مقالة منهجية

الكشف عن الحمض النووي في الموقع لطفيليات التريبانوزوماتيد و Nosema ceranae من خلال التحلل القلوي المقترن بنظام RPA / CRISPR / Cas12a

1.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68874

⸱

يوليو 18, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Group of Biochemical and Molecular Parasitology CTS-183, Department of Parasitology, University of Granada, 2Institute of Biotechnology, Faculty of Sciences, University of Granada, 3Apinevada S.L Parque Metropolitano Industrial de Granada

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

هنا ، نصف إجراء بسيطا وسريعا للكشف عن الحمض النووي من مسببات الأمراض النحل ، مثل Lotmaria passim و Nosema ceranae ، باستخدام تحلل الخلايا الجاهز للتضخيم ، وتضخيم البوليميراز المعاد تجميعه ، وفحوصات CRISPR / Cas12a.

الملخص

يعد الكشف المبكر في الموقع لمسببات الأمراض المجهرية أمرا ضروريا للإدارة الفعالة وصحة مستعمرات نحل العسل. حاليا ، المعيار الذهبي للكشف الجزيئي لمسببات الأمراض النحل هو qPCR أو RT-qPCR. هنا ، نقدم بديلا سريعا وحساسا وفعالا من حيث التكلفة للكشف عن مسببات الأمراض الحمض النووي القابل للنشر في الميدان. تجمع هذه الطريقة بين تحلل الخلايا المباشر الجاهز للتضخيم لبطون النحل العامل مع تضخيم البوليميراز المعاد تكيجيه (RPA) ، والانقسام عبر مجسات المراسل بوساطة CRISPR / Cas12a ، والكشف عن طريق فحوصات التدفق الجانبي. لقد نجحنا في التحقق من صحة هذا البروتوكول في نحل العسل المصاب ب Nosema ceranae و Lotmaria passim. يمكن تنفيذ البروتوكول الموصوف باستخدام كتلة حرارية بسيطة أو في درجة حرارة الغرفة ومن المحتمل أن يكون قابلا للتطبيق على أي مسببات الأمراض القائمة على الحمض النووي أو ميكروبات الأمعاء لنحل العسل. تستغرق العملية برمتها حوالي 180 دقيقة وتحقق حساسية مماثلة ل qPCR ، حيث تكتشف ما لا يقل عن 96 نسخة طفيلية / ميكرولتر. في الختام ، يوفر هذا النهج أداة واعدة للتشخيص الميداني الموثوق والسريع لعدوى نحل العسل دون الحاجة إلى معدات معملية معقدة ، مما يجعله مثاليا لمراقبة المستعمرات في الموقع.

المقدمة

النحل هو نوع رئيسي متورط في تلقيح النباتات وهو ضروري لتكاثر النباتات والتنوع البيولوجي والأمن الغذائي1. تستفيد خدمات التلقيح الخاصة بهم من مجموعة واسعة من المحاصيل ذات القيمة الاقتصادية العالية ، حيث تساهم بما يقدر بنحو 235-577 مليار دولار سنويا في الزراعة العالمية. ومع ذلك ، فإن الانخفاض العالمي في أعداد النحل أثار مخاوف جدية بسبب عواقبه المحتملة على الاستقرار البيئي وإنتاجية المحاصيل ، مما أدى إلى خسارة تقدر ب 4.8-16.3 مليار دولار في البلدان الفقيرة المثقلةبالديون 2. تتضمن كتلة اختفاء النحل تفاعلات متعددة بين عدة عوامل: استخدام مبيدات الآفات ، وفقدان الموائل ، وتغير المناخ ، والعدوى بمسببات الأمراض ، بما في ذلك الفيروسات والبكتيريا والفطريات والطلائعيات.

من بين هذه الكائنات الحية الدقيقة ، يتم توزيع Nosema spp. ، وهو فطر ميكروسبوريدي يزعج عمل الأمعاء ، وطفيليات المثقبيات - وخاصة Lotmaria passim - على نطاق واسع في مستعمرات نحل العسل في جميع أنحاءالعالم 3 ، 4. تظهر النتائج الحديثة أن عدوى L. passim ، حتى عندما لا تظهر عليها أعراض ، يمكن أن تقلل من تنظيم الجينات المرتبطة بالمناعة وتغير عملية التمثيل الغذائي للطاقة في نحل العسل ، مما قد يضر بمرونته تحت ضغط إضافي5. وبالمثل ، فإن Nosema spp. تقلل العدوى من طول عمر النحل ، وتثبط وظيفة المناعة ، وتعطل ديناميكيات البحث عن الطعام في المستعمرة ، مما يؤدي إلى انخفاض إنتاج العسل وزيادة وفيات المستعمرات. علاوة على ذلك ، فإن العدوى المصاحبة التي تشمل كلا من Nosema spp. وقد يكون للمثقبيات تأثيرات تآزرية ، مما يؤدي إلى تفاقم الإجهاد الفسيولوجي وإضعاف دفاعات المضيف. تؤكد هذه النتائج على أهمية مراقبة مسببات الأمراض المتعددة في وقت واحد.

