مقالة منهجية

القياس الكمي لامتصاص الأحماض الدهنية البطانية باستخدام نظائر الأحماض الدهنية الفلورية

DOI:

10.3791/68859

⸱

أغسطس 15, 2025

 ,  , 
1Department of Biology, Union College, 2Department of Biology, University of North Carolina Chapel Hill, 3Department of Pathology & Laboratory Medicine and McAllister Heart Institute, University of North Carolina Chapel Hill

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل مقايسة في المختبر لقياس امتصاص الدهون الخلوية في الخلايا البطانية عند التحفيز باستخدام نظائر الفلورسنت BODIPY-C12 و BODIPY-C16 للأحماض الدهنية المشبعة طويلة السلسلة وطويلة السلسلة. هذه الطريقة فعالة وقابلة للتكيف مع أنواع الخلايا الأخرى ، مما يوفر نهجا مفيدا لدراسة التمثيل الغذائي للدهون.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب الخلايا البطانية (ECs) دورا مركزيا في تنظيم نقل الأحماض الدهنية (FA) من مجرى الدم إلى الأنسجة الأيضية ، ومع ذلك تظل أدوات تحديد كمية امتصاص EC FA بطريقة موثوقة وقابلة للتطوير محدودة. هنا ، نقدم اختبارا سريعا وكميا وفعالا من حيث التكلفة لقياس امتصاص FA في ECs باستخدام نظائر FA الفلورية (BODIPY-C12 و BODIPY-C16) ، والتي تسمح بالتحقيق في ديناميكيات الامتصاص الخاصة بطول السلسلة في شكل لوحة 96 بئرا. يشتمل البروتوكول على عناصر تحكم إيجابية (3-هيدروكسي إيزوبوتيرات ، لاكتات) وسالبة (نيكلوساميد) ويتم التحقق من صحته في كل من خطوط EC الأولية (HUVECs) والتخليد (EA.hy926). يكتشف الاختبار امتصاص FA المعتمد على الوقت والجرعة ، مع تطبيع النتائج إلى رقم الخلية باستخدام تلطيخ Hoechst النووي وتصحيحها للخلفية باستخدام عناصر التحكم المناسبة. يمكن تكييفه مع مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا وطرق التصوير والظروف التجريبية ، بما في ذلك تصوير الخلايا الحية وتنسيقات مطاردة النبض. بالمقارنة مع تلطيخ الدهون التقليدي أو أدوات التتبع ذات العلامات الإشعاعية ، توفر هذه الطريقة أمانا محسنا وسرعة وتنوعا أثناء التقاط امتصاص FA الديناميكي في الخلايا الحية. يوفر هذا الاختبار منصة قوية لدراسة تنظيم نقل الدهون البطانية ومساهمته في أمراض التمثيل الغذائي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لكي تدخل العناصر الغذائية المنقولة بالدم مثل الدهون إلى الأنسجة الأيضية ، مثل العضلات الهيكلية ، يجب عليها أولا عبور حاجز الخلية البطانية (EC) الذي يتكون من جدران الأوعية الدموية الشعرية. بينما كان يعتقد منذ فترة طويلة أن الأحماض الدهنية (FAs) تنتشر ببساطة عبر هذا الحاجز للوصول إلى الأنسجة الأساسية ، تشير الأدلة الناشئة إلى أن ECs تنظم هذه العملية بنشاط من خلال آليات نقل متخصصة تم تطويرها لنقل الجزيئات الكارهة للماء عبر العوالم المائية خارج الخلايا وداخلالخلايا 1.

في مجرى الدم ، توجد FAs إما كأحماض دهنية حرة مرتبطة بالألبومين (FFAs) أو يتم تعبئتها داخل البروتينات الدهنية الغنية بالدهون الثلاثية (TRLs) مثل الكيلوميكرون والبروتينات الدهنية منخفضة الكثافة (VLDLs) 2. على السطح اللمعي ل ECs ، يقوم ليباز البروتين الدهني (LPL) بتحلل TRLs لإطلاق FFAs لامتصاصها. تشارك مجموعة متنوعة من البروتينات في نقل FA ، بما في ذلك CD36 ، الذي يقوم بالامتصاص الفعلي ل FA في الخلية. بروتينات نقل الأحماض الدهنية (FATPs) وتركيبات acyl-CoA (ACSLs) ، التي تتوسط النقل المتجه. البروتينات الملزمة الدهنية (FABPs) ، والتي تعمل كمرافقات محبة للدهون ، وعدد لا يحصى من البروتينات الأخرى ، بعضها لم يتم اكتشافه وتصنيفهبعد 2،3. يستخدم النسيج الأساسي أيضا آليات مماثلة لتناول الدهون المنقولة ، على الرغم من أن الأشكال الإسوية المحددة الموجودة غالبا ما تختلف بناء على نوع الخلية.

