Method Article

معالجة وتحليل العمليات المعتمدة على دورة الخلية في الخميرة الناشئة

DOI:

10.3791/68887

⸱

September 26th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل طريقتين لإيقاف دورة خلية الخميرة والإفراج الاختياري ، ويشرح بالتفصيل استخدام الفحص المجهري الفلوري لدراسة العمليات المعتمدة على دورة الخلية في S. cerevisiae.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتبع الخلايا حقيقية النواة دورة خلوية محفوظة تنظم عمليات متنوعة ، بما في ذلك صيانة الحمض النووي وتوازن العضية. غالبا ما تكون دراسة العمليات الخلوية بطريقة تعتمد على دورة الخلية ضرورية لتفسير النتائج التجريبية بشكل صحيح. هناك طرق كيميائية وجينية متاحة لإنتاج مزامنة دورة الخلية في الخلايا المستزرعة عبر مجموعة واسعة من الكائنات الحية ، بما في ذلك نماذج الفقاريات ، مما يتيح دراسة العمليات المعتمدة على دورة الخلية. ومع ذلك ، من بين الكائنات الحية النموذجية ، تظل الخميرة الناشئة مركزا قويا لتحليل دورة الخلية نظرا لطرق التزامن القوية بشكل خاص ، ووقت الجيل القصير ، وقابلية التتبع الجيني. تشترك الخميرة في آلات دورة الخلية الأساسية مع حقيقيات النوى الأخرى ، مما مكن من اكتشافات بارزة في تنظيم دورة الخلية. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل طرق تحليل دورة الخلية في الخميرة ، مع التركيز على تجارب إطلاق التوقف والانقسام G1 ، بما في ذلك بناء السلالة ، وإعداد المزرعة ، والفحص المجهري. يتم تقديم طرق وضع علامات PCR لإنتاج سلالات مناسبة لاعتقالات دورة الخلية والفحص المجهري الفلوري. يتم تحقيق إيقاف G1 باستخدام عامل α فرمون الببتيد ، ويؤدي الغسيل القصير إلى إطلاق متزامن وتقدم دورة الخلية. يتم أخذ العينات في نقاط زمنية مختلفة بعد إطلاقها في دورة الخلية وتثبيتها للفحص المجهري. الطريقة الثانية توقف خلايا الخميرة في الانقسام عن طريق استنفاد منظم دورة الخلية Cdc20 لتحقيق مجموعة سكانية تم إيقافها ، بالإضافة إلى الإطلاق الاختياري في الطور. يتم إصلاح العينات وإعدادها للتصوير قبل وبعد الإطلاق ، ويتم تصويرها وتحليلها. يركز تحليل الصور على فهرسة التوطين الديناميكي وتغيرات وفرة البروتينات السكانية في دورة الخلية. طرق التزامن هذه مناسبة للتلاعب بدورة الخلية المتنوعة ، وبينما يتم تسليط الضوء على استخدامها في تصوير الخلايا الثابتة هنا ، يمكن تكييفها للعديد من التحليلات الأخرى ، بما في ذلك تصوير الخلايا الحية بالإضافة إلى المقايسات الكيميائية الحيوية والجزيئية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تنظيم انقسام الخلايا حقيقية النواة بشكل كبير من خلال برنامج يسمى دورة الخلية. إن العمليات الديناميكية والمحفوظة للغاية التي تحدث في دورة الخلية تجعل من المثير للاهتمام الدراسة في حد ذاتها ، ولكن لها أيضا آثار واسعة الانتشار تعلم التحقيقات في العمليات البيولوجية للخلية الأخرى - على سبيل المثال ، تخضع العديد من العضيات لإعادة تشكيل دراماتيكية أثناء انقسام الخلية ، ويتم تنظيم وفرة وتوطين العديد من البروتينات بشكل كبير في جميع أنحاء1،2،3. على الرغم من وجود بعض طبقات التعقيد الإضافية الموجودة في أنظمة metazoan مقارنة بالخميرة ، بما في ذلك المز....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. بناء سلالات لتحليل دورة الخلية والتصوير

