مقالة منهجية

الكشف عن التحكم الكهروميكانيكي في توازن الأنسجة باستخدام جهاز الموائع الدقيقة من طبقتين

DOI:

10.3791/68894

⸱

سبتمبر 19, 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Westlake University, 2Mechanobiology Institute, National University of Singapore, 3Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 4Research Center for Industries of the Future, Westlake University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا لتصنيع جهاز موائع دقيقة فريد من طبقتين لدراسة التنظيم الكهروميكانيكي لتوازن الأنسجة الظهارية. يطبق الجهاز تيارات كهربائية فسيولوجية ثابتة عموديا على مستوى الأنسجة ، مما يؤثر على التصاق الخلية والانتشار والبثق. يكشف تصوير الخلايا الحية وقياسات الإجهاد الميكانيكي عن آليات هذه العمليات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتأثر سلوك الخلية ومصير الخلية بالتيارات الكهربائية أو الحقول الداخلية أو المطبقة خارجيا. يمكن تطبيق الإشارات الكهربائية الساكنة في أجهزة الموائع الدقيقة المخصصة لتقليد البيئة الكهربائية في العمليات الفسيولوجية البطيئة مثل التطور والتئام الجروح والتوازن. تتمثل إحدى الفئات المهمة من الدراسات الكهربائية الخلوية في التحكم في هجرة الخلايا عن طريق التيارات الجلفانية الساكنة داخل المستوى في قنوات الموائع الدقيقة البسيطة التي تحاكي تيارات الجرح ، بكثافات حالية ~ 0.1-1000 أمبير / م2. ومع ذلك ، نظرا للهندسة غير المتوافقة ، فإن هذه الأجهزة ليست مناسبة لدراسة التأثيرات الكهربائية في توازن الأنسجة ، حيث تتبنى الخلايا قطبية أبيكو قاعدية وفرق جهد عبر الظهارة (TEPD). هنا ، نقوم بتفصيل جهاز فريد قائم على الموائع الدقيقة يطبق تيارات أيونية فسيولوجية عمودية على مستوى طبقات الخلايا الظهارية المتجمعة لاضطراب TEPD والتحقيق في التنظيم الكهربائي للحالات المستقرة للأنسجة. الإعداد مصنوع من بوليمر من طبقتين قابل للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية مدمج مع ركيزة هلام بولي أكريلاميد ناعمة مطلية ببروتين مصفوفة خارج الخلية من اختيارك. يوفر هذا الجهاز الموائع الدقيقة الهندسة الصحيحة والركيزة القابلة للاختراق للحث على تيار أيوني موحد نسبيا عبر طبقات الخلية ذات المقياس السنتيمتري. الإعداد متوافق مع تصوير الخلايا الحية متحد البؤر والفحص المجهري لقوة الجر لاستنتاج الضغوط الميكانيكية التي تسببها التيارات عبر الظهارة. اللافت للنظر ، أن تكاثر الخلايا وبثقها وهجرتها يتأثران بشكل جماعي داخل الظهارة الملتقية اعتمادا على اتجاه التيار الأيوني ، مما يؤدي إلى حالة نسيج جديدة تتميز بقوة تفاعل الخلية والخلية المختلفة ، وأحداث الخلية (الموت والتكاثر) ، وهياكل الأنسجة. يمكن فهم سلوكيات الخلية التي يتم التحكم فيها كهربائيا على أنها إجهاد ميكانيكي ناتج كهربائيا واستجابة الخلية. يوفر هذا الجهاز والبروتوكول الجديدان للموائع الدقيقة الأداة والوثائق المطلوبة لمجتمعات علم الأحياء الميكانيكية والهندسة الحيوية لدراسة التأثيرات الكهربائية في توازن الأنسجة وتطوير تطبيقات جديدة لهندسة الأنسجة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإشارات الكهروحرية الحيوية هي عوامل فيزيائية حيوية مهمة تساهم في التحكم في سلوك الخلية. المثال الأكثر شهرة هو جهد الفعل في الخلايا العصبية وخلايا القلب ، والتي تنقل الإشارات الكهربائية عبر مسافات طويلة (تصل إلى متر) وبترددات عالية (تصل إلى مئات الهرتز)1. يمكن استخدام النبضات الكهربائية المطبقة مع الأقطاب الكهربائية لتحفيز إطلاق جهد العمل وهي مفيدة في البحث والتطبيقات الطبية2. كما تم قياس الإشارات الكهروحرية الحيوية الداخلية في العمليات الفسيولوجية البطيئة مثل التطور والتئام الجروح والتوازن3،4،5،6،7،8 9،10 على مدى ساعات إلى أيام. ومن الأمثلة المهمة على ذلك الطبقات الظهارية المتقاربة التي تحافظ بنشاط على فرق جهد عبر الظهارة (TEPD) يتراوح من بضعة إلى عشرات الملي فولت4،11. يولد القطع أو الجرح في هذه الطبقات المتقاربة تيارا ماس كهربائى ، مدفوعا بالنشاط الكهربائي للأنسجة12،13. تم الإبلاغ عن تيارات جرح تصل إلى عشرات ميكرو أمبير / سم2 ومجالات كهربائية تصل إلى مئات المللي فولت / مم بتقنيات مختلفة. تشير الدراسات إلى أن هذه الإشارات الكهربائية تنتج إشارة اتجاهية للخلايا للهجرة نحو الجرح أو مواقع العدوى المهمة لعملية الشفاء3،6،14. بشكل عام ، تعتبر كل من الإشارات الكهربائية الثابتة (أو البطيئة) والإشارات الكهربائية سريعة التغير مهمة وتؤدي إلى استجابات مختلفة للخلايا أو الأنسجة.

في عالم الإشارات بطيئة التغير ، تتمثل إحدى الظواهر المهمة في عملية الهجرة المدفوعة بالكهرباء والتي تسمى "الجاذب الجلفانوتي". يمكن تطبيق التيارات الجلفانية المتحكم فيها داخل المستوى في أجهزة الموائع الدقيقة ذات القنوات البسيطة لتقليد تيارات الجرح بينما يتم التحقيق في هجرة الخلايا كدالة لكثافة التيار15،16. تم العثور على المجالات الكهربائية من 0.1-1000 فولت / م (كثافة التيار المقابلة من 0.1-1000 أمبير / م2) لدفع هجرة الخلايا في العديد من أنواع الخلايا في هذا الإعداد في المختبر 17 ، في حين أن مسارات الإشارات المتعارف عليها إلى الانجذاب الكيميائي (هجرة الخلايا الموجهة بالتدرجات الكيميائية) ، مثل PI3K ، متورطة في الجلفانوتاكس7،18. يمكن تصنيع أجهزة الموائع الدقيقة "العظام العارية" لدراسة الجلفانوتاكسي باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة القياسية وتقنيات التصنيع الدقيق19. تشتمل هذه الأجهزة عادة على ركيزة متعددة ثنائي ميثيل سيلوكسان أحادية القناة (PDMS) مرتبطة بشريحة زجاجية (حجم المقطع العرضي للقناة: مئات الميكرومتر ، الطول: سنتيمتر). يتم تثبيت الأقطاب الكهربائية المستخدمة لتزويد التيار الساكن بعيدا عن منطقة الخلية ، ويتم توصيلها بجسور الملح أو بدونها. يمكن إجراء اتصال جسر الملح عن طريق ثقوب مثقوبة من خلال ركيزة PDMS ، وموصلات الموائع الدقيقة ، والأنابيب المملوءة بالأجار. تدعم الشريحة الزجاجية البسيطة (عادة 170 ميكرومتر) أسفل القناة أيضا تصوير الخلايا الحية عالي الدقة أثناء تجارب الجلفانوتاكس ، وهي ميزة حاسمة لدراسة العملية.

دور الإشارات الكهربائية الداخلية في الحفاظ على توازن الأنسجة أقل فهما بكثير من دور التئام الجروح. أحد الأسباب المهمة هو عدم وجود أدوات مناسبة لدراسة هذه التأثيرات في الأنسجة السليمة. جهاز الموائع الدقيقة لمحور الجلفانوتيك غير مناسب لهذا الغرض بسبب هندسته ، والتي تدعم فقط التيارات الكهربائية داخل الطائرة. في سياق التوازن الظهاري ، هناك حاجة إلى جهاز جديد للتحكم في TEPD أو التيارات خارج المستوى وإزعاجه عبر طبقة ظهارية متقاربة. لتحقيق هدف تطبيق كثافة تيار أيوني منتظمة نسبيا عبر طبقة أحادية ، قمنا بتصميم وتصنيع جهاز موائع دقيقة مع ابتكارات في هندسة الجهاز ، واستخدام المواد ، وقدرات القياس الميكانيكية الحيوية في الموقع 4. القدرة الأخيرة مهمة لأن التأثيرات الكهربائية قد تؤثر على سلوك الخلية من خلال الاقتران بمسارات الميكانيكا الحيوية وعلم الأحياء الميكانيكي ، والتي يمكن دراستها باستخدام هذه الميزة.

