مقالة منهجية

الكشف عن تعديل الفسفرة باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام Phos-tag SDS-PAGE ومقايسة كيناز في المختبر

DOI:

10.3791/68884

⸱

أغسطس 8, 2025

 ,  , 
1Department of Gastroenterology, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 2Medical School of Nanjing University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول إجراءات الكشف عن التغيرات في تعديلات الفسفرة للبروتينات المستهدفة باستخدام الرحلان الكهربائي لجل Phos-tag في العينات السريرية وفحوصات كيناز في المختبر .

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفسفرة هي تعديل كلاسيكي بعد الترجمة ينظم وظيفة البروتين. تحتوي البروتينات عادة على العديد من مواقع الفسفرة المحتملة ، والتي يمكن تعديلها بواسطة كينازات مختلفة في مواقع مختلفة. غالبا ما تتطلب دراسة تغيرات الفسفرة للبروتينات المستهدفة في المرض أجساما مضادة خاصة بالفوسفو. ومع ذلك ، قد تقتصر الخيارات التجارية على موقع واحد أو غير متاحة تماما. هنا ، يتم وصف طريقة للكشف عن التغيرات في تعديلات الفسفرة للبروتينات المستهدفة في العينات السريرية باستخدام الرحلان الكهربائي لجل Phos-tag وتحديد مواقع الفسفرة التفصيلية من خلال فحوصات كيناز في المختبر . تظهر البروتينات الفسفرية المرتبطة بعلامة Phos-tag معدلات هجرة أبطأ في الرحلان الكهربائي للهلام SDS-PAGE ، مما يتيح التحليل شبه الكمي لتغيرات الفسفرة في أنسجة المرض بناء على متوسط شدة البكسل للنطاقات المهاجرة ببطء. من خلال الجمع بين Phos-tag SDS-PAGE مع النشاف المناعي باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالعموم ضد العديد من البروتينات المرشحة ، يمكن للباحثين تحديد البروتينات المستهدفة بكفاءة مع تغييرات الفسفرة. بعد فحص الكينازات المرشحة ، يتم إجراء فحوصات كيناز في المختبر باستخدام البروتين المستهدف ، وتخضع المنتجات الفسفرة الناتجة لقياس الطيف الكتلي لتحديد الموقع بدقة. لا تتطلب هذه الطريقة أجساما مضادة محددة للبروتين الفسفري ، مما يسمح بفحص عينات الأنسجة على نطاق واسع لتحديد حالات الفسفرة المتغيرة في المرض. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام مواقع الفسفرة المحددة لتطوير أجسام مضادة محددة للتحليل الكمي والتوطين في أنسجة المرض ، مما يوفر رؤى أعمق حول أدوارها الوظيفية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفسفرة هي تعديل رئيسي بعد الترجمة لتعديل التوطين تحت الخلوي ونشاط كيناز ونشاط النسخ للبروتينات. تم العثور على أكثر من 500 جين من جينات كيناز البروتين في الجينوم البشري ، والتي تشارك في نقل الإشارة ، والتعبير الجيني ، وتفاعل البروتينوالبروتين 1. تخضع الفسفرة وإزالة الفسفرة لسيطرة العديد من الكينازات ، والتي يمكن عكسها بسرعة لتنظيم التصاق الخلايا وتكاثر الخلايا وتمايز الخلايا2. ومع ذلك ، فإن تعديلات فسفرة البروتين غير الطبيعية مسؤولة عن العديد من الأمراض البشرية ، بما في ذلك تكوين الأورام واضطرابات المناعة الذاتية والتنكس العصبي وشدة الخصوبة3،4،5.