  1. تصميم الاشعال لوضع علامة على الجين ذي الأهمية باستخدام بلازميدات Pringle Tagging (بلازميدات pFA6a) 24. باختصار ، تصميم البادئات F2 و R1 التي ، عند استخدامها مع بلازميد سلسلة pFA6a ، تنتج منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يمكن تحويله مباشرة إلى خميرة لتوليد نسخة "ذات علامة" من الجين محل الاهتمام. استخدم أزواج التمهيدي والبلازميدات الواردة في الجدول 1 لوضع علامات على الجينات ذات الأهمية في هذا البروتوكول. تم وصف استراتيجيات تصميم البلازميد والتمهيدي لوضع علامات على المحطة C لجينات الخميرة بالتفصيل بواسطة Longtine et al.24....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن تحليل التغيرات في توطين البروتين المعتمد على دورة الخلية عن طريق الفحص المجهري الفلوري بسهولة باستخدام الطرق التي وصفناها هنا. لطالما اهتمت مجموعتنا بالتنظيم الديناميكي ووظيفة المغزل الانقسامي. في الخميرة ، تعمل أجسام قطب المغزل (المميزة بالمكون Spc110) كمراكز تنظيم للأنابيب الدقيقة تنبثق منها خيوط الأنابيب الدقيقة لإنشاء بنية المغزل الانقسامي30. يلعب بروتين ربط الأنابيب الدقيقة ، Stu2 ، دورا في تكوين المغزل عن طريق بلمرة الأن.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح استخدام مزامنة دورة الخلية في الخميرة الناشئة دراسة آليات مهمة لمجموعة متنوعة من العمليات الخلوية. يسمح استخدام إطلاق التوقف G1 مع العلاج α العامل بالتقدم المتزامن لمجموعة من الخلايا خلال مراحل دورة الخلية ، وكما أوضحنا ، يمكن أن يكشف عن أنماط التوطين الديناميكية للمنظمين الخلويين مثل Stu236. يمكن أيضا تحقيق توقيف دورة الخلية باستخدام الوسائل الجينية عن طريق استنفاد منظمات دورة الخلية مثل Cdc20 ، والتي تستخدم لإيقاف الخلايا في الطور الطوري. يسمح هذا .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر جامعة يوتا لتصوير الخلايا الأساسية للحفاظ على مرفق مجهر دلتا فيجن. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة F31CA2717405 (إلى M.G.S) و T32GM141848 (إلى M.G.S. و TCS) ، و 5 For the Fight (إلى MPM) ، و Pew Biomedical Scholars (إلى MPM) ، و NIH منحة R35GM142749 (إلى MPM).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
؟-عاملمنشأة التوليف الأساسي بجامعة يوتاالتسلسل: WHWLQLKPGQPMY
أنابيب إيبندورف سعة 1.5 ملأكسجينMCT-175-C
خليط dNTP 10 مللي ميالثيرمو ساينتفيكR0193
أنابيب مخروطية بحجم 50 ملجراينر بيو-ون227 261
5x مخزن تفاعل Phusion HFمختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةB0518S
حمض الخليك، العصر الجليديفيشر كيميكالBP2401C-212
ملح نصف كبريتات الأدينينسيغما-ألدرتشA9126-100G
أغار، محبيبأبيكس للكيماويات والكواشف20-275
الأغاروزمنتجات أبيكس بيوبريسيرش20-102GP
جهاز تعقيم البخار أمسكو سينشري على جهاز التعقيمستيريسSV-1262
ماء DI المعقم
أوكسينسيغما-ألدرتشCat#I3750-5G-A; CAS: 87-51-4
سائل ليزر كارجيلمختبرات كارجيل20130
دي-سوربيتولسيغما-ألدرتشS1876-500G
DAPI (40,6-دياميدينو-2-فينيل إندول، ديهيدروكلوريد)المجسات الجزيئيةCat#D1306
حمض الديوكسي ريبونوكليك ملح الصوديوم من خصيتي السلمونسيغما-ألدرتشD1626
ديكستروزفيشر كيميكالD16-10
ثنائي الصوديوم إيثيلينيديامين تترا أسيتاتفيشر كيميكالS811-10
DMSOثيرمو ساينتفيك20688
FIJI/ImageJ2 مقابل 2.14.0/1.54fImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
خلاط الدوامة الثابتة السرعةVWRhttps://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
المجهر الفلوري DV Ultraلايكاhttps://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwEالتسلسل #: NV01063. لم يعد مدعوما
فورمالدهيدفيشر كيميكالCat#F79-500
جهاز جلثيرمو ساينتفيكبومة إيزي كاست B1
خليط سلم DNA من جين رولرفيرمنتاسSM0333
خرز الزجاجفيشر ساينتيفك11312A
شرائح زجاجيةVWR48300-026
جهاز هزاز منصة Innova 2300نيو برونزويكNB-2300
كيموايبسكيمتيك06-666
جهاز طرد مركزي مختبر لأنابيب 1.5 ملإبندورف2525
جهاز طرد مركزي مختبر لأنابيب 50 ملإبندورف5804
ثنائي هيدرات أسيتات الليثيومسيغما-ألدرتشL4158-250G
ماستر سيكلير نيكسس X2إبندورفhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
الماصات الدقيقة p2، p20، p200 و p1000 والأطراف المقابلةراينينL-2XLS+R، L-20XLS-R، L-200XLS-R، L-1000XLS-R
زجاج المجهرفيشر ساينتيفك12541014
نوكودازولكالبيوكيمياءقط#487928; CAS: 31430-18-9; القطعة#B35705
أورانج جيسيغما-ألدرتشO7252
الوتدأبحاث هامبتونHR2-591
حبيبات بيبتون كواشف فيشر الحيويةBP9725-5
بوليميراز حمض نووي فيوجن HFمختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةM0530L
Pipet-XراينينPX-100R
فوسفات البوتاسيوم، ثنائي القاعديثيرمو ساينتفيك424195000
فوسفات البوتاسيوم، أحادي الأساسثيرمو ساينتفيك424200025
مصدر الطاقةبيو-راد23786
Start Acquire Ultra 1.2.2سوفت ووركس سايتيفاالحصول على البطاقة باستخدام DV Ultra
قاعدة تريسكواشف فيشر الحيويةBP152-10
ترايتون X-100سيغما-ألدرتش9002-93-1
دوار الأنابيبVWR10136-084
حمام الماءVWRWBE10A11B
الماء، ألترا بيورمنتجات أبيكس بيوبريسيرش18-194
مستخلص الخميرة محبيبكواشف فيشر الحيويةBP9727-5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carlton, J. G., Jones, H., Eggert, U. S. Membrane and organelle dynamics during cell division. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (3), 151-166 (2020).
  2. Cai, Y., et al. Experimental and computational framework for a dynamic protein atlas of human cell division. Nat....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Cycle AnalysisBudding YeastCell Cycle SynchronizationG1 Arrest ReleaseMitotic Arrest ReleaseChromosome SegregationFluorescence MicroscopyProtein LocalizationImageJ AnalysisSpindle Pole

Related Articles