Method Article

معالجة وتحليل العمليات المعتمدة على دورة الخلية في الخميرة الناشئة

DOI:

10.3791/68887

⸱

September 26th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل طريقتين لإيقاف دورة خلية الخميرة والإفراج الاختياري ، ويشرح بالتفصيل استخدام الفحص المجهري الفلوري لدراسة العمليات المعتمدة على دورة الخلية في S. cerevisiae.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتبع الخلايا حقيقية النواة دورة خلوية محفوظة تنظم عمليات متنوعة ، بما في ذلك صيانة الحمض النووي وتوازن العضية. غالبا ما تكون دراسة العمليات الخلوية بطريقة تعتمد على دورة الخلية ضرورية لتفسير النتائج التجريبية بشكل صحيح. هناك طرق كيميائية وجينية متاحة لإنتاج مزامنة دورة الخلية في الخلايا المستزرعة عبر مجموعة واسعة من الكائنات الحية ، بما في ذلك نماذج الفقاريات ، مما يتيح دراسة العمليات المعتمدة على دورة الخلية. ومع ذلك ، من بين الكائنات الحية النموذجية ، تظل الخميرة الناشئة مركزا قويا لتحليل دورة الخلية نظرا لطرق التزامن القوية بشكل خاص ، ووقت الجيل القصير ، وقابلية التتبع الجيني. تشترك الخميرة في آلات دورة الخلية الأساسية مع حقيقيات النوى الأخرى ، مما مكن من اكتشافات بارزة في تنظيم دورة الخلية. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل طرق تحليل دورة الخلية في الخميرة ، مع التركيز على تجارب إطلاق التوقف والانقسام G1 ، بما في ذلك بناء السلالة ، وإعداد المزرعة ، والفحص المجهري. يتم تقديم طرق وضع علامات PCR لإنتاج سلالات مناسبة لاعتقالات دورة الخلية والفحص المجهري الفلوري. يتم تحقيق إيقاف G1 باستخدام عامل α فرمون الببتيد ، ويؤدي الغسيل القصير إلى إطلاق متزامن وتقدم دورة الخلية. يتم أخذ العينات في نقاط زمنية مختلفة بعد إطلاقها في دورة الخلية وتثبيتها للفحص المجهري. الطريقة الثانية توقف خلايا الخميرة في الانقسام عن طريق استنفاد منظم دورة الخلية Cdc20 لتحقيق مجموعة سكانية تم إيقافها ، بالإضافة إلى الإطلاق الاختياري في الطور. يتم إصلاح العينات وإعدادها للتصوير قبل وبعد الإطلاق ، ويتم تصويرها وتحليلها. يركز تحليل الصور على فهرسة التوطين الديناميكي وتغيرات وفرة البروتينات السكانية في دورة الخلية. طرق التزامن هذه مناسبة للتلاعب بدورة الخلية المتنوعة ، وبينما يتم تسليط الضوء على استخدامها في تصوير الخلايا الثابتة هنا ، يمكن تكييفها للعديد من التحليلات الأخرى ، بما في ذلك تصوير الخلايا الحية بالإضافة إلى المقايسات الكيميائية الحيوية والجزيئية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تنظيم انقسام الخلايا حقيقية النواة بشكل كبير من خلال برنامج يسمى دورة الخلية. إن العمليات الديناميكية والمحفوظة للغاية التي تحدث في دورة الخلية تجعل من المثير للاهتمام الدراسة في حد ذاتها ، ولكن لها أيضا آثار واسعة الانتشار تعلم التحقيقات في العمليات البيولوجية للخلية الأخرى - على سبيل المثال ، تخضع العديد من العضيات لإعادة تشكيل دراماتيكية أثناء انقسام الخلية ، ويتم تنظيم وفرة وتوطين العديد من البروتينات بشكل كبير في جميع أنحاء1،2،3. على الرغم من وجود بعض طبقات التعقيد الإضافية الموجودة في أنظمة metazoan مقارنة بالخميرة ، بما في ذلك المزيد من مجموعة متنوعة من الكينازات والبروتينات التنظيمية ، بالإضافة إلى مدخلات إضافية من الإشارات الخارجية في metazoans ، إلا أن انقسام الخلايا يتم الحفاظ عليه بشكل عام بشكل كبير في جميع حقيقيات النوى4،5. تم القيام بالكثير من العمل الأساسي لوضع رؤى رئيسية حول تقدم دورة الخلية والخطوات التنظيمية الحاسمة في الخميرة ، ولا يزال كائنا جذابا للغاية لدراسة الأسئلة المتعلقة بدورة الخلية للعديد من الأسباب6،7. من أهمها مجموعة واسعة من الطرق المتاحة لمعالجة دورة الخلية ، مما يسمح بالتوقف في مراحل مختلفة ومزامنة الخلايا. تشمل المزايا الإضافية دورة الخلية القصيرة للخميرة (~ 90-150 دقيقة حسب درجة الحرارة وظروف الوسائط) ، وسهولة التلاعب الجيني ، والاتساع الكبير للأليلات الشرطية التي تمكن الدراسة في سياق من النوع البري.