تتطلب معالجة هذه التهديدات تطوير أدوات تشخيصية سريعة ودقيقة ، والتي تعتمد بدورها على فهم أعمق لاستراتيجيات البيولوجيا والانتقال والبقاء على قيد الحياة لهذه مسبباتالأمراض 6. يظل الكشف عن هذه مسببات الأمراض من خلال الطرق التقليدية ، بما في ذلك الفحص المجهري الضوئي والتضخيم الجزيئي ، موثوقا به ولكنه يواجه قيودا معينة. تم تطوير أمثلة على qPCR و RTqPCR (يتطلب ركوب الدراجات في درجات حرارة مختلفة) ، وطرق متساوية الحرارة ، مثل التضخيم بوساطة الحلقة (LAMP ، يعمل عند درجة حرارة ثابتة) ، للطفيليات الفطرية أو الفيروسية أو البكتيرية أو الأوليات6،7،8،9،10. ومع ذلك، فإن تنفيذ هذه الأساليب يحتاج إلى معدات متخصصة، إلى جانب موظفين مدربين ومرافق مختبرية مجهزة تجهيزا جيدا، مما يحد من عمليتها للتطبيقات الميدانية والرصد الواسع النطاق. لمعالجة هذه المشكلات ، تم تطوير تقنيات جزيئية جديدة - تضخيم أهداف الحمض النووي من خلال تضخيم البوليميراز المركب (RPA) ، جنبا إلى جنب مع الكشف المستند إلى CRISPR / Cas12a - وهو نهج سريع ومحدد وحساس. تعمل الطريقة متساوية الحرارة وتنتج نتائج بصرية تجعلها مناسبة للتشخيص في الموقع أو في نقطة الرعاية ، وفقا ل Shao et al.11 و Xiao et al.12.

RPA هي طريقة بسيطة وسريعة لتضخيم الحمض النووي تعمل عند درجة حرارة ثابتة ، عادة بين 37 درجة مئوية و 42 درجة مئوية. يعتمد على إنزيمات إعادة المؤتلفة ، والبروتينات الملزمة بالحمض النووي أحادية الشريطة ، والبوليميراز الذي يزيح الخيوط لتضخيم الحمض النووي دون الحاجة إلى دورة حرارية. تعتبر تقنية RPA مناسبة بشكل خاص للاختبار في الموقع والتشخيص الميداني نظرا لسرعتها والحد الأدنى من متطلبات المعدات وتوافقها مع العينات الخام11،12،13. لتعزيز الخصوصية ، يمكن اكتشاف منتج RPA باستخدام نوكلياز داخلي Cas12a ، والذي يعمل أيضا ضمن نفس نطاق درجة الحرارة. يرتبط Cas12a بالحمض النووي الريبي لتوجيه CRISPR (gRNA) ، وهو RNA قصير يوجه Cas12a نحو التسلسل المستهدف المضخم ويرتبط بالتسلسل التكميلي في الحمض النووي. عند الربط ، يتم تنشيط Cas12a ويظهر نشاط انقسام جانبي (عبر) ، وتحديدا ضد الحمض النووي أحادي الشريطة (ssDNA). يتيح ذلك استخدام جزيئات مراسل ssDNA المصنفة بالفلوروفورات أو البيوتين ، والتي يمكن أن تولد إشارات مضان أو مرئية ، بما في ذلك قراءات شريط التدفق الجانبي. تشكل RPA و CRISPR / Cas12a معا منصة تشخيص جزيئية قوية سريعة وحساسة ومناسبة للاستخدام في الإعدادات الميدانية أو محدودة الموارد12.

لزيادة تعزيز التطبيق العملي لنهج التشخيص الجزيئي هذا ، قمنا أيضا بتنفيذ طريقة مبسطة لتحلل الخلايا الجاهزة للتضخيم (ARCL) تعتمد على تحلل هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) لبطن النحل11،14 ، مما يلغي الحاجة إلى تحضير العينات على نطاق واسع والكواشف المختبرية. تتيح تقنية الاستخراج السريع للحمض النووي هذه ، جنبا إلى جنب مع التضخيم متساوي الحرارة ونظام الكشف CRISPR / Cas12a ، سير عمل قابل للنشر في الميدان يقلل بشكل كبير من الوقت والتكلفة. الأهم من ذلك ، أن الاختبار يحافظ على الجودة والحساسية العالية والخصوصية التي يمكن مقارنتها ب qPCR ، المعيار الذهبي الحالي للكشف عن مسببات الأمراض في النحل.

هنا ، قمنا بتطبيق هذه المنهجية بنجاح للكشف عن Nosema ceranae و L. passim في نحل العسل (الشكل 1). قمنا بمقارنة هذه الطريقة بمقايسات qPCR القياسية والتحقق من أدائها باستخدام عينات مصابة بشكل طبيعي. تظهر النتائج التي توصلنا إليها أن هذا النهج هو بديل عملي وموثوق للمراقبة الميدانية لصحة نحل العسل ، مع إمكانات قوية للمراقبة واسعة النطاق وجهود التدخل المبكر في تربية النحل.

البروتوكول

تم إجراء جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية للعمل مع اللافقاريات واستخدام أقل عدد من النحل اللازم لإثبات المفهوم. تم نقل نحل العسل في صناديق خلية متخصصة مع تهوية ودرجة حرارة مناسبة وتخزينها في المختبر عند -20 درجة مئوية حتى التحليل.

1. تحلل الخلايا القلوية HotSHOT

  1. تحضير الحل
    1. تحضير المخزن المؤقت HotSHOT Lysis بسعة 100 مل
      1. يزن 99.993 مجم من هيدروكسيد الصوديوم و 8.32 مجم من EDTA ، ويضاف 90 مل من الماء المقطر ويخلط. اضبط الرقم الهيدروجيني على 12 والحجم إلى 100 مل ؛ الأوتوكلاف.
    2. 40 ملي Tris-HCl ، درجة الحموضة 5
      1. إلى 484.544 مجم من تريس ، أضف 90 مل من الماء منزوع الأيونات ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 5 باستخدام حمض الهيدروكلوريك ، وارفع الحجم إلى 100 مل.
  2. بروتوكول التحلل
    1. قم بتشريح بطن النحلة باستخدام مشرط معقم وانقل الأنسجة المقطوعة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
      ملاحظة: للكشف عن مسببات الأمراض ، تم استخدام البطن فقط ، وتم التخلص من أجزاء الجسم المتبقية.
    2. أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت HotSHOT ، ونقع الأنسجة باستخدام مدقة يمكن التخلص منها ، وقم بتجانسها عن طريق الدوامة.
      ملاحظة: يمكن إعادة استخدام المدقة إذا تم تطهيرها عن طريق احتضان المادة طوال الليل في محلول هيدروكسيد الصوديوم 0.1 نيوتن ، ثم شطفها بماء مزدوج منزوع الأيونات ، متبوعا بدورة أوتوكلاف واحدة وتجفيف لاحق في حاضنة.
    3. احتضان التجانس عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتحلل الخلايا. بعد الحضانة ، ضع الأنبوب على الفور على الجليد ليبرد.
    4. لتحييد التفاعل ، أضف حجما متساويا (400 ميكرولتر) من 40 ملي مولار Tris-HCl ، مما ينتج عنه تركيز نهائي يبلغ 20 ملي مولار Tris-HCl في المحلول.
      ملاحظة: يتم توضيح إجراء التحلل هذا في الشكل 2.

