تحليل R سهل الاستخدام وقوي لمجموعات البيانات واسعة النطاق

مع زيادة توافر مجموعات البيانات الكبيرة في المجال العلمي ، من المهم تطوير أدوات سهلة الاستخدام للسماح للباحثين بتحليل مجموعات البيانات الكبيرة هذه بسرعة بدقة وسهولة. يأتي أحد أنواع مجموعة البيانات الكبيرة الشائعة من استخدام جين لوسيفيراز كمراسل ، مما سمح بإجراء فحص سهل ومستمر وغير جراحي للتعبير الجيني في الخلايا الحية والكائنات الحية. أدت الأتمتة في تسجيل التلألؤ إلى تغيير قياس تلألؤ اللوسيفيراز وأدت إلى توسيع جمع البيانات ، على وجه الخصوص ، في مجال الساعة البيولوجية^1،2. باستخدام صفيحة دقيقة ذات 96 بئرا وقارئ لوحة أوتوماتيكي مع مكدس ، يمكن فحص آلاف العينات التي تعبر عن جين لوسيفيراز بشكل فردي في سلاسل زمنية ، أحيانا على فترات ساعة واحدة لأيام ، في تجربة واحدة. أدت هذه التجارب عالية الإنتاجية إلى إنتاج مجموعات بيانات كبيرة لم تستطع تجارب التعبير الجيني التقليدية باستخدام جمع العينات اليدوية ، متبوعة بمعالجة الحمض النووي الريبي ، تحقيقها. يعد تحليل مجموعات البيانات الكبيرة هذه في الوقت المناسب أمرا مهما ولكنه قد يكون صعبا.

على الرغم من وجود عدد كبير من الأدوات لتحليل البيانات من أجل الإيقاع ، إلا أن العديد من الأدوات تحلل المقايسات القائمة على سلوك بدلا من تعبير مراسل التلألؤ^{3،4،5،6،7} (الجدول التكميلي S1). تتطلب بعض الأدوات من الباحثين امتلاك مهارات برمجة الكمبيوتر السابقة ، مثل مهارات Python أو الوصول إلى MATLAB. تتطلب الأدوات الأخرى شراء البرامج ، والتي قد تكون مكلفة. تتوفر بعض الحلول العملية المجانية عبر الإنترنت. إحدى هذه الأدوات هي BioDare2⁸ ، والتي تقدم مجموعة متنوعة من الطرق المختلفة لتحليل بيانات الإيقاع. BioDare2 هي أداة سهلة الاستخدام عبر الإنترنت وتتطلب الحد الأدنى من الخبرة الحسابية. يحتاج المستخدمون إلى تحميل إدخال البيانات عبر الإنترنت وتنزيل إخراج البيانات من الواجهة عبر الإنترنت لمزيد من المعالجة.

هنا ، نقدم نصوص R سهلة الاستخدام مع إمكانات متعددة لتحليل مجموعات البيانات واسعة النطاق بسهولة. نحن نستخدم البرنامج المجاني مفتوح المصدر RStudio⁹ ، وهو واجهة ل R و Python ، لتشغيل البرامج النصية. يمكن استخدام RStudio على أنظمة الكمبيوتر المختلفة ، بما في ذلك Windows و Mac و Linux. في هذا التقرير ، يتم توفير تعليمات تفصيلية تدريجية لإرشاد المستخدمين حول كيفية استخدام البرامج النصية R ، وتحديدا في قسمي البروتوكول 1 و 2. تتطلب هذه الطريقة الحد الأدنى من الإدخال من المستخدم. يجب أن يكون المبتدئ الذي ليس لديه معرفة سابقة ب R وليس لديه خبرة في البرمجة قادرا على استخدام الطريقة لتحليل مجموعات البيانات الكبيرة من فحوصات لوسيفيراز أو أنواع أخرى من مجموعات البيانات مع بيانات السلاسل الزمنية. يتم تخزين جميع بيانات الإدخال والإخراج على جهاز كمبيوتر محلي ، وبالتالي ، يمكن إجراء تحليل في أي مكان دون تقييد الوصول إلى الإنترنت ، بمجرد تنزيل جميع حزم R ذات الصلة لأول مرة. يتم فرز بيانات الإخراج في مجلدات جيدة التنظيم مع النتائج الجاهزة للمعالجة للمنشورات. يتم تضمين التحليلات الإحصائية أيضا كجزء من المخرجات لتوفير تقييم سريع للاختلافات بين العينات. وبالتالي ، يمكن أن توفر طريقة R حلا سهلا وقويا للباحثين في تحليل مجموعات البيانات الكبيرة.