يتم دفع التقدم خلال المراحل المختلفة لدورة الخلية من خلال نشاط العديد من الكينازات الرئيسية ، بما في ذلك الكيناز المعتمد على السيكلين (Cdk) في كل مكان ، والكيناز الشبيه بالبولو ، والشفق القطبي كيناز. تنظم نقاط تفتيش دورة الخلية التقدم خلال دورة الخلية ، مما يضمن عدم تقدم الخلايا إلى المرحلة التالية من الانقسام ما لم يتم استيفاء شروط محددة8،9. يمكن للباحثين اختطاف نقاط التفتيش هذه ، والتحولات التي تنظمها ، لتحقيق اعتقال طويل الأمد ، أو اعتقال عابر وإطلاقه لمزامنة مجموعة من الخلايا (الشكل 1). على سبيل المثال ، تضمن نقطة تفتيش التزام دورة الخلية (نقطة التقييد أو البدء في الخميرة) أن الخلية لديها ما يكفي من العناصر الغذائية للالتزام بالانقسام قبل بدء تكرار الحمض النووي10. يمكن التلاعب بنقطة التفتيش هذه في الخميرة أحادية الصيغة الصبغية لتحقيق اعتقال G1 ، مع الاستفادة من برنامج تزاوج الخميرة الذي يتفاعل مع دورة الخلية. في خميرة الخباز (Saccharomyces cerevisiae) ، تحتوي الخلايا أحادية الصيغة الصبغية على واحد من نوعين من التزاوج ، MATa أو MATα ، والذي يتم تحديده وراثيا بواسطة موضع نوع التزاوج. الخميرة من نوع التزاوج حساسة لفرمون التزاوج من نوع التزاوج الآخر وتستجيب عن طريق تنشيط سلسلة إشارات MAP kinase التي تقوم في النهاية بفسفرة وتثبيت مثبط Cdk Far1 ، والذي يمنع دخول دورة الخلية عن طريق الارتباط بمركب Cln1 / 2-Cdk ومنع نشاطه11،12،13. يمكن تحديد الخلايا التي تستجيب لفيرومونات التزاوج بصريا من خلال وجود إسقاط التزاوج أو shmoo (الشكل 1). وبالتالي ، يمكن إضافة عامل α المركب كيميائيا إلى مزارع خلايا MATلتحقيق اعتقال G1. انتقال آخر لدورة الخلية يمكن للباحثين استهدافه لمزامنة خلايا الخميرة هو الانتقال من الطور إلى الطور. أثناء الانقسام ، تراقب نقطة تفتيش تجميع المغزل (SAC) ارتباط الحركية بالأنابيب الدقيقة وتمنع الطور المعزز للمجمع / الجسيم الدائري (APC / C) عن طريق عزل منشطه ، Cdc20 ، عند اكتشاف الحركية غير المتصلة. APC / C عبارة عن مركب E3 ligase ضروري لدخول الطور. عندما يتم استيفاء SAC ، يقوم Cdc20 بعد ذلك بربط APC / C ، و APC / C في كل مكان العديد من البروتينات ، في المقام الأول السيكورين والسيكلين B ، والتي تستهدفها للتحلل ، وتعزز فصل الكروموسوم والخروج الانقسامي14،15. على الرغم من أن Cdc20 نفسه ليس مكونا من مكونات SAC ، إلا أن تثبيطه هو هدف تنشيط SAC. لذلك ، يمكن الاستفادة من الاستنفاد المحفز ل Cdc20 لإيقاف ثقافة الخميرة في الطور (الشكل 1) 16.

يشمل هذا البروتوكول طريقتين للتلاعب بدورة خلايا الخميرة ، بالإضافة إلى مثال على تطبيق كل طريقة. في الأول ، يتم استخدام عامل α لإيقاف الخلايا في G1 ، تليها خطوة غسيل لتحرير الخلايا من التوقف ، مما يؤدي إلى إعادة دخول دورة الخلية المتزامنة. ستستمر الخلايا المتزامنة خلال دورة الخلية بأكملها ، مما يمكن الباحثين من تتبع الخلايا ودراستها في كل مرحلة من مراحل دورة الخلية. في هذه الطريقة ، تتم مراقبة التوطين الديناميكي لبروتين ذو علامة GFP ، Stu2 ، طوال الوقت ، ويتم تتبع ارتباطه بالمغزل الانقسامي. تستفيد هذه الطريقة أيضا من مكون جسم عمود المغزل الموسوم (SPB) ، Spc110-mCherry ، والذي يتيح قياسات طول المغزل الانقسامي وهو وكيل ممتاز لتقدم دورة الخلية17. توضح هذه الطريقة كيف يتيح إيقاف دورة الخلية وإطلاقها مزامنة مجموعات الخلايا ، مما يسهل دراسة البروتين أو أي مكون آخر ذي أهمية طوال دورة الخلية.

في الطريقة الثانية ، يتم تحقيق التوقف الانقسامي عن طريق استنفاد Cdc20 باستخدام نظام degron المحفز للأوكسين (AID)18. في الخلايا التي تعبر عن TIR1 (بروتين F-box من أصل نباتي) ، سيتم نشر أي بروتين يحتوي على علامة AID في كل مكان وتحلل عند إضافة الأوكسين. هنا ، نستخدم Cdc20 الموسوم ب AID لتمكين التحلل المحفز ل Cdc20 ، مما يتسبب في التوقف في الطور الوصفي. ثم تتم مراقبة مجموعة الخلايا هذه لتجنيد مكون SAC الموسوم Bub1-GFP في kinetochores ، باستخدام بروتين kinetochore الموسوم Mtw1-mCherry كعلامة ائتمانية. على الرغم من أن Bub1 يلعب أدوارا مستقلة عن SAC في الحركية ويتوطين إلى الحركية في الانقسام المبكر ، إلا أن توطين الحركية المستمر في الخلايا المعتقلة يشير إلى مرفقات غير صحيحة للأنابيب الحركيةالدقيقة 19. لقد أظهرنا ذلك من خلال معالجة الخلايا بسم الأنابيب الدقيقة ، نوكودازول ، الذي يعطل مرفقات الأنابيب الحركية والميكروتوبولية. تسلط هذه التجربة الضوء على كيفية دراسة العمليات الخاصة بمرحلة دورة الخلية المميزة باستخدام طرق توقف قابلة للضبط بدرجة كبيرة. نوضح أيضا أنه يمكن غسل الأوكسين من مزارع cdc20-AID ، مما يسمح بإطلاقه في الطور والدخول إلى دورة خلية جديدة ، على الرغم من تجربتنا ، لا يتم إطلاق هذه الثقافات بشكل متزامن مثل إطلاق الاعتقال وإطلاق عامل α. هاتان الطريقتان لإطلاق الإيقاف فعالة وسهلة التنفيذ ، ولكن العديد من الطرق الأخرى متاحة للباحثين في الخميرة لإيقاف الخلايا في مراحل دورة الخلية المختلفة20،21،22،23. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول هذه الأساليب في المناقشة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. بناء سلالات لتحليل دورة الخلية والتصوير