2. تضخيم متساوي الحرارة بواسطة RPA

ملاحظة: تم تصميم البادئات بمساعدة أداة برنامج eprimer3 (https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/eprimer3) ، على الرغم من أنه يمكن استخدام أدوات تصميم أولية أخرى.

  1. إعداد حلول العمل
    1. حلول RPA التمهيدي
      1. تحضير محاليل المرق بتركيز 100 ميكرومتر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. على سبيل المثال ، أعد تكوين 10.0 نانومول من التمهيدي المجفف بالتجميد في 100 ميكرولتر من المياه المعالجة بثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) وتخزينها عند -20 درجة مئوية. تحضير محاليل العمل بتركيز 10 ميكرومتر عن طريق تخفيف المخزون 1:10 ؛ امزج 90 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC مع 10 ميكرولتر من محلول المخزون 100 ميكرومتر في أنبوب 0.2 مل. قم بتخزين هذه الحلول عند -20 درجة مئوية.
  2. بروتوكول RPA
    1. قم بإعداد المزيج الرئيسي وفقا لعدد ردود الفعل التي سيتم إجراؤها. قم بتضمين كل من التحكم السلبي (استبدال ARCL بالمياه المعالجة DEPC) والتحكم الإيجابي باستخدام الحمض النووي لمسببات الأمراض (في هذا المثال ، الحمض النووي من ثقافة الخلايا L. passim promastigotes والنحل إيجابي ل Nosema spp. (تم اكتشاف الجراثيم بواسطة الفحص المجهري)) (الجدول 1).
      ملاحظة: قم دائما بإعداد مزيج RPA الرئيسي على الثلج واستخدم أطراف المرشح لتجنب التلوث.
    2. انقل كمية 46.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى كل أنبوب 0.2 مل.
    3. أضف أسيتات المغنيسيوم (MgOAc) وقالب الحمض النووي إلى أغطية الأنابيب ، باتباع الأحجام المحددة في الجدول 2. قم بالطرد المركزي للأنابيب لفترة وجيزة لخلط المحتويات وبدء تفاعل RPA.
      ملاحظة: لتحسين قابلية التكرار ، قم بتدوير جميع المكونات وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة قبل الاستخدام. يجب تضمين عناصر التحكم الإيجابية والسلبية في كل دفعة للتحقق من صحة التفاعل.
    4. احتضان العينات عند 39 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة لتفاعل تضخيم RPA.
      ملاحظة: بعد الحضانة ، يمكن استخدام تفاعلات RPA مباشرة للكشف عن المصب (على سبيل المثال ، المقايسات المستندة إلى CRISPR / Cas12a) ، الموضحة في القسم 3.

3. الكشف عن الحمض النووي لمسببات الأمراض بواسطة CRISPR / Cas12a

ملاحظة: يمكن إجراء الكشف بعد تقنية RPA بطرق مختلفة. في هذا البروتوكول ، سنقوم بتفصيل الكشف عن طريق التألق (FAM-TTTTTTTT-MGB) والشرائط الكروماتوغرافية المناعية (Biotin-TTTTTTTT-FITC).

قم بتنفيذ جميع الإجراءات في منطقة نظيفة وخالية من الحمض النووي (على سبيل المثال ، مساحة مخصصة لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). نظف أسطح العمل والماصات باستخدام 0.5٪ مبيض ، متبوعا بنسبة 70٪ إيثانول. استخدم دائما أطراف المرشح وارتد القفازات. تعامل مع الحمض النووي أو المواد المضخمة في منطقة منفصلة عن منطقة تحضير الكاشف. قم بإذابة جميع الكواشف على الجليد وحافظ على الظروف الباردة طوال فترة التحضير.

  1. إعداد حلول العمل
    1. كرنا
      ملاحظة: تم تنفيذ تصميم Nosema ceranae و Lotmaria passim crRNA باستخدام أداة تصميم الحمض النووي الريبي / الحمض النووي (EuPaGDT) دليل مسببات الأمراض حقيقية النواة CRISPR (EuPaGDT) http://grna.ctegd.uga.edu/. لتصميم crRNA المخصص ، يمكن استخدام برامج أخرى مثل GPP sgRNA Designer (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) أو CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/).
      1. لتحضير محلول مخزون 100 ميكرومتر crRNA ، أعد تكوين 10 نانومول من كل crRNA مجفف بالتجميد مع 100 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC وتخزينها عند -20 درجة مئوية. لتحضير محلول عمل 1 ميكرومتر ، قم بإجراء تخفيف 1: 100 عن طريق خلط 1 ميكرولتر من محلول المخزون 100 ميكرومتر مع 99 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC في أنبوب 0.2 مل (الشكل 3).
        ملاحظة: يجب تخزين كلا المحاللين عند -20 درجة مئوية.
    2. تحضير Cas12a
      ملاحظة: يمكن توفير Cas12a بتركيزات إما 1 ميكرومتر أو 100 ميكرومتر.
      1. إذا تم توفيره عند 100 ميكرومتر ، فقم بتخفيفه إلى محلول عمل 1 ميكرومتر قبل الاستخدام عن طريق خلط 1 ميكرولتر من إنزيم 100 ميكرومتر Cas12a مع 99 ميكرولتر من المخفف الموجود في المجموعة (تخفيف 1: 100 ، الشكل 3).
        ملاحظة: يمكن تعديل تركيز إنزيم Cas12a اعتمادا على نوع العينة. نظرا لأن الإنزيم يتم تخزينه في مخفف قائم على الجلسرين ، فمن المهم التأكد من أن حجم الإنزيم المضاف لا يتجاوز 20٪ من إجمالي حجم التفاعل لتجنب التأثيرات المثبطة المحتملة.
    3. تحضير محاليل مسبار FAM و Biotin
      ملاحظة: يتم توفير مسبار FAM في شكل مجفف بالتجميد.
      1. لتحضير محلول مخزون 100 ميكرومتر ، أعد تعليق المسبار بإضافة 1 ميكرولتر من الماء المعالج DEPC لكل 1 نانومول من المسبار (على سبيل المثال ، ل 102 نانومول ، أضف 102 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC). قم بتخزين محلول المخزون عند -20 درجة مئوية. للاستخدام في مزيج الكشف الرئيسي ، قم بتخفيف المخزون 1:10 (90 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC مع 10 ميكرولتر من 100 ميكرومتر FAM) للحصول على محلول عمل 10 ميكرومتر (الشكل 3).
  2. بروتوكول الكشف CRISPR / Cas12a
    1. الكشف القائم على التألق (مسبار FAM)
      1. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل ، قم بإعداد مزيج التفاعل كما هو موضح في الجدول 3 ، باستثناء مكبرات الصوت.
      2. تخلط جيدا باستخدام دوامة ووزع الخليط في أنابيب PCR.
      3. ثم أضف 4 ميكرولتر من أمبليكون RPA (الموصوف في الخطوة 2.2) إلى كل أنبوب.
      4. احتضان التفاعلات عند 37 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة في جهاز تدوير حراري مع إمكانية قراءة التألق ، وتسجيل التألق كل دقيقة.
      5. اختياري: في نهاية الحضانة ، انقل التفاعلات إلى أنابيب 0.2 مل وتصورها باستخدام نظام توثيق هلام للتصوير.
    2. الكشف باستخدام مسبار البيوتين في اختبار التدفق الجانبي
      1. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل ، أضف المكونات الموضحة في الجدول 4.
      2. اصنع المزيج كما هو موضح في القسم 3.2.1 ، واخلطه ووزعه في لوحة PCR. أخيرا ، أضف 4 ميكرولتر من الأمبليكون إلى الآبار المعنية.
      3. احتضن لمدة 120 دقيقة في جهاز تدوير حراري (بدون قراءة مضت) أو كتلة حرارية عند 37 درجة مئوية.
      4. انقل العينات إلى أنابيب 0.2 مل وقم بإجراء الكشف باستخدام شرائط مناعية. للقيام بذلك ، أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتشغيل و 10 ميكرولتر من خليط التفاعل في كل أنبوب وأدخل الشريط مباشرة في الأنبوب. احتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة واقرأ النتائج بعد 10 دقائق من الغمر ، كما هو موضح في الشكل 3.

النتائج

لقد وصفنا هنا طريقة سريعة في الموقع باستخدام التحلل القلوي لبطن النحل العامل إلى جانب تضخيم RPA والكشف المستند إلى CRISPR / Cas12a عن طريق التألق و / أو أساليب التدفق الجانبي. يتم تمثيل مخطط سير العمل الكامل في الشكل 3 ، ومخطط التحلل القلوي HotSHOT لبطون النحل العامل في الشكل 4. تظهر النتائج التمثيلية لمقايسة RPA / CRISPR / Cas12a في الشكل 5. للكشف عن L. passim و N. ceranae ، تم استخدام جهاز تدوير حراري لتحديد وحدات التألق النسبية (RFUs) باستخدام مسبار مسمى FAM (الشكل 4 أ). تم إجراء تفاعلات RPA باستخدام 10 نانوغرام من الحمض النووي ، وتم رسم بيانات التألق في رسم بياني (الشكل 4 ب). في المرحلة الأخيرة من الفحص ، تم تصوير عينات في أنابيب مخروطية باستخدام نظام تصوير هلامي (الشكل 4C). للكشف عن مسبار يحمل علامة البيوتين ، تم احتضان العينات في كتلة حرارية (الشكل 4 أ) ؛ تم تحضير محلول الكشف وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وتطبيقه على شريط تدفق جانبي (الشكل 4 ب ، ج). أدت هذه الطريقة إلى اكتشاف ناجح لكل من مسببات الأمراض في نحل العسل.

لتحديد كفاءة تفاعلات RPA ، قارنا هذه الطريقة مع qPCR القياسي باستخدام الحمض النووي المنقى من نحل العسل باستخدام المجموعة المشار إليها (انظر جدول المواد). تم اختبار ما مجموعه 32 عينة من النحل باستخدام مواد أولية تستهدف جين β-tubulin ل L. passim لكلتا الطريقتين ثم تم اكتشافها بواسطة CRISPR / Cas12a عبر الانقسام لمجسات الفلورسنت. والجدير بالذكر أنه نتيجة لذلك ، تم العثور على 12 عينة إيجابية بواسطة qPCR ، بينما اكتشف RPA / CRISPR / Cas12a L. passim في 16 عينة (الشكل 5 أ). يشير هذا إلى أن أداء تفاعل RPA أكثر حساسية من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، كطريقة تضخيم الحمض النووي القياسية الذهبية.