أظهرت الدراسات الحديثة أن ECs تنسق مع الخلايا المجاورة من خلال إشارات paracrine لتعديل نقل FA إلى الأنسجة المستهدفة. على سبيل المثال ، تفرز الخلايا العضلية الهيكلية مجموعة من عوامل الباراكرين مثل 3-هيدروكسي إيزوبوتيرات (3-HIB) ، وعامل نمو بطانة الأوعية الدموية B (VEGFB) ، والأبيلين لتعزيز نقل FA عن طريق البطانةالقريبة 4،5،6. ومن المثير للاهتمام ، أن نظام الغدد الصماء قد يكون متورطا أيضا ، كما هو الحال عندما يحفز الأنسولين الخلايا الشحمية على إفراز اللاكتات ، مما يحفز أيضا ECs على تناول FAs7.

وبالتالي ، تعمل ECs كحراس بوابات معدلة للدهون ، مما يشير إلى أنها تلعب دورا رئيسيا في اضطرابات التمثيل الغذائي للدهون مثل أمراض القلب والأوعية الدموية أو مرض السكري من النوع 2. أظهرت الأدلة الحديثة أن ECs نفسها ستتراكم قطرات الدهون (LDs) استجابة للحمل الزائد للدهون ، مما قد يكون بمثابة مخزن مؤقت ينظم توصيل الأحماض الدهنية إلى الأنسجة الأساسية8،9. في حالة الاستهلاك العالي للدهون, كما هو الحال مع النظم الغذائية الحديثة, قد يساهم التراكم المفرط لهذه LDs في ضعف الأوعية الدموية والأمراض, بما في ذلك ارتفاع ضغطالدم 10. إجمالا ، قد يوفر لنا الفهم الأفضل لكيفية تناول ECs ونقلها FAs مقابض علاجية جديدة لمعالجة الأمراض المنقولة بالدهون.

في هذه الدراسة ، نصف فحصا بسيطا وسريعا وفعالا من حيث التكلفة لقياس امتصاص FA البطاني باستخدام نظائر FA طويلة السلسلة الفلورية BODIPY-C12 و BODIPY-C16. هذه الكواشف غير مكلفة إلى حد ما وآمنة تماما ، خاصة بالمقارنة مع FAs المشعة أو الثقيلة المسماة بالنظائر الثقيلة ، والتي تم استخدامها تقليديا لقياس امتصاص الدهون الخلوية11،12. من المهم ملاحظة أن هذه الكواشف تختلف عن صبغة BODIPY "الحرة" غير المقترنة ، والتي تتراكم بشكل سلبي في المناطق الكارهة للماء من الخلية ، خاصة في LDs13. في المقابل ، فإن اقتران BODIPY بسلسلة FA أليفاتية (على سبيل المثال ، C12 أو C16) ينتج جزيئا يحاكي هيكليا FAs الأصلية طويلة السلسلة. يسمح هذا التعديل بقياس محدد لامتصاص الأحماض الدهنية الديناميكية في الخلايا ، بدلا من عكس تخزين الدهون داخل الخلايا أو تكوين القطيرات.

وتتمثل إحدى نقاط القوة الرئيسية لهذا النهج في مرونته. يمكن للباحثين استخدام أنواع الخلايا الأخرى ، وأوقات الحضانة المتغيرة ، ومجموعة من نظائر FA المترافقة ب BODIPY لدراسة الامتصاص المعتمد على طول السلسلة ، أو حتى الدهون الفلورية بشكل طبيعي مثل أحماض رابطة الدول المستقلة الدهنية14. بشكل عام ، سيوفر هذا البروتوكول للباحثين طريقة سهلة لاختبار امتصاص FA الخلوي في ظل ظروف متعددة ويمهد الطريق للإجابة على الأسئلة الأساسية في استقلاب الدهون والبيولوجيا البطانية وأمراض التمثيل الغذائي (الشكل 1).

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على جميع الخلايا البطانية المشتقة من الإنسان (HUVECs) المستخدمة في هذه الدراسة من مصادر متاحة تجاريا وغير محددة الهوية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والبائعين للاستخدام الأخلاقي للمواد البيولوجية البشرية. قم بتنفيذ جميع الخطوات في بيئة معقمة تحت غطاء التدفق الرقائقي. انظر جدول المواد للحصول على قائمة بجميع الكواشف والمعدات.