  1. تصميم الاشعال لوضع علامة على الجين ذي الأهمية باستخدام بلازميدات Pringle Tagging (بلازميدات pFA6a) 24. باختصار ، تصميم البادئات F2 و R1 التي ، عند استخدامها مع بلازميد سلسلة pFA6a ، تنتج منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يمكن تحويله مباشرة إلى خميرة لتوليد نسخة "ذات علامة" من الجين محل الاهتمام. استخدم أزواج التمهيدي والبلازميدات الواردة في الجدول 1 لوضع علامات على الجينات ذات الأهمية في هذا البروتوكول. تم وصف استراتيجيات تصميم البلازميد والتمهيدي لوضع علامات على المحطة C لجينات الخميرة بالتفصيل بواسطة Longtine et al.24.
    ملاحظة: يمكن استخدام هذه الطريقة لإنتاج بروتينات ذات علامات فلورية للتصوير ، أو بروتينات الموسومة ب Auxin Inboostible Degron (AID) لتسهيل توقف دورة الخلية والتجارب الأخرى التي تم تمكينها من خلال تحلل البروتين المستهدف18. على سبيل المثال ، لتمييز CDC20 بعلامة AID (IAA7) ، يتكون التمهيدي لوضع العلامات الأمامية من 25-40 قاعدة من جين CDC20 مباشرة قبل كودون الإيقاف ، باستثناء كودون STOP (5 'TACAAGGAGGCCCTTAGTAC
    CAGCCAATATTTGATCAGG 3 ') ، وأيضا تسلسل محول Pringle Plasmid F2 (5 'cggatccccgggttaattaa 3') الملحق بالطرف 3 'لإنتاج تسلسل التمهيدي النهائي (5 'TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
    CAGCCAATATTTGATCAGG cggatccccgggttaattaa 3'). يحتوي التمهيدي العكسي لوضع العلامات CDC20 على مكمل عكسي لزوج القواعد 25-40 مباشرة بعد كودون STOP (5 'ATTATATGCCTTGACATGAA
    CTTTTTTTTTTTTTTTTA 3 ') وتسلسل محول Pringle Plasmid R1 (5 'gaattcgagctcgtttaaac 3') لإنتاج تسلسل التمهيدي النهائي (5 'ATTATATGCCTTGACATGAACTTTTTTT
    TTTTTTATTTTTA gaattcgagctcgtttaaac 3'). من المهم أيضا ملاحظة أن استخدام بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل الأقصر من 40 زوجا أساسيا سيقلل من كفاءة الاندماج في جينوم الخميرة.
  2. قم بتخفيف البادئات في درجة البيولوجيا الجزيئية إلى 10 ميكرومتر.
  3. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل مع زوج البلازميد F2 و R1 وبلازميد وضع العلامات المناسب باستخدام الطرق القياسية ، باتباع برنامج الدورة الحرارية الوارد في الجدول 2 ، ثم قم بتأكيد حجم منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز.
  4. قم بتلقيح سلالة الخميرة لتتحول إلى 25 مل من مستخلص الخميرة من مزرعة سكر العنب الببتون الأدينين (YPAD) وتنمو طوال الليل عند 23 درجة مئوية. لبناء خميرة cdc20-AID (التي ستتحلل Cdc20 عند العلاج بالأوكسين) ، قد تحتوي السلالة المحولة إما بالفعل على OsTIR1 معبرا عنه من موضع خارج الرحم ، أو يمكن عبور OsTIR1 في وقت لاحق18.
  5. في صباح اليوم التالي ، تحقق من OD600 للثقافة الليلية. إذا كانت الزراعة OD <2.0 ، فانتقل إلى الخطوة 1.6. إذا كان OD > 2.0 ، فقم بتخفيفه إلى ~ 0.2-0.4 واسمح ب 2-3 دورات من النمو.
  6. حصاد الخلايا عند OD600 = ~ 0.4-2.0 للتأكد من أنها في مرحلة النمو اللوغاريتمي. احصد 5 ODs من الخلايا لكل تحويل (على سبيل المثال ، 5 مل من OD600 = 1.0). في حالة إجراء أكثر من تحويل واحد لنفس السلالة ، يمكن دمج الخلايا في هذه المرحلة. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 3,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 23 درجة مئوية.
  7. تخلص من المادة الطافية واغسل حبيبات الخلية ب 25 مل من الماء ، متبوعا بالطرد المركزي عند 3,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 23 درجة مئوية.
  8. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من 0.1 M من أسيتات الليثيوم (LiAc) ونقلها إلى أنبوب (أنبوب) سعة 1.6 مل. في حالة إجراء أكثر من تحويل واحد ، قم بتقسيم إعادة التعليق 1 مل إلى أنابيب متعددة (على سبيل المثال ، لتحويلين مقسمين 2 × 500 ميكرولتر ؛ ل 3 تحويلات مقسمة 3 × 333 ميكرولتر ، إلخ).
  9. خلايا الطرد المركزي عند 1,000 × جم لمدة دقيقتين عند 23 درجة مئوية وتخلص من المادة الطافية.
  10. أضف ما يلي إلى حبيبات الخلية (بهذا الترتيب): أنا) 240 ميكرولتر من PEG (50٪) ، ثانيا) 36 ميكرولتر من 1.0 م LiAc ، ثالثا) 20 ميكرولتر = 50 ميكروغرام من الحمض النووي للحيوانات المنوية السلمون المسلوق مسبقا لمدة 5 دقائق ، رابعا) 54 ميكرولتر من الماء.
  11. أضف 10 ميكرولتر من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (تم الحصول عليه في الخطوة 1.3) إلى الخلايا والدوامة لمدة دقيقة واحدة ، مما يضمن خلط كل شيء جيدا.
  12. احتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في أسطوانة دوارة في غرفة دافئة أو شاكر حراري عند 1000 دورة في الدقيقة.
  13. خلايا صدمة حرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حمام مائي.
    ملاحظة: قد يختلف الوقت الأمثل للصدمة الحرارية اعتمادا على خلفية إجهاد الخميرة. تم تحسين هذا البروتوكول لخلفية سلالة W303.
  14. خلايا الطرد المركزي عند 1,000 × جم لمدة دقيقتين عند 23 درجة مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليقها برفق في 100 ميكرولتر من الماء.
  15. للتحويلات باستخدام KanMX أو اختيار الأدوية الأخرى ، قم بخلايا اللوحة على YPAD واحتضان الألواح عند 23 درجة مئوية ، ثم اللوحة المقلدة إلى لوحة الدواء في اليوم التالي.
    ملاحظة: يعد السماح بيوم من النمو على YPAD أمرا بالغ الأهمية للسماح بالتعبير عن جينات مقاومة الأدوية في الخلايا المحولة.
  16. للتحويلات باستخدام علامات auxotrophic (URA ، HIS ، إلخ) ، خلايا اللوحة مباشرة على وسط انتقائي.
  17. احتضان الألواح عند 23 درجة مئوية لمدة 3 أيام للسماح لمستعمرات تحويل الخميرة بالنمو.
  18. تحقق من وضع العلامات الصحيحة للجين عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الجيني أو عن طريق النشاف الغربي. تم وصف هذه الطرق بالتفصيل بواسطة Burnette25 و Chu etal 26.
    ملاحظة: لإنتاج سلالات ذات أليلات متعددة ذات علامات ، لا ينصح بالتحويل المتكرر دون العبور الخلفي ، حيث يمكن أن يكون التحويل عملية مطفرات. لإنتاج السلالة التي تحتوي على Stu2-GFP و Spc110-mCherry ، على سبيل المثال ، نوصي بتحويل السلالات بشكل منفصل لإنتاج Stu2-GFP و Spc110-mCherry ، ثم دمج هذه الأليلات في سلالة أحادية الصيغة الصبغية واحدة عن طريق تقاطع الخميرة ، والأبواغ ، وتشريح رباعي ، وتحليل النمط الجيني. يتوفر مزيد من المعلومات حول صلبان الخميرة من Stansfield و Stark27 و Morin et al.28. لإجراء إطلاق القبض على عامل α ، يجب أن تكون السلالة أحادية الصيغة الصبغية المستخدمة MATa.