يعرض هذا الجهاز الجديد العديد من الميزات المبتكرة. إنه مصمم بطبقتين بدلا من القناة المفردة الموجودة في أجهزة الجلفانوتاكس (الابتكار في الهندسة) ، مع الحفاظ على الاتصال بغرف القطب الكهربائي مشابها لتلك الموجودة في الأخيرة. تحتوي الطبقة الدقيقة الأولى على قنوات لتوجيه التيارات الأيونية إلى (أو بعيدا عن) منطقة الأنسجة ، بينما تحتوي الطبقة الثانية على فتحة توجه هذا التيار بشكل عمودي عبر الظهارة الموجودة فوق هذه الطبقة الدقيقة الثانية (الشكل 1 أ ، ب). تستخدم تقنيات التصنيع الدقيق لإنتاج طبقات رقيقة بما فيه الكفاية بحيث يكون التصوير متحد البؤر عالي الدقة ممكنا على الرغم من تكديس طبقات الموائع الدقيقة التي تزيد من سمك العينة. بالنسبة للابتكارات المهمة الأخرى ، يتم دمج هيدروجيل بولي أكريلاميد (PA) الاصطناعي في منتصف الجهاز ، والذي يلعب دورا مهما (الشكل 1 أ ، ب). الخصائص الفيزيائية والكيميائية لهذا الجل ، مثل الكيمياء المتاحة لتغطية بروتينات المصفوفة خارج الخلية ، ونفاذية الأيونات ، بالإضافة إلى المرونة المعروفة ، ضرورية على التوالي لارتباط الخلية ونموها ، وتطبيق التيارات خارج المستوى ، وقياس الإجهاد الميكانيكي20 أثناء التحفيز الكهربائي. يتم دمج هياكل الحاجز في الطبقة 1 من منطقة الأنسجة لحبس محلول السلائف الهلامية PA ، كما هو الحال في أجهزة الموائع الدقيقةالسابقة 21 (الشكل 1 أ ، ب). أخيرا وليس آخرا ، نظرا لأن بلمرة هلام PA مثبطة للأكسجين على أسطح PDMS المنفذة لغاز الأكسجين ، يتم استخدام مادةأخرى 22 لتصنيع الجهاز ، والتي يمكن أن تسمح بالبلمرة والترابط المحكم لهلام PA. جميع الميزات المبتكرة ضرورية لعمل الجهاز الجديد.

بشكل عام ، أصبحت الدراسة المتعمقة للإشارات الكهروحرية الحيوية الثابتة أو المتغيرة ببطء في توازن الأنسجة السليمة ممكنة باستخدام هذا الجهاز الجديد ، والذي سيتم تفصيل البروتوكول الخاص به أدناه. يركز البروتوكول والنتائج المشار إليها هنا على خط الخلايا الظهارية Madin Darby Canine Kidney II (MDCK II) ، بما في ذلك أحداث الخلية (التكاثر والموت والبثق والهجرة) والتغيرات الهيكلية للأنسجة التي يسببها التيار الكهربائي. هذه الدراسات مفيدة أيضا للباحثين المهتمين بتطبيق هذه التقنية لدراسة التنظيم الكهربائي للنقل الظهاري وتحريض أحداث الخلية وتغيرات مصير الخلية في طبقات الخلية والأنظمة الأكثر تعقيدا ، مثل الخلايا الأولية والعضيات ثنائية الأبعاد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يوفر هذا البروتوكول خطوات لإنشاء إعداد يطبق التيارات الكهربائية الساكنة ويزعج TEPD للظهارة المتقاربة ودراسة آثاره من خلال تصوير الخلايا الحية وتقنيات علم الأحياء الميكانيكية (الشكل 1). يتكون الإعداد من أجهزة مصنوعة من رقائق الموائع الدقيقة المرتبطة بخراطيش وإدخالات وحوامل لإيواء أجهزة متعددة للتجارب متعددة على المجهر ، وزوج من غرف الأقطاب الكهربائية المتصلة بمقياس مصدر وأجهزة ، وغطاء غرفة الخلية الحية للحفاظ على ظروف الخلايا الحية المناسبة (الشكل 1 ج). يمكن العثور على مبادئ التصميم ورسومات ملف CAD للخرطوشة والمكونات المهمة الأخرى للإعداد في الملف التكميلي 1. تشمل الخطوات: 1) الطباعة الحجرية الناعمة PDMS. 2) تصنيع الرقائق وتجميع الجهاز ؛ 3) الانتهاء من الإعداد. و 4) نمو أحادي الطبقة وتجارب الخلايا الحية. يتم تقديم معلومات مفصلة حول الكواشف والمواد المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد.

1. الطباعة الحجرية الناعمة PDMS

ملاحظة: يوضح هذا القسم تفاصيل إنتاج اللدائن PDMS من رقائق SU-8 (الشكل 2 أ ، ب) لتشكيل طبقات لاصقة قابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية من رقاقة الموائع الدقيقة.

  1. الطباعة الحجرية الناعمة PDMS
    1. قم بتصنيع رقاقة منفصلة قائمة على SU-8 لكل طبقة من طبقات الموائع الدقيقة ، الطبقة 1 و 2 ، باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الضوئية (الملف التكميلي 2 والملف التكميلي 3).
      ملاحظة: قد يستغرق تصنيع الرقاقة شهرا إذا تم إرسال طلب إلى منشأة تصنيع دقيق / غرفة نظيفة. يمكن أيضا استخدام تقنية نقش السيليكون لتصنيع الرقاقة.
    2. قم بسيلان رقاقة السيليكون للسماح بفك القوالب PDMS19.
      1. نظف الرقاقة بمسدس نفخ هواء النيتروجين المضغوط. قم بتنشيط سطح الرقاقة عن طريق تطبيق عملية بلازما أكسجين قصيرة (30 ثانية ، 30 واط في 20 سم مكعب O2 تدفق غاز عند ضغط مفاعل 1-3 ملي بار)23.
      2. ماصة 200 ميكرولتر من Tridecafluoro-1،1،2،2-tetrahydrooctyl-1-trichlorosilane في غطاء بلاستيكي نظيف (قطر 60 مم ، ارتفاع 15 مم). ضع الغطاء بجوار الرقاقة في المجفف الفراغي (فقط للسيلانة). قم بتشغيل مضخة التفريغ وانتظر لمدة 1-2 ساعة ، بينما يتم ترسيب السيلان المتبخر كطبقة أحادية على رقاقة السيليكون.
        تحذير: سيلان أكال وسامة. ارتد قفازات ونظارات واقية ، وقم بالعمل في غطاء دخان لضمان التشغيل الآمن.
        ملاحظة: يمكن استخدام رقاقة سيلان حديثة لتصنيع 10-20 قطعة من قوالب PDMS. يعتمد وقت الفراغ على حالة مضخة التفريغ. يسبب السيلانالة المفرطة سمكا غير متساو وينتج عنه مظهر غائم ، وهو ما يجب تجنبه. قم بتخزين الرقاقة في غرف يتم التحكم فيها بالرطوبة عندما لا تكون قيد الاستخدام. يمكن فحص هياكل PDMS المصنوعة من رقائق جديدة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM).
    3. امزج راتنج PDMS الأساسي الكافي وعامل التشابك جيدا (w: w = 10: 1 ، و 70-80 جم) لبضع دقائق في طبق بتري (قطر 150 مم ، ارتفاع 25 مم). تأكد من تشكل فقاعات صغيرة بشكل موحد في الخليط ، مما يؤكد وجود خليط جيد. انقل الخليط إلى أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل وجهاز طرد مركزي عند 550 × جم لمدة 3 دقائق لإزالة فقاعات الهواء تماما.
      ملاحظة: سائل PDMS لزج ويصعب تنظيفه. كن حذرا عند الصب. نظف بالأيزوبروبانول إذا كانت أسطح مقاعد البدلاء ملوثة بخليط PDMS المنسكب.
    4. اسكب خليط PDMS برفق على الرقاقة في طبق بلاستيكي أو زجاجي (قطر 150 مم ، ارتفاع 25 مم) بقاع مسطح ، ثم ادفع الرقاقة لأسفل لتطهير PDMS من قاع الرقاقة. خليط ديغاز بمضخة تفريغ.
      ملاحظة: من المهم تطهير PDMS السائل من أسفل الرقاقة ؛ تجعل طبقة PDMS السميكة في الأسفل من الصعب إزالة الرقاقة من الطبق البلاستيكي ، مما يزيد من احتمالية تحطم الرقاقة. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء قطع PDMS على طول حافة الرقاقة والاحتفاظ بالرقاقة في طبق بتري. تأكد من سمك PDMS يبلغ حوالي 1.5 مم للطبقة 1 لضمان مرونة القالب في خطوات التصنيع اللاحقة. تأكد من سمك PDMS بحوالي 2.5 مم للطبقة 2 لتقليل احتمالية الترهل في خطوات التصنيع اللاحقة. يتم قياس سمك PDMS بواسطة مسطرة بعد تقطيع قوالب PDMS إلى الأشكال المطلوبة.
    5. عالج PDMS في فرن على حرارة 80 درجة مئوية لمدة ساعتين ، وتأكد من وضع الطبق أفقيا قدر الإمكان أثناء العملية. اترك قالب PDMS والرقاقة تبرد إلى درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة قالب PDMS بالكامل بعناية من الرقاقة باستخدام شفرة جراحية حادة وملاقط مبطنة.
      ملاحظة: احرص على عدم خدش سطح الرقاقة. تحقق مما إذا كانت بقايا PDMS قد تشكلت على سطح الرقاقة عند تقشير PDMS. يشير هذا إلى أنه يجب إعادة تشكيل سطح الرقاقة.
    6. قم بتقطيع قالب PDMS إلى كتل تحتوي على ميزات ذات أهمية وقم بتخزين هذه الكتل في أطباق بتري نظيفة (قطر 150 مم ، ارتفاع 25 مم) أو غرفة مفرغة عندما لا تكون قيد الاستخدام. قم بمعالجة قالب PDMS دون لمس الميزات الأساسية.