ينتج عن التنميط الفوسفوروبروتيني للعينات السريرية العديد من البروتينات الفسفرية المرشحة تفاضليا6. للكشف عن تعديلات الفسفرة الرئيسية في الأمراض البشرية ، من الضروري وجود طريقة سهلة وفعالة للكشف عن حالة الفسفرة للبروتينات المستهدفة المحددة. يمكن أن تؤدي الفسفرة في مواقع مختلفة إلى تغييرات وظيفية مميزة في البروتين. ومن ثم ، فإن استخدام الأجسام المضادة الخاصة بالفسفرة التي تستهدف مواقع معينة من الأحماض الأمينية هو بلا شك أفضل طريقة للكشف عن التغيرات في فسفرة البروتين. ومع ذلك ، فإن الأجسام المضادة الخاصة بالفوسفو المميزة جيدا غائبة للعديد من البروتينات. بالإضافة إلى ذلك ، هناك حاجة إلى نهج أكثر ملاءمة لتحديد مواقع الفسفرة المحتملة الجديدة. غالبا ما يغير الفسفرة في بقايا معينة من الأحماض الأمينية معدل هجرة البروتين في الرحلان الكهربائي للهلام ، ويمكن أن تعكس النطاقات البطيئة الهجرة التغيرات في حالة الفسفرة7. ومع ذلك ، عادة ما تكون هذه التحولات في التنقل دقيقة ، مما يجعل من الصعب تمييزها. Phos-tag هو مركب كيميائي مركب مصمم من مجال تحفيزي للفوسفاتيز القلوي كنموذج ، والذي يمكنه التقاط بقايا Ser / Thr / Tyr و His / Asp / Lys الفسفرة. لذلك ، يؤدي اقتران علامة الفوسفورة بشكل فعال إلى تضخيم الاختلافات في معدل الهجرة بين البروتينات الفسفرة وغير الفسفرة ، مع تمييز الاختلافات في عدد مواقع الفسفرة8.

توفر هذه المنهجية القائمة على علامة الفوس للكشف عن تغيرات فسفرة البروتين المستهدف في عينات الأنسجة مزايا مميزة مقارنة بالأساليب التقليدية. بشكل حاسم ، أنه يلغي الحاجة إلى الأجسام المضادة الخاصة بالفوسفو ، وبدلا من ذلك يستخدم الأجسام المضادة القياسية الخاصة بالبروتين من الدرجة WB للكشف. يتم حل الأشكال الفسفرة وغير الفسفرة للبروتينات المستهدفة كنطاقات متميزة أثناء Phos-tag SDS-PAGE ، مما يتيح التقييم شبه الكمي لتغيرات مستوى الفسفرة في حالات المرض من خلال تحليل شدة النطاق المقارن. يتضمن سير العمل في هذا البروتوكول: (1) فصل Phos-tag SDS-PAGE لعينات البروتين ، (2) فحص اللطخة المناعية للأهداف الفسفرية ، (3) فحوصات كيناز في المختبر مع الكينازات المرشحة التي تم التحقق منها بواسطة الأجسام المضادة phospho-Ser / Thr. يحدد تحليل قياس الطيف الكتلي اللاحق (الذي يتم إجراؤه بواسطة منصة خدمة خارجية) مواقع الفسفرة لتمكين تطوير الأجسام المضادة الخاصة بالموقع. المنهجية التفصيلية غير مدرجة في البروتوكول الحالي. والجدير بالذكر أن هذا النهج تم تطبيقه بنجاح للكشف عن تغيرات الفسفرة Nur77 في العينات السريرية ، وتحديد Mst1 كيناز باعتباره منظم المنبع لفسفرة Nur77 وتطوير جسم مضاد فوسفوي خاص بالموقع للكشف السريري عن الفسفرة في ثريونين 366 من Nur779. لذلك ، يثبت هذا النهج أنه ذو قيمة خاصة خلال مراحل البحث الأولية عند التحقيق في العديد من البروتينات المرشحة ، لأنه يسمح بفحص واسع النطاق لتغيرات حالة الفسفرة عبر العديد من الأهداف باستخدام الأجسام المضادة المتاحة تجاريا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وافقت مجالس المراجعة المؤسسية في مستشفى نانجينغ درام تاور على البحث البشري (2013-408081-01). تم إنشاء البروتوكول الحالي باستخدام أنسجة بطانة الرحم كنموذج تمثيلي. مع التحسين المناسب ، يمكن توسيع هذه المنهجية لتشمل عينات سريرية أخرى ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر أنسجة الورم لاستخراج البروتين والتحليلات اللاحقة. يتم إجراء خزعة بطانة الرحم في مرحلة منتصف الإفراز من النساء الخصوبات (المجموعة الشاهدة) والنساء المصابات بفشل زرع الأجنة المتكرر اللواتي يخضعن للتخصيبفي المختبر - نقل الأجنة (مجموعة المرض). قدم جميع المرضى موافقة مستنيرة قبل إجراء أخذ العينات. الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير العينات

  1. اشطف عينات الأنسجة الطازجة التي تم الحصول عليها مرتين باستخدام PBS المبرد مسبقا لإزالة خلايا الدم ، وافصل ما يقرب من 100 مجم من الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل.
  2. ضع الأنسجة في أنبوب طحن دائري القاع سعة 2 مل يحتوي على 1 مل من محلول تحلل بروتين الأنسجة (150.0 مليمول / لتر كلوريد الصوديوم ، 1.0٪ NP-40 ، 50.0 مليمول / لتر تريس درجة الحموضة 8.0 ، 0.5٪ ديوكسيكولات الصوديوم ، كوكتيل مثبط البروتياز ، وكوكتيل مثبط الفوسفاتيز 2 و 3).
  3. اضبط سرعة موزع الأنسجة عالي السرعة على المستوى 5 (من أصل 6 مستويات) ، وطحن الأنسجة لمدة 10 ثوان ، متبوعة ب 30 ثانية من الحضانة على الجليد. كرر هذه العملية 5 مرات للحصول على تجانس الأنسجة.
  4. قم بتحليل الجانس عن طريق الدوران البطيء على شاكر عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية و 13,000 × جم لمدة 10 دقائق ، وجمع المادة الطافية.
  5. تحديد تركيز البروتين باستخدام طريقة BCA.
  6. خذ ما مجموعه 300 ميكروغرام من البروتين ، واضبطه على حجم متساو ، واخلطه مع 4× عازلة لعينة بروتين Laemmli. قم بتغيير طبيعة الخليط عن طريق تسخينه عند 95 درجة مئوية لمدة 8 دقائق ، وتبريده إلى درجة حرارة الغرفة ، ثم تحميله لمزيد من التحليل.
    ملاحظة: قبل الخطوة 2 ، يوصى بإجراء تحليلات النشاف الغربي التقليدية للكشف عن البروتين محل الاهتمام باستخدام الأجسام المضادة الكلية لتقييم مستويات التعبير.

2. تحضير جل جل Phos-tag SDS-PAGE

  1. تحضير 100 مل 30٪ وزن / حجم محلول أكريلاميد / N ، N'-methylene-bisacrylamide المختلط عن طريق إضافة 29.0 جم من مادة الأكريلاميد و 1.0 جم من N و N'-methylene-bisacrylamide.
    ملاحظة: يحفظ عند 4 درجات مئوية في الظلام.
  2. قم بإعداد محلول 1.5 مول / لتر Tris-HCl (درجة الحموضة 8.8) ، و 0.5 مول / لتر محلول Tris-HCl (درجة الحموضة 6.8) ، و 10٪ وزن / حجم محلول SDS ، و 10٪ وزن / حجم محلول بيرسلفات الأمونيوم كما هو مستخدم في SDS-PAGE التقليدي.
  3. قم بإعداد محلول 5.0 مليمول / لتر من محلول Phos-tag و 10 مليمول / لتر محلول MnCl2 خاص بجل Phos-tag SDS-PAGE.
  4. تحضير محلول جل قابل للحل ، في حالة تحضير محلول 10 مل مع 6 واط / حجم ٪ هلام بولي أكريلاميد مع محلول 50 ميكرومتر فوسم و 100 ميكرومتر MnCl2 ، عن طريق خلط 2 مل 30٪ (وزن / حجم) محلول مختلط من الأكريلاميد / ثنائي الأكريلاميد ، 2.5 مل 1.5 مول / لتر محلول تريس / حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.8) ، 0.1 مل 5.0 مليمول / لتر محلول فوس-تاغ ، 0.1 مل 10 مليمول / لتر محلول MnCl2 ، 0.1 مل 10٪ (وزن / حجم) محلول SDS ، 10 ميكرولتر من TEMED ، و 5.14 مل من الماء المقطر.
  5. قم بدوامة محلول الجل المحلل المحضر برفق لضمان التجانس ، ثم ضع أنبوب محلول الهلام في مجفف فراغ وقم بتطبيق فراغ (0.1 ميجا باسكال) لمدة دقيقتين حتى تختفي فقاعات مرئية.
  6. أضف 50 ميكرولتر من 10٪ بيرسلفات الأمونيوم واخلطها برفق ولكن جيدا.
  7. ضع المحلول على الفور في علبة الجل المجمعة حتى يصل إلى ~ 1 سم تحت الحافة العلوية للوحة القصيرة. تجنب إدخال الفقاعات.
  8. ضع طبقة بعناية من 0.5 مل من الماء المقطر فوق الجل لاستبعاد الهواء وضمان واجهة مسطحة. السماح بالبلمرة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة.
  9. في الوقت نفسه ، قم بإعداد محلول هلام قياسي للتكديس المخزن ثلاثي حمض الهيدروكلوريك (4.5٪ وزن / حجم جل بولي أكريلاميد) عن طريق خلط 0.6 مل 30٪ (وزن / حجم) محلول مختلط من أكريلاميد / بيس أكريلاميد ، 1 مل 0.5 مول / لتر محلول Tris-HCl (درجة الحموضة 6.8) ، 40 ميكرولتر 10٪ (وزن / حجم) محلول SDS ، 4 ميكرولتر TEMED و 2.33 مل ماء مقطر. بلطف دوامة والديغا.
  10. تأكد من أن الجل قد تصلب تماما (قم بإمالة كاسيت الجل لمراقبة إمالة الطبقة السائلة العليا مع تأكيد ثبات الواجهة الوسيطة). اسكب تراكب الماء بحذر ، ثم صفيه تماما.
  11. أضف 20 ميكرولتر من بيرسلفات الأمونيوم بنسبة 10٪ في محلول جل التكديس المحضر ، واخلطه برفق ، ثم قم بتثبيته على الفور فوق جل الحل.
  12. ضع مشطا بعناية من 10 أو 15 بئرا في محلول جل التكديس ، وتجنب الفقاعات. اترك جل التكديس يتبلمر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: قم دائما بإعداد الجل قبل الاستخدام مباشرة. يرجى تحسين تركيزات الأكريلاميد الموسومة بالفوس لكل بروتين ذي أهمية.

3. الرحلان الكهربائي ل Phos-tag SDS-PAGE

  1. قم بتجميع معدات الرحلان الكهربائي واملأ غرف القطب الكهربائي بمخزن تشغيل Tris / Glycine / SDS التقليدي.
  2. قم بتحميل 30 ميكروغرام من عينة البروتين في كل بئر باستخدام ماصة دقيقة.
  3. قم بإجراء الرحلان الكهربائي في ظل ظروف تيار مستمر (30 مللي أمبير / جل) حتى يصل اللون الأزرق البروموفينول إلى قاع الجل المحلل.
  4. انقع المواد الهلامية في SDS-PAGE Transfer Buffer الخالي من الميثانول مع 5 ملي مولار EDTA لمدة 10 دقائق مرتين لإزالة الكاتيونات ثنائية التكافؤ.
  5. انقل البروتينات إلى غشاء PVDF عند 90 فولت لمدة 90 دقيقة باستخدام أنظمة النشاف الرطب / الخزان.

4. النشاف المناعي والتحليل

  1. قم بسد الغشاء بمحلول 5٪ من الحليب الخالي من الدسم أو مسحوق زلال مصل الأبقار (مخفف في محلول 1×Tris-Borate-Sodium Tween-20 ، TBST) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  2. تمييع الجسم المضاد الأساسي ضد البروتين المستهدف بنسبة مناسبة واحتضانه بالغشاء عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  3. اغسل الغشاء 3 مرات باستخدام TBST ، 10 دقائق لكل غسلة ، في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف.
  4. احتضان الغشاء بجسم مضاد ثانوي مترافق ب HRP في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  5. اغسل الغشاء 3 مرات باستخدام TBST ، 10 دقائق لكل غسلة ، في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف.
  6. احتضن مع الركيزة التلألؤ الكيميائي المحسنة في الظلام لمدة 1 دقيقة ، متبوعة بالتعرض.
  7. التقط الصور باستخدام نظام توثيق هلام آلي ، وحدد النطاقات المستهدفة (البروتين المستهدف الفسفوري المهاجر ببطء والبروتين المستهدف غير الفسفري المهاجر بسرعة) لكثافة التدرج الرمادي باستخدام برنامج ImageJ.
    ملاحظة: لا يمكن استخدام البقع الغربية من المواد الهلامية Phos-Tag لإجراء تعيينات الوزن الجزيئي.
  8. احسب نسبة النطاقات الفسفرية المهاجرة ببطء إلى النطاقات غير الفسفرية المهاجرة بسرعة لكل عينة ، وقم بتحليل الفرق الإحصائي لنسبة الفسفرة بين المجموعات.

5. الترسيب المناعي للبروتين المستهدف

  1. قم ببناء بلازميدات التعبير التي تشفر علامات FLAG (أو علامات الحتمة البديلة بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر HA أو GFP أو GST أو His) من النوع البري أو الخاص بالموقع من البروتين المستهدف.
  2. قم بتحويل خلايا HEK293 مع بلازميدات التعبير باستخدام Lipofectamine 3000 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  3. خلايا الليز في 1 مل من محلول تحلل بروتين الأنسجة كما هو موضح في الخطوة 1 لاستخراج البروتين الطافي الطافي.
  4. احتضان المادة الطافية ب 20 ميكرولتر من جل التقارب المضاد ل FLAG M2 طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الدوران.
  5. جهاز طرد مركزي (1000 × جم ، 3 دقائق) ، يجمع حبات الاغاروز ، ويغسل ب 10 أحجام أعمدة من TBS لإزالة البروتينات المرتبطة بشكل غير محدد.
  6. قم بإذابة ببتيد FLAG في TBS إلى تركيز نهائي يبلغ 100 ميكروغرام / مل.
  7. قم بإزالة بروتين اندماج FLAG المرتبط من جل التقارب المضاد ل FLAG M2 عن طريق الشطف التنافسي بخمسة أحجام من عمود واحد من محلول الببتيد FLAG (استخدم محلول 100 ميكرولتر لحبات الاغاروز سعة 20 ميكرولتر) لمدة 5-10 دقائق مع الخلط اللطيف.
  8. جهاز طرد مركزي (1000 × جم ، 3 دقائق) وجمع طاف.
    ملاحظة: إذا كان الكيناز معروفا ، فانتقل إلى الخطوة 6 ؛ خلاف ذلك ، حدد أولا الكينازات المحتملة من خلال فحص الخميرة ثنائية الهجين أو التنبؤ بالمعلوماتية الحيوية (على سبيل المثال ، باستخدام PhosphositePlus أو نظام التنبؤ القائم على المجموعة) قبل المتابعة إلى الخطوة 6.

6. فحص كيناز في المختبر لتحديد الأحماض الأمينية الفسفرة

  1. تحضير عازلة كيناز (30 ميكرولتر لكل تفاعل): 40 ملي مولار هيبس pH7.6 ، 10 ملي مولار MgCl2 ، 1 ملي مولار EGTA ، 1 ملي مولار DTT ، 2.5 ملي مولار β-جليسيروفوسفات ، 200 ميكرومتر ATP ، 100 نانوغرام من كيناز نشط ، بروتين اندماج FLAG المترسب المناعي.
  2. احتضن عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في خلاط حراري مع تحريك لطيف.
  3. أوقف التفاعلات بإضافة 10 ميكرولتر 4× عازلة Laemmli ، وقم بتشويه عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  4. إجراء الرحلان الكهربائي التقليدي SDS-PAGE باستخدام بروتين اندماج FLAG المترسب المناعي الذي يتفاعل مع أو بدون كيناز نشط.
  5. مسبار باستخدام الأجسام المضادة للفوسفو والجسم المضاد للفوسفو Ser لتحديد الأحماض الأمينية الفسفرة. مسبار بجسم مضاد مضاد للعلم كعنصر تحكم (انظر جدول المواد).
  6. أكمل النشاف المناعي والتحليل كما هو موضح في الخطوة 4.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حدد التنميط الأولي للعينات الفوسفورية للعينات البشرية من المجموعة الضابطة ومجموعة المرض Nur77 كبروتين فسفري مرشح تفاضليا. لتقييم فعالية Phos-tag SDS-PAGE في الكشف عن فسفرة بروتين Nur77 ، تم إجراء تجربة Mn2 + -Phos-tag SDS-PAGE. بعد استخراج البروتين الكلي من عينات الأنسجة ، تم تحميل 30 ميكروغرام من البروتين وفصله عن طريق الرحلان الكهربائي لجل Mn2 + -Phos-tag ، متبوعا بالنقل إلى غشاء PVDF. تم إجراء النشاف المناعي باستخدام جسم مضاد أولي Nur77 متبوعا بجسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب مترافق ب HRP ، مع الكشف ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر النهج القائم على علامة الفوس للكشف عن تغيرات الفسفرة للبروتينات المستهدفة في الأنسجة السريرية مزايا كبيرة لأبحاث فسفرة البروتين. تظهر البروتينات الفسفرة حركية كهربائية منخفضة بسبب ارتباط علامة الفوس، مما يتيح الفحص عالي الإنتاجية لحالة الفسفرة للبروتينات المرشحة دون الحاجة إلى أجسام مضادة خاصة بالفوسفو. هذا ذو قيمة خاصة للتنميط الأولي على نطاق واسع للبروتينات المرشحة المتعددة. يمكن إعطاء الأولوية للبروتينات ذات تعديلات الفسفرة المتغيرة لاختبار كيناز اللاحق في المختبر لتحديد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب محتمل في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82271698) ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة جيانغسو (BK20231117).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10٪ SDS SolutionSangon BiotechB548118
10x Tris / Glycine / SDSBIO-RAD
4 مرات ؛   عازلة عينة البروتين LaemmliBIO-RAD1610747
أكريلاميدسانجون التكنولوجيا الحيويةA601032
بيركبريتات الأمونيومسانجون التكنولوجيا الحيويةA100486
جل التقارب المضادل FLAG M2 MilliporeA2220
طقم تلألؤ كيميائي محسنThermoFisher32106
FLAG الجسم المضادCST14793
FLAG  الببتيدMilliporeF3290
الأجسام المضادة الثانوية المترافقةتقنية BioworldBS13278
Lipofectamine 3000ThermoFisherL3000015
Mini Trans-Blot CellBIO-RAD1703930
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorestic CellBIO-RAD1658005
Mst1 الأجسامالمضادةCST3682
N ، N'-methylene-bisacrylamideSangon BiotechA600025
N ، N ، N '، N '، N'-TETRAMETHYLETHYLENEDIAMINE (TEMED)Sangon BiotechA610508
Nur77 الجسم المضادCST3960
كوكتيل مثبطات الفوسفاتيز 2SigmaP5726لتثبيط فوسفاتيز بروتين التيروزين والحمض و الفوسفاتيز القلوي
كوكتيل مثبط الفوسفاتيز 3سيجماP0044لتثبيط بروتين الفوسفاتيز 2A ، الفوسفاتيز القلوي ، بروتين الفوسفاتيز 1 و 2A
الأجسام المضادة للفوسفو سيرينسيجماP5747
الأجسام المضادة فوسفو ثريونينسيجماP6623
فوس-تاغ أكريلاميدواكو304-93526لإعداد علامة الفوسفات SDS PAGE جل
بيرس BCA بروتين الفحص كيتThermo  23227
كوكتيل مثبط البروتيازSigmaS8830EDTA-Free ، قرص ، لتثبيط غشاء PVDF للسيرين والسيستين والأسبارتيك والمعادن
؛Roche3010040001
ThermoMixerEppendorf2231001127
Tissue DisperserIKAT 10 & nbsp ؛للحصول على تجانس الأنسجة
عازلة Tris-HCl (0.5 متر ، درجة الحموضة 6.8)Sangon BiotechB546020
Tris-HCl Buffer (1.5 م ، درجة الحموضة 8.8)Sangon BiotechB546019
ThermoFisher5311-0250لإزالة الغاز من محلول الهلام
& -MercaptoethanolSigmaM3148
1610732 HRP مجفف الفراغ