2. زراعة الخميرة ومزامنة دورة الخلية: إطلاق الاعتقال α العامل

  1. قم بتلقيح الخميرة في 25 مل من ثقافة YPAD طوال الليل عند 23 درجة مئوية ، لتكون عند OD600 = 0.5-2.0 في صباح اليوم التالي.
    1. إذا كانت الخلايا أعلى من OD600 = 2.0 في الصباح ، فقم بتخفيفها مرة أخرى إلى OD600 = 0.2-0.4 واتركها تنمو لمدة دورة خلية واحدة على الأقل (2-3 ساعات عند 23 درجة مئوية).
  2. قم بتخفيف الخلايا مرة أخرى إلى OD600 = 0.5 وأضف عامل α إلى تركيز نهائي قدره 1 ميكروغرام / مل (مخزون 10 مجم / مل في DMSO). من الناحية المثالية ، سيكون للخلايا طفرة bar1 (على سبيل المثال bar1-1) ، مما يجعلها أكثر حساسية لعامل α. تعتبر الخلايا من النوع البري BAR1 أقل حساسية لعامل α وتتطلب تركيزا من عامل α يكون على الأقل أعلى من حيث الحجم لتوقفه بشكل صحيح ، وهو أقل اقتصادا.
  3. في الساعة 2.5-3.5 ساعة بعد الاعتقال ، تحقق من درجة الاعتقال عن طريق حساب النسبة المئوية للخلايا غير المذكورة. عندما يتم القبض على 90-95٪ من الخلايا (تم القبض عليها في G1) ، استمر في إطلاق سراحها. سيختلف التوقيت اعتمادا على سلالة الخميرة ووسط النمو ودرجة الحرارة.
  4. حرر الخلايا من التوقف α العامل عن طريق الدوران في جهاز طرد مركزي عند 3,000 × جم لمدة 3-5 دقائق عند 23 درجة مئوية ، ثم سكب الطافية.
  5. اغسل الخلايا عن طريق إعادة تعليق الحبيبات في 25 مل من YPAD + 1٪ DMSO.
  6. كرر الخطوات 2.4-2.5 مرتين ليصبح المجموع ثلاث غسلات ، وقم بتغيير الأنبوب المستخدم مرة واحدة بعد الغسيل الأول.
  7. أضف YPAD إلى الخلايا لرفع الحجم النهائي إلى 25 مل ونقل الخلايا إلى قارورة جديدة.
    ملاحظة: يعد استخدام قارورة جديدة أمرا بالغ الأهمية للتخلص من الكميات الضئيلة من عامل α المتبقي التي قد تمنع الإطلاق.
  8. خذ عينة من نقطة زمنية (0 دقيقة) وقم بإصلاحها (راجع تعليمات التثبيت في الخطوات من 4.1 إلى 4.4).
  9. استمر في أخذ عينات من النقطة الزمنية كل 15 دقيقة إذا حدث النمو عند 23 درجة مئوية. سيتغير هذا التوقيت في درجات حرارة أخرى بناء على مدى سرعة نمو الخلايا.
  10. في الوقت المناسب لمدة 60 دقيقة ، احكم على تزامن الإطلاق عن طريق التحقق من وجود براعم صغيرة موحدة (حجم البراعم < حجم الخلية الأم بنسبة 25٪) تحت المجهر الضوئي.
  11. اختياري) في 60 دقيقة بعد الإطلاق ، أضف عامل α مرة أخرى إلى تركيز نهائي قدره 1 ميكروغرام / مل لمنع التقدم إلى دورة الخلية التالية. قم بتأكيد إطلاق الخلايا المتزامن عن طريق التحقق من التشكل الموحد صغير البراعم قبل الإضافة.
  12. استمر في أخذ عينات من النقطة الزمنية لمدة تصل إلى 180 دقيقة ، أو طالما رغبت في ذلك. عند 23 درجة مئوية ، يحدث الطور الطوري ~ 45-60 دقيقة بعد الإطلاق ، ويحدث الطور ~ 60-90 دقيقة بعد الإطلاق ، وستكون معظم الخلايا في G1 الجديد بمقدار 120 دقيقة بعد الإصدار.

3. زراعة الخميرة ومزامنة دورة الخلية: Cdc20 توقيف النضوب وإطلاق

  1. قم بتلقيح مزرعة الخميرة طوال الليل عند 23 درجة مئوية لتكون عند OD600 = 0.5-2.0 في صباح اليوم التالي.
    1. إذا كانت الخلايا أعلى من OD600 = 2.0 في صباح اليوم التالي ، فقم بتخفيفها مرة أخرى إلى OD600 = 0.2-0.4 واتركها تنمو لمدة خلية واحدة على الأقل (2-3 ساعات عند 23 درجة مئوية).
  2. خفف مرة أخرى إلى OD600 = 0.5 وأضف الأوكسين إلى تركيز نهائي قدره 500 ميكرومتر من مخزون 1 م (500x) لجميع الثقافات. بالنسبة للمزارع التي تتلقى أدوية أخرى (نوكودازول) ، أضفها بالتزامن مع الأوكسين بالتركيز المناسب (على سبيل المثال ، ~ 10 ميكروغرام / مل نوكودازول).
  3. في 2 ساعة بعد الاعتقال ، تحقق من درجة الاعتقال عن طريق حساب النسبة المئوية للخلايا الكبيرة (يتم تحديد البراعم الكبيرة على أنها وجود برعم > حجم الخلية الأم 25٪). عندما يتم القبض على 90-95٪ من الخلايا في الانقسام ، انتقل إما إلى جمع العينات أو تحرير الخلايا من التوقف ، اعتمادا على التطبيق التجريبي. إذا لم يتم القبض على 90٪ من الخلايا ، اسمح للثقافة بالاستمرار في النمو ، وفحصها كل 15-30 دقيقة. سيختلف التوقيت اعتمادا على سلالة الخميرة ووسط النمو ودرجة الحرارة.
    ملاحظة: لا ينصح بالسماح للاعتقالات بالاستمرار لفترة طويلة جدا (أكثر من 4 ساعات) في حالة الإفراج عنها ، لأن الاعتقالات المطولة قد تقلل من بقاء الخلية.
  4. للإفراج عن توقف استنفاد Cdc20 ، قم بزراعة الحصاد عن طريق الطرد المركزي عند 3000 × جم لمدة 3-5 دقائق عند 23 درجة مئوية.
  5. اغسل الخلايا عن طريق تعليق الحبيبات في 25 مل من YPAD + 1٪ DMSO ، ثم الحصاد عن طريق الطرد المركزي عند 3,000 × جم لمدة 3-5 دقائق عند 23 درجة مئوية.
  6. كرر الخطوات 3.4-3.5 ليصبح المجموع 2 غسلة.
  7. أضف YPAD إلى الخلايا لرفع الحجم النهائي إلى 25 مل ونقل الخلايا إلى قارورة جديدة.
    ملاحظة: يعد استخدام قارورة جديدة أمرا بالغ الأهمية لإزالة الكميات الضئيلة من الأوكسين التي قد تمنع الإطلاق.
  8. خذ النقطة الزمنية 0 وقم بإصلاحها (راجع تعليمات التثبيت في الخطوات 4.1 إلى 4.4).
  9. استمر في أخذ النقاط الزمنية كل 10-15 دقيقة للمدة المطلوبة للدورة الزمنية. عند 23 درجة مئوية ، كانت معظم الخلايا قد تحررت من الاعتقال بعد 50-70 دقيقة.
    ملاحظة: لا يتم تحرير الخلايا بشكل متزامن من إيقاف استنفاد Cdc20 كما تفعل مع إيقاف عامل α. ومع ذلك ، قد يكون من المفيد دراسة أحداث الطور أو الخروج الانقسامي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن القيود الفنية لإطلاق الاعتقال هذا هو أنه في النقاط الزمنية اللاحقة بعد الإطلاق ، يكون من الصعب التمييز بين خلايا الطور التي لم يتم إطلاقها بعد والخلايا التي تم إطلاقها في وقت سابق ووصلت إلى الطور الطولي لدورة الخلية التالية. إذا لزم الأمر ، يمكن التغلب على ذلك إما عن طريق إجراء تصوير الخلايا الحية لتتبع الخلايا الفردية أثناء إطلاقها من الاعتقال أو عن طريق إضافة عامل α إلى المزرعة (بافتراض أن الخلايا هي MATa) لإيقاف الخلايا في G1 بعد الخروج الانقسامي.

4. تثبيت الخميرة

  1. جهاز طرد مركزي 1 مل (أو 0.5-1.5 ODs) من الثقافة لمدة دقيقة واحدة بسرعة قصوى (~ 20,000 × جم) عند 23 درجة مئوية.
  2. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المحلول المثبت (3.7٪ فورمالديهايد في 0.1 M فوسفات البوتاسيوم (KPi) درجة الحموضة 6.4).
  3. احتضان الخلايا في محلول التثبيت لمدة 2-15 دقيقة في
    23 درجة مئوية. بالنسبة لتجارب الدورة الزمنية ، ينصح عموما بإصلاح الخلايا لمدة 15 دقيقة لمحاذاة توقيت خلايا الطرد المركزي عند أخذ العينات.
    ملاحظة: يجب تحسين توقيت التثبيت لأنواع معينة من الفلوروفورات والبروتينات ذات الأهمية.
  4. خلايا الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة بسرعة قصوى عند 23 درجة مئوية ، تستنشق من المادة الطافية ، وتعيد تعليقها في 500 ميكرولتر من 0.1 متر كيلو باي (درجة الحموضة 6.4). يمكن تخزين الخلايا في KPi عند 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للصورة.
    ملاحظة: يمكن أن تستمر إشارة مضان الخلية الثابتة لمدة تصل إلى أسبوعين ، اعتمادا على الفلوروفور ، ومع ذلك ، لقياس إشارات الفلورسنت ، اجمع الصور في غضون 7 أيام.

5. إعداد الشرائح للتصوير

  1. عند الاستعداد للتصوير ، قم بتشغيل خلايا الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة بسرعة قصوى عند 23 درجة مئوية وتخلص من الطافية. أعد تعليق الخلايا في 10-100 ميكرولتر من محلول Triton / DAPI / sorbitol (1.2 M sorbitol ، 1٪ triton ، 0.1 M KPi ، درجة الحموضة 7.5 ، 2 ميكروغرام / مل DAPI).
  2. ماصة ~ 0.8 ميكرولتر من الخلايا مباشرة على غطاء نظيف. استخدم طرف الماصة لنشر قطرة الخلية برفق في دائرة 1 سم2 تقريبا في وسط الغطاء.
  3. ضع الغطاء على شريحة مجهرية. استخدم Kimwipe للضغط برفق حول الشريحة لتوزيع العينة.
  4. أغلق حواف الغطاء بطلاء الأظافر.
  5. اختياريا ، قم بتخزينه في مكان بارد ومظلم لمدة تصل إلى 4-6 ساعات قبل التصوير لمساعدة الخلايا على الاستقرار ومنع الحركة الزائدة.

6. التصوير

  1. خذ الشريحة إلى مجهر مزود بهدف زيت 60x / 1.42 ومجموعة ليزر وفلتر أحمر وأخضر وأزرق وأحمر بعيد يمكن أيضا استخدام أهداف تكبير أعلى (حتى 100x).
  2. ركز المجهر على خلايا الخميرة الملتصقة بالغطاء.
    ملاحظة: إذا كانت خلايا الخميرة تتحرك كثيرا ، فقد تترك الشرائح في مكان بارد ومظلم لمدة 20-60 دقيقة لتستقر.
  3. بمجرد أن تصبح الخميرة في بؤرة التركيز ، قم بضبط إعدادات التعرض لكل قناة لإنتاج نسبة إشارة إلى ضوضاء لا تقل عن 3: 1 ، مما يضمن عدم تعرض نقاط الفلورسنت بشكل مفرط.
    ملاحظة: على سبيل المثال ، في نظام التصوير الذي نستخدمه مع كاميرا CMOS العلمية ، باستخدام زيت هدف وغمر 60 × 550 مع معامل انكسار n = 1.516 ، وضبط الإشارة القصوى للقناة الحمراء على 1000-2000 وحدة فلكية ، والقناة الخضراء على 3000 وحدة فلكية ، والقناة الزرقاء على 3000 وحدة فلكية وقناة DIC على 4000-5000 وحدة فلكية تنتج صورا عالية الجودة.
  4. اضبط إعدادات الاستحواذ لأخذ 14-20 0.2 ميكرومتر مكدسة Z لتمتد إجمالا 2-4 ميكرومتر.
  5. بالنسبة للمجاهر المزودة بوحدات ما بعد المعالجة ، حدد Deconvolution و Quick Projection لكل مكدس.
  6. اجمع مجموعات Z من الخلايا ، والتقط صورا كافية لالتقاط ~ 100-200 خلية لكل حالة أو نقطة زمنية.
  7. ارجع إلى الملف التكميلي 1 للحصول على إرشادات البرنامج مع لقطات شاشة من برنامج التصوير.

7. تحليل الصور

  1. افتح الصور المعروضة في ImageJ واضبط السطوع والتباين لعرض قنوات مختلفة. إذا كان المجهر المستخدم للتصوير لا يحتوي على وحدات ما بعد المعالجة ، فقم بإجراء أقصى إسقاط لمكدسات Z في هذه المرحلة.
  2. لتحديد تقدم دورة الخلية ، قم بحساب 100 خلية لكل نقطة زمنية وصنفها على أنها تحتوي على نواة واحدة أو اثنتين. بدلا من ذلك، احسب طول عمود الدوران أو المسافة بين أجسام قطب عمود الدوران لتحديد حالة دورة الخلية. تتوافق المسافة بين بؤر Spc110 < 1.5 ميكرومتر مع خلايا الطور ، والمسافة > 1.5 ميكرومتر تتوافق مع خلايا الطور.
  3. لحساب شدة بروتين بونكتا (على سبيل المثال ، Stu2-GFP) ، استخدم أداة الاختيار اليدوي للرسم حول حدود إشارة الاهتمام. أضف هذه الإشارة إلى مدير ROI (منطقة الاهتمام) بالضغط على T أو باستخدام القائمة. في مدير عائد الاستثمار ، حدد قياس لحساب شدة كل نقطة محددة. لعرض التغييرات في إشارة النقاط بمرور الوقت ، ارسم متوسط الكثافة بفاصل ثقة 95٪ على الرسم البياني الخطي لكل نقطة زمنية.
  4. لحساب النسبة المئوية للخلايا مع Bub1-GFP puncta, تأكد من أن الحد الأدنى للقناة الخضراء والحد الأقصى لإعدادات السطوع هي نفسها عبر الصور المختلفة. يتم احتساب الخلايا التي تحتوي على نقطة Bub1-GFP تظهر تداخلا مع نقطة Mtw1-mCherry على أنها Bub1 مترجمة إلى الحركية. خلاف ذلك ، يتم احتساب الخلية على أنها سالبة. عد ~ 100 خلية لكل حالة. يحتوي Aravamudhan et al.29 على مزيد من المعلومات حول توطين Bub1 إلى kinetochores.
  5. لحساب النسبة المئوية للخلايا أحادية النواة كبيرة البراعم ، احسب عدد الخلايا ذات البرعم الكبير ونواة واحدة (إشارة DAPI واحدة) في السكان واقسمها على العدد الإجمالي للخلايا.
  6. ارجع إلى الملف التكميلي 1 للحصول على إرشادات البرنامج مع لقطات شاشة من برنامج التصوير.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن تحليل التغيرات في توطين البروتين المعتمد على دورة الخلية عن طريق الفحص المجهري الفلوري بسهولة باستخدام الطرق التي وصفناها هنا. لطالما اهتمت مجموعتنا بالتنظيم الديناميكي ووظيفة المغزل الانقسامي. في الخميرة ، تعمل أجسام قطب المغزل (المميزة بالمكون Spc110) كمراكز تنظيم للأنابيب الدقيقة تنبثق منها خيوط الأنابيب الدقيقة لإنشاء بنية المغزل الانقسامي30. يلعب بروتين ربط الأنابيب الدقيقة ، Stu2 ، دورا في تكوين المغزل عن طريق بلمرة الأن...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح استخدام مزامنة دورة الخلية في الخميرة الناشئة دراسة آليات مهمة لمجموعة متنوعة من العمليات الخلوية. يسمح استخدام إطلاق التوقف G1 مع العلاج α العامل بالتقدم المتزامن لمجموعة من الخلايا خلال مراحل دورة الخلية ، وكما أوضحنا ، يمكن أن يكشف عن أنماط التوطين الديناميكية للمنظمين الخلويين مثل Stu236. يمكن أيضا تحقيق توقيف دورة الخلية باستخدام الوسائل الجينية عن طريق استنفاد منظمات دورة الخلية مثل Cdc20 ، والتي تستخدم لإيقاف الخلايا في الطور الطوري. يسمح هذا ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر جامعة يوتا لتصوير الخلايا الأساسية للحفاظ على مرفق مجهر دلتا فيجن. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة F31CA2717405 (إلى M.G.S) و T32GM141848 (إلى M.G.S. و TCS) ، و 5 For the Fight (إلى MPM) ، و Pew Biomedical Scholars (إلى MPM) ، و NIH منحة R35GM142749 (إلى MPM).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
؟-عاملمنشأة التوليف الأساسي بجامعة يوتاالتسلسل: WHWLQLKPGQPMY
أنابيب إيبندورف سعة 1.5 ملأكسجينMCT-175-C
خليط dNTP 10 مللي ميالثيرمو ساينتفيكR0193
أنابيب مخروطية بحجم 50 ملجراينر بيو-ون227 261
5x مخزن تفاعل Phusion HFمختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةB0518S
حمض الخليك، العصر الجليديفيشر كيميكالBP2401C-212
ملح نصف كبريتات الأدينينسيغما-ألدرتشA9126-100G
أغار، محبيبأبيكس للكيماويات والكواشف20-275
الأغاروزمنتجات أبيكس بيوبريسيرش20-102GP
جهاز تعقيم البخار أمسكو سينشري على جهاز التعقيمستيريسSV-1262
ماء DI المعقم
أوكسينسيغما-ألدرتشCat#I3750-5G-A; CAS: 87-51-4
سائل ليزر كارجيلمختبرات كارجيل20130
دي-سوربيتولسيغما-ألدرتشS1876-500G
DAPI (40,6-دياميدينو-2-فينيل إندول، ديهيدروكلوريد)المجسات الجزيئيةCat#D1306
حمض الديوكسي ريبونوكليك ملح الصوديوم من خصيتي السلمونسيغما-ألدرتشD1626
ديكستروزفيشر كيميكالD16-10
ثنائي الصوديوم إيثيلينيديامين تترا أسيتاتفيشر كيميكالS811-10
DMSOثيرمو ساينتفيك20688
FIJI/ImageJ2 مقابل 2.14.0/1.54fImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
خلاط الدوامة الثابتة السرعةVWRhttps://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
المجهر الفلوري DV Ultraلايكاhttps://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwEالتسلسل #: NV01063. لم يعد مدعوما
فورمالدهيدفيشر كيميكالCat#F79-500
جهاز جلثيرمو ساينتفيكبومة إيزي كاست B1
خليط سلم DNA من جين رولرفيرمنتاسSM0333
خرز الزجاجفيشر ساينتيفك11312A
شرائح زجاجيةVWR48300-026
جهاز هزاز منصة Innova 2300نيو برونزويكNB-2300
كيموايبسكيمتيك06-666
جهاز طرد مركزي مختبر لأنابيب 1.5 ملإبندورف2525
جهاز طرد مركزي مختبر لأنابيب 50 ملإبندورف5804
ثنائي هيدرات أسيتات الليثيومسيغما-ألدرتشL4158-250G
ماستر سيكلير نيكسس X2إبندورفhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
الماصات الدقيقة p2، p20، p200 و p1000 والأطراف المقابلةراينينL-2XLS+R، L-20XLS-R، L-200XLS-R، L-1000XLS-R
زجاج المجهرفيشر ساينتيفك12541014
نوكودازولكالبيوكيمياءقط#487928; CAS: 31430-18-9; القطعة#B35705
أورانج جيسيغما-ألدرتشO7252
الوتدأبحاث هامبتونHR2-591
حبيبات بيبتون كواشف فيشر الحيويةBP9725-5
بوليميراز حمض نووي فيوجن HFمختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةM0530L
Pipet-XراينينPX-100R
فوسفات البوتاسيوم، ثنائي القاعديثيرمو ساينتفيك424195000
فوسفات البوتاسيوم، أحادي الأساسثيرمو ساينتفيك424200025
مصدر الطاقةبيو-راد23786
Start Acquire Ultra 1.2.2سوفت ووركس سايتيفاالحصول على البطاقة باستخدام DV Ultra
قاعدة تريسكواشف فيشر الحيويةBP152-10
ترايتون X-100سيغما-ألدرتش9002-93-1
دوار الأنابيبVWR10136-084
حمام الماءVWRWBE10A11B
الماء، ألترا بيورمنتجات أبيكس بيوبريسيرش18-194
مستخلص الخميرة محبيبكواشف فيشر الحيويةBP9727-5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carlton, J. G., Jones, H., Eggert, U. S. Membrane and organelle dynamics during cell division. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (3), 151-166 (2020).
  2. Cai, Y., et al. Experimental and computational framework for a dynamic protein atlas of human cell division. Nature. 561 (7723), 411-415 (2018).
  3. Litsios, A., et al. Proteome-scale movements and compartment connectivity during the eukaryotic cell cycle. Cell. 187 (6), 1490-1507.e21 (2024).
  4. Satyanarayana, A., Kaldis, P. Mammalian cell-cycle regulation: Several Cdks, numerous cyclins and diverse compensatory mechanisms. Oncogene. 28 (33), 2925-2939 (2009).
  5. Gross, S. M., Rotwein, P. Unraveling growth factor signaling and cell cycle progression in individual fibroblasts. J Biol Chem. 291 (28), 14628-14638 (2016).
  6. Hartwell, L. H., Culotti, J., Reid, B. Genetic control of the cell-division cycle in yeast, I. detection of mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 66 (2), 352-359 (1970).
  7. Forsburg, S. L., Nurse, P. Cell cycle regulation in the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Annu Rev Cell Biol. 7 (1), 227-256 (1991).
  8. Morgan, D. O. Cyclin-dependent kinases: engines, clocks, and microprocessors. Annu Rev Cell Dev Biol. 13 (1), 261-291 (1997).
  9. Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: Controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246 (4930), 629-634 (1989).