وبالمثل ، حددنا حد الكشف (LOD) ل qPCR و RPA مقترنا باكتشاف CRISPR / Cas12a ل L. passim DNA كنموذج عامل الأمراض باستخدام التخفيفات التسلسلية ل L. passim DNA تتراوح من 66 نانوغرام إلى 6 fg. اكتشف qPCR أقل من 6 بيكوغرام ، أي ما يعادل ما يقرب من 96 طفيليا (الشكل 5 ب). وبالمقارنة ، فإن LOD ل RPA يتوافق مع 96 طفيليا (الشكل 5 ج ، د).

figure-results-1
الشكل 1: سير العمل العام للتحلل القلوي HotSHOT إلى جانب تضخيم RPA وطرق الكشف عن Cas12 في نحل العسل. الاختصارات: RPA = تضخيم البوليميراز المركب ؛ كريسبر = التكرارات المتجانسة القصيرة العنقودية المتباعدة بانتظام ؛ كاس = بروتين مرتبط ب CRISPR. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: معالجة تحلل الخلايا الجاهزة للتضخيم باستخدام المخزن المؤقت HotSHOT. (أ) قطع بطن نحل العسل بمشرط ووضعه في أنبوب طرد مركزي ؛ (ب) باستخدام مدقة ، قم بالنقع باستخدام 400 ميكرولتر من HotShot ؛ (ج) احتضان على كتلة حرارية عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ و (د) تحييد ب 400 ميكرولتر من 40 ملي مولار Tris-HCl. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: سير العمل العام لإعداد إنزيم Cas12a وحلول مسبار المراسل المسمى FAM والبيوتين. الاختصارات: DEPC-water = المياه المعالجة بثنائي إيثيل بيروكربونات. crRNA = RNA CRISPR. Cas12 = نوع البروتين المرتبط ب CRISPR. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: الكشف عن Lotmaria passim و Nosema ceranae. بطريقة CRISPR / Cas12a باستخدام مجسات FAM و biotin. للكشف عن FAM ، (أ) يتم احتضان العينات في جهاز تدوير حراري. (ب) وحدات التألق النسبية (RFU's) ل L. passim و N.ceranae ؛ (ج) تصور نفس العينات في إطار نظام التوثيق الضوئي. في اختبارات البيوتين ، (أ) عينة تحتضن في كتلة حرارية. (ب) أضيفت عينات في شريط مناعي من المجموعة (انظر جدول المواد)؛ (ج) النتائج بعد الحضانة. الاختصارات: LP = Lotmaria passim; NC = Nosema ceranae. NTC= لا يوجد تحكم في القالب؛ RFU: وحدات التألق النسبية الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: مقارنة بين qPCR و RPA ، وحد الكشف عن Lotmaria passim. (أ) الكشف عن L. passim في عينات نحل العسل باستخدام qPCR و RPA التقليديين. (ب) حد الكشف عن qPCR ل L. passim باستخدام SsoFast EvaGreen. (ج) حد الكشف عن L. passim باستخدام CRISPR/Cas12a مع مسبار يحمل علامة FAM؛ (د) تصور نفس اكتشاف CRISPR / Cas12a (من C) تحت نظام تصوير هلام (الصف العلوي) ، ونتائج التدفق الجانبي المقابلة باستخدام CRISPR / Cas12a مع مسبار مسمى بالبيوتين (الصف السفلي). الاختصارات: RPA = تضخيم البوليميراز المركب ؛ qPCR = تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الكاشفالتركيز النهائي10 ميكرولتر50 ميكرولتر
2x عازلة التفاعل1x5 ميكرولتر25 ميكرولتر
dNTPs (10 ملليمتر)1.8 ملي1.8 ميكرولتر9 ميكرولتر
10x المزيج الأساسي1x1 ميكرولتر5 ميكرولتر
التمهيدي الأمامي (10 ميكرومتر)480 نانومتر0.5 ميكرولتر2.4 ميكرولتر
التمهيدي العكسي (10 ميكرومتر)480 نانومتر0.5 ميكرولتر2.4 ميكرولتر
20x مزيج التفاعل الأساسي1x0.5 ميكرولتر2.5 ميكرولتر
مياه DEPC--0.7 ميكرولتر3.7 ميكرولتر

الجدول 1: مكونات Mastermix ل RPA بأحجام نهائية تبلغ 10 ميكرولتر و 50 ميكرولتر ، وتركيزات العمل المقابلة:

الكاشفالتركيز النهائيتفاعل 10 ميكرولترتفاعل 50 ميكرولتر
280 ملي ملي مغنليجرام OAc1.8 ملي0.5 ميكرولتر2.5 ميكرولتر
دنا10-0.1 نانوغرام1 ميكرولتر2 ميكرولتر

الجدول 2: حجم الكواشف المراد إضافتها لكل عينة في تفاعل RPA

الكاشف[مخزون][نهائي]1x (ميكرولتر)
إنزيم Cas12a1 ميكرومتر50 نانومتر2.5
الحمض النووي الريبي (cRNA)1 ميكرومتر100 نانومتر5
مسبار FAM10 ميكرومتر250 نانومتر1.25
NEB المخزن المؤقت 10x10 أضعاف1x5
ئامبليكون RPA--4
الماء--32.25
مجموع50

الجدول 3: تركيزات الكواشف لعمل مزيج من الكشف عن FAM بطريقة CRISPR / Cas 12a.

الكاشف[مخزون][نهائي]1x (ميكرولتر)
إنزيم Cas12a1 ميكرومتر50 نانومتر2.5
الحمض النووي الريبي (cRNA)1 ميكرومتر100 نانومتر5
مسبار البيوتين10 ميكرومتر500 نانومتر2.5
NEB المخزن المؤقت 10x10 أضعاف1 مرة5
ئامبليكون RPA--4
الماء--31
مجموع50

الجدول 4: تركيزات الكواشف لعمل مزيج من الكشف عن البيوتين بطريقة CRISPR / Cas 12a.

المناقشة

في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير والتحقق من صحة بروتوكول تشخيص جزيئي عملي للكشف عن مسببات أمراض نحل العسل. يدمج سير العمل تحلل الخلايا الجاهز للتضخيم ، والتضخيم متساوي الحرارة باستخدام RPA ، والكشف عالي التحديد عبر CRISPR / Cas12a. من بين طرق استخراج الحمض النووي الكيميائي التي تم تقييمها ، يوفر بروتوكول التحلل القلوي HotSHOT مزايا كبيرة من حيث التكلفة والسرعة والبساطة. إنها تنتج بكفاءة محللات جاهزة للتضخيم دون الحاجة إلى مجموعات تجارية. أثبتت هذه الطريقة موثوقيتها في العديد من التطبيقات ، بما في ذلك الكشف عن مسببات الأمراض في نحلالعسل 14،15،16،17،18. تؤدي الظروف القلوية ذات درجة الحرارة العالية إلى تعطيل أغشية الخلايا والترابط الهيدرجيني بين خيوط الحمض النووي ، مما يؤدي إلى إطلاق الحمض النووي أحادي الشريطة المناسب للتضخيم النهائي. على الرغم من أن القيود المحتملة تشمل وجود مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل أو التحييد دون المستوى الأمثل ، فقد ثبت أن التحلل القلوي يعمل بفعالية في كائنات حية متنوعة مثل العتائق19 والبكتيريا20 والفطريات14 ، وهو متوافق مع PCR و qPCR وطرق متساوية الحرارة مثل LAMP21 و RPA12.

في أيدينا ، أظهر نظام RPA / CRISPR / Cas12a خصوصية قوية وحساسية مرضية. سمح استخدام crRNAs التي تستهدف المناطق المحفوظة في كل مسببات الأمراض بتحديد دقيق مع عدم وجود تفاعل متبادل مع الحمض النووي المضيف أو الكائنات الحية الدقيقة غير ذات الصلة. حققت التطبيقات السابقة لهذا النظام في نحل العسل حدود الكشف حوالي 6.5 × 102 و 6.2 × 101 نسخة / ميكرولتر لفيروس الجناح المشوه من النوعين A وB 8،12. ومع ذلك ، لم يتم تحسين هذه المقايسات للظروف الميدانية مع استخراج الحمض النووي الريبي السريع و / أو الحمض النووي. في هذا العمل ، قمنا بتكييف الطريقة خصيصا لمسببات الأمراض في الحمض النووي - N. ceranae و L. passim - مما يتيح الكشف المتوافق مع المجال.

تظهر نتائجنا أن RPA / CRISPR / Cas12a تفوقت على تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي في تحديد العينات الإيجابية (16 مقابل 12) ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى الإشارة المحسنة باستخدام نشاط الانقسام الجانبي CRISPR / Cas12a ، والذي يظل فعالا حتى في المحللات الخام. تم الإبلاغ سابقا عن التحسن في الحساسية مقارنة بالطرق القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل في نماذج مسببات الأمراض المختلفة مثل Yersinia enterocolitica22 أو Diaporthe aspalathi23 أو Vibrio vulnificus24. علاوة على ذلك ، كشف التحليل الكمي عن حد مكافئ للكشف عن RPA / CRISPR / Cas12a و qPCR في ظل ظروف معملية (~ 96 نسخة طفيلية / ميكرولتر). هذا يعني أداء جيدا للطريقة مع خصوصية مماثلة ل TaqMan qPCR ، نظرا للتعرف على التسلسل الإضافي الذي يوفره crRNA. علاوة على ذلك ، لا يتطلب الاختبار سوى الحد الأدنى من المعدات ، ولا يعتمد على جهاز تدوير حراري أو قارئ مضان ، ويمكن تصوره باستخدام شرائط التدفق الجانبي كما تم تطويرها مسبقا لمسببات الأمراض الأخرى25،26. هذا يبسط التفسير ويجعل الاختبار في متناول الفنيين الميدانيين ومربي النحل.

يسفر البروتوكول الحالي عن نتائج قوية ، ولكن من الممكن إجراء المزيد من التحسينات. إن تكييف الاختبار لاستهداف مسببات أمراض النحل الأخرى القائمة على الحمض النووي سيتطلب فقط إعادة تصميم بادئات RPA و crRNAs. بالنسبة لفيروسات الحمض النووي الريبي ، يمكن توسيع البروتوكول ليشمل خطوة النسخ العكسي (RT-RPA) كما هو موضح سابقا للعديد من الأمراض المعدية الفيروسية26،27،28 ، بما في ذلك DWV-A و DWV-B في نحلالعسل 15. بالإضافة إلى ذلك ، من المحتمل أن يتم تقليل إجمالي وقت الفحص - حاليا حوالي 180 دقيقة - من خلال تحسين البروتوكول لتقليل توقيت كل خطوة. بديل آخر هو وعاء واحد RPA / CRISPR / Cas12a الذي يجمع بين جميع كواشف RPA / CRISPR / Cas12a في تفاعل واحد. تم تطبيق هذه المنهجية الشاملة بنجاح للكشف عن مجموعة واسعة من مسببات الأمراض الفيروسية والبكتيرية25،26،29. إلى جانب ذلك وعلى الرغم من أن مجسات ssDNA قد تم توسيعها ونشرها للكشف عن Cas12a ، فقد أبلغت بعض الدراسات عن قدرة Cas12a على مجسات الحمض النووي المزدوج الشريطة عبر الانقسام (dsDNA) التي قد تكون مفيدة للاختبار بسبب استقرار dsDNA30. سيؤدي ذلك إلى وقت الوصول إلى النتيجة أقل من 30 دقيقة ، مما يزيد من تعزيز قابلية التطبيق الميداني. كما أن كواشف RPA و CRISPR المجفدة بالتجميد من شأنها أن تحسن استقرار الكاشف وتلغي الحاجة إلى سلسلة تبريد ، مما يزيد من ملاءمتها للبيئات البعيدة أو منخفضة الموارد. تم تحديد الأداء الناجح ل RPA / CRISPR / Cas12a باستخدام الكواشف المجففة بالتجميد بنجاح للكشف عن Actinobacillus pleuropneumonia31 والفيروسات المعدية التنفسية28،32 ، بما في ذلك SARS-Cov226.

باختصار ، تقدم هذه الدراسة منصة تشخيص جزيئية كاملة في الميدان وفعالة من حيث التكلفة ومحمولة للكشف عن مسببات أمراض نحل العسل. ستستمر هذه المنهجية ، كما هي ، 180 دقيقة تقريبا ، لكن توقيتها الإجمالي يمكن أن يخضع لمزيد من التحسينات. بينما ركزنا على L. passim و Nosema spp. كأهداف لإثبات المفهوم ، فإن النظام معياري وقابل للتكيف مع مجموعة واسعة من مسببات أمراض النحل القائمة على الحمض النووي (على سبيل المثال ، يرقات Paenibacillus أو Melisococcus plutonious) وكذلك لمراقبة المتعايشين المعنيين. يوسع هذا النهج الوصول إلى التشخيص الجزيئي إلى ما هو أبعد من البيئات المختبرية التقليدية ويدعم استراتيجيات التدخل المبكر في تربية النحل. على نطاق أوسع ، تظهر نتائجنا جدوى التقنيات القائمة على كريسبر في تطبيقات التشخيص الجاهزة ميدانيا.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منحة "أدوات جزيئية جديدة للمراقبة السريعة لأمراض نحل العسل في المناحل في مقاطعة غرناطة" (GOPG-GR-23-0002) في إطار دعوة المساعدة للمجموعات التشغيلية لجمعية الابتكار الأوروبية (AEI) في الإنتاجية الزراعية والاستدامة للحكومة الأندلسية. كما نقدر الدعم المقدم من البرنامج الإسباني لتوليد المعرفة والتعزيز العلمي والتكنولوجي لنظام R + D + I ، ومنحة PID2021-126938OB-I00 بتمويل من MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 و "ERDF / EU". نحن نقدر بشدة المساعدة والموارد التي يقدمها مربي النحل في Asociación de Pequeños Apicultores de Granada (APAG) و Cooperativas Agroalimentarias de Granada (FAECA). الدراسة جزء من أطروحة الدكتوراه ل D. Pedro García Olmedo. برنامج الدكتوراه في علم الأحياء الأساسي والأنظمة (جامعة غرناطة ، UGR).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.2 مل أنابيب Eppendorf خالية من الحمض النووي والحمض النووي الريبيأكسيجنMTC-02-C
1.5 مل أنابيب Eppendorf خالية من الحمض النووي والحمض النووي الريبيأكسيجنMTC-150-C
10 μ L نصائح مصفاة منخفضة الاحتفاظعيادات المختبر5-063-ف 5-0
100 μ L نصائح مصفاة منخفضة الاحتفاظعيادات المختبر5-120-ف 5-0
1000 μ L نصائح مصفاة منخفضة الاحتفاظعيادات المختبر5-203-ف 4-0
BH-200 سلسلة ستيوارت سخان بلوك جافكول بارمرEW-36610-00
المياه المعالجة ب DEPCأمبيكونAM9906
إيدتاسيجما ألدريتش798681
EnGen LBA Cas12a (Cpf1)نيو إنجلاند بيولابسطراز M0653T
سيجما ألدريتشسيجما ألدريتش64-17-5
حمض الهيدروكلوريكسيجما ألدريتش7647-01-0
مدقات الأنابيب الدقيقةفيشربراند12141364
ميلينيا جينلاين HybriDetectميلينياإم جي إتش دي 1
هيدروكسيد الصوديومسيجما ألدريتش221465
طقم RPA TwistAmp Liquid Basicتويستأمبير  TALQBAS01
شفرات مشرطسوان مورتون201
ماصة شانيل واحدة PIPETMAN P1000L Micropipette إخراج معدنيجيلسونF144059M
ماصة شانيل واحدة PIPETMAN P100L ماصة معدنيةجيلسونF144057M
ماصة شانيل واحدة PIPETMAN P10L Micropipette إخراج معدنيجيلسونF144055M
هيبوكلوريت الصوديوم
نظام الكشف عن PCR في الوقت الحقيقي يعمل باللمسبيورادسي إف إكس 96
تريس حمض الهيدروكلوريكسيجما ألدريتشتي 1503
تويس أمب سائل أساسيجدلTALQBAS01