2. تصنيع الرقائق وتجميع الجهاز

ملاحظة: استخدم بوليمر منخفض اللزوجة وقابل للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية (أقصى نطاق امتصاص للأشعة فوق البنفسجية 350-380 نانومتر) لتصنيع رقاقة الموائع الدقيقة من خلال صب PDMS. يسمح المادة اللاصقة القابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية بدمج هيدروجيل بولي أكريلاميد (PA) كركيزة خلايا شفافة ونفاذة للأيونات ومرنة. تدعمه خصائص جل PA كمستشعر إجهاد ميكانيكي للأنسجة يسمح بتصوير الخلايا الحية وتحفيز التيار الساكن. سيتم توصيل الشريحة أخيرا بخرطوشة تحتوي على وسيط ثقافة وتتصل بغرف القطب.

  1. غطاء زجاجي لإعداد قاعدة الانزلاق
    1. سجل الكمية المطلوبة من الأغطية الزجاجية المستطيلة (170 ميكرومتر) باستخدام قاطع الماس بحجم 37 × 24 مم2 ، لتناسب أبعاد الخرطوشة (الملف التكميلي 4).
      ملاحظة: يبلغ سمك الغطاء 170 ميكرومتر متوافق مع التصوير عالي الدقة ، ولكنه هش ويتطلب معالجة دقيقة. ارتد قفازات وحماية للعين. تخلص من الأغطية الزجاجية المستطيلة على الفور في حالة ظهور أي تشققات مرئية ، لأن الرقائق من هذه الأغطية الزجاجية المستطيلة قد تشكل خطر التسرب. بدلا من ذلك ، اطلب أغطية بالحجم المناسب من الشركات المصنعة للغطاء. تجنب لمس أسطح الأغطية الزجاجية المستطيلة تنزلق بأيدي عارية وتترك بقعا يمكن أن تؤدي إلى تدهور جودة التصوير.
    2. ضع الأغطية المستطيلة في طبق بتري نظيف دون تداخل ، وانقلها إلى غرفة البلازما. إحداث حالة فراغ ، لكن اترك القليل من الهواء في النهاية. قم بتنشيط أسطح الأغطية الزجاجية المستطيلةزلات باستخدام البلازما الهوائية (30 ثانية إلى 5 دقائق ، 29.6 واط ، حسب حالة الجهاز)
      ملاحظة: يجب استخدام الجوانب المعرضة بالكامل للبلازما (أي الأسطح العلوية) فقط في الخطوة التالية (الخطوة 2.1.3). أكمل الخطوة 2.1.3 في غضون 30 دقيقة بعد التعرض للبلازما. يجب أن تظهر الغرفة على شكل وردي أرجواني في هذه المرحلة إذا تم إنشاء بلازما الهواء. إذا نجحت خطوات الترابط الأخيرة ، قلل من مدة البلازما للراحة.
    3. تحضير 10 مل من محلول المعالجة السطحية المصنوع من 0.3٪ حمض الأسيتيك و 0.5٪ 3- (تريميثوكسيسيليل) بروبيل ميثاكريلات مذاب في 100٪ إيثانول. عالج الأغطية الزجاجية المستطيلة بهذا المحلول في طبق بتري (قطر 150 مم ، ارتفاع 25 مم) لمدة 5 دقائق على شاكر ، للسماح بالترابط الجيد مع طبقات الموائع الدقيقة القائمة على المواد اللاصقة القابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية. تأكد من أن الأغطية الزجاجية المستطيلة مغمورة بالكامل في المحلول ، ومعالجة كلا الجانبين.
      تنبيه: محلول المعالجة السطحية قابل للتآكل. تعامل معها في غطاء الدخان.
    4. شطف الأغطية الزجاجية المستطيلة مع 100٪ الإيثانول ثلاث مرات ، دون تركها تجف أثناء العملية. تنزلق الأغطية الزجاجية المستطيلة الجافة واحدة تلو الأخرى بغاز النيتروجين ومسدس النفخ. تأكد من معدل نفخ كاف يزيل قطرات السائل بشكل نظيف من أسطح قاعدة الغطاء ، مما يمنع بقع السوائل. قم بتخزين الأغطية الزجاجية المستطيلة في طبق بتري نظيف (قطر 150 مم ، ارتفاع 25 مم).
      ملاحظة: استخدم مسدس النفخ لتوجيه تدفق الهواء بالتوازي مع قواعد الغطاء المنزلق وتجنب استخدام معدل النفخ المفرط لمنع تحطم النظارات.
  2. تصنيع الطبقة 1 (الشكل 2 ج)
    1. ضع قالب PDMS من الطبقة 1 نظيفا وافرده، ووجهه لأعلى، على غطاء طبق بلاستيكي نظيف (قطر 60 مم، ارتفاع 15 مم). ماصة 500 ميكرولتر مادة لاصقة سائلة قابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية على القالب ببطء ، وترطيب جميع الهياكل البارزة بعناية بمساعدة ملعقة. قم بإزالة فقاعات الهواء بسبب عملية الترطيب.
      ملاحظة: يمكن تحضير قوالب PDMS النظيفة باستخدام شريط لاصق لإزالة الغبار أو بقايا المواد اللاصقة القابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية ، أو عن طريق التنظيف بالإيثانول. لمزيد من الاحتياطات ، احتفظ بقوالب PDMS في غرف مفرغة عندما لا تكون قيد الاستخدام.
    2. اضغط برفق على الغطاء على قالب PDMS. امنع المادة اللاصقة الزائدة القابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية من ترطيب الجانب العلوي من الغطاء ، حيث يمكن أن تمنع بقايا المواد اللاصقة القابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية انزلاق الغطاء النظيف والمسطح. قم بإزالة المادة اللاصقة الزائدة القابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية باستخدام مساحات المختبر.
      ملاحظة: من الأهمية بمكان التأكد من أن ميزات قالب PDMS المنقولة إلى الطبقة اللاصقة القابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية ستتماشى مع الخرطوشة التي سيتم ربطها بها. للقيام بذلك ، قم بتمييز الغطاء بقلم تحديد قابل للذوبان حيث سيتم وضع مراكز آبار الخرطوشة (ثلاثة منها). استخدم هذه العلامات لمحاذاة انزلاق الغطاء مع ميزات قالب PDMS عند الضغط على الغطاء الزجاجي المستطيل لأسفل.
    3. قم بمعالجة الهيكل جزئيا تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية المضاء بشكل موحد (363-370 نانومتر ، 224 ميجاوات / سم2) لمدة 10 ثوان. امسح العلامات بنسبة 75٪ من الإيثانول لاحقا. أمسك الهيكل بقوة على سطح مستو ، وقشر قالب الطبقة 1 PDMS ببطء منه.
      ملاحظة: يتيح المعالجة الجزئية تكوين طبقة لاصقة صلبة بما فيه الكفاية قابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية ، مما يسمح بتقشير قالب PDMS في هذه المرحلة. هذا يسهل أيضا الترابط مع الطبقة 2 المعالجة جزئيا في الخطوات اللاحقة لتصنيع هيكل لاصق قابل للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية من طبقتين. يضمن قالب PDMS من الطبقة 1 ، الذي تم تحضيره بسماكة 1.5 مم (الخطوة 1.2.4) ، مرونة كافية في PDMS تقلل من احتمالية تحطم الغطاء الرقيق أثناء عملية التقشير. يمكن إعادة استخدام قالب PDMS لمدة تصل إلى عشر إلى عشرين مرة ، وبعد ذلك قد تكون هناك طبقة بيضاء من بقايا المواد اللاصقة القابلة للعلاج بالأشعة فوق البنفسجية على سطح PDMS ، مما يقلل من سمك الهيكل. استخدم قوالب PDMS جديدة في هذه الحالة.
  3. تصنيع الطبقة 2 (الشكل 2D)
    1. ضع قالب PDMS من الطبقة 2 نظيفا ، ووجهه لأسفل ، على لوح PDMS مسطح (سمك البلاطة > 2.5 مم لضمان صلابة عالية). اضغط برفق على الميزات من الأعلى باستخدام ملاقط. راقب واجهة التغميق أو التباين البصري أسفل الميزات - وهذا يشير إلى الاتصال المناسب.
      ملاحظة: تعتبر أعمدة الدعم المحيطة بالسمات الرئيسية (فتحتان دائريتان وشق) ضرورية لمنع سطح قالب PDMS من الترهل.
    2. املأ الفراغ بين قالب PDMS والبلاطة بمادة لاصقة سائلة قابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية عبر تأثير شعري. عالج الهيكل جزئيا تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (363-370 نانومتر ، 224 ميجاوات / سم2) لمدة 10 ثوان.
    3. قشر برفق الطبقة اللاصقة المركبة القابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية وقالب PDMS من لوح PDMS باستخدام ملقط مبطن ناعم. قم بقص الحواف الزائدة للطبقة اللاصقة القابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية باستخدام مقص حاد إذا لزم الأمر.
  4. الترابط من الطبقة 1 و 2 (الشكل 2E)
    1. ضع الطبقة 1 متصلة بغطاء زجاجي مستطيل على سطح مستو. قم بمحاذاة الطبقة 2 (لا تزال متصلة بقالب PDMS الخاص بها) مع الطبقة 1 واضغط على كلتا الطبقتين بقوة ، مما يضمن ظهور "الظلال" أسفل الميزات.
    2. قم بمعالجة الهيكل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (363-370 نانومتر ، 224 ميجاوات / سم²) لمدة 10 ثوان لربط الطبقتين 1 و 2 ، والتي تشكل الهيكل المكون من طبقتين لشريحة الموائع الدقيقة. قشر قالب PDMS برفق من الشريحة.
      ملاحظة: لضمان التقشير الناجح لقالب PDMS من الرقاقة ، استخدم الملقط لفصل كل عمود دعم PDMS عن الطبقة اللاصقة 2 القابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية في الخطوة 2.4.1. يساعد هذا الإجراء على تقليل الالتصاق الكلي بين قالب PDMS والطبقة 2 ، وهو أمر مهم للتقشير.
  5. تكامل هلام بولي أكريلاميد (الشكل 2F)
    ملاحظة: قبل هذا القسم ، قم بإعداد أكبر عدد ممكن من الرقائق حسب الحاجة لتجربة متعددة الإرسال.
    1. قم بإعداد محلول السلائف الهلامية PA عن طريق خلط المكونات برفق في الجدول أدناه ، بما يتوافق مع صلابة هلام PA من الاختيار24 (تحقق من الجدول 1). احرص على عدم إدخال فقاعات الهواء أثناء سحب العينة لأن الأكسجين يمنع التبلور.
      تحذير: TEMED و APS سامة. اعمل في غطاء الدخان وارتد القفازات.
      ملاحظة: يلزم سحب العينات والمناولة بعناية نظرا لوجود كميات صغيرة من السوائل (1 ميكرولتر TEMED ل 1 مل من محلول السلائف الهلامية PA). يمكن أن يؤثر تصلب الجل على سلوك الخلية كما هو موضح في العديد من دراسات علم الأحياء الميكانيكي. اختر الصلابة الأنسب لتجاربك. تعمل حبات الفلورسنت كعلامات ائتمانية لتشوه الهلام واستدلال الإجهاد الميكانيكي. محلول حبة دوامة قبل سحب المحلول في محلول سلائف جل PA. يوصى بعدم خلط الحجم الصغير TEMED أخيرا لأن محاليل سلائف هلام PA تبدأ في الهلام عند إضافة كلا البادئين ويصعب خلط الكميات الصغيرة جيدا خلال هذا الوقت القصير.
    2. على الفور ماصة 10 ميكرولتر من محلول السلائف الهلامية PA في منتصف منطقة الأنسجة وفوق شق الطبقة 2 (الشكل 1 ب ، 2 ف). اضغط برفق لأسفل باستخدام غطاء زجاجي دائري (قطر 10 مم) لتشكيل جل مسطح. راقب تدفق محلول PA إلى الطبقة 1 من خلال الشق وتوقف عند صف أعمدة الحاجز.
      ملاحظة: ينتج حجم 10 ميكرولتر من محلول سلائف هلام PA جل بسمك 100 ميكرومتر فوق الطبقة 2. قم بتغيير هذا الحجم حسب سمك الجل المطلوب. قم بلصق المحلول على الرقاقة في أسرع وقت ممكن ، حيث يبدأ محلول PA في البلمرة بمجرد إضافة البادئات. اضغط على المحلول بالقدر المناسب من القوة لمنع المحلول من التدفق عبر أعمدة الحاجز وسد القناة. تجاهل الشريحة إذا كانت القنوات مسدودة. بالنسبة للمواد الهلامية اللينة ذات الصلابة 5 كيلو باسكال أو أقل ، استخدم طارد الماء الزجاجي لمعالجة الأغطية الزجاجية المستديرة لجعل الأغطية كارهة للماء. على وجه الخصوص ، اغمر الأغطية في طارد الماء الزجاجي لمدة 5 دقائق ، ثم اشطفها بالإيثانول بنسبة 100٪ 3 مرات ، وجففها بغاز النيتروجين. هذا يسهل تقشير الغطاء من الجل المبلمر لاحقا دون تدمير الجل.
    3. عالج الرقاقة الدقيقة على الفور تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (363-370 نانومتر ، 224 ميجاوات / سم2) لمدة 5 دقائق. انتظر لمدة ~ 1 ساعة على الأقل حتى يتجمد جل PA تماما.
      ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى علاج الرقاقة بالكامل مع السماح لهلام PA المبلمر بالالتصاق بالهيكل. وينبغي إكمال الخطوات 1.5.2 و2.5.2 و3.5.2 في تتابع سريع.
    4. احتضن الرقاقة جيدا في HEPES (0.1 M، درجة الحموضة 7.4) لمدة ساعة واحدة على الأقل أو أكثر لترطيب الجل وفك الالتصاق بين الغطاء والجل. قم بإزالة زجاج الغطاء برفق باستخدام زوج حاد من الملقط.
      ملاحظة: بالنسبة للمواد الهلامية الأكثر نعومة بصلابة 5 كيلو باسكال أو أقل ، قم بزيادة فترة الحضانة حتى 10 ساعات على الخلاط لضمان إزالة زجاج الغطاء من الجل بشكل نظيف دون تعطيل بنية الجل. في بعض الأحيان ، قد تتشكل أنماط هيكلية من عدة عشرات ومئات ميكرومترات بين قاعدة الغطاء المستطيلة والطبقة اللاصقة 1 القابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية. يمكن أن تتداخل هذه الأنماط مع تصوير المجال الساطع ولكن لها تأثيرات ضئيلة على التصوير الفلوري. يمكن تحسين ذلك عن طريق تنشيط البلازما للأغطية المستطيلة كما في الخطوة 2.1.2.
  6. ربط الرقاقة والخرطوشة (الشكل 2F)
    1. ضع خرطوشة بولي كربونات نظيفة من الدرجة الطبية (الملف التكميلي 4) على سطح مستو ، بحيث يكون الجزء السفلي متجها لأعلى. جفف الجل على الرقاقة بمناديل المختبر المبللة من الجانب. قم بمحاذاة الشريحة ، ووجهها لأسفل ، مع الخرطوشة.
      ملاحظة: عند اختبار تصميمات الخراطيش الجديدة ، يمكن للمرء استخدام طرق المعالجة أو الطباعة ثلاثية الأبعاد. عندما يتم تعيين التصميم ، يمكن للمرء استخدام قولبة الحقن لإنتاج كميات كبيرة من الخرطوشة.
    2. ماصة لاصقة قابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية في الشقوق بين الرقاقة والخرطوشة ، والتي سيتم ملؤها عبر تأثير شعري. علاج بضوء الأشعة فوق البنفسجية (363-370 نانومتر ، 224 ميجاوات / سم2) لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: احرص على تجنب فيضان المادة اللاصقة القابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية في القنوات ، أو إلى الجانب الآخر من قاعدة الانزلاق الغطاء.
  7. إزالة محلول PA غير المبلمر
    1. استخدم سدادة PDMS ومحقنة لسحب ما يقرب من 5 مل من HEPES (0.1 M، درجة الحموضة 7.4) عبر قنوات إزالة النفايات لطرد محلول سلائف هلام PA غير المبلمر السام للخلايا.
    2. احتضان الجل في الجهاز ب 2 مل من HEPES (0.1 M ، درجة الحموضة 7.4) لكل جهاز ، وضعه على شاكر لمدة 1-2 أيام ، لضمان الإزالة الكاملة لمحلول سلائف جل PA غير المبلمر.

3. الانتهاء من الإعداد

ملاحظة: مع الأجهزة المصنوعة ، أكمل الإعداد (الشكل 1 ج) عن طريق طلاء هلام PA ببروتين ECM لبذر الخلايا ، وتوصيل الأجهزة بغرفة القطب الكهربائي للتحفيز الكهربائي ، ووضع الأجهزة في إدخالات ، وحوامل ، وغطاء غرفة الخلية الحية لتجارب التصوير متعددة الإرسال للخلايا الحية.

  1. تحضير المكونات المعقمة
    1. يجب أن تكون جميع مكونات الإعداد بخلاف الجهاز (جدول المواد) صوتنية بالترتيب التالي: أولا في الماء والصابون لمدة 30 دقيقة ، ثم في ماء MQ لمدة 30 دقيقة ، وأخيرا في 75٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، جففها في فرن على حرارة 60 درجة مئوية وعالجها بضوء الأشعة فوق البنفسجية عند 200-280 نانومتر في خزانة السلامة الحيوية لمدة 30 دقيقة لتحقيق التعقيم.
  2. وظيفة هلام PA مع بروتين ECM
    1. قم بتعقيم الأجهزة بضوء الأشعة فوق البنفسجية (200-280 نانومتر) في خزانة السلامة الحيوية.
    2. قم بإعداد الكمية المطلوبة من 50 ميكروغرام / مل من محلول الكولاجين I في 1x DPBS على الثلج.
      ملاحظة: حافظ على مخزون الكولاجين الأول على الثلج لمنع التبلور. مطلوب 100-150 ميكرولتر من محلول عمل الكولاجين I لكل جهاز لغمر الجل بالكامل. قم بتعبئة محلول الكولاجين I بلطف لتجنب تكوين الألياف.
    3. قم بإعداد الكمية المطلوبة من محلول العمل Sulfo-SANPAH (SS) على الثلج. تتطلب كل معالجة هلامية ما يقرب من 80 ميكرولتر من محلول عمل SS ، حيث يتم تخفيف محلول مخزون SS 2 ميكرولتر (مذاب في DMSO اللامائي) في 80 ميكرولتر من HEPES بارد (من ثلاجة 4 درجات مئوية ، 0.1 متر ، درجة حموضة 7.4).
      ملاحظة: SS حساس للرطوبة. تجنب تكثيف الرطوبة على المنتج عن طريق موازنة قوارير المخزون مع درجة حرارة الغرفة قبل الفتح. استخدم SS بدون وزن للحصول على أفضل أداء ، وقم بإعداد مخزون في DMSO اللامائي. استخدمه في أسرع وقت ممكن. يتم استخدام مخزن مؤقت HEPES بارد لتقليل معدل التحلل المائي ل SS استعدادا لمحلول عمل SS. يتطلب كل جل علاجين باستخدام محلول العمل SS لضمان تشغيل سطح هلام PA بشكل جيد.
    4. جفف الجل في الجهاز عن طريق التربيت بمناديل المختبر على حواف الجل. ماصة 80 ميكرولتر من محلول عمل SS على الجل ، مما يضمن غمر سطح الجل تماما بمحلول SS. عالج الجل بالأشعة فوق البنفسجية (363-370 نانومتر ، 24.5 ميجاوات / سم2) لمدة 5 دقائق لتنشيط SS. اشطف 3 مرات باستخدام HEPES البارد (0.1 م ، الرقم الهيدروجيني 7.4).
      ملاحظة: ضع الماصة SS بعناية في منتصف الخرطوشة جيدا لمنع SS من الانجذاب إلى الحائط.
    5. كرر الخطوة 3.2.4 ، لكن اشطفها ثلاث مرات ب 1x DPBS باردة في النهاية.
      ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات من 3.2.3 إلى 3.2.5 في تتابع سريع لمنع التحلل المائي SS. يجب أن يظهر الجل المغسول كظل أحمر أغمق في هذه المرحلة إذا نجح تنشيط السطح بواسطة SS.
    6. ماصة محلول الكولاجين I 100 ميكرولتر على هلام PA ، مع التأكد من غمر الجل بالكامل. احتضني في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ، ثم اشطفي الكولاجين غير المتصل ب 1x DPBS ثلاث مرات. اغمر الجل في 1x DPBS قبل الاستخدام.
      ملاحظة: يمكن تخزين العينة المطلية بالكولاجين I في ثلاجة 4 درجات مئوية لبضعة أيام.
  3. توصيل الأجهزة بغرف القطب الكهربائي
    1. قم بتوصيل الأجهزة بالإدخالات باستخدام البراغي (الشكل 1 ج ، نوع المسمار: M3 × 10 مم). بعد ذلك ، قم بتثبيت ما يصل إلى أربعة مجموعات لإدخال الجهاز في الحامل المصمم للتركيب على مرحلة المجهر (نوع المسمار: M3 × 5 مم).
      ملاحظة: إذا لم يتم استخدام الحد الأقصى لعدد مجموعات إدخال الجهاز، فمن المستحسن ملء جميع فتحات الحامل الأخرى بأجهزة فارغة لإغلاق الفراغ بحيث يمكن الحفاظ على ظروف الخلايا الحية الجيدة لتجارب التصوير لاحقا. يمكن ببساطة تصنيع الأجهزة الفارغة عن طريق ربط خراطيش بأغطية زجاجية مستطيلة عارية.
    2. املأ الأجهزة بوسط ثقافة (DMEM ++ ، 2 مل في كل من الآبار الرئيسية). اسحب أيضا 2 مل من الوسط عبر قنوات إزالة النفايات لطرد واستبدال 1x DPBS.
    3. قم بإعداد أنبوبين سعة 50 مل بأغطية بها فتحات لتعمل كغرف قطب. قم بإنشاء ثقوب بحجم وكمية مناسبين لتناسب الأقطاب الكهربائية البلاتينية وأنابيب Tygon بشكل آمن ، وتوصيل غرف القطب الكهربائي بالأجهزة. املأ كل غرفة قطب كهربائي ب 45 مل من وسط الاستزراع.
      ملاحظة: يمكن إنشاء ثقوب بسهولة على الأغطية باستخدام شفرات جراحية حادة.
    4. قم بإعداد الاتصال بين غرف القطب الكهربائي والأجهزة: قم بتوصيل موصلين أنبوبيين بكل جهاز. قم بفتحة مشبك أنبوب على كل أنبوب Tygon (الشكل 1 ج). اسحب وسط الثقافة من خلال الأنابيب بحقنة وقم بقصها بإحكام. قم بتوصيل أحد طرفي الأنبوب المتوسط المملوء بغرفة القطب الكهربائي والآخر بالجهاز.
      ملاحظة: قلل من احتمالية ظهور فقاعات في الأنابيب باستخدام وسط مسخن مسبقا و / أو تفريغ الوسط في غرفة مفرغة. امنع فقاعات الهواء من التكون عند الواجهة بين أنابيب Tygon وموصل الأنابيب ، أو اضغط على نهايات الأنابيب لانتفاخ السطح المتوسط للخارج قبل الغمر في الوسط في الأنبوب ، أو قم بعمل مرفق مادي بموصلات الأنابيب.
    5. اضبط الارتفاعات النسبية بين أسطح وسط الاستزراع في الأجهزة وغرف القطب الكهربائي باستخدام مقبس المختبر. حرر مشابك الأنابيب واترك جميع الأسطح المتوسطة تتوازن بنفس الارتفاع.
      ملاحظة: تذكر ربط مشابك الأنابيب كلما تم تحريك الإعداد بالكامل لتجنب فيضان السوائل.
    6. قم بإجراء مراقبة الجودة عن طريق قياس مقاومة كل جهاز على حدة باستخدام مقياس مصدر كهربائي.
      ملاحظة: تأكد من تحرير مشبك الأنبوب الخاص بالجهاز الذي يتم قياس المقاومة له فقط، مع الحفاظ على مشابك الأجهزة الأخرى المتصلة بالتوازي مثبتة بإحكام.