  10. Hartwell, L. H., Culotti, J., Pringle, J. R., Reid, B. J. Genetic control of the cell division cycle in yeast: A model to account for the order of cell cycle events is deduced from the phenotypes of yeast mutants. Science. 183 (4120), 46-51 (1974).
  11. Chan, R. K., Otte, C. A. Isolation and genetic analysis of Saccharomyces cerevisiae mutants supersensitive to G1 arrest by a factor and α factor pheromones. Mol Cell Biol. 2 (1), 11-20 (1982).
  12. Madhani, H. D. From a to alpha: Yeast as a model for cellular differentiation. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. N.Y. (2007).
  13. Skotheim, J. M., Di Talia, S., Siggia, E. D., Cross, F. R. Positive feedback of G1 cyclins ensures coherent cell cycle entry. Nature. 454 (7202), 291-296 (2008).
  14. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22 (22), R966-R980 (2012).
  15. Stern, B. M., Murray, A. W. Lack of tension at kinetochores activates the spindle checkpoint in budding yeast. Curr Biol. 11 (18), 1462-1467 (2001).
  16. Lim, H. H., Goh, P. Y., Surana, U. Cdc20 is essential for the cyclosome-mediated proteolysis of both Pds1 and Clb2 during M phase in budding yeast. Curr Biol. 8 (4), 231-237 (1998).
  17. Chan, L. Y., Amon, A. Spindle position is coordinated with cell-cycle progression through establishment of mitotic exit-activating and -inhibitory zones. Mol Cell. 39 (3), 444-454 (2010).
  18. Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nat Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
  19. Gillett, E. S., Espelin, C. W., Sorger, P. K. Spindle checkpoint proteins and chromosome-microtubule attachment in budding yeast. J Cell Biol. 164 (4), 535-546 (2004).
  20. Rosebrock, A. P. Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods. Cold Spring Harb Protoc. 2017 (1), (2017).
  21. Yeong, F. M., Lim, H. H., Padmashree, C. G., Surana, U. Exit from mitosis in budding yeast. Mol Cell. 5 (3), 501-511 (2000).
  22. Uhlmann, F., Wernic, D., Poupart, M. A., Koonin, E. V., Nasmyth, K. Cleavage of cohesin by the CD clan protease separin triggers anaphase in yeast. Cell. 103 (3), 375-386 (2000).
  23. Wäsch, R., Cross, F. R. APC-dependent proteolysis of the mitotic cyclin Clb2 is essential for mitotic exit. Nature. 418 (6897), 556-562 (2002).
  24. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  25. Burnette, W. N. "Western blotting": Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112 (2), 195-203 (1981).
  26. Chu, J. H., Yeast, A. M. Yeast colony PCR: it doesn't get any easier than this. , https://www.protocols.io/view/yeast-colony-pcr-it-doesn-t-get-any-easier-than-th-gzwbx7e (2017).
  27. Stansfield, I., Stark, M. J. Yeast genetics and strain construction. Methods Microbiol. 36, 23-43 (2007).
  28. Morin, A., Moores, A. W., Sacher, M. Dissection of Saccharomyces cerevisiae asci. J Vis Exp. (27), e1146(2009).
  29. Aravamudhan, P., Chen, R., Roy, B., Sim, J., Joglekar, A. P. Dual mechanisms regulate the recruitment of spindle assembly checkpoint proteins to the budding yeast kinetochore. Mol Biol Cell. 27 (22), 3405-3417 (2016).
  30. Kilmartin, J. V. Lessons from yeast: the spindle pole body and the centrosome. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1650), 20130456(2014).
  31. Brouhard, G. J., et al. XMAP215 is a processive microtubule polymerase. Cell. 132 (1), 79-88 (2008).
  32. Zahm, J. A., Stewart, M. G., Carrier, J. S., Harrison, S. C., Miller, M. P. Structural basis of Stu2 recruitment to yeast kinetochores. Elife. 10, e65389(2021).
  33. Wang, P. J., Huffaker, T. C. Stu2p: A microtubule-binding protein that is an essential component of the yeast spindle pole body. J Cell Biol. 139 (5), 1271-1280 (1997).
  34. Severin, F., Habermann, B., Huffaker, T., Hyman, T. Stu2 promotes mitotic spindle elongation in anaphase. J Cell Biol. 153 (2), 435-442 (2001).
  35. van Breugel, M., Drechsel, D., Hyman, A. Stu2p, the budding yeast member of the conserved Dis1/XMAP215 family of microtubule-associated proteins is a plus end-binding microtubule destabilizer. J Cell Biol. 161 (2), 359-369 (2003).
  36. Stewart, M. G., Carrier, J. S., Zahm, J. A., Harrison, S. C., Miller, M. P. A coordinated kinase and phosphatase network regulates Stu2 recruitment to yeast kinetochores. J Cell Biol. 224 (8), e220410196(2025).
  37. London, N., Ceto, S., Ranish, J. A., Biggins, S. Phosphoregulation of Spc105 by Mps1 and PP1 regulates Bub1 localization to kinetochores. Curr Biol. 22 (10), 900-906 (2012).
  38. Lampson, M. A., Grishchuk, E. L. Mechanisms to avoid and correct erroneous kinetochore-microtubule attachments. Biology (Basel). 6 (1), 1-15 (2017).
  39. Samson, F., Donoso, J. A., Heller-Bettinger, I., Watson, D., Himes, R. H. Nocodazole action on tubulin assembly, axonal ultrastructure and fast axoplasmic transport. J Pharmacol Exp Ther. 208 (3), 411-417 (1979).
  40. Banerjee, A., Deshaies, R. J., Chau, V. Characterization of a dominant negative mutant of the cell cycle ubiquitin-conjugating enzyme Cdc34. J Biol Chem. 270 (44), 26209-26215 (1995).
  41. Jones, M. H., et al. Chemical genetics reveals a role for Mps1 kinase in kinetochore attachment during mitosis. Curr Biol. 15 (2), 160-165 (2005).
  42. Valenti, R., et al. A proteome-wide yeast degron collection for the dynamic study of protein function. J Cell Biol. 224 (2), e202409050(2025).
  43. Sepers, J. J., et al. The mIAA7 degron improves auxin-mediated degradation in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 12 (10), jkac222(2022).
  44. Yesbolatova, A., et al. The auxin-inducible degron 2 technology provides sharp degradation control in yeast, mammalian cells, and mice. Nat Commun. 11 (1), 5701(2020).
  45. Feng, W., et al. Genomic mapping of single-stranded DNA in hydroxyurea-challenged yeasts identifies origins of replication. Nat Cell Biol. 8 (2), 148-155 (2006).
  46. Osborn, A. J., Elledge, S. J., Zou, L. Checking on the fork: the DNA-replication stress-response pathway. Trends Cell Biol. 12 (11), 509-516 (2002).
  47. An, Z., et al. Autophagy is required for G1/G0 quiescence in response to nitrogen starvation in Saccharomyces cerevisiae. Autophagy. 10 (10), 1702-1711 (2014).
  48. Smets, B., et al. Life in the midst of scarcity: adaptations to nutrient availability in Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet. 56 (1), 1-32 (2010).
  49. Haase, S. B., Lew, D. J. Flow cytometric analysis of DNA content in budding yeast. Methods Enzymol. 283, 322-332 (1997).
  50. Touati, S. A., Kataria, M., Jones, A. W., Snijders, A. P., Uhlmann, F. Phosphoproteome dynamics during mitotic exit in budding yeast. EMBO J. 37 (10), e98745(2018).
  51. Baro, B., et al. SILAC-based phosphoproteomics reveals new PP2A-Cdc55-regulated processes in budding yeast. Gigascience. 7 (5), giy053(2018).
  52. Fees, C. P., Estrem, C., Moore, J. K. High-resolution imaging and analysis of individual astral microtubule dynamics in budding yeast. J Vis Exp. (122), e55610(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Cycle AnalysisBudding YeastCell Cycle SynchronizationG1 Arrest ReleaseMitotic Arrest ReleaseChromosome SegregationFluorescence MicroscopyProtein LocalizationImageJ AnalysisSpindle Pole

Related Articles