1. طلاء الجيلاتين للوحة 96 بئر

  1. قم بإعداد محلول جيلاتين 0.1٪ عن طريق تخفيف 25 مل من مخزون الجيلاتين 2٪ في 500 مل 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
  2. تخلط جيدا وتعقيمها بالترشيح باستخدام مرشح فراغ 0.2 ميكرومتر (أو الأوتوكلاف).
  3. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من الجيلاتين 0.1٪ إلى صفيحة سوداء ذات قاع شفاف 96 بئرا.
  4. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل أو من الناحية المثالية طوال الليل.

2. بذر الخلايا

  1. قم بإعداد تعليق أحادي الخلية من ECs في وسائط كاملة.
    1. تحضير وسائط كاملة عن طريق استكمال الوسط القاعدي المناسب بنسبة 10٪ مصل بقري للجنين و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (حجم / حجم لكليهما).
      ملاحظة: سيختلف الوسط القاعدي بناء على نوع الخلية المحدد ؛ في هذه الدراسة ، تم استخدام وسط نمو البطانة (EGM-2) ووسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco لخلايا HUVECs و EA.hy926 ، على التوالي.
  2. ماصة 100 ميكرولتر من الخلية معلقة في كل بئر بكثافة بذر تسمح للخلايا بالوصول إلى التقاء بحلول اليوم التالي.

3. إعداد كاشف العلاج وتطبيقه

  1. تحضير جميع الكواشف في PBS ثنائي التكافؤ (مع Ca2+ و Mg2+) وتسخينها مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
    1. قم بإعداد 3-HIB (التحكم الإيجابي) كحل عمل 20 ملم. قم بإذابة محلول المرق على ارتفاع 1 متر في ماء مقطر مزدوج وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    2. تحضير اللاكتات (التحكم الإيجابي) كمحلول عمل 20 ملم. قم بإذابة محلول المرق على ارتفاع 1 متر في ماء مقطر مزدوج وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    3. تحضير نيكلوساميد (تحكم سلبي) بتركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر. قم بإذابة محلول المخزون عند 10 ملي مولار في DMSO. قم بتخزينها في أحجام أصغر لتجنب التجميد والذوبان ، وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  2. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS ثنائي التسخين مسبقا.
  3. أضف 50 ميكرولتر لكل بئر من كاشف العلاج المناسب (3-HIB أو اللاكتات أو النيكلوزاميد) واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (للنيكلوزاميد) أو 60 دقيقة (ل 3-HIB واللاكتات).

4. BODIPY-FA: إعداد وتطبيق مجمع BSA

  1. قم بإعداد مجمعات BODIPY-FA: BSA عند تركيزات نهائية تبلغ 0.5 ميكرومتر أو 1 ميكرومتر أو 2 ميكرومتر في PBS ، باستخدام نسبة مولية 2: 1 FA: BSA. للحصول على محلول 2 ميكرومتر BODYPY-FA ، احتضن مع 1 ميكرومتر BSA خال من FA في PBS. بالنسبة ل 1 ميكرومتر من BODPY-FA ، استخدم 0.5 ميكرومتر BSA ، وهكذا. قم دائما بحماية المجمعات من الضوء أثناء الحضانة.
  2. احتضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق قبل الاستخدام.
  3. أضف 50 ميكرولتر من المركب إلى الآبار المعالجة.
    ملاحظة: استخدم الأعمدة العشرة الوسطى فقط لتجنب تأثيرات الحافة. احتفظ بالأعمدة الخارجية كعناصر تحكم في التألق الذاتي ، مع إضافة PBS فقط إلى هذه الآبار.
  4. احتضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة أو 5 دقائق أو 10 دقائق.

5. التبريد الفلوري والكشف عن الإشارات داخل الخلايا

  1. قم بإعداد 1 ميكرومتر من BSA الخالي من FA في PBS كمخزن مؤقت للغسيل وتسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
  2. قم بإزالة BODIPY-FA: BSA واغسل الطبق بالكامل مرتين باستخدام 50 ميكرولتر من BSA الخالية من FA 1 ميكرومتر الدافئة مسبقا في PBS. قم بإجراء كل غسلة لمدة 1.5 دقيقة.
  3. أضف 50 ميكرولتر من 0.08٪ Trypan Blue لإرواء التألق خارج الخلية.
  4. قم بقياس التألق داخل الخلايا على الفور باستخدام قارئ صفيحة دقيقة بالإعدادات التالية: الإثارة: 488 نانومتر ، الانبعاث: 515 نانومتر ، القطع: 495 نانومتر ، الوضع: القراءة السفلية.
    ملاحظة: اطرح خلفية التألق الذاتي باستخدام آبار العمود الخارجي التي تحتوي على خلايا لم تتم معالجتها باستخدام BODIPY-FA في الخطوة 4.