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science (New York, N.Y.). 298 (5600), 1912-1934 (2002).
  2. Lim, S., et al. Regulation of mitochondrial functions by protein phosphorylation and dephosphorylation. Cell Biosci. 6, 25(2016).
  3. Pang, K., et al. Role of protein phosphorylation in cell signaling, disease, and the intervention therapy. MedComm. 3 (4), e175(2022).
  4. Bollu, L. R., Mazumdar, A., Savage, M. I., Brown, P. H. Molecular Pathways: Targeting protein tyrosine phosphatases in cancer. Clin Cancer Res. 23 (9), 2136-2142 (2017).
  5. Martin, L., et al. Tau protein kinases: involvement in Alzheimer's disease. Ageing Res Rev. 12 (1), 289-309 (2013).
  6. Bhardwaj, S., et al. Integrating the analysis of human biopsies using post-translational modifications proteomics. Protein Sci. 33 (4), e4979(2024).
  7. Kristjansdottir, K., Wolfgeher, D., Lucius, N., Angulo, D. S., Kron, S. J. Phosphoprotein profiling by PA-GeLC-MS/MS. J Proteome Res. 7 (7), 2812-2824 (2008).
  8. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
  9. Cai, X., et al. Mst1-mediated phosphorylation of Nur77 improves the endometrial receptivity in human and mice. EBioMedicine. 88, 104433(2023).
  10. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E. Improved Phos-tag SDS-PAGE under neutral pH conditions for advanced protein phosphorylation profiling. Proteomics. 11 (2), 319-323 (2011).
  11. Shih, H. H., et al. An ultra-specific avian antibody to phosphorylated tau protein reveals a unique mechanism for phosphoepitope recognition. J Biol Chem. 287 (53), 44425-44434 (2012).
  12. Cui, H., Loftus, K. M., Noell, C. R., Solmaz, S. R. Identification of cyclin-dependent kinase 1 specific phosphorylation sites by an in vitro kinase assay. J Vis Exp. (135), e57674(2018).
  13. Mehla, J., Caufield, J. H., Uetz, P. Mapping protein-protein interactions using yeast two-hybrid assays. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (5), 442-452 (2015).
  14. Ayati, M., Yilmaz, S., Blasco Tavares Pereira Lopes, F., Chance, M., Koyuturk, M. Prediction of kinase-substrate associations using the functional landscape of kinases and phosphorylation sites. Pac Symp Biocompu. 28, 73-84 (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة