة من جمع البويضات.
      ملاحظة: يفضل B6CBAF1 الفئران (نسل F1 من C57BL / 6J × CBA / CaCrl) بسبب إنتاجية البويضات الفائقة وخصائص النضج المواتية.
  2. إعداد وسائل الإعلام الثقافية
    1. قم بتصفية وسائط M2 و M16 (انظر جدول المواد) باستخدام مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر. مكمل مع IBMX إلى تركيز نهائي قدره 100 ميكرومتر عن طريق التخفيف من مخزون 100 مللي مولار.
    2. قم بإعداد 5-6 قطرات من M2-IBMX (~ 30 ميكرولتر لكل منهما) و 3 قطرات من M16-IBMX في أطباق زراعة الأنسجة البلاستيكية مقاس 35 مم. تراكب جميع القطرات بالزيت المعدني. ضع أطباق M2-IBMX على كتلة ساخنة 37 درجة مئوية (الشكل 1 أ) وأطباق M16-IBMX في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل عزل البويضات (الشكل 1 ج).
    3. قم بإعداد طبق إضافي يحتوي على 800-1,000 ميكرولتر من M2-IBMX (بدون زيت) لتشريح المبيض. ضعه على لوح تسخين 37 درجة مئوية مثبت فوق مجهر مجسم (الشكل 1 ب).
  3. عزل البويضات
    1. التضحية بالفئران عن طريق خلع عنق الرحم. امسح أسفل البطن بنسبة 70٪ إيثانول ، ثم قم بعمل شق أفقي صغير في الجلد والصفاق لدخول التجويف البريتوني. قم بتمديد الشق عن طريق تفكيك حواف الشق بالأصابع.
    2. باستخدام الملقط ، امسح الأمعاء بعيدا عن الطريق لفضح المبايض في الجزء العلوي من البطن ، الموجود في القطب العلوي للكلى. باستخدام ملقط ناعم ومقص دقيق ، قم باستئصال المبايض بعناية مع تجنب تلف الأنسجة. انقل المبايض على الفور إلى أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على 100-200 ميكرولتر من وسط M2-IBMX الذي تم تسخينها مسبقا.
    3. انقل المبايض إلى 1 مل من وسط M2-IBMX المسخن مسبقا وانتقل إلى مرحلة مجهر التشريح الساخن (الشكل 1 ب). قم بإزالة الأنسجة الدهنية وبقايا قناة البيض بعناية.
      ملاحظة: تعامل مع المبايض برفق لمنع تلف البصيلات أو البويضات. حافظ على المبايض في وسط دافئ أثناء النقل من غرفة إلى المختبر.
    4. إطلاق مجمعات البويضات الركامية (COCs) عن طريق ثقب البصيلات باستخدام إبرة 27 جم (الشكل 1A-B). اجمع COCs ونقلها إلى قطرات 25-30 ميكرولتر من M2-IBMX (الشكل 1D).
    5. قم بفصل الخلايا الركامية عن طريق سحب العينة المتكرر باستخدام ماصة باستور زجاجية ضيقة التجويف (الشكل 1E).
      ملاحظة: على الرغم من استخدام سحب العينات الفموي بشكل شائع في التعامل مع البويضات، فإن الماصات الميكانيكية أو المتلاعبين الدقيقة توفر بدائل، خاصة في الأماكن التي تكون فيها سحب العينات عن طريق الفم مقيدا أو غير ممكن. تم استخدام هذه البدائل بنجاح في بروتوكولات مماثلة10،11.
    6. تحديد واختيار البويضات كاملة النمو في مرحلة الحواجز الجنسية بناء على قطر أكبر وموقع مركزي باستخدام مجهر متسهي بتكبير 20 × 40 ضعفا. انقله إلى 30 ميكرولتر من قطرات M2-IBMX على كتلة ساخنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية، محمية من الضوء.
      ملاحظة: حافظ على البويضات عند 37 درجة مئوية طوال جميع الإجراءات للحفاظ على السلامة الفسيولوجية. قم بتسخين جميع الوسائط مسبقا واستخدم مراحل التحكم في درجة حرارتها لجميع المناولة القائمة على المجهر والحقن المجهري.
    7. اترك البويضات تتعافى لمدة 20 دقيقة في مرحلة تسخين 37 درجة مئوية قبل الحقن المجهري.

2. إعداد H2B-RFP cRNA

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات وارتداء القفازات في بيئة نظيفة وخالية من RNase. استخدم فقط الماء والكواشف الخالية من RNase ، ويفضل العمل في وجود مثبطات RNase.

  1. تحقق من تسلسل البلازميد H2B-RFP (انظر جدول المواد) عن طريق تسلسل Sanger باستخدام البادئات التي تحيط بالإدخال. قم بتضخيم البلازميد عن طريق تحويل الإشريكية القولونية المختصة (على سبيل المثال ، DH5α) ، واختيار مستعمرة واحدة ، وزراعتها في مرق LB مع المضادات الحيوية المناسبة. قم بتنقية البلازميد باستخدام مجموعة إعداد ميدي أو ماكسي قياسية. للحصول على إجراءات مفصلة ، انظر Green and Sambrook12.
  2. قم بتنقية الحمض النووي للبلازميد باستخدام مجموعة أدوات التحضير الصغيرة التجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تحديد تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
  3. قم بخطية 2-4 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد في اتجاه مجرى الإدخال، باستخدام إنزيم تقييد مناسب يقطع مرة واحدة في العمود الفقري للناقل (تم استخدام NotI ل H2B-RFP). قم بإعداد تفاعل الهضم باستخدام المخزن المؤقت المناسب وتركيز الإنزيم كما هو موضح في الجدول 1 واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة. تأكد من الخطية الكاملة عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. تشير العصابات المتعددة إلى عدم اكتمال الهضم. إذا كنت تستخدم مجموعة تجارية ، فاتبع تعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: اختر إنزيم تقييد يقطع بدقة في اتجاه مجرى النهر وفي ظل ظروف الهضم المثلى. تحقق من الخطية عن طريق تشغيل حصة صغيرة على هلام الاغاروز.
  4. قم بإزالة تلوث RNase عن طريق احتضان تفاعل الهضم ب 1 ميكرولتر من البروتيناز K (10 ميكروغرام / مل) ، و 5.3 ميكرولتر من 10٪ SDS ، و 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز عند 50 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
    ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية للتخلص من ملوثات RNase والبروتين. استخدم الكواشف الخالية من RNase فقط وحافظ على ظروف عمل نظيفة.
  5. استخرج الحمض النووي المهضوم باستخدام الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزوميل (25: 24: 1) ، متبوعا باستخراج الكلوروفورم.
    ملاحظة: لتقليل السمية وتبسيط مناولة العينات، يمكن أيضا استخدام طرق التنقية القائمة على الأعمدة التجارية أو الخرزة (مثل غشاء السيليكا أو أنظمة الخرزة المغناطيسية) بدلا من استخراج الفينول/الكلوروفورم.
  6. قم بترسيب الحمض النووي بإضافة 3 M من أسيتات الصوديوم و 100٪ إيثانول. احتضان عند -80 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل.
  7. بيل الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي عند 12,000-14,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. اغسل الحبيبات بنسبة 70٪ إيثانول ، وقم بالطرد المركزي مرة أخرى بنفس السرعة لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وجففها في الهواء لفترة وجيزة (2-5 دقائق) ، وأعد تعليقها في 6 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase.
    ملاحظة: بعد ترسيب الإيثانول والطرد المركزي ، يجب أن تتشكل حبيبات شفافة أو بيضاء مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب. إذا لم يتم رؤية حبيبات ، كرر الطرد المركزي بسرعة أعلى أو أعد تقييم تركيز الحمض النووي.
  8. قم بإجراء النسخ في المختبر باستخدام مجموعة T7 mMESSAGE mMACHINE (انظر الجدول 2) ، باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
  9. احتضان تفاعل النسخ عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل. تمديد فترة الحضانة إذا تجاوز طول النسخة 5 كيلو بايت.
  10. قم بإزالة الحمض النووي للقالب عن طريق معالجة DNase باستخدام 1 وحدة من DNase I لكل حجم تفاعل 10 ميكرولتر ، محتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  11. تنقية الحمض النووي الريبوزي المركب المركب باستخدام ترسيب كلوريد الليثيوم13. بعد هطول الأمطار والطرد المركزي ، يجب أن تتشكل حبيبات شفافة أو بيضاء مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب. اغسل حبيبات الحمض النووي الريبي بنسبة 70٪ إيثانول.
  12. أعد تعليق حبيبات الحمض النووي الريبي (cRNA) النهائية في 20 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase. قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي وتأكد من وجود وطول ذيل البولي (A) عن طريق إجراء RT-PCR متبوعا بتسلسل منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قم بتقسيم الحمض النووي الريبي المربي إلى أحجام 1 ميكرولتر وتخزينها عند -80 درجة مئوية.

3. تحضير البويضات وحقنها المجهري

ملاحظة: طوال الإجراء، حافظ على البويضات عند 37 درجة مئوية باستخدام وسائط مسخنة مسبقا ومراحل مجهرية يتم التحكم في درجة حرارتها للحفاظ على جودة البويضات.

  1. اعداد
    1. قم بإذابة كميات H2B-RFP cRNA على الجليد ، وجهاز طرد مركزي لفترة وجيزة ، وتخفيفه إلى التركيز المطلوب (على سبيل المثال ، 250 نانوغرام / ميكرولتر).
      ملاحظة: قد يختلف التركيز الأمثل للحمض النووي الريبي (cRNA) اعتمادا على البناء ونظام التعبير والأهداف التجريبية. نوصي بمعايرة تركيز الحمض النووي الريبي (على سبيل المثال ، في حدود 50-300 نانوغرام / ميكرولتر) لتقليل القطع الأثرية المفرطة مع ضمان إشارة كافية. يجب على المستخدمين أيضا مراقبة التقدم الانتصالي (على سبيل المثال ، GVBD ، وتكوين المغزل ، وبثق الجسم القطبي) كقراءة وظيفية لصحة البويضات وقابليتها للبقاء بعد التعبير عن البناء. تم الإبلاغ عن أن تركيزات حقن الحمض النووي الريبي (cRNA) تتراوح عادة من 0.2 إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر ، مع تحقيق النتائج المثلى غالبا عند 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر2،3،4،5،7،8،9.
    2. قم بإعداد إبر الحقن الدقيق من الشعيرات الدموية الزجاجية للبورسليكات (OD = 1.5 مم ، المعرف = 0.86 مم ، الطول = 100 مم) باستخدام مجتذب الماصة (الشكل 2 أ).
      ملاحظة: نستخدم مجتذب ماصة عمودي (انظر جدول المواد؛ الشكل 2 أ). تحسين معلمات السحب تجريبيا. يجب أن يكون طرف الإبرة جيدا بما يكفي لتقليل تلف البويضات ولكن واسعا بما يكفي لتجنب الانسداد والسماح بتوصيل cRNA بسلاسة.
    3. قم بتحميل 0.5-1.5 ميكرولتر من محلول cRNA في طرف الإبرة باستخدام أطراف اللودر الصغير الخالية من RNase. قم بإزالة أي فقاعات هواء قبل الحقن.
  2. إعداد طبق الحقن المجهري
    1. قم بإعداد طبق حقن دقيق بسعة 100 ميكرولتر من وسط M2-IBMX وقم بتغطيته بالكامل بالزيت المعدني لمنع التبخر وتحولات الأسمولية.
  3. الحقن المجهري للبويضات
    1. قم بتركيب الماصات القابضة والحقن على نظام المعالج الدقيق (الشكل 2B,C).
    2. ضع طبق الحقن المجهري على مرحلة المجهر. باستخدام ماصة الفم ، انقل البويضات إلى قطرة M2-IBMX.
    3. أحضر الماصات القابضة والحقن إلى نفس المستوى الأفقي مثل البويضات.
    4. التقط بويضة واحدة باستخدام شفط لطيف باستخدام الماصة المثبتة (الشكلان 2B وC).
    5. أدخل إبرة الحقن من خلال المنطقة الشفافة وoolemma، مستهدفا السيتوبلازم وتجنب النواة.
    6. قم بتوصيل H2B-RFP cRNA باستخدام نبضة قصيرة من السعة السلبية من خلال مقياس كهربائي داخل الخلايا (الشكل 2B-E). حافظ على حجم الحقن حوالي 5٪ من حجم البويضة. عادة ما يكون الحقن الناجح مرئيا على أنه تشتت صغير ولكنه مميز للسيتوبلازم. اضبط ضغط الحقن وتوقيت الحقن لتجنب تلف الغشاء.
    7. اسحب الإبرة بسرعة وسلاسة بنفس الزاوية لتقليل تمزق الغشاء.
    8. حرر البويضة من الماصة القابضة وأعد وضعها في منطقة منفصلة من الطبق لتمييز البويضات المحقونة عن البويضات غير المحقونة (الشكل 2F). لهذا الإعداد ، قم بتنظيم سير العمل عن طريق الاحتفاظ بالبويضات غير المحقونة في الجزء العلوي من الطبق ونقل البويضات المحقونة إلى الأسفل.
    9. كرر الخطوات 3.3.4-3.3.8 لجميع البويضات المتبقية. تختلف معدلات البقاء على قيد الحياة بعد الحقن باختلاف خصائص التقنية والحمض النووي الريبوزي المرسال. توقع 60٪ -80٪ قابلية للحياة.
  4. التعامل مع ما بعد الحقن
    1. انقل البويضات المحقونة إلى قطرة جديدة من وسط M16-IBMX في طبق مزرعة نظيف.
    2. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1-4 ساعات للسماح بتعبير H2B-RFP. اضبط مدة الحضانة بناء على تركيز الحمض النووي الريبي (cRNA) وحجم النسخ وكفاءة التعبير.

4. تصوير الفاصل الزمني للكروموسومات المسماة ب H2B-RFP أثناء الانقسام الاختزالي

  1. إعداد المعدات والوسائط
    1. قم بتسخين حاضنة مرحلة المجهر متحد البؤر والغرفة البيئية إلى 37 درجة مئوية لمدة ≥ 30 دقيقة قبل الاستخدام (الشكل 3 أ). قم بتشغيل وحدة التحكم في الغاز وابدأ تدفق الغاز للحفاظ على الغرفة عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 والمحيط O2. تأكد من ترطيب الغرفة لدعم صحة البويضات أثناء التصوير الممتد للخلايا الحية.
    2. تحضير قطرات الثقافة: ضع 5-6 قطرات من 50 ميكرولتر من وسط M16 مكمل ب SiR-Tubulin (تركيز نهائي 100 نانومتر) في طبق بتري 35 مم. تراكب بالزيت المعدني. في طبق تصوير منفصل ذو قاع زجاجي ، ضع ثلاث قطرات 5 ميكرولتر من M16 + SiR-Tubulin وقم بتغطيتها بالزيت المعدني. قم بتسخين كلا الطبقين مسبقا على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ≥ 30 دقيقة قبل الاستخدام.
  2. نقل البويضات وغسلها
    1. غسل البويضات: نقل البويضات المحقونة بالتتابع من خلال قطرات M16 + SiR-Tubulin سعة 50 ميكرولتر لغسل بقايا IBMX (يوصى ب 5 غسلات). قم بإجراء الغسيل برفق لتجنب تلف البويضات.
      ملاحظة: يمكن أن يمنع IBMX المتبقي استئناف الانقسام الاختزالي، لذا فإن الغسيل الشامل أمر بالغ الأهمية.
    2. النقل النهائي: بعد الغسيل ، انقل 15-20 بويضة إلى قطرة 5 ميكرولتر من M16 + SiR-Tubulin في طبق التصوير ذو القاع الزجاجي المسخن مسبقا.
  3. إعداد المجهر
    1. تركيب طبق التصوير: ضع الطبق ذو القاع الزجاجي على مرحلة المجهر متحد البؤر (الشكل 3 أ). اترك البويضات تستقر لمدة ~ 10 دقائق.
    2. تحديد موضع المرحلة: باستخدام تصوير المجال الساطع ، مركز البويضات في مجال الرؤية. حفظ المواضع باستخدام برنامج المجهر.
      ملاحظة: في هذه الدراسة ، استخدمنا مجهر متحد البؤر Leica TCS SP8 مع عدسة موضوعية للغمر في الماء HC PL APO 20x / 1.0 NA. ومع ذلك ، يمكن استخدام أنظمة متحد البؤر والعدسات الشيئية الأخرى بمواصفات مماثلة حسب التوافر.
    3. إعداد مضخة المياه لأهداف الغمر في الماء: في حالة استخدام عدسة موضوعية لغمر الماء ، قم بتشغيل نظام مضخة المياه لتزويد المياه بشكل متقطع على فترات تتراوح من 5 إلى 10 دقائق. يحافظ هذا التدفق الدوري على عمود الماء بين العدسة وطبق التصوير ذو القاع الزجاجي ، مما يمنع الجفاف ويضمن ظروف تصوير مستقرة أثناء التجارب طويلة الأمد. بالنسبة لعدسات الغمر بالزيت، لا يلزم إعداد تدفق المياه هذا.
  4. إعدادات التصوير
    1. قم بالتبديل إلى وضع المسح بالليزر. اضبط شدة الليزر على النحو التالي: 561 نانومتر عند 0.5٪ (~ 100 ميكروواط عند الهدف) ل H2B-RFP (الكروموسومات) ؛ 633 نانومتر عند 3٪ (~ 300 ميكروواط عند الهدف) ل SiR-Tubulin (الأنابيب الدقيقة للمغزل ؛ الشكل 3 ب ، ه).
      ملاحظة: اتبع إرشادات سلامة الليزر المناسبة. قلل من التعرض لليزر لحماية صلاحية العينة.
  5. اكتساب Z-stack
    1. احصل على مكدسات Z تمتد من 30 إلى 50 ميكرومتر بحجم خطوة 2-4 ميكرومتر (الشكل 3 ب ، ج).
    2. التقط الصور على فترات تتراوح من 5 إلى 10 دقائق باستخدام سرعة مسح ضوئي تبلغ 600 هرتز (الشكل 3 ب ، د). يمكن أن تمتد فترات التصوير الإجمالية من 12 إلى 16 ساعة ، اعتمادا على المرحلة الانتصافية التي يتم مراقبتها ، وهي محدودة بالسمية الضوئية وتحمل البويضات لتمتد في الثقافة المختبرية.
  6. الحصول على الصور المتسلسلة
    1. في أنظمة المجهر ، قم بإجراء مسح متسلسل باستخدام كاشفين من HyD: H2B-RFP: الإثارة عند 561 نانومتر ؛ الانبعاثات التي تم جمعها عند 580-630 نانومتر ؛ إثارة SiR-Tubulin عند 633 نانومتر ؛ تم جمع الانبعاثات عند 650-700 نانومتر (الشكل 3E).
  7. بدء التصوير بفاصل زمني
    1. قبل البدء في الحصول على الفاصل الزمني طويل الأجل، تحقق من جودة الإشارة عن طريق التقاط صورة اختبار. يجب توزيع إشارات الفلورسنت بالتساوي: يجب أن يصنف H2B-RFP الكروماتين بوضوح ، ويجب أن يسلط SiR-tubulin الضوء على هياكل الأنابيب الدقيقة بدون خلفية مفرطة. تأكد من ثبات التركيز البؤري التلقائي والحد الأدنى من التبييض الضوئي في عمليات تصوير أولية قصيرة.
    2. ابدأ التصوير بفاصل زمني بالنقر فوق ابدأ.
      ملاحظة: GVBD ، الذي يشير إلى دخول المرحلة M ، يحدث عادة 60-90 دقيقة بعد غسل IBMX (الشكل 4 أ). في هذا الإعداد ، تقوم البويضات C57BL / 6 ببثق الجسم القطبي الأول حوالي 8-9 ساعات بعد GVBD (الشكل 4 أ). قد يختلف التوقيت باختلاف إجهاد الفأر وظروف الثقافة.

5. معالجة ما بعد التصوير

  1. افتح ملف التصوير في برنامج تحليل الصور عن طريق تحديد ملف > فتح واختيار ملف .lif من جلسة التصوير.
  2. قم بإنشاء إسقاطات Z لقنوات H2B RFP و SiR-Tubulin عن طريق تحديد المعالجة > إنشاء الإسقاط. قم بتعيين نوع العرض إلى الحد الأقصى لعرض الكثافة. حدد كل من قناتي RFP و SiR Tubulin، ثم انقر فوق تشغيل.
    ملاحظة لا تقم بإجراء إسقاط Z لقناة DIC ، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى عدم وضوح الصورة. بدلا من ذلك ، حدد وحدد مستوى DIC الفردي الأكثر تركيزا حدة. استخدم صورة DIC المركزة هذه جنبا إلى جنب مع إسقاطات الكثافة القصوى لقنوات H2B-RFP و SiR-Tubulin لتحقيق التصور الأمثل.
  3. استخرج مستوى بؤري واحد للمجال الساطع. ارجع إلى أدوات المعالجة وحدد تحرير > اقتصاص. اختر قناة Brightfield، واستخدم شريط تمرير Z للعثور على المستوى البؤري الأمثل، وانقر فوق تطبيق.
  4. ادمج صور العرض والحقل الساطع عن طريق فتح أدوات العملية، وتحديد دمج > إضافة قنوات. أضف إسقاط RFP وإسقاط SiR-Tubulin وصورة المجال الساطع الفردي. انقر بزر الماوس الأيمن فوق المجموعة المدمجة ثم انقر فوق تطبيق.
  5. قم بتصدير الصورة المدمجة النهائية عن طريق تحديد ملف > تصدير > صورة. اختر تنسيق TIFF للحصول على إخراج عالي الجودة وغير مضغوط.
    ملاحظة: يوصى بالتصدير بتنسيق TIFF للتحليل النهائي وإعداد الشكل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما هو موضح في الشكل 4 أ ، ب ، يتيح هذا البروتوكول تصويرا عالي الجودة للخلايا الحية للكروموسومات (H2B-RFP) والأنابيب الدقيقة للمغزل (SiR-tubulin) في البويضات ، وبالتالي توفير معلومات زمانية مكانية شاملة طوال فترة النضج الانتصافي.

تكشف قناة H2B-RFP في الشكل 4 أ عن جميع جوانب حركة الكروموسوم من المحاذاة الأولية بعد GVBD (الشكل 4 أ ، 03:00 - 08:00) إلى الفصل عند الطور الأول (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد البروتوكول المقدم هنا طريقة قوية للحقن المجهري وتصوير الخلايا الحية لبويضات الفأر ، مما يتيح تصور ديناميكيات الكروموسوم أثناء الانقسام الاختزالي بدقة زمنية ومكانية عالية. من الأمور الحاسمة لنجاح هذا النهج التعامل الدقيق مع البويضات طوال كل مرحلة من مراحل الإجراء ، من الجمع والحقن المجهري إلى التصوير. البويضات حساسة للغاية للتقلبات البيئية ، ويمكن أن تؤدي الانحرافات في درجة الحرارة أو الأس الهيدروجيني أو الأسمولية إلى الإضرار بسلامتها الفسيولوجية وإمكاناتها التنموية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل من قبل صندوق البروفيسور كريستوفر تشين للوقف ، وتمويل الشركات الناشئة من كلية الطب ، جامعة كوينزلاند ، ومنح مشروع المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (APP1078134 و APP1103689) لسهام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محاقن 1 ملتيروموSS + 01T Tuberculinمحاقن لحقن PMSG دقيقة.
جل الاغاروزإنفيتروجين16500500تستخدم للرحلان الكهربائي لهلام الحمض النووي والحمض النووي الريبي لفصل الأحماض النووية حسب الحجم ، لتتوافق مع تسلسل H2B-RFP
موقد الكحوللابتيكLW15557-01تستخدم للتعقيم وتحضير ماصة الفم.
وسائط الاستزراع البكتيري (مرق LB)سيجما ألدريتشL3022الوسط القياسي المستخدم لزراعة الإشريكية القولونية والثقافات البكتيرية الأخرى.
أطباق زراعة الخلايا (35 &مرة ؛ 10 مم و 60 × ؛ 15 مم)سيجما ألدريتشCLS430165 ، CLS430166تستخدم لزراعة البويضات. متوفر بأحجام مختلفة.
جهاز طرد مركزي (منضدة)إيبندورف5424صجهاز طرد مركزي مضغوط لأحجام العينات الصغيرة التي يشيع استخدامها في مختبرات الأبحاث.
أنابيب الطرد المركزي (15 مل و 50 مل)كورنينج352096, 352070أنابيب أكبر للطرد المركزي ، يشيع استخدامها لمعالجة الخلايا والبروتين.
كلوروفورمسيجما ألدريتشسي 2432مذيب شائع الاستخدام في بروتوكولات البيولوجيا الجزيئية ، خاصة في استخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي.
حاضنة CO2سانيو  (الموديل: MCO-18AIC)حاضنة مصممة للحفاظ على جو ثاني أكسيد الكربون المتحكم فيه لزراعة البويضات.
إبر فائقة النعومة يمكن التخلص منها (27 جم &مرات ؛ 1/2 بوصة)هانكي ساس وولف4710004012إبر دقيقة لجمع البويضات
DNase I (خال من RNase)ثيرمو فيشر العلميطراز EN0521إنزيم يستخدم لإزالة الحمض النووي الملوث من مستحضرات الحمض النووي الريبي.
كتلة تسخين جافةأدوات المنح (الموديل: QBD4)كتلة تستخدم لتسخين العينات أو التفاعلات في درجات حرارة دقيقة دون الحاجة إلى الماء.
الإيثانول (درجة البيولوجيا الجزيئية)سيجما ألدريتشإ7023تستخدم لترسيب الحمض النووي والحمض النووي الريبي ، وكذلك في إجراءات التعقيم.
مقص تشريح دقيقMet-App الأدوات العلمية والجراحية2235تستخدم لتشريح بويضات الفأر بدقة
ملقط ناعمMet-App الأدوات العلمية والجراحية2127تستخدم لتشريح بويضات الفأر بدقة
نظام الرحلان الكهربائي للهلامبيو راد1645050نظام لإجراء الرحلان الكهربائي للأحماض النووية أو البروتينات في المواد الهلامية.
كبريتات الجنتاميسينسيجما ألدريتشجي 1264المضادات الحيوية المستخدمة لمنع التلوث البكتيري في مزارع الخلايا.
ماصات باستور زجاجية (230 مم)VWR6121702الماصات الزجاجية المستخدمة في ماصة فم البويضات 
آي بي إم إكسسيجما ألدريتشط5879مثبط فوسفوديستراز يستخدم للوقاية من GVBD
مجهر مقلوبنيكونمجهر مصمم لمراقبة الخلايا الحية أو الكائنات الحية من تحت طبق الاستزراع.
زيت معدني خفيف مناسب لزراعة أجنة الفأرسيجما ألدريتشم 5310تستخدم لتغطية البويضات في المزرعة لمنع التبخر والحفاظ على درجة الحرارة.
كلوريد الليثيومسيجما ألدريتشل9650تستخدم في طرق ترسيب الحمض النووي الريبي.
نظام تصوير الخلايا الحيةلايكالاس إكسنظام تصوير مصمم لمراقبة الخلايا الحية في الوقت الفعلي باستخدام تقنيات الفحص المجهري المتقدمة.
M16 متوسط (للثقافة في المختبر)سيجما ألدريتشم 7292وسيط مصمم لثقافة بويضات الفئران والأجنة وغيرها من التطبيقات في المختبر.
أنابيب الطرد المركزي الدقيق (0.6 مل و 1.6 مل)نبتون3735.X ، 3745.Xأنابيب صغيرة الحجم للطرد المركزي ، وغالبا ما تستخدم في بروتوكولات البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية.
أنابيب الطرد المركزي الدقيق (خالية من RNase)إيبندورف / نبتون022431081 (إيبندورف)تعمل الأنابيب الخالية من RNase للحمض النووي الريبي على منع تدهور الحمض النووي الريبي.
إبر الحقن المجهريأدوات سوترP-30 ماصة مجتذبإبر للحقن الدقيق في البويضات
نظام الحقن المجهريجهاز هارفاردفيمتو جيت ، بيكو بامبالأنظمة المستخدمة لحقن الحمض النووي الريبي المربي في بويضات الفئران بدقة عالية.
طقم Miniprepكياجين27106 (طقم QIAprep Spin Miniprep)مجموعة لعزل الحمض النووي البلازميد من الثقافات البكتيرية لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية.
مجموعة أنبوب شفاط الفمسيجما ألدريتشأ 5177لبويضات الشفط
بيليه الطلاءميرك ميليبور69049-3منتج لتصور تكوين الحبيبات أثناء الطرد المركزي.
الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزوميلثيرمو فيشر العلمي15593031محلول يستخدم في استخراج H2B-RFP لفصل الطور.
تشفير البلازميد H2B-RFPأدجينالبلازميد # 20972   ؛البلازميد المستخدم لوضع العلامات على الكروموسومات باستخدام بروتين التألق الأحمر (RFP)   ؛
PMSGبروسبيكهور -272للبيضاوي الفائق للفأر 
البروتيناز كثيرمو فيشر العلميطراز EO0491إنزيم يستخدم لهضم البروتينات ، يشيع استخدامه في إجراءات استخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي.
إنزيم التقييد NotIنيو إنجلاند بيولابس (NEB)R3189Sإنزيم تقييد يستخدم في استنساخ الحمض النووي وتطبيقات البيولوجيا الجزيئية ، لخط البلازميد H2B-RFP.
مثبط RNase (اختياري)نيو إنجلاند بيولابس (NEB)طراز M0314Sيستخدم الإنزيم لمنع تدهور الحمض النووي الريبي أثناء التجارب المتعلقة بالحمض النووي الريبي.
قفازات خالية من RNaseVWR / فيشر العلميةيختلف حسب الحجمقفازات معالجة لمنع تلوث RNase ، وتستخدم في بروتوكولات معالجة الحمض النووي الريبي.
أطراف الماصة الخالية من RNaseأكسيجن / ثيرمو فيشرتي -300-آر إسأطراف الماصة المصممة لتكون خالية من تلوث RNase للتطبيقات المتعلقة بالحمض النووي الريبي.
Rمياه خالية من النيازثيرمو فيشر العلميطراز AM9932تنقية المياه لإزالة إنزيمات RNase ، وهي ضرورية لعمل الحمض النووي الريبي لتجنب التدهور.
SDS (10٪)سيجما ألدريتشL3771كبريتات دوديسيل الصوديوم المستخدمة في تغيير طبيعة البروتينات في الرحلان الكهربائي وغيرها من التجارب.
سير توبولينسبيروكرومSC002صبغة فلورية ترتبط على وجه التحديد بالتوبولين لتصوير الخلايا الحية للمغزل
أسيتات الصوديوم (3 م)سيجما ألدريتشط7899تستخدم كمخزن مؤقت ولترسيب الحمض النووي في إجراءات البيولوجيا الجزيئية.
مقياس الطيف الضوئيثيرمو فيشر (NanoDrop)ND-ONE-Wأداة تستخدم لقياس الأحماض النووية والبروتينات والمواد الأخرى عن طريق قياس الامتصاص.
المجهر المجسملايكا مايكرو سيستمز   م 165 جمجهر مصمم لمراقبة العينات في ثلاثة أبعاد بتكبير منخفض ، مفيد للتشريح.
وحدة تصفية الحقنة (0.22- & m)ميركSLGP033RSتستخدم للترشيح المعقم للسوائل ، خاصة في تطبيقات علم الأحياء الدقيقة والبيولوجيا الجزيئية.
المحاقن وتجميع الإبرةتيروموSS + 01T محاقن السلتستخدم لتسليم PMSG بدقة.
طقم T7 mMESSAGE mMACHINEثيرمو فيشر العلميايه ام 1344مجموعة لنسخ الحمض النووي الريبي في المختبر من محفز T7 لتحضير H2B-RFP cRNA.
حمام مائي / كتلة تدفئةأدوات المنحQBD4تستخدم للحفاظ على درجات حرارة دقيقة في التجارب التي تتطلب حرارة.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
  2. Wei, Z., Greaney, J., Loh, W. N., Homer, H. A. Nampt-mediated spindle sizing secures a post-anaphase increase in spindle speed required for extreme asymmetry. Nat Commun. 11 (1), 3393(2020).
  3. Zhou, C., Hancock, J. L., Khanna, K. K., Homer, H. A. First meiotic anaphase requires Cep55-dependent inhibitory cyclin-dependent kinase 1 phosphorylation. J Cell Sci. 132 (18), jcs233379(2019).
  4. Zhou, C., Homer, H. A. The oocyte spindle midzone pauses Cdk1 inactivation during fertilization to enable male pronuclear formation and embryo development. Cell Rep. 39 (5), 110789(2022).
  5. Zhou, C., Ye, Y., Homer, H. Using FRET to define Cdk1-dependent ordering of events during exit from second meiotic M-phase in oocytes. Methods Mol Biol. 2874, 99-114 (2025).
  6. Jones, K. T. Meiosis in oocytes: Predisposition to aneuploidy and its increased incidence with age. Hum Reprod Update. 14 (2), 143-158 (2008).
  7. Schuh, M., Ellenberg, J. Self-organization of MTOCs replaces centrosome function during acentrosomal spindle assembly in live mouse oocytes. Cell. 130 (3), 484-498 (2007).
  8. Verlhac, M. H., Lefebvre, C., Guillaud, P., Rassinier, P., Maro, B. Asymmetric division in mouse oocytes: with or without Mos. Curr Biol. 10 (20), 1303-1306 (2000).
  9. Schuh, M., Ellenberg, J. Self-Organization of MTOCs Replaces Centrosome Function during Acentrosomal Spindle Assembly in Live Mouse Oocytes. Cell. 130 (3), 484-498 (2007).
  10. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation, and ploidy assessment. J Vis Exp. (55), e2851(2011).
  11. Yoshida, N., Perry, A. C. F. Piezo-actuated mouse intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Nat Protoc. 2 (2), 296-304 (2007).
  12. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2012).
  13. Melton, D. A., Krieg, P. A., Rebagliati, M. R., Maniatis, T., Zinn, K., Green, M. R. Efficient in vitro synthesis of biologically active RNA and RNA probes. Nucl Acids Res. 12 (18), 7035-7056 (1984).
  14. Wei, Z., Greaney, J., Zhou, C., Homer, H. A. Cdk1 inactivation induces post-anaphase-onset spindle migration and membrane protrusion required for extreme asymmetry in mouse oocytes. Nat Commun. 9, 4029(2018).
  15. Davydenko, O., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Increased CDK1 activity determines the timing of kinetochore-microtubule attachments in meiosis I. J Cell Biol. 202 (2), 221-229 (2013).
  16. Swain, J. E., Pool, T. B. ART failure: oocyte contributions to unsuccessful fertilization. Hum Reprod Update. 14 (5), 431-446 (2008).
  17. Sun, Q. Y., Schatten, H. Regulation of dynamic events by microfilaments during oocyte maturation and fertilization. Reproduction. 131 (2), 193-205 (2006).
  18. Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
  19. Nakagawa, S., FitzHarris, G. Quantitative microinjection of morpholino antisense oligonucleotides into mouse oocytes to examine gene function in meiosis-I. Methods Mol Biol. 1457, 217-230 (2016).
  20. Courtois, A., Solc, P., Kitajima, T. S. Triple-color live imaging of mouse oocytes. Methods Mol Biol. 1818, 89-97 (2018).
  21. Kline, D. Quantitative microinjection of mouse oocytes and eggs. Methods Mol Biol. 518, 135-156 (2009).
  22. Yamagata, K., Suetsugu, R., Wakayama, T. Long-term, six-dimensional live-cell imaging for the mouse preimplantation embryo that does not affect full-term development. J Reprod Dev. 55 (3), 343-350 (2009).
  23. Rémillard-Labrosse, G., et al. Oocyte and embryo culture under oil profoundly alters effective concentrations of small molecule inhibitors. Front Cell Dev Biol. 12, 1337937(2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

H2B RFP SiR Tubulin mRNA

مقالات ذات صلة