6. تلطيخ Hoechst النووي لتطبيع الخلايا

  1. قم بإزالة محلول Trypan Blue واغسله برفق باستخدام PBS.
    ملاحظة: قد تكون الخلايا هشة إلى حد ما وعرضة للانزلاق. توخي الحذر عند الغسيل.
  2. أضف 4 ميكروغرام / مل Hoechst في وسائط 10٪ واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: قد يتطلب وقت حضانة Hoechst التحسين. اعتمادا على نوع الخلية ، قد تكون هناك حاجة إلى 5 دقائق إلى 60 دقيقة لتحقيق وضع العلامات النووية الموحدة وكثافة الإشارة الكافية. لا تقم بإضافة Hoechst إلى الأعمدة الخارجية.
  3. اغسل الطبق مرة واحدة باستخدام PBS.
  4. أضف PBS جديدا وقم بقياس مضان Hoechst باستخدام الإعدادات التالية: الإثارة: 350 نانومتر ، الانبعاث: 461 نانومتر ، القطع: 455 نانومتر ، الوضع: القراءة السفلية.
    ملاحظة: اطرح خلفية التألق الذاتي Hoechst باستخدام آبار العمود الخارجي.
  5. تطبيع مضان BODIPY-FA إلى رقم الخلية عن طريق قسمة القيم المصححة بالتألق الذاتي من الخطوة 5.3 على قيم Hoechst المقابلة التي تم الحصول عليها في الخطوة 6.4. استخدم القيم المصححة في الخلفية لكل من إشارات BODIPY و Hoechst.
    ملاحظة: تمثل القيم النهائية امتصاص BODIPY-FA الذي تم تطبيعه إلى رقم الخلية ، وتم تصحيحه للتألق الذاتي في كل من قنوات BODIPY و Hoechst.

7. التحليل الإحصائي

  1. قم بإجراء تحليل إحصائي للشكل 2 باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه لتقييم تأثيرات الوقت والتركيز وتفاعلها. قم بتطبيق اختبار Tukey اللاحق للمقارنات المتعددة.
  2. بالنسبة للشكل 3 والشكل 4 ، استخدم اختبار t ثنائي الذيل غير المقترن للطالب عند مقارنة شرطين. بالنسبة للتجارب التي تتضمن ثلاثة شروط أو أكثر ، استخدم ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار Dunnett للمقارنات المتعددة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما هو موضح في الشكل 1 ، يستخدم هذا الاختبار تنسيق لوحة 96 بئرا حيث يتم زرع ECs مباشرة في الآبار. يتم اقتران FAs المسمى BODIPY مع ألبومين مصل الأبقار (BSA) ويتم تطبيقه على كل من الآبار التجريبية والآبار الضابطة. قبل علاج FA ، يمكن التلاعب ب ECs من خلال العلاجات الدوائية أو الاضطرابات الجينية مثل تعداء الحمض النووي الريبي أو تحرير الجينات كريسبر. بشكل حاسم ، تسمح مثل هذه التلاعبات أيضا بإدراج ضوابط إيجابية وسلبية مناسبة لضمان موثوقية المقايس.

لوحظت زيادة واضحة تعتمد على الجرعة والوقت في إشارة BODIPY-C12 داخل الخلايا بعد احتضان BODIPY-C12 عند 0.5 ميكرومتر و 1 ميكرومتر و 2 ميكرومتر لمدة دقيقة واحدة و 5 دقائق و 10 دقائق في كل من خلايا HUVECs و EA.hy926 (الشكل 2). لحساب الاختلافات المحتملة في عدد الخلايا لكل بئر ، تم تطبيع قيم BODIPY-C12 إلى تلطيخ Hoechst النووي وقياسها بالفلورسنت. تم تصحيح التألق الذاتي في الخلفية باستخدام آبار التحكم الخالية من BODIPY و no-Hoechst.

للتحقق من صحة قابلية الاختبار والاستنساخ والمدى ، تم اختبار معدلات التمثيل الغذائي للأحماض الدهنية المعروفة في EA.hy926 ECs باستخدام BODIPY-C12 (الشكل 3). عزز العلاج 1-H بتركيزات متزايدة من اللاكتات (0 ملي مولار ، 5 ملي مولار ، 20 مل) أو 3-HIB (0 ملي مولار ، 5 ملي مولار ، 20 مل) امتصاص BODIPY-C12 بطريقة تعتمد على الجرعة ، مما يؤكد أدوارها كمنظمات إيجابية لامتصاص FA. على العكس من ذلك ، فقد ثبت سابقا أن مادة النيكلوساميد الكيميائية يمكن أن تمنع امتصاص الأحماض الدهنية عن طريق فصل الميتوكوندريا15. في الواقع ، تم استنساخ نتائج مماثلة هنا ، حيث أن 30 دقيقة من العلاج بالنيكلوزاميد (1 ميكرومتر) قللت بشكل كبير من إشارة BODIPY-C12 بالنسبة للتحكم في السيارة ، مما يثبت فائدتها كعنصر تحكم سلبي. بينما يتم تطبيع هذه البيانات إلى Hoechst لحساب أي اختلافات في عدد الخلايا ، لم يغير أي من هذه العلاجات صلاحية الخلية أو قيم مضان Hoechst.

من أجل تقييم قدرة الاختبار على التكيف مع نظائر الأحماض الدهنية المختلفة ، تم إعطاء BODIPY-C16 ، والذي يمكن اعتباره وكيلا لحمض دهني طويل السلسلة جدا ، إلى HUVECs ، وتم قياس امتصاصه بعد حضانات لمدة 5 دقائق (الشكل 4). لوحظ أن معالجة اللاكتات (0 ملي مولار ، 10 ملي مولار ، 20 ملليمتر) زادت من إشارة BODIPY-C16 بطريقة تعتمد على الجرعة ، بينما قلل النيكلوساميد (1 ميكرومتر) من الإشارة ، مما يعكس النتائج التي لوحظت مع BODIPY-C12.

بشكل عام ، أتاح هذا الاختبار القياس الكمي القوي والقابل للتكرار لامتصاص FA في كل من ECs الأولية (HUVEC) والخالدة (EA.hy926). علاوة على ذلك ، توضح هذه النتائج تعدد استخدامات الاختبار عبر FAs بأطوال سلسلة مختلفة ، بالإضافة إلى إظهار صحة كل من الضوابط الإيجابية والسلبية.

figure-results-1
الشكل 1: تخطيطي لمقايسة امتصاص الأحماض الدهنية باستخدام الأحماض الدهنية المسماة BODIPY. يتم زرع الخلايا البطانية في صفيحة سوداء ذات قاع شفاف مكون من 96 بئرا وتحضنها بنظائر الأحماض الدهنية المترافقة (FA) BODIPY لتمكين الامتصاص داخل الخلايا. بعد الحضانة ، يتم إخماد التألق خارج الخلية باستخدام Trypan Blue ، ويتم قياس الإشارة داخل الخلايا باستخدام قارئ صفيحة مضان للقراءة السفلية. يتم تطبيق صبغة Hoechst النووية بعد قياس التألق لتحديد عدد الخلية للتطبيع. يمكن تطبيق العلاج الدوائي أو الاضطرابات الجينية قبل حضانة BODIPY-FA. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: القياس الكمي لامتصاص BODIPY-C12 في الخلايا البطانية الأولية والخالدة. (أ) الزيادة المعتمدة على الوقت والتركيز في امتصاص BODIPY-C12 في HUVECs بعد حضانات دقيقة واحدة و 5 دقائق و 10 دقائق عند 0.5 ميكرومتر و 1 ميكرومتر و 2 ميكرومتر BODIPY-C12 مركب إلى 0.25 ميكرومتر و 0.5 ميكرومتر و 1 ميكرومتر بدون FA BSA ، على التوالي. (ب) أظهرت خلايا EA.hy926 امتصاصا مشابها يعتمد على الوقت والجرعة BODIPY-C12 في ظل ظروف متطابقة. تم تطبيع متوسط شدة التألق إلى النوى الملطخة ب Hoechst (رقم الخلية) وضوابط عدم وجود BODIPY. تم إجراء التحليل الإحصائي ±باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه لتقييم تأثيرات الوقت والتركيز وتفاعلها ، متبوعا باختبار Tukey اللاحق للمقارنات المتعددة. لوحظت تأثيرات رئيسية كبيرة على الوقت (ص < 0.0001) ، والتركيز (ص < 0.0001) ، وتفاعلها (ص = 0.0443). يشار إلى المقارنات الزوجية ذات الدلالة الإحصائية التي تم تحديدها بواسطة اختبار Tukey على الرسم البياني الشريطي على النحو التالي: * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001 ، و **** p < 0.0001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: التحقق من صحة الفحص باستخدام الضوابط الإيجابية والسلبية في EA.hy926. (أ) أدى علاج اللاكتات لمدة 1 ساعة (0 ملي مولار ، 5 ملي مولار ، 20 ملم) إلى زيادة امتصاص BODIPY-C12 بطريقة تعتمد على الجرعة. (ب) 1-ساعة 3-HIB العلاج (0 ملي مولار ، 5 ملي مولار ، 20 مل) زاد بالمثل من امتصاص FA. (ج) قمع علاج النيكلوساميد لمدة 30 دقيقة (1 ميكرومتر) بشكل كبير امتصاص BODIPY-C12 بالنسبة للتحكم في السيارة (DMSO). تم تطبيع متوسط شدة التألق إلى النوى الملطخة ب Hoechst (رقم الخلية) وضوابط عدم وجود BODIPY. يتم عرض البيانات كمتوسط ± SD. تم تحضين 2 ميكرومتر BODIPY-C12 (معقد إلى 1 ميكرومتر من BSA الخالي من الأحماض الدهنية) لمدة 5 دقائق لجميع التجارب. تم تحديد إحصائيات (أ) و (ب) باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Dunnett للمقارنات المتعددة ، و C باستخدام اختبار T ثنائي الذيل غير المزدوج للطالب. ص < 0.0001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: التحقق من صحة الفحص باستخدام BODIPY-C16 في HUVECs. (أ) علاج اللاكتات (0 ملي مو، 10 ملليمتر، 20 ملي مولار لمدة ساعة) عزز امتصاص BODIPY-C16 بطريقة تعتمد على الجرعة. (ب) المعالجة بالنيكلوساميد (1 ميكرومتر لمدة ساعة واحدة) قلل بشكل كبير من إشارة BODIPY-C16 مقارنة بالتحكم المعالج بالمركبة. تم تطبيع متوسط شدة التألق إلى النوى الملطخة ب Hoechst (رقم الخلية) وضوابط عدم وجود BODIPY. يتم عرض البيانات كمتوسط ± SD. تم تحضين 2 ميكرومتر BODIPY-C16 (معقد إلى 1 ميكرومتر من BSA الخالي من الأحماض الدهنية) لمدة 5 دقائق لجميع التجارب. تم تحديد إحصائيات (أ) باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Dunnett للمقارنات المتعددة ، وبالنسبة ل B باستخدام اختبار T ثنائي الذيل غير المتزاوج للطالب. * ص < 0.05 ، *** ص < 0.001 ، و **** ص < 0.0001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا الاختبار طريقة سريعة وكمية وفعالة من حيث التكلفة لقياس امتصاص FA في ECs باستخدام تنسيق قائم على لوحة 96 بئرا ونظائر FA طويلة السلسلة الفلورية. من خلال دمج كل من الضوابط الإيجابية والسلبية والتحقق من الصحة عبر ECs الأولية (HUVECs) والخالدة (EA.hy926) ، يوضح هذا البروتوكول المتانة وقابلية التكرار وقابلية التطبيق على نطاق واسع.

لعبت التحليلات القائمة على التألق دورا أساسيا في الكشف عن منظمات paracrine لنقل الدهون البطانية ، كما ذكرنا سابقا4،5،7. تسلط هذه الأمثلة الضوء على كيف يمكن للنظام الموحد الاستمرار في توضيح التنظيم المدفوع بالمستقلبات لنقل الدهون بشكل موثوق به في بيئة مختبرية خاضعة للرقابة. يحدد البروتوكول الموصوف هنا معلمات رئيسية لقياسات امتصاص FA الموثوقة ، بما في ذلك استخدام BODIPY-C12 و BODIPY-C16 بتركيزات متعددة (0.5-2 ميكرومتر) وأوقات حضانة (1 دقيقة و 5 دقائق و 10 دقائق). كما أنه اكتشف بشكل فعال زيادة الامتصاص استجابة ل 3-HIB واللاكتات ، وانخفاض الامتصاص بعد العلاج بالنيكلوساميد ، مما يؤكد حساسيته ومداه الديناميكي. على الرغم من تحسينه هنا ل ECs ، يمكن تكييف هذا الاختبار بسهولة مع أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا الشحمية أو الأنابيب العضلية أو خلايا الكبد مع تعديلات على نسب BODIPY: BSA وظروف العلاج. يمكن أيضا تعديله لتصوير الخلايا الحية باستخدام لوحات متوافقة أو تكييفه في تنسيق مطاردة النبض لتقييم الاحتفاظ بالجليلة الجلدية داخل الخلايا أو التمثيل الغذائي أو التدفق.

بالمقارنة مع الأساليب الأخرى ، توفر هذه الطريقة مزايا مميزة: فهي قابلة للتطوير وكمية وقابلة للتكيف مع أطوال سلسلة FA المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، فهو فعال من حيث التكلفة ، ولا يتضمن سوى عدد قليل من الخطوات ، ويتطلب أدوات ليست أكثر تعقيدا من قارئ الألواح الدقيقة الشائعة ، مما يسمح للمستخدمين الجدد ، بما في ذلك الطلاب ، بإتقان هذا البروتوكول بسرعة. أخيرا ، على عكس الطرق المستندة إلى الفحص المجهري النوعي أو بقع نقطة النهاية مثل Oil Red O ، والتي تعكس محتوى الدهون التراكمي ، يلتقط هذا البروتوكول امتصاص FA في الوقت الفعلي دون الحاجة إلى التثبيت أو التحلل.

ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى العديد من القيود. لا يلخص استخدام نظام الاستزراع الثابت ثنائي الأبعاد التعقيد الفسيولوجي للبيئة الوعائية. العوامل الرئيسية مثل إجهاد القص أو تحلل الدهون بوساطة LPL ، وكذلك التفاعلات البطانية المتني ، غائبة عن هذا النموذج المبسط. الأنظمة المتقدمة ، مثل الثقافات ثلاثية الأبعاد القائمة على الموائع الدقيقة أو العضوية ، تحاكي بشكل أفضل في الجسم الحي الهندسة المعمارية والإشارات ، على الرغم من أنها تتطلب خبرة فنية وبنية تحتيةأكبر 16،17. على سبيل المثال ، توفر المفاعلات الحيوية للموائع الدقيقة بيئة يمكن فيها للمركبات الكهربائية تقليد تكوين الأوعية الدموية الدقيقة والتفاعل مع أنواع الأنسجة الأخرى ، مما يسمح للباحثين بنمذجة ديناميكيات paracrine في بيئة أكثر فسيولوجية18. علاوة على ذلك ، أظهر العمل الأخير أنه يمكن تطوير أنظمة متخصصة لإجراء التصوير الفلوري الحي في مزارع الهيدروجيل ثلاثية الأبعاد19. توفر هذه التطورات الثقة في أن هذا الاختبار يمكن تكييفه يوما ما مع أنظمة زراعة الخلايا الأكثر تمثيلا من الناحية الفسيولوجية ، ولكن يجب إجراء التحسين.

باختصار ، يمثل هذا الاختبار نظاما أساسيا مرنا ويمكن الوصول إليه وقابلا للتكرار للتحقيق في امتصاص FA الخلوي في ظل ظروف متنوعة. في حين أنه الأنسب للدراسات الميكانيكية في المختبر ، إلا أن الأفكار المكتسبة من هذا النظام قد تفيد العمل المستقبلي باستخدام نماذج أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية لنقل الدهون البطانية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل تانيشا تشودري من خلال زمالة بحثية الصيفية الجامعية من مكتب أبحاث البكالوريوس في جامعة نورث كارولينا في تشابل هيل. تم دعم بوا كيم من قبل NHLBI (R56HL162660) و AHA (24CDA1264317). تم دعم أيون إبراهيم من قبل صندوق أبحاث أعضاء هيئة التدريس في كلية الاتحاد.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3-هيدروكسي إيزوبيوتيرات (3-HIB)شركة كايمان للكيماويات26105التحكم الإيجابي، تركيز نهائي 5 أو 20 ملليمول
لوحة دقيقة من البوليسترين باللون الأسود بحجم 96 بئر وقاعدة شفافةسيغما-ألدرتشCLS3603-48EAلاختبار خلايا الطلاء
بوديبي FL C12 (بوديبي-FA)ثيرمو فيشر العلميD3822حمض دهني أخضر فلوري طويل السلسلة
بوديبي FL C16 (بوديبي-FA)ثيرمو فيشر العلميD3821حمض دهني أخضر فلوري طويل السلسلة
محلول ألبومين مصل البقرسيغما-ألدرتشA9205-50MLيستخدم لتحضير مركب بوديبي:BSA
كبريتات ثنائي ميثيل (DMSO)سيغما-ألدرتشD2650المذيب لمخزون الأدوية
خزانات الأنابيب القابلة للتخلص من مرة واحدةVWR89094-680يحتوي على المحاليل المختلفة التي سيتم وضعها بالبيبت على الخلايا
دولبيكو' s Modified Eagle' س ميديومكورنينج لايف ساينسز10-013-CVوسائط لخلايا EA.hy926
خلايا EA.hy926ATCCCRL-2922 خط هجين خلوي بطانة الغلاف الخليد
EGM-2 متوسط نمو الخلايا البطانية-2 BulletKitلونزاCC-3162وسائط لأجهزة HUVEC
مصل البقر الجنيني (FBS) VWR97068-085مكمل 10٪ في EGM-2 وDMEM
قارئ الصفائح الدقيقة بالفلورةمختلفلا يوجدأي قارئ ميكروبليت قادر على قياسات فلوريسنس
محلول الجيلاتينسيغما-ألدرتشG1393-100mlيستخدم لتغطية الألواح بتركيز عمل 0.1٪
حل Hoechst 33342علوم الحياة62249صبغة نووية لتطبيع الخلية (4 μ M)
خلايا بطانة الأوردة السرية البشرية (HUVECs)لونزاC2519Aالخلايا البطانية البشرية الأولية
الماصبة متعددة القنواتVWR76627-768لصب الماصات في صفيحة بسعة 96 بئر
نيكلوساميد ميليبور سيغماN3510-50Gالتحكم السلبي، 1 & mu; M  التركيز النهائي
PBS، مع الكالسيوم والمغنيسيومفيشر ساينتيفك21031CVيستخدم لتحضير العلاجات وكمحلول غسيل (مع BSA)
PBS، بدون الكالسيوم والمغنيسيومجينيسي ساينتيفك25-508لتخفيف الجيلاتين، وتلوين هوشست، والغسولات العامة
البنسلين/الستربتوميسينثيرمو فيشر العلمي15140122مكمل 1٪ في EGM-2 وDMEM
الصوديوم L-لاكتاتسيغما-ألدرتشL7022-5Gالتحكم الإيجابي، تركيز نهائي 5 أو 20 ملليمول
محلول تريبان بلوسيغما-ألدرتشT8154-20MLيستخدم بنسبة 0.08٪ لإخماد الفلورة خارج الخلايا
أنظمة مرشح الفراغ، غشاء PES بسعة 500 مل، 0.45 وميكرو؛ mجين كلون25-227لتعقيم محلول الجيلاتين

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schwenk, R. W., Holloway, G. P., Luiken, J. J. F. P., Bonen, A., Glatz, J. F. C. Fatty acid transport across the cell membrane: regulation by fatty acid transporters. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 82 (4-6), 149-154 (2010).
  2. He, Q., Chen, Y., Wang, Z., He, H., Yu, P. Cellular uptake, metabolism and sensing of long-chain fatty acids. Front Biosci (Landmark Ed). 28 (1), 10(2023).
  3. Mashek, D. G., Coleman, R. A. Cellular fatty acid uptake: the contribution of metabolism. Curr Opin Lipidol. 17 (3), 274-278 (2006).
  4. Jang, C., et al. A branched-chain amino acid metabolite drives vascular fatty acid transport and causes insulin resistance. Nat Med. 22 (4), 421-426 (2016).
  5. Hagberg, C. E., et al. Vascular endothelial growth factor B controls endothelial fatty acid uptake. Nature. 464 (7290), 917-921 (2010).
  6. Hwangbo, C., et al. Endothelial APLNR regulates tissue fatty acid uptake and is essential for apelin's glucose-lowering effects. Sci Transl Med. 9 (407), eaad4000(2017).
  7. Ibrahim, A., et al. Insulin-stimulated adipocytes secrete lactate to promote endothelial fatty acid uptake and transport. J Cell Sci. 135 (5), jcs258964(2022).
  8. Kuo, A., Lee, M. Y., Sessa, W. C. Lipid droplet biogenesis and function in the endothelium. Circ Res. 120 (8), 1289-1297 (2017).
  9. Ibrahim, A., Arany, Z. Does endothelium buffer fat. Circ Res. 120 (8), 1219-1221 (2017).
  10. Kim, B., et al. Endothelial lipid droplets suppress eNOS to link high-fat consumption to blood pressure elevation. J Clin Invest. 133 (24), e173160(2023).
  11. Dubikovskaya, E., Chudnovskiy, R., Karateev, G., Park, H. M., Stahl, A. Measurement of long-chain fatty acid uptake into adipocytes. Methods Enzymol. 538, 107-134 (2014).
  12. Watkins, O. C., et al. Metabolism of 13C-labeled fatty acids in term human placental explants by liquid chromatography-mass spectrometry. Endocrinology. 160 (6), 1394-1408 (2019).
  13. Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. J Biomed Biotechnol. 2011, 598358(2011).
  14. Fraser, H., et al. Fatty acid uptake in diabetic rat adipocytes. Mol Cell Biochem. 167 (1-2), 51-60 (1997).
  15. Ibrahim, A., Yucel, N., Kim, B., Arany, Z. Local mitochondrial ATP production regulates endothelial fatty acid uptake and transport. Cell Metab. 32 (2), 309-319.e7 (2020).
  16. Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Opin Biotechnol. 25, 95-102 (2014).
  17. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-21 (2022).
  18. Maiullari, F., et al. Modeling breast cancer dynamics through modulable small vessel environment bioreactor (sVEB). Biomaterials. 323, 123441(2025).
  19. Murphy, A. R., Franco, R. A., Allenby, M. C. Fabricating microfluidic co-cultures of immortalized cell lines uncovers robust design principles for the simultaneous formation of patterned, vascularized, and stem cell-derived adipose tissue. Small. , e2501834(2025).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

BODIPY Fatty AcidEndothelial CellsFatty Acid Transport96 Well Plate AssayHoechst Nuclear StainingLive Cell ImagingDose Dependent UptakeMetabolic Disease

مقالات ذات صلة