المراجع

  1. Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L. Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers. Science. 347 (6229), 1255957(2015).
  2. Murphy, J. T., Breeze, T. D., Willcox, B., Kavanagh, S., Stout, J. C. Globalisation and pollinators: pollinator declines are an economic threat to global food systems. People and Nature. 4 (3), 773-785 (2022).
  3. Zattara, E. E., Aizen, M. A. Worldwide occurrence records suggest a global decline in bee species richness. One Earth. 4 (1), 114-123 (2021).
  4. Carreira de Paula, J., et al. Promastigote EPS secretion and haptomonad biofilm formation as evolutionary adaptations of trypanosomatid parasites for colonizing honeybee hosts. NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 27(2024).
  5. Requier, F., et al. First large-scale study reveals important losses of managed honeybee and stingless bee colonies inLatin America. Sci Rep. 14 (1), 10079(2024).
  6. Babin, A., Schurr, F., Rivière, M. P., Chauzat, M. P., Dubois, E. Specific detection and quantification of three microsporidia infecting bees, Nosema apis, Nosema ceranae, and Nosema bombi, using probe-based real-time PCR. Eur J Protistol. 86, 125935(2022).
  7. Cameron, T. C., Wiles, D., Beddoe, T. Current status of loop-mediated isothermal amplification technologies for the detection of honeybee pathogens. Front Vet Sci. 8, 659683(2021).
  8. Schurr, F., et al. Validation of quantitative real-time RT-PCR assays for the detection of six honeybee viruses. J Virol Methods. 270, 70-78 (2019).
  9. Xu, G., et al. Triplex real-time PCR for detection of Crithidia mellificae and Lotmaria passim in honeybees. Parasitol Res. 117 (2), 623-628 (2018).
  10. D'Alvise, P., Seeburger, V., Gihring, K., Kieboom, M., Hasselmann, M. Seasonal dynamics and co-occurrence patterns of honeybee pathogens revealed by high-throughput RT-qPCR analysis. Ecol Evol. 9 (18), 10241-10252 (2019).
  11. Shao, G., Zhu, X., Hua, R., Chen, Y., Yang, G. Development of a copro-RPA-CRISPR/Cas12a assay to detect Echinococcus granulosus nucleic acids isolated from canine feces using NaOH-based DNA extraction method. PLoS Negl Trop Dis. 18 (12), e0012753(2024).
  12. Xiao, Y., Fei, D., Li, M., Ma, Y., Ma, M. Establishment and application of CRISPR-Cas12a-based recombinase polymerase amplification and a lateral flow dipstick and fluorescence for the detection and distinction of deformed wing virus types A and B. Viruses. 15 (10), 2041(2023).
  13. Li, Z., et al. Cas-OPRAD: a one-pot RPA/PCR CRISPR/Cas12 assay for on-site Phytophthora root rot detection. Front Microbiol. 15, 1390422(2024).
  14. Osmundson, T. W., Eyre, C. A., Hayden, K. M., Dhillon, J., Garbelotto, M. M. Back to basics: an evaluation of NaOH and alternative rapid DNA extraction protocols for DNA barcoding, genotyping, and disease diagnostics from fungal and oomycete samples. Mol Ecol Resour. 13 (1), 66-74 (2013).
  15. Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT). BioTechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
  16. Klintschar, M., Neuhuber, F. Evaluation of an alkaline lysis method for the extraction of DNA from whole blood and forensic stains for STR analysis. J Forensic Sci. 45 (3), 669-673 (2000).
  17. Galanis, A., et al. Bee foraging preferences, microbiota and pathogens revealed by direct shotgun metagenomics of honey. Mol Ecol Resour. 22 (7), 2506-2523 (2022).
  18. Xiang, Z., et al. A simple alkali lysis method for Plasmodium falciparum DNA extraction from filter paper blood samples. Mol Biochem Parasitol. , 254(2023).
  19. Shwani, A., Zuo, B., Alrubaye, A., Zhao, J., Rhoads, D. D. A simple, inexpensive alkaline method for bacterial DNA extraction from environmental samples for PCR surveillance and microbiome analyses. Appl Sci. 14 (1), 141(2024).
  20. Fowler, E. V., et al. Development of a cost-effective, morphology-preserving method for DNA isolation from bulk invertebrate trap catches: tephritid fruit flies as an exemplar. PLoS One. 18 (2), e0281759(2023).
  21. Yuan, J., et al. CRISPR-Cas12a-mediated hue-recognition lateral flow assay for point-of-need detection of Salmonella. Anal Chem. 96 (1), 220-228 (2024).
  22. Xiao, Y., et al. Ultra-sensitive and rapid detection of pathogenic Yersinia enterocolitica based on the CRISPR/Cas12a nucleic acid identification platform. Foods. 11 (14), 2160(2022).
  23. Dong, J., et al. Comparative evaluation of PCR-based, LAMP and RPA-CRISPR/Cas12a assays for the rapid detection of Diaporthe aspalathi. Int J Mol Sci. 25 (11), 5773(2024).
  24. Zhang, X., et al. CRISPR/Cas12a combined with recombinase polymerase amplification for rapid and sensitive detection of Vibrio vulnificus in one tube. Acta Biochim Biophys Sin. 55 (2), 322-326 (2023).
  25. Li, P. R., et al. An RPA-assisted CRISPR/Cas12a assay combining fluorescence and lateral flow strips for the rapid detection of enterotoxigenic Bacillus cereus. J Agric Food Chem. 72 (24), 14000-14010 (2024).
  26. Sun, Y., et al. One-tube SARS-CoV-2 detection platform based on RT-RPA and CRISPR/Cas12a. J Transl Med. 19 (1), 74(2021).
  27. Aman, R., et al. iSCAN-V2: a one-pot RT-RPA-CRISPR/Cas12b assay for point-of-care SARS-CoV-2 detection. Front Bioeng Biotechnol. 9, 800104(2022).
  28. Peng, R., Lu, Z., Liu, M., Hu, F. RT-RPA-assisted CRISPR/Cas12a for rapid and multiplex detection of respiratory infectious viruses based on centrifugal microfluidics. Sens Actuators B Chem. 399, 134838(2024).
  29. Liu, Y., et al. One-tube RPA-CRISPR Cas12a/Cas13a rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Anal Chim Acta. 1278, 341757(2023).
  30. Nguyen, L. T., Smith, B. M., Jain, P. K. Enhancement of trans-cleavage activity of Cas12a with engineered crRNA enables amplified nucleic acid detection. Biochemistry. 59 (17), 1474-1481 (2020).
  31. Hao, J., et al. Application of a lyophilized CRISPR/Cas12a and RPA assay for rapid detection of Actinobacillus pleuropneumoniae. Microchem J. 206, 111443(2024).
  32. Lin, C., et al. A universal all-in-one RPA-Cas12a strategy with de novo autodesigner and its application in on-site ultrasensitive detection of DNA and RNA viruses. Biosens Bioelectron. 239, 115609(2023).

إعادة الطباعة والأذونات

تصحيح


Formal Correction: Erratum: On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System
Posted by JoVE Editors on 8/14/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68874

الوسوم

تضخيم البوليمراز المعتمد على الربطمقايسة التدفق الجانبيالكشف عن مسببات الأمراض في نحل العسلالتشخيص الميدانيالتشخيص الجزيئي
الكشف عن الحمض النووي في الموقع لطفيليات التريبانوزوماتيد و Nosema ceranae من خلال التحلل القلوي المقترن بنظام RPA / CRISPR / Cas12a
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.