4. نمو أحادي الطبقة وتجارب الخلايا الحية

ملاحظة: لتشكيل طبقة أحادية ملتقاء مناسبة وتحقيق كثافة تيار كهربائي موزعة بشكل موحد تعتمد على التقاء الطبقة الأحادية والمقاومة الكهربائية. بعد ذلك ، تأكد من ظروف الخلايا الحية المناسبة على المجهر للتصوير طويل الأمد وتجارب التحفيز الكهربائي.

  1. نمو أحادي الطبقة
    1. افصل خلايا MDCK باستخدام التربسين من قوارير T25. جهاز طرد مركزي لأسفل وعد الحجم المتوسط اللازم للحصول على 0.1 مليون خلية. هذا العدد من الخلايا واخلطها جيدا في وسط 2 مل في أنابيب الطرد المركزي.
    2. ماصة كل الوسط المحمل بالخلايا في البئر على منطقة الأنسجة. دع الخلايا تترسب لمدة 15 دقيقة قبل نقل الإعداد بأكمله ببطء إلى حاضنة زراعة الأنسجة.
      ملاحظة: بالنسبة لكل جهاز، تتوافق كثافة البذر البالغة 0.1 مليون خلية مع 0.06 مليون خلية لكل سنتيمتر مربع (6 × 104 خلايا/سم2). كثافة البذر هذه متناثرة بما فيه الكفاية ، وتنمو الخلايا لمدة يومين قبل أن تصل إلى حالة التقاء. تضمن هذه العملية طبقة أحادية مستقطبة ومتجانسة بشكل صحيح ، دون الحاجة إلى شطف الخلايا الزائدة غير المتصلة التي تخاطر باضطراب الأنسجة. من المهم ترك خطوة الترسيب دون إزعاج حتى يكون هناك بذر للخلايا.
    3. اسمح للخلايا بالنمو في الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، 90٪ رطوبة) لمدة 72 ساعة للوصول إلى كثافة خلية تبلغ > ~ 50 خلية / 100 ميكرومتر2. تحقق يوميا من المجهر على مقاعد البدلاء ، مع تباين الطور ، لمراقبة عملية النمو.
      ملاحظة: مع هذا العدد من الخلايا المزروعة ، ستصل خلايا MDCK إلى التقاء 70٪ -80٪ بعد 24 ساعة ، والتقاء كامل بعد 48 ساعة ، والمزيد من زيادة كثافة الخلايا ونضج الأنسجة حتى 72 ساعة. بعد 24 ساعة ، يبلغ متوسط طول الخلية حوالي 10-20 ميكرومتر. عند 48 ساعة ، يكون لوصلات الخلية وجسم الخلية تباين واضح تحت تصوير تباين الطور. هذا التباين يقلل بشكل كبير بعد 72 ساعة.
  2. تصوير الخلايا الحية
    1. اختر مجهرا مضانا أو مجهره متحد البؤر حسب الاحتياجات التجريبية. عندما تعبر الخلايا عن علامات الفلورسنت أو تلطخها ، اختر متحد البؤر للمراقبة ثلاثية الأبعاد لشكل الخلية وتشوهات ركيزة الهلام. للمراقبة ثنائية الأبعاد ، اختر تباين الطور والتألق ، مما ينتج عنه سمية ضوئية أقل. قم بتشغيل نظام الخلايا الحية قبل ساعة واحدة من إحضار الإعداد إلى المجهر ، مما يسمح لحاضنة المجهر العلوية بالاستقرار إلى 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، و 90٪ رطوبة.
      ملاحظة: تعرض وحدة التحكم في نظام الخلية الحية الظروف في الحاضنة العلوية وستصدر تحذيرا عندما تكون الظروف دون المستوى الأمثل. نظرا لأن غطاء الحاضنة العلوي يختلف عن الغطاء التجاري بسبب الحاجة إلى استيعاب أنابيب الجهاز التي تمتد إلى الخارج ، يحتاج النظام إلى إعادة المعايرة لضمان ظروف جيدة للخلايا الحية لتجارب طويلة الأمد (بضعة أيام حتى أسبوع). يمكن إجراء المعايرة بناء على دليل المستخدم ، ويجب الحفاظ على مواضع المستشعرات كما هي في التجارب كما هو الحال في ظروف المعايرة. تحقق من معدل تبخر الوسط في الحاضنة العلوية للمرحلة ، وظروف الأس الهيدروجيني باستخدام وسط مملوء بالفينول الأحمر.
    2. قم بتركيب الإعداد على المجهر، مع وضع غرف القطب الكهربائي على الجانبين. تأكد من أن المرحلة الإلكترونية للمجهر بها مساحة كافية للتحرك وعدم الاصطدام بغرف القطب. تأكد من أن ارتفاعات السطح المتوسطة متوازنة وبنفس الارتفاع بين تلك الموجودة في الأجهزة وغرف القطب.
      ملاحظة: السطح المتوسط في آبار الجهاز ، حيث توجد منطقة الأنسجة (الشكل 1 ج) ، له تأثير كبير على تصوير المجال الساطع وتباين الطور. سوف يتسبب الغضروف المفصلي في تركيز الضوء غير المرغوب فيه. تأكد من أن السطح المتوسط مسطح عند حافة البئر ، ولكن لاحظ أن التبخر المتوسط في غرفة الخلية الحية سيؤدي إلى تشويه هذا السطح المسطح بعد مرور بعض الوقت. للتغلب على هذه المشكلة ، يتمثل أحد الحلول في وضع غطاء زجاجي مسطح ملامسا للسطح المتوسط لتسطيح هذا السطح. يجب أن يكون لهذا الغطاء مساحة أصغر من البئر حتى لا يعيق تبادل الغازات ، وهو أمر مهم لنمو الخلايا. خيار آخر هو وضع طبقة من الزيت المعدني بدرجة زراعة الخلايا على الوسط.
    3. إعداد البرنامج.
      1. اختر عدسات موضوعية 10x أو 20x لتصوير الأنسجة الكاملة باستخدام مجهر فوق التألق ، وعدسات موضوعية 30x (WD 0.8 مم ، NA 1.05) للتصوير متحد البؤر عالي الدقة.
      2. لتصوير الأنسجة الكاملة ، اختر مواضع متعددة لتغطية المنطقة المستطيلة في منطقة الأنسجة (الشكل 1 أ ، على سبيل المثال ، 5 صفوف × 5 أعمدة ، الصف الأوسط يغطي الشق ، بينما يغطي الصف الآخر خارج الشق). اختر قنوات الفلورسنت والمجال الساطع وفقا لخطوط الخلايا المستخدمة في الجزء الناتج (القناة 488 للفلورة الخضراء والقناة 561 للفلورة الحمراء). اختر فاصلا زمنيا قدره ساعة واحدة لتقليل السمية الضوئية في تجربة التصوير طويلة الأمد هذه لمدة تصل إلى بضعة أيام.
        ملاحظة: يمكن اختيار العدسات الشيئية الأخرى ، مثل 4x ، إذا كانت هناك حاجة إلى رؤية أكبر للأنسجة بأكملها.
  3. التحفيز الكهربائي
    1. تحقق من عدد الأجهزة ومقاومة الجهاز النسبية والتيار الكهربائي المستهدف لكل جهاز. حدد إجمالي التيار الكهربائي الذي سيتم الحصول عليه لبضع ساعات حتى أسبوع في الإعداد العام.
    2. مصدر إشارة كهربائية تحت وضع المشبك الحالي. بالنسبة ل 3 أجهزة بنفس مقاومة القناة ، مع مجموعة تحكم واحدة (بدون تيار كهربائي ، مشبك أنبوب مثبت) ، وحالة حالية واحدة من قمي إلى قاعدي (AtB) ، وحالة حالية واحدة من القاعدي إلى القمي (BtA) (الشكل 1D) ، قم بتوفير تيار إجمالي قدره 20 ميكرو أمبير مع مقياس مصدر. يؤدي هذا إلى توفير 10 ميكرو أمبير لكل جهاز بكثافة تيار مقدرة ~ 10 ميكرو أمبير / سم2 ذات صلة من الناحية الفسيولوجية (مزيد من التفاصيل في المناقشة).
      ملاحظة: يبلغ إجمالي الجهد حوالي عشرات الملي فولت ، اعتمادا على طول أنبوب Tygon. يمكن توفير هذا التيار الكهربائي بشكل مستمر لبضعة أيام حتى أسبوع. سيتغير لون مؤشر الفينول الأحمر في غرف القطب الكهربائي (أكثر حمضية في الغرفة ذات القطب الموجب) ، ولكن ليس في الحاضنة العلوية ، والتي تمت معايرتها جيدا. ستبقى الخلايا صحية طالما تم الحفاظ على ظروف الخلايا الحية بشكل جيد. يمكن للباحثين تغيير الوسيط في الحاضنة العلوية مرة واحدة كل يومين ، والوسط في غرف القطب مرة كل بضعة أيام. اربط مشابك الأنابيب عند تبديل غرف القطب لتجنب فيضان الوسط. كما هو مذكور في الخطوة 3.1.1 ، تذكر أن يكون لديك جهاز فارغ لتغطية مساحة الحامل. هذا يضمن أن غرفة الخلية الحية في حالة مناسبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع النتائج المعروضة هنا مقتبسة من المنشور السابق4. لمزيد من التفاصيل ، راجع هذا المنشور.

يسمح هذا البروتوكول بتطبيق تيار أيوني خارجي أو مجال كهربائي عمودي على مستوى الخلايا أو الأنسجة. يزعج هذا التحفيز الكهربائي فرق الجهد الكهربائي عبر الظهارة الداخلي (TEPD) ويسمح للمرء بدراسة دور TEPD في التحكم في سلوك الأنسجة. باتباع البروتوكول ، تم زرع خلايا MDCK من النوع البري والمعدل وراثيا (GFP-actin و H1-GFP و GFP-E-cadherin MDCK) على الأجهزة ونمت إلى التقاء لمدة ثلاثة أيام. لد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول خطوات مفصلة ومنطق تصميم لتصنيع جهاز موائع دقيقة جديد لإجراء تجارب اضطراب الجهد الكهربائي عبر الظهارة ودراسة التأثيرات الكهربائية الحيوية من خلال تصوير الخلايا الحية وطرق علم الأحياء الميكانيكية. أهمية هذه الطريقة واضحة عند مقارنتها بالطرق الأخرى ذات الصلة. على سبيل المثال ، تستخدم إحدى الطرق ذات الصلة شريحة موائع دقيقة بسيطة بتصميم قناة واحدة تطبق تيارا ثابتا داخل المستوى لدراسة الجلفانوتاكس (هجرة الخلايا كدالة لكثافة التيار) 15،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تأكد من أن جميع المؤلفين قد كشفوا عن أي وجميع تضارب المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعترف XJ و PX و FF و TBS بالمناقشات المفيدة مع الدكتور Xumei Gao و Xinru Yu وأعضاء المجموعة الآخرين في مختبر الفيزياء الحيوية للأنسجة. نشكر مرفق خدمة التكنولوجيا المخصصة (CTSF) في جامعة ويستليك للمساعدة في الرسم التخطيطي الخاص بنا. تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة Westlake Education Foundation ، ومختبر Westlake لعلوم الحياة والطب الحيوي ، ومركز أبحاث صناعات المستقبل (RCIF) في جامعة Westlake.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1x DPBSجيبكو14190144
3- (تريميثوكسيسيليل) بروبيل ميثاكريلات ، TPMسيغما2530850يحفظ تحت النيتروجين بعد الفتح.
أنبوب الصقر 50 ملكورنينج430829قم بعمل 4 ثقوب في غطاء أنبوب الصقر سعة 50 مل ، لتمكين مرور القطب الكهربائي والأنابيب عبر الغطاء والانغماس في الوسط. لمجموعة من أجهزة الموائع الدقيقة ، هناك حاجة إلى 2 قبعات على الأقل.
حمض الخليكسينوفارم10000208
محلول أكريلاميد ، 40٪سيغما79061سام
مفرغة الهواءمختبر OKOأوكو - أس بمكون حاضنة المجهر
بركبريتات الأمونيوم ، APSعلاء الدينA112447
خرطوش--الخرطوشة مصنوعة حسب الطلب ، ويشير التصميم إلى المواد التكميلية. المواد الخام هي PC Makrolon 2858 Medical Grade ، وهنا يمكنك العثور على مزيد من التفاصيل: https://solutions.covestro.com/zh/products/makrolon/2858_000000000000508397?SelectedCountry=US
مشابك--روبرت كليب ، للأنابيب   ؛ من قطر خارجي 4.5 مم. https://item.taobao.com/item.htm?id=18717491819&pisk=gAsj0ailDjcjqv-tCE2rVYReT5-1h8rFWA9OKOnqBnKv6A1RBjpxDchRepvBWczD0Ft1wQS2gt-v6c1NQi5NBGJOfnjPucR4ih6OThNUTkrFntYBXWPETzI4tHpikchwH3nJbds8Mz2dntxMXYlT8aBmCOO1qfp968tJCdc9XKnte89wBdK9MFh-ypdJXhdvkYpJBpn9HCnYF3pDKKhv6qK-edJXXCC9X86JZdt96bH_3dwJgtw2FbzzkyxCHQitXiEMlB_i7ci1TKLfXtd5zaSWhEOpWac1uiCPBiSDrzgJjT7C1NCLaqRARp1W8ZNIc61DB6tV4jeJXFQP8E_7McOP0dTpXUMtXTtPPFsWvkhWEaBVWifjCcpc0M86tUwtjF-RYeQdGA2henpOsejatmAAB9jh8HZjtK_Rd3syxDRBL50sFem6FBy7FV0GhSGPYc782SYvEK__F8GxLEpkFBy7FV0MkLvf18wSMv5..&spm=a21xtw.29978518.0.0&skuId=3344063585144< / أ>
الكولاجين الأولكورنينج354236
ماء DI Milli-Qملي كيو-
وسط الاستزراع المتوسط للنسر المعدل من Dulbecco ، DMEM (نسبة عالية من الجلوكوز)جيبكو11965092DMEM ++ هو DMEM مع 10٪ إضافية  FBS (سيجما ألدريتش) ، و 100 &thinsp ؛ الوحدات / مل البنسلين الستربتومايسين (جيبكو).
الضميمة: قفص أسودمختبر OKOإتش201مكون حاضنة المجهر
مجهر مضان مقلوبأوليمبوستاسعة 83
الإيثانول المطلقسينوفارم10009218
مصل الأبقار الجنينيةسيغماF8318
حبات الفلورسنت ، 0.1 &mu ؛ L ، أحمر (580/605)الحراريهF8801
غرفة الغازمختبر OKOH201-PRIOR-SP200/400/600مكون حاضنة المجهر
خلاط الغاز اليدويمختبر OKO2GF-خلاطمكون حاضنة المجهر
جينيسينجيبكو10131027GFP – الأكتين و H1 &ndash ؛ تم الحفاظ على GFP MDCK باستخدام وسائط مكملة ب 0.5  مجم / مل جينيسين (جيبكو) للحفاظ على تعبيرهم الجيني
HEPESسيغما736459
إيزوبوبانولسينوفارم80109218
كيموايتكيمبرلي كلارك بروفيشنالإل إتش-70155ممسحة المختبر
برغي أطول--برغي آلة دقيقة متقاطعة مطلية بالنيكل ، M3 × 10 مم. https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n< / أ>
موصل الموائع الدقيقة--تركيب اتحاد مستقيم من مادة البولي بروبيلين ، 1/16 "-10-32UNF. https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=16&detail_redpacket_pop=true&id=555839592609<k2=1752310108435i7ldxj7ekdgu9qhnphlmj&ns=1&priceTId=2150470617523101021033708e1a4b&query=10-32unf%E8%9E%BA%E7%BA%B9%E7%9B%B4%E9%80%9A%E6%8E%A5%E5%A4%B4%20%E5%A1%91%E6%96%99%E5%A4%96%E8%9E%BA%E7%BA%B9%E6%8E%A5%E5%A4%B4&skuId=3600497427939&spm=a21n57.1.hoverItem.1&utparam=%7B%22aplus_abtest%22%3A%2245243a364caf5527e8392ded0656451a%22%7D&xxc=taobaoSearch< / أ>
حامل لوحات Multiwellمختبر OKOH201-MW-حامل - NZ500مكون حاضنة المجهر
N '، N'-Methylenebisacrylamide ، 2٪سيغما110269سام
نوا 73منتجات نورلاند17-345لاصق قابل للشفاء بالأشعة فوق البنفسجية
البنسلين الستربتومايسين ، PS (10،000 وحدة / مل)جيبكو15140122
طبق بتري (150 مم وحاد ؛ 25 مم)كورنينج430599مقاومة 80 درجة على الأقل ؛ C لمدة 2 ساعة
أداة بيكو بلازماداينر الالكترونية GmbH + Co. KGبيكو بلازمالعلاج البلازما O2
منظف البلازماهاريك بلازماPDC-002لعلاج بلازما الهواء
طبق بلاستيكي (قطر 60 مم ، ارتفاع 15 مم)عش705001
أقطاب كهربائية من البلاتينتيانجين عايدة هينغشنغنقطة 005القطر 0.5 مم ، الطول 37 مم   ؛
طارد الماء الزجاجي الأصلي Rain-XITW المنتجات الكيميائية800002242
غطاء مستطيلمارينفيلد0107222  1.5 ح ، 24 &حاد ؛ 50 مم < sup >2 < / sup > ، 170 &mu ؛ سمك م
غطاء زجاجي دائريمارينفيلد0111500  1.5 ساعة ، قطر دائري 10 مم