1. تحليل الساعة البيولوجية المستندة إلى لوسيفيراز

1. الإعداد التجريبي لمقايسة لوسيفيراز
   ملاحظة: مقايسة لوسيفيراز هي طريقة شائعة تستخدم لقياس نشاط الساعة البيولوجية في الوقت الفعلي. يمكن تسجيل اللمعان ، المنبعث من مراسل لوسيفيراز الذي تحمله الكائنات الحية و / أو الخلايا المعدلة وراثيا ، تلقائيا ، مما يؤدي إلى إنتاج مجموعات بيانات سلسلة زمنية واسعة النطاق. يستخدم مختبرنا في المقام الأول شتلات نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا التي تعبر عن جين لوسيفيراز كمراسل. يوضح الشكل 1 والشكل 2 مخططا انسيابيا للإعداد التجريبي النموذجي لمقايسة لوسيفيراز مع الشتلات بتنسيق 96 بئرا في مختبرنا ، تم تعديله بناء على الوصف السابق².
   1. قم بتعقيم البذور ببخار التبييض الناتج عن إضافة 3 مل من 36٪ (وزن / وزن) حمض الهيدروكلوريك إلى 100 مل من مبيض المنزل في دورق لمدة 3 ساعات. ضع الدورق في وعاء جرس بغطاء محكم الغلق ، يوضع في غطاء دخان كيميائي. بعد التعقيم ، قم بوضع البذور على ألواح 1/2 مللي ثانية تحتوي على 0.5٪ سكروز و 0.8٪ أجار (درجة الحموضة 5.7) ، باستخدام ماصة باستور زجاجية معقمة ، في خزانة تدفق صفحية. جمع النفايات الكيميائية في برطمان بغطاء والتخلص منها من خلال العمل مع قسم خدمات الصحة البيئية المؤسسية.
   2. ضع الألواح في 4 درجات مئوية لمدة يومين قبل نقلها إلى غرفة زراعة الأنسجة مع ضوء 12 ساعة ودورة ضوء داكن 12 ساعة (LD).
   3. دع الشتلات تنمو لمدة 4 أيام باللكافة.
   4. نقل الشتلات إلى طبق 96 بئرا ؛ كل بئر يحتوي على 180 ميكرولتر من وسائط الفحص (1/2 مللي ثانية ، 0.5٪ سكروز ، 0.4٪ أجار ، 0.25 ملي لوسيفيرين). ضع اللوحات لمدة يوم واحد في LD متبوعا بيوم واحد في 24 ساعة من الضوء المستمر (LL).
   5. أضف المعالجات أو المحلول الوهمي إلى الآبار وسجل اللمعان على فترات 1 ساعة لمدة 5-7 أيام في LL. اضبط عدسة مرشح الانبعاث على 3,600 للكسب ووقت الفاصل الزمني للقياس عند 1 ثانية.
      ملاحظة: يمكن أن يكون وقت بدء التسجيل في أي وقت. ومع ذلك ، نظرا لأن البرنامج النصي R يأخذ فقط أعدادا صحيحة (أعداد صحيحة) ، يجب أن تكون فترات التسجيل رقما صحيحا. على سبيل المثال ، يسمح بفاصل زمني مدته ساعة واحدة ، ولكن لا يسمح بفاصل زمني مدته 15 دقيقة للبرنامج النصي R.
   6. في نهاية التسجيل ، التقط صورة للوحة لتسجيل نمو الشتلات.
   7. احفظ البيانات الأولية كملف CSV لتحليل R ، باستخدام وظيفة الحفظ باسم مع برنامج تحليل البيانات لقارئ اللوحة.
2. شرح تدريجي لتحليل R لبيانات الساعة البيولوجية القائمة على لوسيفيراز
   ملاحظة: يستخدم تحليل R هذا البرنامج النصي Rالملف التكميلي 1(LUC_2025.R) ، تم تطويره لتحليل البيانات اليومية ، وملف الإدخالالملف التكميلي 2(NO7.csv). البرنامج النصي R جنبا إلى جنب مع ملف الإدخال متاح للجمهور عبر منصة المستودع عبر الإنترنت Github (https://github.com/elvenfire29/Circadian-Luciferase-Analysis).
   1. قم بتنزيل برنامج RStudio المتوافق مع نظام الكمبيوتر ^9,10.
   2. قم بتنزيل حزم خوارزميات RStudio المطلوبة بواسطة الملف التكميلي 1 (LUC_2025.R): MetaCycle¹¹: خوارزمية ARSER¹² من حزمة MetaCycle ، ggplot2¹³ ، dplyr¹⁴ ، magrittr¹⁵ ، stringr¹⁶ ، filesstrings¹⁷ ، التعميم¹⁸ ، AICcmodavg¹⁹ ، والمكنسة²⁰.
      ملاحظة: انظر أيضا الجزء العلوي من البرنامج النصي R للحصول على قائمة الحزم.
   3. قم بتغيير إدخال المستخدم I (وفقا لمجموعة بيانات محددة على جهاز كمبيوتر محلي ، بما في ذلك دليل العمل ، واسم ملف الإدخال ، وتسميات المعالجات ، ووقت البدء النسبي للمقايسة.
      ملاحظة: يجب إكمال الخطوتين 1.2.1 و2.2.1 مرة واحدة فقط؛ بعد ذلك تكون وحدة تحكم واجهة RStudio جاهزة لأخذ مدخلات المستخدم ، مع تعديلات لكل تحليل جديد. هناك جزءان في قسم إدخال المستخدم (الشكل التكميلي S1).
      1. حدد دليل العمل. حدد مكان وجود ملف الإدخال. سيكون نفس المجلد هو موقع ملفات الإخراج.
      2. حدد ملف الإدخال ، وهو ملف CSV منسق بشكل صحيح للبرنامج النصي R (الشكل 2 ب). على وجه التحديد ، يحتوي الصف العلوي على السلسلة الزمنية ، ويحتوي العمود الأول على مواضع عينة فردية على لوحة 96 بئرا.
         ملاحظة: يمكن العثور على مثال على ملف CSV للإدخال هذا في الملف التكميلي 2 (NO7.csv).
      3. قم بتسمية العينات و / أو العلاجات. نظرا لأن هذا التحليل يستخدم للبيانات التي تم الحصول عليها من 96 بئرا مع مسار زمني ، صمم التجارب على أنها 8 تكرارات لكل معالجة ليصبح المجموع 12 معالجة لكل لوحة ، أو 12 تكرارا لكل معالجة ليصبح المجموع ما يصل إلى 8 معالجات لكل لوحة. تأكد من إدخال العدد الصحيح للعينات ، إما 8 أو 12 ، لأن رقم العينة مهم. إذا لم يكن عدد العينات 8 أو 12، فلن يتم تشغيل التعليمات البرمجية. ومع ذلك ، إذا كانت هناك صفوف من الآبار الفارغة ، فما عليك سوى إدراجها على هذا النحو في مساحة أسماء المعالجة ، على سبيل المثال ، التسمية على أنها فارغة 1 ، فارغة 2 ...
         ملاحظة: بالنسبة لأسماء العينات، يجب على المرء تجنب استخدام الشرطة المائلة العكسية أو الرموز المماثلة لأنها قد تتسبب في حدوث مشكلات في اسم الملف. بالإضافة إلى ذلك ، يجب على المرء أيضا تجنب استخدام "NA" كتسمية عند اختيار استخدام ANOVA في إدخال المستخدم II. سيتم دمج أي علاجات تحمل نفس الاسم بالضبط في مجموعة علاج واحدة كبيرة.
      4. حدد وقت البدء النسبي للمقايسة. بالنسبة ليوم معين مدته 24 ساعة ، يكون الفجر الذاتي هو عندما يتم تشغيل ضوء الغرفة أثناء دورة الضوء / الظلام العادية. على سبيل المثال ، إذا كان الضوء مضاء في الساعة 7 صباحا ، فضع في اعتبارك هذه المرة الوقت اليومي 0. إذا بدأ اختبار لوسيفيراز في الساعة 9 صباحا ، فإن وقت الفحص يكون في الساعة البيولوجية 2 ؛ الإدخال 2 كوقت بدء نسبي.
         ملاحظة: يجب أن يكون وقت البدء النسبي رقما صحيحا ولا يمكن أن يكون سالبا. سيؤثر هذا على قراءة المرحلة للعينات.
   4. قم بتغيير خيارات إدخال المستخدم II حسب الاحتياجات المحددة.
      ملاحظة: توفر الإرشادات أدناه شرحا أكثر تفصيلا لأقسام إدخال المستخدم ودليلا تفصيليا لإجراء التغييرات.
      1. قم بتضمين الرسوم البيانية: منحنيات التلألؤ ، ومخططات الفترة ، والطور ، والسعة لكل نمط وراثي وعلاج.
      2. استخدم اختبار ANOVA مع Tukey HSD لمقارنة العلاجات على الدورة الشهرية والمرحلة والسعة. اختر عنصر تحكم لإخراج اختبار ANOVA ؛ حدد عنصر التحكم لاختبار ANOVA أو اترك الخيار فارغا لاستخدام كل معالجة كعنصر تحكم في المقارنة الزوجية. بدلا من ذلك، اختر ما إذا كنت تريد ترقيم ملفات إخراج ANOVA للرجوع إليها وتنظيمها بشكل أسرع.
      3. استخدم اختبار t لمقارنة العلاجات على الدورة الشهرية والمرحلة والسعة. اختر ما إذا كان يجب أن يكون اختبار t مقارنة زوجية ؛ إذا تم تحديد اختبار t الزوجي، فحدد ما إذا كانت البيانات مقترنة أم لا. اختيار عنصر تحكم لاختبار t; حدد عنصر التحكم لاختبار T أو اترك الخيار فارغا لاستخدام كل معالجة كعنصر تحكم. اختر ما إذا كنت تريد ترقيم ملفات إخراج اختبار t للرجوع إليها وتنظيمها بشكل أسرع.
         ملاحظة: يجب استخدام هذا فقط لمقارنة علاجين في وقت واحد ، مثل سطرين من نفس النمط الجيني مع إضافة SA أو Mock. لا يتم تعديل القيم p المعروضة لحساب المقارنات المتعددة مع نفس السطر.
      4. اختر ما إذا كنت تريد تقريب النقاط الزمنية. إذا كانت النقاط الزمنية متوقفة لمدة دقيقة أو دقيقتين فقط ، فقم بالتقريب إلى أقرب ساعة واستخدم هذا التحليل.
         ملاحظة: يحسب هذا الرمز الفترة والطور والسعة باستخدام طريقة ARS¹². تتطلب هذه الطريقة سلسلة زمنية متسقة بالساعات للتشغيل.
      5. اعتمادا على كيفية تسجيل قارئ اللوحة للآبار ، قم بتغيير طريقة قراءة الإدخال. اختر إما قائمة البيانات القياسية للآبار حسب A1 و A2 و A3 ... أو الآبار المدرجة في A1 ، B1 ، C1 ...
   5. قم بإجراء التحليل ببساطة عن طريق النقر فوق المصدر زر في الزاوية اليمنى العليا من وحدة التحكم.
      ملاحظة: يستغرق التحليل أقل من 1 دقيقة حتى يكتمل. سيظهر إخراج تحليل R تلقائيا في نفس مجلد الملف مثل مجموعة بيانات الإدخال.
   6. عرض المخرجات: يحتوي مجلد الإخراج على العديد من المستندات والمجلدات الفرعية لتوفير تحليل شامل ، بما في ذلك المعلومات الإحصائية لمتوسط الفترة والطور والسعة للتكرارات لكل نمط وراثي و / أو علاج.
      ملاحظة: بالنسبة للملف التكميلي 2 (NO7.csv) لملف المدخل، يرد في الجدول 1 وصف لقائمة بوثائق الإخراج التي تم إنشاؤها بواسطة البرنامج النصي للملف التكميلي 1 (LUC_2025.R) في القسم 1 من البروتوكول ويمكن عرضها بسهولة باستخدام بنية الشجرة في الشكل التكميلي S2.

2. فحص ROS القائم على الألومينول

1. الإعداد التجريبي لمقايسة ROS
   1. قم بقص أقراص الأوراق بقطر 4 مم من الأوراق الرابعة إلى السابعة للنباتات البالغة من العمر 25 يوما باستخدام مثقاب خزعة.
   2. قم بتعويم أقراص الأوراق بحيث يكون الجانب المشعر لأعلى فوق 100 ميكرولتر من الماء المعقم في صفيحة مكونة من 96 بئرا.
   3. قم بتغطية الطبق بورق قصدير نظيف وضعه في غرفة نمو LD طوال الليل.
   4. استبدل الماء ب 100 ميكرولتر من محلول اللومينول (300 ميكرومتر في 10 ملي مولار MOPS مع درجة الحموضة 7.4 ، و 1 ميكرومتر flg22 أو مستحضر آخر). استخدم المحلول الوهمي بدلا من flg22 كعنصر تحكم.
   5. ابدأ على الفور في تسجيل قراءات اللمعان كل دقيقة لمدة 40-60 دقيقة.
2. شرح تدريجي لتحليل R لبيانات ROS
   ملاحظة: يستخدم تحليل R هذا Rstudio ، والبرنامج النصي R ،  والملف التكميلي 3 (ROS_2025.R) ، وملفات الإدخال الملف التكميلي 4 (ROS_flg22.csv) أو الملف التكميلي 5 (ROS_elf26.csv). البرنامج النصي R جنبا إلى جنب مع ملف الإدخال الملف التكميلي 4 (ROS_flg22.csv) متاح للجمهور عبر منصة المستودع عبر الإنترنت Github (https://github.com/elvenfire29/ROS-Luminol-Analysis)
   1. قم بتنزيل حزم RStudio: gplot2¹³ و dplyr¹⁴ و magrittr¹⁵ و stringr¹⁶ و filesstrings¹⁷.
      ملاحظة: يجب إكمال الخطوات 2.2.1 مرة واحدة فقط. لمساعدة المستخدمين على تخصيص كل تحليل لمجموعة محددة من البيانات على الكمبيوتر ، تم إنشاء قسم يسمى "إدخال المستخدم" للسماح للمستخدمين بالإشارة إلى معلمات محددة لتجاربهم (الشكل التكميلي S3).
   2. قم بتغيير إدخال المستخدم I وفقا لمجموعة بيانات محددة على جهاز كمبيوتر محلي ، بما في ذلك دليل العمل واسم ملف الإدخال وتسميات المعالجات ووقت البدء النسبي للمقايسة.
      1. حدد دليل العمل. حدد مكان وجود ملف الإدخال. سيكون نفس المجلد هو موقع ملفات الإخراج.
      2. حدد ملف الإدخال ، وهو ملف CSV منسق بشكل صحيح للبرنامج النصي R (الشكل 2 ب). على وجه التحديد ، يحتوي الصف العلوي على السلسلة الزمنية ، ويحتوي العمود الأول على مواضع عينة فردية على لوحة 96 بئرا.
         ملاحظة: يمكن العثور على مثال على ملف CSV للإدخال هذا في المادة التكميلية ، الملف التكميلي 4 (ROS_flg22.csv) أو الملف التكميلي 5 (ROS_elf26.csv).
      3. قم بتسمية العينات و / أو العلاجات. نظرا لأن هذا التحليل يستخدم للبيانات التي تم الحصول عليها من 96 بئرا مع مسار زمني ، صمم التجارب على أنها 8 تكرارات لكل معالجة ليصبح المجموع 12 معالجة لكل لوحة ، أو 12 تكرارا لكل معالجة ليصبح المجموع ما يصل إلى 8 معالجات لكل لوحة. إذا كانت هناك صفوف من الآبار الفارغة ، فما عليك سوى إدراجها على هذا النحو في مساحة أسماء المعالجة ، على سبيل المثال ، التسمية على أنها فارغة 1 ، فارغة 2 ...
         ملاحظة: من المهم إدخال العدد الصحيح من العينات، إما 8 أو 12، لأن رقم العينة مهم. إذا لم يكن عدد العينات 8 أو 12، فلن يتم تشغيل التعليمات البرمجية. بالنسبة لأسماء العينات، تجنب استخدام الشرطة المائلة العكسية أو الرموز المشابهة لأنها قد تتسبب في حدوث مشكلات في اسم الملفات. تجنب أيضا استخدام "NA" كتسمية عند تحديد استخدام ANOVA في إدخال المستخدم II. على عكس البرنامج النصي للملف التكميلي 1 (LUC_2025.R) ، لا تتحد العلاجات التي تحمل نفس الاسم في مجموعة واحدة في هذا البرنامج النصي للملف التكميلي 3 (ROS_2025.R).
   3. قم بتغيير خيارات إدخال المستخدم II وفقا لاحتياجات المستخدم الخاصة.
      ملاحظة: يمكن رؤية مثال على مدخلات المستخدم في الشكل التكميلي S3.
      1. استخدم اختبار ANOVA مع Tukey HSD لمقارنة مجاميع تلألؤ المعالجة.
      2. استخدم اختبار t على الوجهين لمقارنة البيانات من علاجين فقط في وقت واحد.
         ملاحظة: لا يتم تعديل القيم p المعروضة لحساب المقارنات المتعددة مع نفس السطر.
      3. رسم بياني لمنحنيات التألق ورسم شريطي يقارن المجموع الكلي للفلورة. أضف الانحراف المعياري أو الخطأ المعياري للمتوسط إلى الرسوم البيانية.
      4. اعتمادا على كيفية تسجيل قارئ اللوحة للآبار ، قم بتغيير طريقة قراءة الإدخال. إما أن تستخدم قائمة البيانات القياسية للآبار بواسطة A1 و A2 و A3 ... أو الآبار المدرجة في A1 ، B1 ، C1 ...
3. قم بتشغيل التحليل ببساطة عن طريق النقر فوق الزر "المصدر" في الزاوية اليمنى العليا من وحدة التحكم.
   ملاحظة: يستغرق التحليل أقل من 1 دقيقة حتى يكتمل. سيظهر إخراج تحليل R تلقائيا في نفس مجلد الملف مثل مجموعة بيانات الإدخال.
4. عرض الإخراج: يحتوي مجلد الإخراج على العديد من المستندات والمجلدات الفرعية لتوفير تحليل شامل.
   ملاحظة: بالنسبة لملف الإدخال الملف التكميلي 4 (ROS_flg22.csv)، تظهر في الشكل التكميلي S4 بنية شجرية لوثائق الإخراج التي تم إنشاؤها بواسطة البرنامج النصي للملف التكميلي 3 (ROS_2025.R) الموضح في القسم 2 من البروتوكول.

دراسة الحالة 1. مقايسة اللمعان لنشاط الساعة البيولوجية مع شتلات نبات الأرابيدوبسيس

لقد أظهرنا سابقا أن جين البروتين المرتبط بالحمض النووي الريبي الغني بالجلايسين 7 (GRP7) تم التحكم فيه بواسطة بروتين الساعة الرئيسية CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1 (CCA1) والتعبير اليومي ل GRP7 مهم لدوره في الدفاع عن النبات ، باستخدام نباتات Col-0 المعدلة وراثيا التي تعبر عن مراسل لوسيفيراز تحت سيطرة محفز GRP7 من النوع البري (pGRP7wt: LUC) 21. قمنا بتحليل أنشطة الساعة البيولوجية لهذه النباتات المعدلة وراثيا جنبا إلى جنب مع محطة التحكم CCA1: LUC / Col-0 ، باستخدام البرنامج النصي R المسمى LUC_2025.R (الملف التكميلي 1 في قسم البروتوكول 1).

يحتوي ملف الإدخال المسمى NO7.csv (الملف التكميلي 2) على قراءات لمعان لسبعة خطوط pGRP7wt: LUC مستقلة وعنصر تحكم CCA1: LUC / Col-0 (الملف التكميلي 2 (NO7.csv)). بعد تشغيل البرنامج النصي ، سيتم إنشاء مجلد الإخراج الفرعي المسمى إخراج NO7 تحت نفس المجلد مثل ملف الإدخال NO7.csv (الملف التكميلي 2 (NO7.csv)). يتم وصف ملفات مجلد الإخراج NO7 في الجدول 1 ويمكن عرضها بسهولة باستخدام بنية الشجرة في الشكل التكميلي S2. تمت معالجة القيم الموجودة في مجلد إخراج NO7 بشكل أكبر لعمل الشكل 3 والشكل 4. يوضح الشكل 3 أن مراسل CCA1: LUC أظهر اتساعا قدره 3,000 RLU ، وفترة 23.5 ساعة ، ومرحلة 3.5 ساعات. وتتسق معلمات الساعة هذه إلى حد كبير مع التقاريرالسابقة 22،23. لوحظ نمط تعبير مختلف لخطوط pGRP7wt: Luc. في حين أن جميع خطوط pGRP7wt: LUC بدت متشابهة في الفترة والطور ، كانت هناك اختلافات في قيم السعة لهذه الخطوط ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى التأثير الموضعي للجينات المحورة في الكروموسومات. تم تأكيد هذه الملاحظات بشكل أكبر عندما تم حساب معلمات الفترة والسعة والطور عبر البرنامج النصي R (الشكل 4). للتحقق من صحة هذا التحليل ، تمت إعادة تحليل نفس مجموعة البيانات باستخدام BioDare2 ، وهي منصة مجانية عبر الإنترنت لتحليل البيانات اليومية8. كانت نتائج تحليل R قابلة للمقارنة مع تلك التي تم الحصول عليها من خوارزمية BioDare2 FFT-NLLS (NLLS) 8،24 (الشكل 4).

دراسة الحالة 2. مقايسة اللمعان لنشاط الساعة البيولوجية مع خلايا الثدييات
تم استخدام البرنامج النصي R LUC_2025.R (الملف التكميلي 1 بشكل أكبر لتحليل نشاط الساعة البيولوجية الذي تعرضه خلايا الثدييات25. خط خلية U2 OS الذي يعبر عن مراسل الساعة البيولوجية هو خط خلية نموذجي شائع الاستخدام لقياس أنشطة الساعة البيولوجية للثدييات26،27. أعدنا تحليل بيانات السلاسل الزمنية التي تم إنشاؤها باستخدام خلايا نظام التشغيل U2 التي تعبر عن مراسل Per2d: Luc المزروع في لوحة مكونة من 96 بئرا. تمت معالجة الخلايا بجزيئات siRNA التي تستهدف جينات معينة. يوضح الشكل 5 أن خلايا التحكم السلبية ، التي لم يتم معالجتها ب siRNA ، أظهرت فترة 23.3 ساعة ، ومرحلة 2.8 ساعة ، وسعة 184.8 RLU. كما هو متوقع ، أدى siRNA الذي يستهدف جين CRY2 إلى تثبيط السعة بشكل كبير وأثر على فترة ومرحلة المراسل. تقوم جينات PSMD4 و PSMD7 بتشفير البروتينات التي تعد جزءا من مكون غطاء البروتيازوم 26S لتحلل البروتين. تمشيا مع التقريرالسابق 25 ، يظهر تحليل R أن إسقاط PSMD4 أو PSMD7 بواسطة siRNA الخاص بهما لا يؤثر على معلمات الساعة. وبالتالي ، فإن نص R هذا قابل للتطبيق بسهولة على الأنظمة التجريبية المختلفة لدراسات الساعة البيولوجية.

دراسة الحالة 3. اختبار ROS للاستجابة الدفاعية
بالإضافة إلى مجموعات البيانات الكبيرة من فحوصات الساعة البيولوجية المضيئة ، يمكن تكييف البرنامج النصي R لتحليل أنواع البيانات الأخرى. نقدم هنا أحد هذه التطبيقات لقياس أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS). من المعروف أن النباتات قد طورت استراتيجيات مختلفة لمحاربة غزو مسببات الأمراض. تتمثل إحدى الاستراتيجيات في التعرف على الجزيئات غير الذاتية من العامل الممرض وبالتالي تنشيط الاستجابات المناعية الفطرية. إحدى هذه الاستجابات المناعية المبكرة هي انفجار ROS ، والذي يحدث في غضون دقائق عندما يواجه المضيف جزيئا غير ذاتي. تم إجراء اختبار ROS نموذجي باستخدام صفيحة 96 بئرا ، تحتوي على 12 قرصا من الأوراق لكل نمط وراثي لكل علاج (قسم البروتوكول 2). هنا ، تم استخدام جزيئين شائعين ، flg22 ، وهو ببتيد مكون من 22 حمض أميني مشتق من المنطقة المحفوظة من بروتينات السوط البكتيرية28 ، و elf26 ، وهو ببتيد مكون من 26 حمض أميني من عامل الاستطالة بروتينTu 29 ، للحث على انفجار ROS. تم تطوير البرنامج النصي ، الملف التكميلي 3 (ROS_2025.R) ، لتحليل بيانات ROS. يمكن تنزيل ملفين من ملفات CVS من فحوصات ROS ، الملف التكميلي 4 (ROS_flg22.csv) والملف التكميلي 5 (ROS_elf26.csv) ، اللذين تم تحويلهما إلى تنسيق تحليل R ، من قسم المواد التكميلية. بعد تحليل R ، يجب إنشاء مجلدات الإخراج في نفس المجلد مثل كل ملف إدخال في جهاز الكمبيوتر الخاص ، والذي يحتوي على منحنيات اندفاع ROS وإجمالي قيم ROS خلال وقت الفحص ، جنبا إلى جنب مع التحليلات الإحصائية (الشكل التكميلي S4). تمت معالجة البيانات بشكل أكبر لعمل الشكل 6. النتائج الموضحة هنا مشابهة لتلك المنشورة ، والتي تمت معالجتهايدويا 30.

الشكل 1: مخطط التدفق لمقايسة لوسيفيراز لتحليل R. تم تعقيم الشتلات التي تعبر عن مراسل لوسيفيراز مدفوعة بمروج الساعة وزراعتها على 1/2 وسائط MS في LD لمدة 4 أيام. تم نقل الشتلات إلى صفيحة 96 بئرا تحتوي على 180 ميكرولتر من وسط 1/2 MS يحتوي على D-luciferin. احتوى كل بئر على شتلة واحدة. بعد يوم واحد في LD متبوعا بيوم واحد في LL, تم تسجيل التلألؤ مع قارئ لوحة. عادة ما يتم تسجيل الشتلات الموجودة على اللوحة للتلألؤ في LL على فترات 1 ساعة لمدة 5-7 أيام. بعد التسجيل ، تم تصوير اللوحات لتقييم نمو الشتلات وتم حفظ البيانات الأولية كملف CSV لتحليل R. الاختصارات: LD = 12 ساعة ضوء / 12 ساعة داكنة ؛ LL = ضوء ثابت. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: مخطط التدفق للحصول على بيانات التلألؤ وتحليل R. (أ) تم تحديد إجراء من خمس خطوات لتحليل الساعة البيولوجية باستخدام البرنامج النصي R. الخطوة 1. قم بإجراء تجارب إما على شكل 8 أو 12 شتلة لكل نمط وراثي و / أو لكل علاج ؛ الخطوة 2. سجل اللمعان في LL بفاصل 1 ساعة لمدة 5-7 أيام ؛ الخطوة 3. الحصول على البيانات وتنسيقها في ملف CSV ؛ الخطوة 4. تحليل البيانات باستخدام R ؛ والخطوة 5. عرض بيانات الإخراج. يمكن أن يكون وقت بدء التسجيل في أي وقت. ومع ذلك ، نظرا لأن البرنامج النصي R يأخذ فقط أعدادا صحيحة (أعداد صحيحة) ، يجب أن تكون فترات التسجيل رقما صحيحا. (ب) لقطة شاشة لملف CSV مدخل منسق بشكل صحيح للبرنامج النصي R. يمكن العثور على ملف الإدخال الأصلي ، NO7.csv ، في الملف التكميلي 2. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: التعبير اليومي عن pGRP7wt: LUC في النباتات المعدلة وراثيا. تظهر آثار اللمعان ل pGRP7wt: LUC. تشير الأشرطة الموجودة أسفل المحور x إلى النهار الذاتي (الأشرطة المفتوحة) والليل (الأشرطة الرمادية). يبلغ متوسط تتبع اللمعان لكل نمط وراثي 12 تكرارا. لم يتم عرض أشرطة الخطأ بسبب العدد الكبير من المنحنيات. الاختصار: RLU = وحدات التلألؤ النسبي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: مقارنة بين بيانات الإخراج من البرنامج النصي R و BioDare2. تم تحليل نفس مجموعة البيانات الموضحة في الشكل 3 بواسطة البرنامج النصي R و BioDare2 لمعلمات الساعة البيولوجية والسعة والفترة والمرحلة. تمثل البيانات متوسط ± SEM (ن = 12). تشير الحروف المختلفة إلى اختلاف كبير بين العينات (P < 0.05; ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار HSD الخاص ب Tukey). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: تحليل نشاط الساعة البيولوجية مع خلايا الثدييات. تم وصف بيانات السلاسل الزمنية التي تم إنشاؤها باستخدام خلايا نظام التشغيل U2 التي تعبر عن مراسل Per2dLuc المزروع على لوحة 96 بئرا في DD مسبقا 25. تم استخدام جزيئات siRNA التي تستهدف CRY2 أو PSMD4 أو PSMD7 لعلاج الخلايا. (أ) آثار اللمعان. (ب) السعة والفترة ومرحلة per2d: لوك. تمثل البيانات متوسط ± SEM (ن = 3). تشير الأحرف المختلفة في اللوحة (B) إلى فرق كبير بين عنصر التحكم السلبي والعينة المعالجة ب siRNA (P<0.05; ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار HSD الخاص ب Tukey). الاختصار: RLU = وحدة التلألؤ النسبي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: تحليل انفجار ROS بواسطة R. تم تسجيل الشتلات لوحدة التلألؤ النسبية مباشرة بعد معالجتها ب 1 ميكرومتر flg22 (يسار) أو 1 ميكرومتر elf26 (يمين). (أ) بلغ متوسط آثار اللمعان من 12 شتلة لكل نمط وراثي (ن = 12) في دورة زمنية بعد الاستنباط. متوسط القيم لكل نمط وراثي لكل علاج هي جزء من ناتج R. (ب) متوسط عدد التلألؤ الكلي لكل نمط وراثي إما مع علاج flg22 أو elf26. تمثل البيانات متوسط ± SEM (ن = 12). تشير الحروف المختلفة إلى اختلاف كبير بين العينات (P < 0.05; ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار HSD الخاص ب Tukey). الاختصار: RLU = وحدة التلألؤ النسبي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: قائمة بوثائق المخرجات من تحليل R. هذه قائمة بمستندات الإخراج التي تم إنشاؤها بواسطة البرنامج النصي LUC_2025.R (الملف التكميلي 1) وملف الإدخال NO7.csv (الملف التكميلي 2).

الشكل التكميلي S1: لقطات شاشة للإدخال I و II في قسم البروتوكول 1. يجب تغيير إدخال المستخدم I لتخصيص التحليل لمجموعة بيانات معينة على جهاز كمبيوتر محلي. التغييرات التي يتم إجراؤها على إدخال المستخدم II اختيارية، وفقا للإعداد التجريبي. من المهم ملاحظة أن البرنامج النصي للملف التكميلي 1 (LUC_2025.R) يتوقع أن تكون جميع الآبار موجودة في الملف وليس فقط الآبار المختارة أو المستخدمة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي S2: هيكل الشجرة لوثائق الإخراج. تم إنشاء هذا الإخراج باستخدام البرنامج النصي LUC_2025.R (الملف التكميلي 1) وملف الإدخال NO7.csv (الملف التكميلي 2). يقوم البرنامج النصي LUC_2025.R بإنشاء مجلد إخراج استنادا إلى اسم ملف الإدخال. لمزيد من التفاصيل حول ملفات الإخراج ، راجع الجدول 1. تمثل المربعات مجلدات الملفات. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي S3: لقطات شاشة لإدخال المستخدم I وإدخال المستخدم II في القسم 2 من البروتوكول. يستخدم البرنامج النصي "الملف التكميلي 3 " (ROS_2025.R) نفس تنسيق الإدخال العام مثل البرنامج النصي "الملف التكميلي 1 " (LUC_2025.R). يجب تغيير إدخال المستخدم I لتخصيص التحليل لمجموعة بيانات معينة على جهاز كمبيوتر محلي. التغييرات التي يتم إجراؤها على إدخال المستخدم II اختيارية، وفقا للإعداد التجريبي. من المهم ملاحظة أن البرنامج النصي للملف التكميلي 3 (ROS_2025.R) يتوقع أن تكون جميع الآبار موجودة في الملف وليس فقط الآبار المختارة أو المستخدمة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي دال-4: بنية الشجرة لوثائق الإخراج. تم إنشاء هذا الإخراج باستخدام البرنامج النصي ROS_2025.R (الملف التكميلي 3) وملف الإدخال ROS_flg22.csv (الملف التكميلي 4). يقوم البرنامج النصي ROS_2025.R بإنشاء مجلد إخراج استنادا إلى اسم ملف الإدخال. يوجد داخل هذا المجلد ملف لإجمالي عدد ROS وملف للرسوم البيانية. هناك أيضا مجلدات فرعية لبيانات PRISM والرسوم البيانية واختبار ANOVA واختبارات t. تمثل المربعات مجلدات الملفات. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الجدول التكميلي S1: قائمة بأدوات المعلوماتية الحيوية المتاحة لتحليل البيانات اليومية. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: LUC_2025.R. هذا هو البرنامج النصي R المستخدم لتحليل بيانات الساعة البيولوجية. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: NO7.csv. هذا هو ملف الإدخال الذي يحتوي على مثال على بيانات الساعة البيولوجية. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: ROS_2025.R. هذا هو البرنامج النصي R المستخدم لتحليل بيانات ROS. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 4: ROS_fig22.csv. هذا هو ملف الإدخال الذي يحتوي على مثال على بيانات ROS. تم تحفيز ROS عن طريق علاج 1 ميكرومتر flg22. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 5: ROS_elf26.csv. هذا هو ملف الإدخال الذي يحتوي على مثال على بيانات ROS. تم إحداث ROS عن طريق علاج 1 ميكرومتر elf26. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.