مقالة منهجية

تقييم تأثير عوامل SASP على تكاثر الخلايا السرطانية باستخدام تحليل مقارن لثلاث منهجيات متميزة

DOI:

10.3791/68883

⸱

سبتمبر 19, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Gazi University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقوم هذه الدراسة بتقييم التأثيرات التكاثرية لعوامل النمط الظاهري الإفرازي المرتبطة بالشيخوخة (SASP) من خلايا HeLa الشائخة على خلايا HeLa غير الشائخة باستخدام ثلاثة نماذج في المختبر مع مراقبة في الوقت الفعلي. تمت مقارنة مزايا وقيود كل طريقة بشكل منهجي لفهم تفاعلات الخلية والخلايا في السرطان بشكل أفضل.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفرز الخلايا السرطانية الشائخة الناجمة عن العلاج الكيميائي أيضا عوامل مختلفة ، تسمى النمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالشيخوخة ، لتنظيم بيئتها المكروية خارج الخلية. أفادت الدراسات السابقة أن عوامل SASP هذه لها تأثيرات ضارة على الخلايا المحيطة ، بما في ذلك تعزيز التكاثر ، والانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة (EMT) ، وتكوين الأوعية الدموية ، والهجرة. تستخدم العديد من تقنيات الزراعة المشتركة في المختبر على نطاق واسع لفهم العمليات الخلوية الناتجة عن التفاعل عن طريق زراعة نفس أنواع الخلايا وأنواع مختلفة من الخلايا معا. هنا ، تم التحقيق في التأثيرات التكاثرية المحتملة لعوامل SASP التي تفرزها خلايا HeLa الشائخة على خلايا HeLa غير الشائخة باستخدام ثلاثة مناهج تكميلية في المختبر . تضمن النهج الأول الزراعة المشتركة للخلايا الشائخة وغير الشائخة للتحقيق في إشارات paracrine بوساطة SASP. في النهج الثاني ، تم تركيز الوسائط المشروطة التي تم جمعها من الخلايا السرطانية الشائخة واستخدامها لاحقا لفحص تأثير الوسائط المكيفة مع المراقبة في الوقت الفعلي للانتشار. في الطريقة الثالثة ، تمت زراعة الخلايا الشائخة وغير الشائخة جنبا إلى جنب لتقييم تأثيرات تجاور SASP من خلال الاتصال المباشر من خلية إلى خلية. أظهرت جميع النماذج التجريبية الثلاثة باستمرار أن عوامل SASP عززت بشكل كبير تكاثر الخلايا السرطانية غير الشائخة. والجدير بالذكر أن الزراعة المشتركة للخلايا الشائخة زادت من معدل التكاثر بنسبة 64.6٪ ، وزادت الوسائط المشروطة ب SASP المركزة 3 أضعاف الانتشار بأكثر من 50٪ مقارنة بالضوابط. أظهر التصوير القائم على التألق زيادة بنسبة 49.3٪ في أعداد الخلايا الإيجابية ل GFP في ظل ظروف تجاور. مكنت هذه الأساليب بشكل جماعي من التقييم الكمي والنوعي للتغيرات التكاثرية التي يسببها SASP. يسلط التحليل المقارن لهذه الأساليب الضوء على نقاط القوة والقيود الخاصة بها ، مما يوفر رؤى قيمة حول التأثيرات paracrine للخلايا الشائخة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الكائنات متعددة الخلايا ، تتواصل الخلايا من خلال إشارات paracrine و juxtacrine عن طريق تبادل الرسائل مع بيئتها الدقيقة ، وبالتالي التأثير على سلوك بعضها البعض. يمكن أن يحدث هذا الاتصال إما بشكل مباشر ، من خلال حفر الأنابيب النانوية النفقية وتقاطعات الفجوة ، أو بشكل غير مباشر من خلال إفراز جزيئات كيميائية قابلة للذوبان مثل السيتوكينات وعوامل النمو والكيموكينات في المصفوفة خارج الخلية. تلعب آليات الإشارات هذه أدوارا أساسية في تنظيم العمليات الفسيولوجية المختلفة ، بما في ذلك نمو الأنسجة واستجابات الخلايا المناعية ، كما أنها متورطة في التسبب في العديد من الأمراض ، مثل السرطان وفيروس نقص المناعة البشرية وارتفاع ضغط الدم ومرض الزهايمر1.

في الستينيات ، اكتشف ليونارد هايفليك أن الخلايا الليفية البشرية الطبيعية لديها قدرة محدودة على التكاثر في المختبر2. تسمى حالة تكاثر الخلايا المحدودة هذه التي تتطور بسبب تقصير التيلوميراز الشيخوخة التكاثرية. كشفت الدراسات اللاحقة أن أشكالا مختلفة من الإجهاد الخلوي يمكن أن تؤدي أيضا إلى الشيخوخة الخلوية. لقد تقرر أن علاجات السرطان الشائعة مثل العلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي تحفز أيضا الشيخوخة الخلوية في كل من الخلايا السرطانية والخلايا اللحمية ، والتي تسمى الشيخوخة الناجمة عن العلاج3،4. الشيخوخة الخلوية والشيخوخة هي عمليات ذات صلة هرمية; أنها تمثل عمليات بيولوجية متميزة. يساهم تراكم الخلايا الشائخة في الكائن الحي في الشيخوخة عن طريق تعزيز الالتهاب وضعف الأنسجة وتطور الأمراض المرتبطة بالعمر. ومع ذلك ، فإن الشيخوخة تشمل نطاقا أوسع بكثير من الأحداث والآليات الجهازية مقارنة بالشيخوخة5.

تتميز الخلايا الشائخة بكون السيتوبلازم الموسع أكبر بكثير ولها مورفولوجيا مسطحة مقارنة بالخلايا الطبيعية6. زادت هذه الخلايا الشائخة من النشاط الليزوزومي وهي إيجابية لنشاط β-galactosidase المرتبط بالشيخوخة (SA-β-gal) ، وهو إنزيم ليزوزومي يظل نشطا حتى عند درجة الحموضة الحمضية 6.0. تلطيخ SA-β-gal هو المؤشر الحيوي الأكثر استخداما للكشف عن الخلايا الشائخة7. يلاحظ التضخم والتشكل غير المنتظم للنوى بشكل شائع في الخلايا التي تمر بالشيخوخة. بالإضافة إلى ذلك ، تتميز هذه الخلايا بإعادة ترتيب الكروماتين الفريدة التي تسمى البؤر غير المتجانسة المرتبطة بالشيخوخة (SAHF) التي تتوسط توقف دورة الخلية التي لا رجعة فيها8،9.

على الرغم من أن الخلايا السرطانية الشائخة فقدت قدرتها على التكاثر في النهاية ، إلا أنها ظلت قابلة للحياة ونشطة من الناحية الأيضية. من المعروف أن الخلايا الشائخة تفرز أيضا عوامل مختلفة لتنظيم البيئة المكروية للورم خارج الخلية ، والتي تسمى النمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالشيخوخة (SASP) 10،11. تشمل عوامل SASP عوامل الإشارات القابلة للذوبان (الإنترلوكينات ، والكيموكينات ، وعوامل النمو) ، والبروتياز المفرز ، والبروتينات غير القابلة للذوبان / مكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM). بشكل جماعي ، تمارس هذه العوامل تأثيرات ضارة على الباراكرين ، بما في ذلك تعزيز تكاثر الخلايا السرطانية ، والهجرة ، والغزو ، وتحريض الانتقال من الظهارة إلى اللحمة المتوسطة (EMT) 4،12. بالإضافة إلى ذلك ، تعزى الآثار الضارة الناجمة عن العلاج الكيميائي جزئيا إلى تراكم الخلايا الشائخة13. لذلك ، أصبح التحقيق في التفاعل بين الخلايا الشائخة وغير الشائخة مجالا مهما للبحث في سياق علاج السرطان. يعتبر تحليل عوامل SASP ، وخاصة تركيباتها وتأثيراتها على البيئة المكروية للسرطان ، استراتيجية واعدة لتحديد الجزيئات المستهدفة الجديدة لعلاج السرطان واكتشاف أدوية جديدة لهذه الجزيئات.

لطالما استخدمت تقنيات الزراعة المشتركة في المختبر لدراسة فهم التفاعلات بين الخلية14. في هذه المقالة المنهجية ، كان الهدف هو تقييم النشاط التكاثري المحتمل للعوامل التي تفرز من الخلايا الشائخة على الخلايا السرطانية غير الشائخة باستخدام ثلاث طرق مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، تمت مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها من الطرق الثلاث المختلفة ، وتم تقييم مزايا وعيوب كل نهج بشكل نقدي.

أولا ، تم إنشاء نموذج ثقافة مشتركة بين خلايا HeLa الشائخة وخلايا HeLa غير الشائخة لمراقبة التغييرات المحتملة في تكاثر الخلايا السرطانية في الوقت الفعلي باستخدام نظام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي12. يتكون هذا النظام من لوحين لتقييم تفاعلات الخلية والخلايا. يحتوي عرض اللوحة الإلكترونية ، الذي يشكل الطبقة السفلية ، على سطح يتم فيه زرع الخلايا المستهدفة ، مع وضع أقطاب كهربائية دقيقة في الجزء السفلي من اللوحة. يتم التعبير عن المقاومة الكهربائية الناتجة عن التصاق الخلايا المستهدفة بهذا السطح بواسطة المعلمة القابلة للقياس مؤشر الخلية (CI). تتناسب قيمة CI مع عدد الخلايا ودرجة الالتصاق بالسطح15. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح عرض اللوحة الإلكترونية بالفحص المورفولوجي للخلايا تحت مجهر تباين الطور. إدراج اللوحة الإلكترونية ، الذي يشكل الطبقة العليا ، هو المنطقة التي يتم فيها زرع الخلايا المستجيبة. الجزء السفلي من هذه اللوحة مغطى بغشاء شبه منفذ بحجم 0.4 ميكرومتر. يمكن أن تمر العوامل التي تفرز من الخلايا المستجيبة عبر الغشاء وتؤثر على الخلايا المستهدفة في عرض اللوحة الإلكترونية. إذا كان هذا التفاعل يحفز تكاثر الخلايا ، فقد لوحظ ذلك كزيادة في قيمة CI. وبالتالي ، يمكن تقييم التفاعلات بين الخلايا كميا.

في الطريقة الثانية ، تم تركيز الوسائط المكيفة التي تم جمعها من خلايا HeLa الشائخة وإضافتها إلى خلايا HeLa غير الشائخة. تمت مراقبة التأثير التكاثري المحتمل على هذه الخلايا باستخدام نظام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي.

في الطريقة الثالثة ، تم التخطيط للاستزراع المشترك لخلايا HeLa الشائخة وخلايا GFP-HeLa غير الشائخة مباشرة في 2D ومراقبة التغيرات التكاثرية المحتملة في الخلايا السرطانية في الوقت الفعلي تحت المجهر.

الهدف من هذه التجربة هو إعداد ثلاثة نماذج لدراسة التفاعل بين خلايا HeLa الشائخة وخلايا HeLa غير الشائخة ومراقبة التغيرات المحتملة في تكاثر الخلايا السرطانية في الوقت الفعلي. وبالتالي ، يمكن التحقيق بسهولة في تأثير عوامل SASP التي تفرزها الخلايا السرطانية الشائخة على الخلايا السرطانية الأخرى. وبناء على ذلك، تم تقييم مزايا وقيود النهج الثلاثة تقييما منهجيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم إجراء جميع إجراءات زراعة الخلايا وفقا لشروط السلامة الحيوية من المستوى II + (BSL2 +) داخل خزانة أمان معتمدة. دوكسوروبيسين عامل علاج كيميائي خطير. يجب تنفيذ جميع الإجراءات في خزانة معتمدة من مستوى السلامة الحيوية II + (BSL2 +) باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) ، بما في ذلك معاطف المختبر والقفازات. وينبغي جمع جميع النفايات المحتوية على دوكسوروبيسين، بما في ذلك الوسائط والمثبتات، في حاويات نفايات خطرة مخصصة وتحمل علامات واضحة والتخلص منها من خلال النظام المؤسسي لإدارة النفايات الخطرة.

1. النموذج 1: الزراعة المشتركة باستخدام نظام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي

  1. زراعة الخلايا وتحريض الشيخوخة (اليوم 1-2)
    1. بذور 8 × 105 خلايا هيلا في قارورة مزرعة T25 تحتوي على 5 مل من وسط النسر المعدل (DMEM) من دولبيكو مكمل بنسبة 10٪ مصل بقري الجنين (FBS) ، والبنسلين (100 وحدة / مل) ، والستربتومايسين (0.1 ميكروغرام / مل) واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    2. في اليوم التالي ، استبدل وسط الخلايا ب 5 مل من الوسط الكامل الطازج. عالج الخلايا ب 300 نانومتر دوكسوروبيسين مباشرة عن طريق إضافته إلى الوسط للحث على الشيخوخة الخلوية. حافظ على قارورة T25 في حاضنة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
  2. بذر الخلايا غير الشائخة (اليوم 4)
    1. بذور 8 × 105 خلايا هيلا غير معالجة (تحكم غير شيخوخة) في قارورة T25 جديدة في 5 مل من DMEM مكملة بنسبة 10٪ من مصل أبقار الجنين والبنسلين (100 وحدة / مل) والستربتومايسين (0.1 ميكروغرام / مل) والحفاظ عليها في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  3. تأكيد تحريض الشيخوخة (اليوم 5)
    1. لتحديد ما إذا كانت 72 ساعة من علاج دوكسوروبيسين تسبب الشيخوخة ، قم بإجراء تلطيخ SA-β-gal6. قم بإجراء هذا الفحص على مجموعة منفصلة من الخلايا غير المستخدمة في التجارب الرئيسية. للحصول على النتائج التي تم الحصول عليها ، انظر الشكل 1 أ ، ب.
    2. قم بقياس IL-6 في الوسط المشروط لخلايا HeLa السرطانية الشائخة لتقييم نشاطها الإفرازي. عالج الخلايا بالدوكسوروبيسين لمدة 72 ساعة ، تليها الحضانة في وسط خال من المصل والفينول الأحمر لمدة يومين إضافيين. تطبيع الوسائط المكيفة التي تم جمعها إلى عدد الخلايا وقياس مستويات IL-6.
      ملاحظة: IL-6 هو السيتوكين المميز ل SASP12. يتم عرض نتائج قياس IL-6 في الشكل 1C.
  4. إعداد نظام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي (اليوم 5)
    1. قم بتشغيل نظام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي قبل بذر الخلايا. قم بتشغيل برنامج RTCA 2.0. انقر فوق الزر Exp Notes (الشكل 2) وأدخل التفاصيل التجريبية.
    2. انقر فوق الزر "جدولة " وأضف خطوتين. الخطوة الأولى هي الخلفية. الخطوة الثانية هي مراقبة تكاثر الخلايا كل 15 دقيقة لمدة 72 ساعة.
    3. اختر الخطوة الأولى وانقر فوق تشغيل لتسجيل مقاومة الخلفية عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من الوسط الكامل إلى كل بئر من عرض اللوحة الإلكترونية.
  5. زرع الخلايا في عرض اللوحة الإلكترونية (اليوم 5)
    1. افحص كل من خلايا HeLa المعالجة بالدوكسوروبيسين (الشائخة) وغير المعالجة (غير الشائخة) تحت مجهر تباين الطور باستخدام تكبير 10x قبل بذر الخلايا. تحت المجهر ، يكون للخلايا الشائخة مورفولوجيا متضخمة أكثر بكثير من الخلايا الطبيعية.
    2. اغسل كل من خلايا HeLa الشائخة وغير الشائخة ب 5 مل من PBS المعقمة المسخنة مسبقا ، ثم استنشاقها.
    3. أضف 1 مل من التربسين المسخن مسبقا بنسبة 0.05٪ وحافظ على القوارير عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين لفصل الخلايا. قم بتحييد التربسين ب 5 مل من DMEM الكامل المكمل ب 10٪ مصل بقري الجنين ، البنسلين (100 وحدة / مل) ، والستربتومايسين (0.1 ميكروغرام / مل).
    4. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق كريات الخلية في 5 مل من DMEM الكامل المكمل ب 10٪ من مصل أبقار الجنين ، والبنسلين (100 وحدة / مل) ، والستربتومايسين (0.1 ميكروغرام / مل).
    5. عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام طريقة استبعاد الصبغة الزرقاء trypan باستخدام مقياس الخلايا الدموية.
    6. بذور خلايا HeLa غير الشائخة بكثافة 5 × 103 خلايا / بئر في كل بئر من عرض لوحة إلكترونية واحدة في 100 ميكرولتر كاملة من DMEM مكملة بنسبة 10٪ من مصل بقري الجنين والبنسلين (100 وحدة / مل) والستربتومايسين (0.1 ميكروغرام / مل).
    7. ضع عرض اللوحة الإلكترونية في مهد نظام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي للسماح للخلايا بالالتصاق بسطح اللوحة في الحاضنة.
    8. اختر الخطوة الثانية في زر الجدول الزمني وانقر فوق تشغيل زر لبدء قياس المعاوقة باستخدام برنامج RTCA 2.0 لمدة 72 ساعة (الشكل 2).
  6. بذر الخلايا في ملحق اللوحة الإلكترونية
    1. خلايا البذور في بئر واحدة للوحة إلكترونية في 60 ميكرولتر من DMEM الكامل مع 10٪ مصل أبقار الجنين والبنسلين (100 وحدة / مل) والستربتومايسين (0.1 ميكروغرام / مل).
    2. يتم إدراج خلايا البذور على اللوحة الإلكترونية تحت ثلاثة إعدادات تجريبية مختلفة: المجموعة 1 (التحكم السلبي): لا توجد خلايا مصنفة (وسائط فقط)
      المجموعة 2: 2 × 104 خلايا HeLa غير الشائخة
      المجموعة 3: 1 × 105 خلايا هيلا الشائخة
    3. حافظ على ملحق اللوحة الإلكترونية عند 37 درجة مئوية في حاضنة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 6 ساعات للتركيب.
  7. الخلايا المشتركة
    1. انقر فوق إيقاف مؤقت بعد 6 ساعات من بذر الخلايا. استنشق وسط الاستزراع برفق من كل بئر في عرض اللوحة الإلكترونية لإزالة المصل والخلايا غير الملتصقة.
    2. اغسل الآبار 2x باستخدام PBS الدافئ مسبقا عند 37 درجة مئوية. أضف 140 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل إلى كل بئر من عرض اللوحة الإلكترونية.
    3. خذ ملحق اللوحة الإلكترونية واستنشق وسط الثقافة. اغسل الآبار برفق باستخدام PBS عند 37 درجة مئوية 2x وأضف 60 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل.
    4. ضع ملحق اللوحة الإلكترونية في عرض اللوحة الإلكترونية واضغط برفق لأسفل حتى يجلس الملحق بالكامل في البئر.
    5. أدخل اللوحة المدمجة في نظام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي وانقر فوق تشغيل لاستئناف المراقبة في الوقت الفعلي لقيم فهرس الخلية على فترات زمنية مدتها 15 دقيقة باستخدام البرنامج (الشكل 2).
    6. قم بإيقاف تشغيل نظام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي عند انتهاء وقت التجربة (الشكل 3 أ).
  8. خلايا التصوير على ملحق اللوحة الإلكترونية
    ملاحظة: نظرا لوجود غشاء في بئر إدخال اللوحة الإلكترونية ، لا يمكن تصور الخلايا المزروعة هنا على الغشاء باستخدام الفحص المجهري لتباين الطور. لذلك ، لاختبار ما إذا كانت الخلايا حافظت على قابليتها للحياة حتى نهاية التجربة وما إذا كانت الخلايا الشائخة تحافظ على سلامتها الهيكلية ، فقد تم تلطيخها ب DAPI (الشكل 3 ب).
    1. قم بإزالة ملحق اللوحة الإلكترونية من عرض اللوحة الإلكترونية. تلطيخ الخلايا في ملحق اللوحة الإلكترونية باستخدام DAPI وتحقق من وجود الخلايا تحت مجهر الفلورسنت16. من المعروف أن نوى الخلايا الشائخة أكبر من نوى الخلايا الطبيعية. لذلك ، بناء على الأحجام النووية للخلايا الملطخة ب DAPI ، حدد البئر الذي تم زرعه بالخلايا غير الشائخة وأيها بالخلايا الشائخة.
  9. تصوير الخلايا على عرض اللوحة الإلكترونية
    1. افحص عرض اللوحة الإلكترونية مباشرة تحت مجهر تباين الطور باستخدام تكبير 10x (الشكل 3 ب). نظرا لأنه تمت إزالة أربعة صفوف من مستشعرات الأقطاب الكهربائية الدقيقة من مركز كل بئر في عرض اللوحة الإلكترونية ، تم إنشاء الفضاء 6 لتمكين مراقبة الخلايا عن طريق الفحص المجهري.
  10. تحليل البيانات
    1. قم بتطبيع قيم CI في النقطة الزمنية التي يتم فيها دمج عرض اللوحة الإلكترونية وإدراج اللوحة الإلكترونية وإدراجها في نظام تحليل الخلية في الوقت الفعلي.
    2. انقر فوق تحليل البيانات زر لحساب معدل التكاثر والكمية باستخدام الحد الأقصى لمؤشر الخلية وبيانات المنحدر التي تم الحصول عليها من نظام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي (الشكل 2). بعد ذلك ، قم بتحليل البيانات باستخدام برنامج إحصائي مناسب (الشكل 3C ، D).

2. النموذج 2: مقايسة معالجة الوسائط المشروط باستخدام نظام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي

  1. زراعة الخلايا وتحريض الشيخوخة (اليوم 1-2)
    1. بذور 35 × 104 خلايا هيلا في كل بئر من 6 صفيحات بئر تحتوي على 2.5 مل من وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) مكمل بنسبة 10٪ مصل بقري الجنين (FBS) ، والبنسلين (100 وحدة / مل) ، والستربتومايسين (0.1 ميكروغرام / مل) واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    2. في اليوم التالي ، استبدل وسط الخلايا ب 2.5 مل من الوسط الكامل الطازج. عالج الخلايا ب 300 نانومتر دوكسوروبيسين مباشرة عن طريق إضافته إلى الوسط للحث على الشيخوخة الخلوية. حافظ على لوحة 6 آبار في حاضنة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
  2. بذر الخلايا غير الشائخة (اليوم 4)
    1. بذور 35 × 104 خلايا هيلا غير معالجة (تحكم غير شائخة) لكل بئر من صفيحة جديدة مكونة من 6 آبار في 2.5 مل من DMEM مكملة بنسبة 10٪ من مصل أبقار الجنين والبنسلين (100 وحدة / مل) والستربتومايسين (0.1 ميكروغرام / مل) والحفاظ عليها في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  3. قم بإجراء تأكيد تحريض الشيخوخة كما هو موضح في الخطوة 1.3.
  4. تحضير وسط مكيف من خلايا HeLa الشائخة وغير الشائخة
    1. افحص كل من الخلايا المعالجة بالدوكسوروبيسين (الخلايا الشائخة) وخلايا HeLa غير المعالجة (الخلايا غير الشائخة) تحت مجهر تباين الطور. تحت المجهر ، يكون للخلايا الشائخة مورفولوجيا متضخمة أكثر بكثير من الخلايا الطبيعية.
    2. استنشاق وسط الاستزراع من كل من 6 صفيحات بئر (خلايا HeLa الشائخة وغير الشائخة). اغسل الخلايا 2x باستخدام PBS المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية لإزالة بقايا المصل وبقايا الخلايا.
    3. أضف 2 مل من DMEM الخالي من المصل المكمل بالبنسلين (100 وحدة / مل) والستربتومايسين (0.1 ميكروغرام / مل) إلى كل بئر. احتضان الخلايا في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 48 ساعة.
  5. جمع وتركيز الوسائط المشروطة (اليوم 7)
    1. اجمع الوسائط المكيفة من كل بئر في أنابيب معقمة في كابينة أمان صفحية.
    2. قم بتهريب الخلايا وعد الخلايا باستخدام طريقة استبعاد صبغة التربان الزرقاء باستخدام مقياس الخلايا الدموية لتطبيع الوسائط المكيفة لأرقام الخلايا.
    3. اضبط الوسائط المكيفة ، التي تم تطبيعها وفقا لعدد الخلية ، إلى الحجم النهائي 2 مل مع DMEM الخالي من المصل المكمل بالبنسلين (100 وحدة / مل) والستربتومايسين (0.1 ميكروغرام / مل) في أنابيب معقمة سعة 2 مل.
    4. قم بالطرد المركزي للوسائط المكيفة التي تم جمعها عند 1,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة حطام الخلية ، متبوعا بالطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية للحصول على المادة الطافية المصفاة.
    5. قم بالطرد المركزي للوسائط المكيفة باستخدام وحدات مرشح طرد مركزي فائق سعة 2 مل عند 4 درجات مئوية لمدة 60 دقيقة عند 3,000 × جم لتركيزها. يركز هذا الإجراء الوسائط المكيفة سعة 2 مل إلى 5 أضعاف 400 ميكرولتر المركزة من الوسائط المكيفة.
    6. قم بتخفيف 40 ميكرولتر من الوسائط المكيفة التي تم الحصول عليها بوسط جديد خال من المصل لتحضير وسائط مركزة مركزة 1x و 2x و 3x في أنابيب معقمة في كابينة أمان صفحية.
      ملاحظة: نظرا لأن الوسط المتبقي على الخلايا لمدة 48 ساعة قد استنفد بسبب الاستهلاك الخلوي ، يتم تخفيف الوسائط المكيفة المجمعة والمركزة لاحقا بوسط جديد.
  6. بذر الخلايا لعرض اللوحة الإلكترونية
    1. قم بإعداد نظام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي كما هو موضح في الخطوات 1.1-1.4.اغسل خلايا HeLa غير الشائخة باستخدام PBS الدافئ مسبقا ، ثم استنطقها.
    2. أضف 1 مل من التربسين المسخن مسبقا بنسبة 0.05٪ وحافظ على القوارير عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين لفصل الخلايا. قم بتحييد التربسين ب 5 مل من DMEM الكامل المكمل ب 10٪ مصل بقري الجنين ، البنسلين (100 وحدة / مل) ، والستربتومايسين (0.1 ميكروغرام / مل).
    3. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق كريات الخلية في 5 مل من DMEM الكامل المكمل ب 10٪ من مصل أبقار الجنين ، والبنسلين (100 وحدة / مل) ، والستربتومايسين (0.1 ميكروغرام / مل).
    4. عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام طريقة استبعاد الصبغة الزرقاء trypan باستخدام مقياس الخلايا الدموية.
    5. بذور خلايا HeLa غير الشائخة بكثافة 5 × 103 خلايا / بئر في كل بئر من عرض لوحة إلكترونية واحدة في 200 ميكرولتر من DMEM الكامل المكملة ب 10٪ مصل أبقار الجنين والبنسلين (100 وحدة / مل) والستربتومايسين (0.1 ميكروغرام / مل).
    6. ضع عرض اللوحة الإلكترونية في مهد نظام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي للسماح للخلايا بالالتصاق بسطح اللوحة في الحاضنة.
    7. اختر الخطوة الثانية في زر الجدول الزمني وانقر فوق تشغيل زر لبدء قياس المعاوقة باستخدام برنامج RTCA 2.0 (الشكل 2). انقر فوق الزر "إيقاف مؤقت" على البرنامج بعد 6 ساعات من طلاء خلايا HeLa غير الشائخة (الشكل 2).
    8. استنشق وسط الاستزراع برفق من كل بئر في عرض اللوحة الإلكترونية لإزالة المصل والخلايا غير الملتصقة. اغسل الآبار 2x باستخدام PBS المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية.
    9. أضف الوسائط المكيفة التي تم تسخينها مسبقا إلى 37 درجة مئوية في المجموعات المناسبة:
      المجموعة 1: وسائل الإعلام الجديدة
      المجموعة 2: 1x وسائط مكيفة لخلايا HeLa غير شائخة
      المجموعة 3: 2x وسائط مكيفة لخلية HeLa غير الشائخة
      المجموعة 4: 3x وسائط مكيفة لخلايا HeLa غير شائخة
      المجموعة 5: 1x وسائط مكيفة لخلية HeLa الشائخة
      المجموعة 6: 2x وسائط مكيفة لخلايا HeLa الشائخة
      المجموعة 7: 3x وسائط مكيفة لخلايا HeLa الشائخة
    10. أدخل عرض اللوحة الإلكترونية في نظام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي وانقر فوق تشغيل لاستئناف المراقبة في الوقت الفعلي لقيم فهرس الخلية على فترات 15 دقيقة لمدة 48 ساعة (الشكل 2).
    11. قم بإيقاف تشغيل نظام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي عند انتهاء وقت التجربة (الشكل 4 أ).
  7. تصوير الخلايا على عرض اللوحة الإلكترونية
    1. افحص عرض اللوحة الإلكترونية مباشرة تحت مجهر تباين الطور بتكبير 10x (الشكل 4 ب). نظرا لإزالة أربعة صفوف من مستشعرات الأقطاب الكهربائية الدقيقة من مركز كل بئر في عرض اللوحة الإلكترونية ، تم إنشاء مساحة لتمكين مراقبة الخلايا بواسطة الميكروسوبي.
  8. تحليل البيانات
    1. تطبيع قيم CI في النقطة الزمنية التي تم فيها إعطاء الوسائط المكيفة المركزة لخلايا HeLa غير الشائخة.
    2. انقر فوق تحليل البيانات زر لحساب معدل التكاثر والكمية باستخدام الحد الأقصى لمؤشر الخلية وبيانات الانحدار التي تم الحصول عليها من نظام تحليل الخلية في الوقت الفعلي (الشكل 2). بعد ذلك ، قم بتحليل البيانات باستخدام برنامج إحصائي مناسب (الشكل 4 ج ، د).

3. النموذج 3: المراقبة في الوقت الحقيقي لتفاعل الخلية والخلية

  1. زراعة الخلايا وتحريض الشيخوخة (اليوم 1-2)
    1. بذور 8 × 105 خلايا هيلا في قارورة مزرعة T25 تحتوي على 5 مل من وسط النسر المعدل (DMEM) من دولبيكو مكمل بنسبة 10٪ مصل بقري الجنين (FBS) ، والبنسلين (100 وحدة / مل) ، والستربتومايسين (0.1 ميكروغرام / مل) واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    2. في اليوم التالي ، استبدل وسط الخلايا ب 5 مل من الوسط الكامل الطازج. عالج الخلايا ب 300 نانومتر دوكسوروبيسين مباشرة عن طريق إضافته إلى الوسط للحث على الشيخوخة الخلوية. حافظ على قارورة T25 في حاضنة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
  2. بذر الخلايا غير الشائخة (اليوم 4)
    1. بذور 8 × 105 خلايا GFP-HeLa (تحكم غير شائخة) في قارورة T25 جديدة في 5 مل من DMEM مكملة بنسبة 10٪ من مصل أبقار الجنين والبنسلين (100 وحدة / مل) والستربتومايسين (0.1 ميكروغرام / مل) والحفاظ عليها في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    2. بذور 8 × 105 خلايا هيلا (تحكم غير شائخة) في قارورة T25 جديدة في 5 مل من DMEM مكملة بنسبة 10٪ مصل بقري الجنين والبنسلين (100 وحدة / مل) والستربتومايسين (0.1 ميكروغرام / مل) والحفاظ عليها في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  3. قم بتأكيد تحريض الشيخوخة كما هو موضح في الخطوة 1.3 (اليوم 5).
  4. الخلايا المشتركة
    1. تحقق من الخلايا المعالجة بالدوكسوروبيسين ، و GFP-HeLa غير المعالجة ، وخلايا HeLa غير المعالجة تحت مجهر تباين الطور قبل بذر الخلايا. تحت المجهر ، يكون للخلايا الشائخة مورفولوجيا متضخمة أكثر بكثير من الخلايا الطبيعية.
    2. اغسل جميع قوارير T25 الثلاثة ب 5 مل من PBS المعقمة المسخنة مسبقا ، ثم استنشاقها. أضف 1 مل من التربسين المسخن مسبقا بنسبة 0.05٪ وحافظ على القوارير عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين لفصل الخلايا.
    3. قم بتحييد التربسين ب 5 مل من DMEM الكامل المكمل ب 10٪ مصل بقري الجنين ، البنسلين (100 وحدة / مل) ، والستربتومايسين (0.1 ميكروغرام / مل).
    4. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق كريات الخلية في 5 مل من DMEM الكامل المكمل ب 10٪ من مصل أبقار الجنين ، والبنسلين (100 وحدة / مل) ، والستربتومايسين (0.1 ميكروغرام / مل).
    5. عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام طريقة استبعاد الصبغة الزرقاء trypan باستخدام مقياس الخلايا الدموية. خلايا البذور في 200 ميكرولتر من DMEM الكامل مكملة ب 10٪ مصل بقري الجنين ، البنسلين (100 وحدة / مل) ، والستربتومايسين (0.1 ميكروغرام / مل).
    6. خلايا البذور على μ منزلق 8 آبار عالية تحت ثلاثة إعدادات تجريبية مختلفة:
      المجموعة 1: 7 × 103 خلايا GFP-HeLa
      المجموعة 2: 18 × 103 خلايا HeLa غير شائخة + 7 × 103 خلايا GFP-HeLa
      المجموعة 3: 18 × 103 خلايا HeLa الشيخوخة + 7 × 103 خلايا GFP-HeLa
    7. حافظ على μ الشريحة لمدة 8 ساعات للتثبيت عند 37 درجة مئوية في حاضنة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. بعد 8 ساعات ، اغسل الخلايا باستخدام PBS المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) 2x للقضاء على تأثير المصل على الخلايا.
    8. أضف 200 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل المحتوي على البنسلين (100 وحدة / مل) والستربتومايسين (0.1 ميكروغرام / مل) إلى كل بئر.
  5. إعداد المجهر
    1. قم بتشغيل وحدة التحكم في درجة الحرارة ووحدة التحكمCO2 واسمح لنظام الحضانة العلوي للمرحلة بالاستقرار لمدة 30 دقيقة.
    2. تحقق من إعدادات تركيز ثاني أكسيد الكربونودرجة الحرارة يدويا وتأكد من الوصول إلى الظروف الفسيولوجية (5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، 37 درجة مئوية).
    3. قم بتشغيل المجهر الفلوري المقلوب واسمح للنظام بإكمال المعايرة الذاتية. قم بتشغيل مصدر ضوء التألق. قم بتشغيل برنامج التصوير والتحليل للتحكم في معلمات التصوير والحصول على الصور.
  6. التصوير بفاصل زمني
    1. ضع الشريحة على غرفة الحضانة العلوية للفحص المجهري المضان المقلوب بكاميرا رقمية عالية الدقة. افتح البرنامج وحدد أوضاع الجزء X و Y و Z و T ، وقم بإجراء تجارب المرحلة في إعدادات الاستحواذ (الشكل 5 أ).
    2. حدد هدفا بمعدل 20 ضعفا مع تباين عال لتصوير التألق وتباين الطور (الشكل 5 أ). أضف قنوات تباين الطور والتألق (مرشح FITC) لتمكين التصوير في كلا الوضعين (الشكل 5 أ).
    3. انقر فوق الزر Live لبدء تصوير الخلايا الحية، ثم اجعل الخلايا في التركيز البؤري تحت تباين الطور (الشكل 5 أ). افتح نافذة z-stack وحدد موضع الخلايا ذات الأهمية (التي تحتوي على كل من خلايا HeLa الشائخة / غير الشائخة وخلايا GFP HeLa). تنقل في المرحلة بين الآبار باستخدام وحدة التحكم التلقائية في المرحلة ، مما يسمح بتحديد موقع دقيق للمناطق المحددة لتحديد الموقع (الشكل 5 أ).
      ملاحظة: بهذه الطريقة ، يمكن تحديد أكثر من منطقة واحدة في نفس بئر الشريحة.
    4. قم بتبديل القناة إلى قناة التألق لبدء التصوير الفلوري. اضبط إعدادات التعريض الضوئي المناسبة (89.506 مللي ثانية) والكسب (10) والشدة (136) (الشكل 5 أ).
      ملاحظة: تختلف هذه المعلمات اعتمادا على شدة التألق للخلايا التي تعبر عن بروتين الفلورسنت.
    5. حدد فاصلا زمنيا μm z-stack ، واضبط المواضع العلوية والسفلية ، وقم بتكوين z-stack تحت تباين الطور (الشكل 5 أ). انقر فوق إيقاف لإغلاق خيار البث المباشر.
    6. قم بتعيين المدة (48 ساعة) والفاصل الزمني (30 دقيقة) باستخدام حقلي المدة والفاصل الزمني للتصوير بفاصل زمني.
    7. انقر فوق ابدأ لبدء التصوير لمدة 48 ساعة (الشكل 5 أ). احفظ المشروع بعد 48 ساعة (الشكل 5 أ).
    8. في كل نقطة زمنية (0 ساعة و 48 ساعة) ، حدد أفضل إطار من z-stack ، وقم بتصدير الصورة (الشكل 5A).
    9. عد الخلايا الموجبة ل GFP في 0 ساعة و 48 ساعة ، واحسب النسبة المئوية للزيادة في الخلايا الإيجابية ل GFP ، وقم بتحليل البيانات باستخدام برنامج مناسب (الشكل 1D ، E).
  7. إنشاء فيلم
    1. انقر فوق إظهار المعرض لعرض جميع الصور الملتقطة منظمة حسب النقاط الزمنية وطبقات z-stack (الشكل 5 ب).
    2. لكل نقطة زمنية ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق الصورة الأفضل تركيزا من z-stack المقابل وحدد تحديد الإبهام في صف واحد. احفظ الإطارات المحددة (الشكل 5 ب).
    3. كرر هذه العملية على حدة لكل موقف. للمساعدة في تحديد الصور الأكثر تركيزا، استخدم وظيفة البحث عن أفضل إطارات مركزة. احفظ الصور المحددة من خلال خيار Save Selected Frames. يتم تحميل الصور المحفوظة تلقائيا في قسم المشروع المفتوح.
    4. انقر بزر الماوس الأيمن فوق الفيلم وحدد تصدير الصورة بمجرد تحميل تسلسلات الصور بالكامل.
    5. انتقل إلى علامة التبويب فيلم في نافذة التصدير ، واضبط معدل الإطارات المطلوب (إطارات في الثانية) ، وحدد خيارات إضافية مثل شريط المقياس والطابع الزمني وما إلى ذلك ، إذا لزم الأمر ، وقم بإنهاء التصدير عن طريق اختيار وجهة باستخدام خيار التصفح (الشكل 5 ب ، الفيديو 1 ، الفيديو 2 ، والفيديو 3).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بحثت هذه المجموعة التمثيلية من التجارب في التأثيرات المحتملة للنمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالشيخوخة المشتق من الخلايا السرطانية الشائخة على الخلايا السرطانية الأخرى. لذلك ، تم التأكيد لأول مرة على ما إذا كان العلاج بالدوكسوروبيسين لمدة 72 ساعة يمكن أن يحفز الشيخوخة في خلايا HeLa باستخدام تلطيخ SA-β-Gal. في الخلايا الشائخة ، يظل الإنزيم الليزوزومي β-galactosidase نشطا حتى عند درجة الحموضة المنخفضة ويشق الركيزة الكروموجينية X-gal ، مكونا راسب أزرق17. وبالتالي ، فإن وجود الخلايا الملطخة باللون الأز...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتبر التفاعلات الديناميكية للخلايا السرطانية في بيئتها المكروية ضرورية لتطور الورم ، مما يؤثر على تحريض ورم خبيث وتطور ورم ثانوي. يذكر أيضا أن السرطان الشيخوخة والخلايا اللحمية تنظم البيئات الدقيقة للورم من خلال العوامل التي تفرز من الخلايا الشائخة4. تحفز هذه العوامل تكاثر الخلايا ، والهجرة ، والغزو ، والتمايز ، وزيادة مقاومة الأدوية المتعددة4،13. وبالتالي ، فإن فهم تأثير SASP على الخلايا السرطانية المحيط...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من قبل وحدة المشاريع العلمية في جامعة غازي (رمز المنحة: TOA-2021-7321) و TUBITAK (رمز المنحة: 122S564 و 223S969).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
&-الشريحة 8 بئر عاليةfigure-materials-1bidi80806
0.05٪ تريبسين-إيدتا (1X)جيبكو25300-054
وحدات المرشح الطرد المركزي Amicon Ultra (Ultracel-3K)ميليبورUFC200324
حاضنة CO<تحت >2تحت > (37&00; C، 5٪ CO2)سانيو
CO2-Controller 2000 Pecon 
DMEMجيبكو41966-029
دوكسوروباسينتوكريس2252
لوحة E INSERT 16 ACEA Biosciences/Agilent6 465 382 001
عرض E-plate 16 ACEA Biosciences/Agilent300 601 140
FBSجيبكوA5256701
خلايا هيلاfigure-materials-2معهد AP، أنقرة، تركياHÜ KÜ K No: 90061901 
مجهر لايكا DMi8 المقلوب الفلوري  لايكا
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)جيبكو70011-044
مجموعة التلوين المرتبطة بالشيخوخة &بيتا-جالاكتوسيداز (SA-&بيتا;-غال)الإشارات عبر الخلايا9860s
نظام الحضانة في قمة المرحلةPecon 
متحكم الحراري 2002-2 Pecon 
صبغة تريبان الزرقاءسيغماT8154
xCELLigence RTCA DP system ACEA Biosciences/Agilent

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Su, J., et al. Cell-cell communication: new insights and clinical implications. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 196(2024).
  2. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res. 25, 585-621 (1961).
  3. Ewald, J. A., Desotelle, J. A., Wilding, G., Jarrard, D. F. Therapy-induced senescence in cancer. J Natl Cancer Inst. 102 (20), 1536-1546 (2010).
  4. Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent Cells in Cancer Therapy: Friends or Foes. Trends Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).
  5. Wang, J., et al. The Common Hallmarks and Interconnected Pathways of Aging, Circadian Rhythms, and Cancer: Implications for Therapeutic Strategies. Research (Wash D C). 8, 0612(2025).
  6. Simay, Y. D., Ozdemir, A., Ibisoglu, B., Ark, M. The connection between the cardiac glycoside-induced senescent cell morphology and Rho/Rho kinase pathway. Cytoskeleton (Hoboken). 75 (11), 461-471 (2018).
  7. Ozdemir, A., Simay Demir, Y. D., Yesilyurt, Z. E., Ark, M. Senescent cells and SASP in cancer microenvironment: New approaches in cancer therapy. Adv Protein Chem Struct Biol. 133, 115-158 (2023).
  8. Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
  9. Heckenbach, I., et al. Nuclear morphology is a deep learning biomarker of cellular senescence. Nat Aging. 2 (8), 742-755 (2022).
  10. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
  11. Kuilman, T., Peeper, D. S. Senescence-messaging secretome: SMS-ing cellular stress. Nat Rev Cancer. 9 (2), 81-94 (2009).
  12. Simay Demir, Y. D., Ozdemir, A., Sucularli, C., Benhur, E., Ark, M. The implication of ROCK 2 as a potential senotherapeutic target via the suppression of the harmful effects of the SASP: Do senescent cancer cells really engulf the other cells. Cell Signal. 84, 110007(2021).
  13. Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discov. 7 (2), 165-176 (2017).
  14. Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Multifunction co-culture model for evaluating cell-cell interactions. Methods Mol Biol. 1202, 29-36 (2014).
  15. Ozdemir, A., et al. Cardiac glycoside-induced cell death and Rho/Rho kinase pathway: Implication of different regulation in cancer cell lines. Steroids. 109, 29-43 (2016).
  16. zdemir, A., Ibisoglu, B., Simay, Y. D., Polat, B., Ark, M. Ouabain induces Rho-dependent rock activation and membrane blebbing in cultured endothelial cells. Mol Biol. 49 (1), 138-143 (2015).
  17. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  18. Simay Demir, Y. D., et al. Antimigratory effect of pyrazole derivatives through the induction of STAT1 phosphorylation in A549 cancer cells. J Pharm Pharmacol. 73 (6), 808-815 (2021).
  19. Ariffin, N. S. The CellProfiler pipeline analysis of cell migration. Acta Histochem. 125 (7), 152074(2023).
  20. Li, D., et al. Decoding the crossroads of aging and cancer through single-cell analysis: Implications for precision oncology. Int J Cancer. 157 (5), 807-818 (2025).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HeLa

مقالات ذات صلة