برغي أقصر--برغي آلة دقة متقاطع مطلي بالنيكل ، M3 × 4 مم https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&<. pisk = gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63 --_ 1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.& SPM = tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n"> https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n< / أ>
سلفو سانباه ، بدون وزنالحراريهأي35395محلول مخزون SS: 20 مجم / مل في DMSO اللامائي ، 2 &mu ؛ L لكل منهما. محلول عمل SS: 0.5 مجم / مل SS في HEPES (0.1 M ، درجة الحموضة 7.4).
SYLGARD 184 طقم مطاط صناعي من السيليكونداو كورنينجH052KCM147المنتج النهائي هو بولي ديميثيل سيلوكسان ، PDMS. تشتمل هذه المجموعة على راتنج PDMS الأساسي وعامل الربط المتشابك.
وحدة درجة الحرارةمختبر OKOH201-T-UNIT-BLمكون حاضنة المجهر
رباعي ميثيل إيثيلين ديامين ، TEMEDسيغما110189سام
شاشة تعمل باللمسمختبر OKOأوكو تاتشمكون حاضنة المجهر
ثلاثي الفلورو-1،1،2،2-رباعي هيدروكتيل-1-ثلاثي كلوروسيلانسيغما78560459
التربسين-EDTA (0.25٪)جيبكو25200072
أنابيب TygonتيجونAJK00002القطر الخارجي (OD) = 3.2 مم ، القطر الداخلي (ID) = 1.6 مم
منظف بالموجات فوق الصوتيةسوبميلدينار كويتي-300 دينار
آلة معالجة LED للأشعة فوق البنفسجيةغوفGHS-MFLGمصدر ضوء UV-LED ، نطاق Emision: 363 &ndash ؛ 370 نانومتر ، كثافة الطاقة القصوى: 230 ميجاوات / سم < sup >2< / sup>
وحدة ترطيب خالية من الاهتزازمختبر OKOإتش إم في إفمكون حاضنة المجهر
فيسيفيوVisitron Systems GmbH-صور أدوات أكثر نعومة
طبقة رقاقة1جامعة سنغافورة الوطنية ، معهد علم الأحياء الميكانيكية مرفق التصنيع الدقيق-الرقاقة مصنوعة حسب الطلب ، ويشير التصميم إلى مواد تكميلية.
طبقة رقاقة 2جامعة سنغافورة الوطنية ، معهد علم الأحياء الميكانيكية مرفق التصنيع الدقيق-الرقاقة مصنوعة حسب الطلب ، ويشير التصميم إلى مواد تكميلية.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alberts, B., et al. Molecular biology of the cell. , 4th ed, Garland Science. New York. (2002).
  2. Cogan, S. F. Neural stimulation and recording electrodes. Annu Rev Biomed Eng. 10 (1), 275-309 (2008).
  3. Zhao, M., et al. Electrical signals control wound healing through PI3K-γ and PTEN. Nature. 442 (7101), 457-460 (2006).
  4. Saw, T. B., et al. Transepithelial potential difference governs wound healing by electromechanics. Nat Phys. 18 (9), 1122-1128 (2022).
  5. Ferreira, F., Moreira, S., Zhao, M., Barriga, E. H. Stretch-induced collective cell migration in vivo. Nat Mater. 24, 452-470 (2025).
  6. Kennard, A. S., Theriot, J. A. Osmolarity-independent electrical response to injury in zebrafish epidermis. Elife. 9, 62386(2020).
  7. Allen, G. M., Mogilner, A., Theriot, J. A. Electrophoresis of keratocyte galvanotaxis. Curr Biol. 23 (7), 560-568 (2013).
  8. Levin, M., Thorlin, T., Robinson, K. R., Nogi, T., Mercola, M. Early step in left-right patterning. Cell. 111 (1), 77-89 (2002).
  9. Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of surface electrical currents with a vibrating probe. Nat Protoc. 2 (3), 661-669 (2007).
  10. Metcalf, M. M., Shi, R., Borgens, R. B. Endogenous ionic currents in embryos. J Exp Zool. 268 (4), 307-322 (1994).
  11. Barratt, L., Rector, F., Kokko, J., Seldin, D. Factors governing the Journal of Clinical Investigation. J Clin Invest. 53 (2), 454-464 (1974).
  12. Zhao, M., et al. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Semin Cell Dev Biol. 20 (6), 674-682 (2009).
  13. Barker, A., Jaffe, L., Vanable, J. Jr The glabrous epidermis in integrative and comparative physiology. Am J Physiol Integr Comp Physiol. 242 (3), R358-R366 (1982).
  14. Sun, Y., et al. Infection-generated electric field in gut epithelium guides migration of macrophages. PLoS Biol. 17 (4), e3000044(2019).
  15. Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. A galvanotaxis assay in a microfluidic culture device. J Vis Exp. (68), e4193(2012).
  16. Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and in vivo. Nat Protoc. 2 (6), 1479-1489 (2007).
  17. McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions of cell signaling. J Cell Sci. 122 (23), 4267-4276 (2009).
  18. Meng, X., et al. PI3K-mediated electrotaxis of embryonic and adult fibroblasts exposed to physiological electric fields. Exp Neurol. 227 (1), 210-217 (2011).
  19. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
  20. Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
  21. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  22. Stoecklin, C., et al. A new approach to design artificial 3D microenvironmental and rheological cues. Adv Biosyst. 2 (7), 1700237(2018).
  23. Khoo, B. L., et al. Expansion of patient-derived circulating tumor cells in a microfluidic culture device. Nat Protoc. 13 (1), 34-58 (2018).
  24. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Methods Cell Biol. 47, 11-16 (2010).
  25. Choudhury, M. I., et al. Kidney epithelial cells are active mechanosensors that drive physiological fluid pumps. Nat Commun. 13 (1), 2317(2022).
  26. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  27. Roy, B., et al. Fibroblast rejuvenation by mechanical reprogramming in the National Academy of Sciences. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (19), 10131-10141 (2020).
  28. Tao, J., et al. Mechanical compression creates a quiescent muscle stem cell niche. Commun Biol. 6 (1), 43(2023).
  29. Iberite, F., Gruppioni, E., Ricotti, L. Skeletal muscle differentiation: Perspectives and challenges. NPJ Regen Med. 7 (1), 23(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة