مقالة منهجية

تشريح الأنسجة القحفية الوجهية لسمك الزرد عند تلطيخها باللون الأزرق ألسي

DOI:

10.3791/68900

⸱

سبتمبر 12, 2025

 , 
1Tata Institute of Fundamental Research

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم البروتوكول الموصوف هنا إجراء بسيطا وسهل المتابعة لتلطيخ وتشريح الغضاريف القحفية الوجهية في يرقة سمك الزرد البالغة من العمر 5 أيام. يمكن استخدامه لدراسة تشريح وشكل وحجم هذه الهياكل في ظل ظروف النمو المختلفة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتبر أسماك الزرد ، نظرا لشفافيتها البصرية ، نموذجا ممتازا للفقاريات لدراسة الآليات التي تتشكل بها الغضاريف القحفية الوجهية في الجنين. يمكن تصنيف الغضاريف القحفية الوجهية على نطاق واسع إلى مجموعتين ، الجمجمة العصبية والجمجمة الحشوية ، والتي بدورها يمكن تقسيمها إلى العديد من مجموعات الغضاريف اللازمة لدعم الدماغ وتشكيل جهاز التغذية والجهاز التنفسي ، من بين أمور أخرى. سيصف هذا البروتوكول أولا إجراء تلطيخ بسيط وراسخ في أسماك الزرد لتصور مجموعات الغضروف هذه ، متبوعا بمنهجية لتشريح وفصل العصب والجمجمج. من هذه التشريح ، يمكن الحصول بسهولة على مقاييس الشكل والحجم البسيطة ، وفي هذا البروتوكول ، يتم توضيح ذلك للحنك ، وهو جزء من الجمجمة العصبية الأمامية ، وهو نسيج غالبا ما يتأثر في معظم الاضطرابات القحفية الوجهية لدى البشر. يمكن تكرار البروتوكول بطريقة مباشرة حتى في البيئات محدودة الموارد ، مما يوفر أداة تعليمية قيمة للطلاب الجامعيين للتعرف على مورفولوجيا الوجه القحفية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ينبثق الغضروف القحفي الوجهي في الفقاريات من مجموعة خلايا متعددة القدرات تسمى خلايا القمة العصبية القحفية1. يتم تحديد هذه الخلايا أولا في الهوامش الظهرية للصفيحة العصبية في الأجنة المبكرة ، والتي تهاجر بعد ذلك لمسافات كبيرة للوصول إلى المنطقة القحفية الوجهية والأقواس البلعومية قبل التمايز2،3. يتم الحفاظ على آليات الإشارات التي تدفع هذا الهجرة والتمايز إلى حد كبير بين الفقاريات4،5. على الرغم من ذلك ، فإن تنظيم عناصر الغضروف الفردية وحجمها وشكلها متميزان عبر الأنواع ، مما يؤدي إلى ظهور أشكال قحفية وجهية متنوعة6. ظهرت أسماك الزرد ، على وجه الخصوص ، كنظام نموذجي قوي لدراسة التشكل القحفي الوجهي ، نظرا للطبيعة الشفافة للأجنة حتى مراحل اليرقات. باستخدام إجراءات تلطيخ بسيطة لتمييز الغضروف ، تم تمييز مورفولوجيا العديد من الهياكل القحفية الوجهية في أسماك الزرد تحت اضطرابات مختلفة لمسارات الإشارات7،8،9 وكذلك عندما تتعرض الأجنة أو اليرقات للملوثات الشائعة الموجودة في البيئة10. يتضمن التلوين الأزرق Alcian الموصوف هنا لتمييز الغضروف استخدام ظروف غير حمضية موحدة بواسطة Walker و Kimmel11 ، والتي تم استخدامها لاحقا من قبل العديد من مختبرات أسماك الزرد التي تعمل على التطور القحفي الوجهي5،12،13،14،15،16،17،18،19، بما في ذلك وصف الاستخدام في إعدادات المدرسة الثانوية20. يحافظ التلوين الخالي من الأحماض على الهياكل العظمية سليمة ، مما يسمح بتلطيخ الغضاريف والعظام معا باستخدام الأزرق الألسي والأحمر الأليزارين ، على التوالي. ومع ذلك ، فإن البروتوكول التفصيلي للتلوين وكذلك لإجراء تشريح دقيق للغضاريف القحفية الوجهية ، خاصة للمساعدة في إجراء مثل هذه الدراسات في أماكن محدودة الموارد ، مفقود.

على الرغم من أن بنية الهيكل العظمي للوجه في أسماك الزرد البالغة معقدة إلى حد ما ، وتتكون من 43 عظمة مشتقة من الغضروف21 ، فإن الغضروف القحفي الوجهي في اليرقة بعد 5 أيام من الإخصاب (dpf) ، والذي اكتسب للتو القدرة على التغذية ، بسيط نسبيا ويمكن تقسيمه على نطاق واسع إلى جمجمة عصبية ظهرية وحشوية بطنية4. تدعم هذه الهياكل الدماغ وتساهم في جهاز التغذية وتؤدي إلى غضاريف داعمة للأنسجة الخيشومية. سيسمح البروتوكول الموصوف هنا بتلطيخ غضاريف الزرد باللون الأزرق الألسي ، متبوعا بإجراء مفصل لتشريح العصب والحشوية إلى هياكل منفصلة ، مما سيمكن في النهاية من التوصيف الدقيق لشكل وحجم الغضاريف المختلفة في هذه الهياكل. على سبيل المثال ، نقيس أبعاد المنطقة الأمامية من الحنك (سقف الفم) تسمى الصفيحة الغربالية ، وهي جزء من الجمجمة العصبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على صيانة أسماك الزرد والإجراءات التجريبية المستخدمة في هذه الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات المؤسسية ، عبر المرجع TIFR/IAEC/2023-1.

1. إعداد الكاشف

  1. وسائط E3:
    1. قم بإعداد مخزون 50x 1 عن طريق خلط 3.25 جم من فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (0.458 ملي مولار Na2HPO4) ، و 0.29 جم من فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم (0.042 ملي KH2PO4) ، و 11.93 جم من كلوريد الصوديوم (4.084 ملي كلوريد الصوديوم) ، و 0.48 جم من كلوريد البوتاسيوم (0.128 ملي كلوريد البوتاسيوم) في 1 لتر من الماء المقطر.
    2. قم بإعداد مخزون 50x 2 عن طريق خلط 2.43 جم من كلوريد الكالسيوم (0.33 ملي مولار CaCl2) و 4.07 جم من كبريتات المغنيسيوم (0.33 ملي مولار MgSO4) في 1 لتر من الماء المقطر.
    3. لتحضير 500 مل من وسائط 1x E3 ، إلى 480 مل من الماء المقطر ، أضف 10 مل لكل من المخزون 1 و 2 (الرقم الهيدروجيني = 7.4).
      ملاحظة: ارتد قفازات أثناء تحضير هذه المحاليل.
  2. 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) في 1x PBS (محلول ملحي مخزنة بالفوسفات):
    1. 100 مل من 1x PBS عند 68 درجة مئوية. أضف 4 جم من PFA واحتضن المحلول عند 68 درجة مئوية مع الخلط الدوري حتى يذوب PFA تماما.
      ملاحظة: ارتد قفازات وقناعا أثناء تحضير هذا الكاشف ، ويفضل أن يكون تحت غطاء الدخان لأن PFA شديد السمية.
  3. محلول MS-222 (المعروف باسم تريكايين) 0.05٪:
    1. اصنع 4٪ من مخزون التريكاين في E3 واحفظه في 4 درجات مئوية. لصنع 10 مل من مخزون التريكاين ، أضف 0.40 جم من MS-222 في 7 مل من E3. رج الأنبوب الذي يحتوي على المحلول برفق لخلطه وتكوين الحجم إلى 10 مل. لصنع 50 مل من محلول ثلاثي الأكيين 0.05٪ ، أضف 625 ميكرولتر من مخزون 4٪ إلى 49.375 مل من E3.
      ملاحظة: ارتد قفازات وقناعا أثناء تحضير هذا الكاشف.
  4. 0.4٪ محلول مخزون أزرق ألسيان في 70٪ إيثانول
    1. لتحضير 2 مل من محلول المخزون ، قم بإذابة 8 مجم من Alcian blue في 1 مل من 50٪ إيثانول. سخني المحلول على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة مع الخلط الدوري حتى يذوب. بمجرد ذوبان البقعة ، قم بتكوين المحلول بنسبة 70٪ من الإيثانول عن طريق إضافة 900 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ و 100 ميكرولتر من الماء المقطر.
      ملاحظة: يمكن تخزين محلول المخزون في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
  5. محلول وصمة عار - 0.02٪ أزرق ألسي ، 200 ملي كلوريد المغنيسيوم (MgCl2) ، و 70٪ إيثانول
    1. لتحضير 5 مل من محلول البقع الأزرق Alcian ، أضف 1 مل من 1 M MgCl2 ، و 3.5 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ ، و 250 ميكرولتر من 0.4٪ مخزون أزرق ألسي (8 مجم من أزرق ألسيان في 2 مل من 70٪ إيثانول) إلى 250 ميكرولتر من الماء واخلطهم جيدا.
      ملاحظة: قم بإعداد محلول البقع طازجا للحصول على أفضل نتائج التلوين.
  6. محلول التبييض:
    1. امزج كميات متساوية من 3٪ بيروكسيد الهيدروجين (H2O2) و 2٪ هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH). لعمل 2 مل من محلول التبييض ، اخلطي 1 مل من بيروكسيد الهيدروجين 3٪ و 1 مل من 2٪ هيدروكسيد البوتاسيوم.
      ملاحظة: قم بإعداد هذا المحلول حديثا قبل البدء في هذه الخطوة. نظرا لأن H2O2 حساس للضوء ، فقم بحمايته من التعرض للضوء قدر الإمكان. ارتد القفازات أثناء التعامل مع H2O2 و KOH.
  7. الحل الأول: 20٪ جلسرين + 0.25٪ KOH
    ملاحظة: نظرا لأن الجلسرين شديد اللزوجة ، فقم بعمل الماصة بعناية. ارتد قفازات أثناء تحضير هذه المحاليل.
    1. لتحضير 5 مل من المحلول الأول ، أضف 2 مل من 50٪ جلسرين و 625 ميكرولتر من 2٪ KOH إلى 2.375 مل من الماء واخلطهم جيدا.
  8. الحل الثاني: 50٪ جلسرين + 0.25٪ KOH
    1. لتحضير 5 مل من المحلول الثاني ، أضف 3.570 مل من 70٪ جلسرين و 625 ميكرولتر من 2٪ KOH إلى 805 ميكرولتر من الماء واخلطهم جيدا.
  9. محلول التخزين: 50٪ جلسرين + 0.1٪ KOH
    1. لتحضير 5 مل من محلول التخزين ، أضف 3.570 مل من 70٪ جلسرين و 250 ميكرولتر من 2٪ KOH إلى 1.180 مل من الماء واخلطهم جيدا.
  10. 3٪ اغاروز
    1. قم بإذابة 3 جم من الاجاروز في 100 مل من الماء المقطر. الميكروويف حتى يصبح المحلول واضحا.
  11. 0.1٪ PBST (0.1٪ Tween 20 في 1x PBS)
    1. لصنع 1 لتر من 1x PBS ، أضف 8 جم من كلوريد الصوديوم ، و 0.20 جم من KCl ، و 1.44 جم من Na2HPO4 ، و 0.24 جم من KH2PO4 في 1,000 مل من الماء المقطر. امزج المحلول واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4. لصنع 500 مل من 0.1٪ PBST ، أضف 5 مل من 10٪ Tween 20 إلى 495 مل من 1x PBS.
  12. 0.50 ميكروغرام / مل محلول DAPI
    1. اصنع مخزون 10 مجم / مل من DAPI في 1x PBS. لصنع 10 مل من محلول DAPI 0.50 ميكروغرام / مل ، أضف 0.50 ميكرولتر من المخزون إلى 10 مل من 1x PBS ورجها بقوة لضمان ذوبان DAPI تماما.
      ملاحظة: ارتد قفازات أثناء تحضير هذه المحاليل. حماية DAPI من الضوء لأنها حساسة للضوء. يمكن تخزين مخزون DAPI عند 4 درجات مئوية لأكثر من عام.

2. جمع الأجنة

  1. قم بإعداد أزواج من أسماك الزرد من الذكور والإناث في أحواض التكاثر في المساء السابق لطلب الأجنة ، مع فصل الأسماك من الذكور والإناث بحواجز.
  2. قم بإزالة الحواجز في صباح اليوم التالي واجمع الأجنة في غضون 15-20 دقيقة بعد إزالة الحواجز.
    ملاحظة: توقيت إزالة الحاجز مفيد في تنظيم أجنة ويرقات سمك الزرد.
  3. رفع الأجنة عند درجة حرارة 28.5 درجة مئوية حتى تصل إلى 5 درجة فهرنهايت.
    ملاحظة: تأكد من استبدال وسائط E3 بمجموعة جديدة من E3 المسخنة مسبقا عند 28.5 درجة مئوية مرة كل يومين.

3. تلطيخ الأزرق ألسي

ملاحظة: ارتد قفازات أثناء إجراء هذه التجربة

  1. قم بتخدير 20-25 يرقة سمك الزرد البالغة من العمر 5 أيام باستخدام 0.05٪ تريكائين في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل (MCT).
  2. بعد أن تتوقف اليرقات عن الحركة ، والتي تستغرق عادة ~ 4-5 دقائق ، قم بإزالة المخدر وقم بتثبيته في 1.5 مل من 4٪ PFA في درجة حرارة الغرفة (RT) على هزاز عند 60 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين.
  3. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المثبت باستخدام ماصة وأضف 1.5 مل من الإيثانول بنسبة 50٪ إلى العينة. احتضن لمدة 10 دقائق أثناء التأرجح عند 60 دورة في الدقيقة عند RT.
  4. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الإيثانول باستخدام ماصة وأضف 1.5 مل من محلول البقعة الزرقاء Alcian.
  5. احتضان اليرقات الثابتة في محلول البقع لمدة 18-20 ساعة على هزاز عند 60 دورة في الدقيقة عند RT.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي الحضانة لفترة زمنية أقصر أو أطول إلى تلطيخ مناطق معينة من الغضروف أو تلطيخها ، على التوالي. هنا ، يبدو أن 18-20 ساعة من التلوين تعمل بشكل أفضل لتصور العصب والحشوية بوضوح ليرقة عمرها 5 أيام.
  6. قم بإزالة محلول البقع ، وأضف 1.5 مل من الماء المقطر ، واحتضن لمدة 1-2 دقيقة على هزاز في RT.
    ملاحظة: يمكن إيقاف التلوين في هذه الخطوة لتصور حدود الخلايا في الغضاريف المقطوعة. ومع ذلك ، فإن عيب إيقاف بروتوكول التلوين في هذه الخطوة دون تنفيذ خطوات المقاصة اللاحقة هو أن حدود العصب والحشوية ستظل غير واضحة قليلا ، ويصبح إجراء التشريح بدقة أكثر صعوبة.
  7. أضف 1 مل من محلول التبييض إلى العينة واحتضنه لمدة 20 دقيقة في RT في العراء دون أي غطاء فوق الطبق أو الآبار.
    ملاحظة: لا تقم بتغطية MCTs أثناء هذه الخطوة لأن التفاعل بين بيروكسيد الهيدروجين وهيدروكسيد البوتاسيوم ينتج عنه غاز الأكسجين ، مما قد يتسبب في انفصال الغطاء إذا تم إغلاقه.
  8. قم بإزالة محلول التبييض وقم بتنفيذ خطوات تنظيف الأنسجة التالية.
    1. أضف 1.5 مل من المحلول I إلى العينة واحتفظ بجهاز هزاز عند 60 دورة في الدقيقة لمدة 40 دقيقة عند RT.
    2. قم بإزالة المحلول I وأضف 1.5 مل من المحلول II إلى العينة واحتفظ ب الروك عند 60 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة عند RT.
      ملاحظة: تساعد خطوات التنظيف على إزالة البقعة الزائدة ، وتحسين الوضوح البصري للعينات وبالتالي المساعدة في إجراء التشريح بكفاءة. تعامل مع العينات بعناية أثناء تغيير الحلول ، حيث يمكن أن يؤثر أي ضرر على التحليل المستقبلي لمورفولوجيتها.
  9. قم بإزالة المحلول II وأضف 1.5-2 مل من محلول التخزين. بسبب وجود الجلسرين ، تغرق العينات الملطخة تدريجيا في القاع في غضون 10 دقائق.
    ملاحظة: يمكن تخزين العينات الملطخة عند 4 درجات مئوية لأكثر من عام.

4. تشريح الهيكل العظمي القحفي الوجهي

  1. قم بإذابة محلول الاغاروز بنسبة 3٪ في الميكروويف حتى يصبح المحلول واضحا.
    ملاحظة: لا تسخن لأن المحلول يمكن أن يخرج من القارورة. احرص على فحص دقيق للحل أثناء تنفيذ هذه الخطوة.
  2. قم بتغطية طبق بتري 90 مم ب 3٪ من الاغاروز عن طريق صب الاغاروز المنصهر حتى يتم تغطية ثلث عمق طبق بتري والسماح له بالتصلب. سيتم إجراء التشريح في هذا الطبق بتر.
    ملاحظة: يمكن تحضير أطباق بتري مع طلاء الاجاروز قبل أسبوع وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يوفر طلاء الاغاروز ركيزة أكثر نعومة يمكن إجراء التشريح عليها دون الإضرار بالملقط.
  3. نظف الملقط المراد استخدامه بنسبة 70٪ من الإيثانول وامسحه بقطعة نظيفة من مناديل المختبر القياسية.
  4. باستخدام ماصة باستور ، انقل 3-4 يرقات ملطخة مع 0.5 مل من محلول التخزين إلى طبق بتري مطلي بالاغاروز.
    ملاحظة: يضمن حل التخزين مزيدا من الوضوح البصري لإجراء التشريح مقارنة بالقيام بنفس الشيء في E3.
  5. قم بتوجيه يرقة ملطخة على جانبها الجانبي (الشكل 1 أ) واكشط صفار البيض بعناية من جسم اليرقة باستخدام الملقط
    ملاحظة: يوضح الشكل 1 ب جنينا تمت إزالة صفار البيض. من الممارسات الجيدة نقل الجنين المكشط بصفار البيض إلى طبق بتري جديد قبل الشروع في مزيد من خطوات التشريح حتى لا تتداخل كتلة الصفار اللزجة التي تطفو حولها مع التشريح.
  6. بعد إزالة الصفار ، أمسك اليرقة من منطقة ذيلها بملقط واحد واستخدم الآخر لإزالة العينين بعناية.
    ملاحظة: يوضح الشكل 1C جنينا مع إزالة صفار البيض والعينين. يجب إزالة العيون بحذر لأن قربها من الهيكل العظمي القحفي الوجهي يمكن أن يتداخل مع تشريحها.
  7. باستخدام الملقط ، اسحب بعناية واقرص الدماغ والأنسجة الظهرية الأخرى إلى الجمجمة العصبية. امسك اليرقة ثابتة بزوج واحد من الملقط واستخدم الزوج الآخر من الملقط لعمل شق في المنتصف (الشكل 1 ج ، السهم الأحمر) ، متبوعا بقرص الأنسجة (الشكل 1 د).
    ملاحظة: أثناء تنفيذ هذه الخطوة ، كن حذرا عند إزالة الأنسجة الأقرب إلى المناطق الأمامية من الجمجمة العصبية ، حيث قد ينفجر الغضروف معها.
  8. افصل رأس اليرقة عن بقية الجسم. تحتوي منطقة الرأس بعد هذه الخطوة بشكل أساسي على الجمجمة العصبية والحشوية المتصلة ببعضها البعض عند نقطتين - عند الأطراف الأمامية والخلفية - جنبا إلى جنب مع عدد قليل من الأنسجة الصغيرة غير الملطخة المرتبطة بهذه الهياكل القحفية الوجهية (الشكل 1 ه).
    ملاحظة: من الصعب إزالة الأنسجة غير الملطخة المرتبطة مباشرة بالجمجمة العصبية والجمجمة الحشوية تماما. على الرغم من وجود بعض الأنسجة المتبقية ، إلا أن وجودها لن يؤثر على أي تحليل للشكل أو الحجم النهائي لأنها غير ملطخة.
  9. اقطع بعناية الرابطتين بين الجمجمة العصبية والحشوية لفصلهما (الشكل 1F ، خطوط متقطعة حمراء). انظر الشكل 2 للحصول على صور للجمجمة العصبية والحشوية في كل من الأجنة السليمة والمشرحة.
  10. على شريحة زجاجية نظيفة ، أضف قطرة أو قطرتين من الجلسرين بنسبة 100٪. بمساعدة الملقط ، انقل بعناية الجمجمة العصبية أو الحشوية المقطوعة إلى هذه الشريحة. استخدم الملقط لوضع غطاء برفق على هذه المناديل ، مع ضمان عدم تكوين فقاعات ، وإغلاق انزلاق الغطاء على جميع الشرائح بطلاء الأظافر.
    ملاحظة: يمكن تخزين هذه الشرائح عند 4 درجات مئوية لأكثر من عام دون فقدان البقعة.

5. القياس الكمي لأبعاد اللوحة الغربالية

  1. التقط صورا للحنك باستخدام كاميرا متصلة بمجهر الاستريو (الشكل 2 د). في حالة عدم وجود كاميرا علمية ، قم بتوصيل هاتف ذكي قياسي بمجهر الاستريو للحصول على الصور.
  2. للقياس الكمي ، قم بتحميل صورة الحنك في FIJI22 ثم استخدم أداة الخط لقياس عرض وارتفاع اللوحة الغربالية بالميكرون (انظر الشكل 3A-C) وتحديد الأبعاد باستخدام دقة البكسل للكاميرا.
  3. ارسم مخططا حول اللوحة الغربالية وانقر على تحليل | مجموعة القياسات | منطقة للحصول على مساحة الصفيحة الغربالية (الشكل 3D ، E).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يكون الهيكل العظمي القحفي الوجهي لسمك الزرد غضروفيا بالكامل بعد 5 أيام من الإخصاب (dpf) ، وبالتالي ، يمكن تلطيخه باستخدام اللون الأزرق الألسي ، وهو صبغة أساسية قادرة على الارتباط بالجليكوزامينوجليكان الموجودة بكثرة في الغضاريف23. ينتج عن هذا تلطيخ الغضروف باللون الأزرق (الشكل 1) بحيث يمكن تمييزه عن الأنسجة الأخرى الموجودة في اليرقة باستخدام مجهر ستيريو قياسي متاح في معظم إعدادات المختبر الجامعية. بمجرد كشط الصفار (الشكل 1 ب) وإزالة العيني...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشكل التشوهات القحفية الوجهية غالبية جميع العيوب الخلقية لدى البشر ، وغالبا ما تؤدي إلى وفيات الرضع. ومع ذلك ، لا يزال يتعين توضيح المسببات الأساسية في معظم التشوهات القحفية الوجهية25. تعتبر الهياكل القحفية الوجهية معقدة في أي فقاريات معينة ، ومن منظور إعداد البكالوريوس ، فإن الشرط الأول هو الحصول على أداة تعليمية توفر للطلاب نظرة عامة على الهياكل المتميزة في منطقة القحف الوجهي. ومع ذلك ، فإن الوصول إلى جنين الثدييات في مثل هذه الأماكن أمر غير ممكن في معظم السياقا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة للإعلان.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نعرب عن تقديرنا للدكتور كاليداس كوهيل وفريقه لصيانة منشأة الأسماك. تعترف SRN بالدعم المالي من وزارة الطاقة الذرية (DAE) ، حكومة الهند (رقم تعريف المشروع. RTI4003 ، DAE OM رقم 1303/2/2019 / R \ & D-II / DAE / 2079 بتاريخ 11.02.2020) ، برنامج مجموعة شركاء جمعية ماكس بلانك (M.PG. أ MOZG0010) ومنحة أبحاث بدء التشغيل من مجلس أبحاث العلوم والهندسة (SRG / 2023 / 001716). نشكر الدكتورة شويتا فيرما من المختبر على تعليقاتها الثاقبة. نشكر سويثا ناجاراجان وأوبال تشاترجي على المساعدة في عمل أشكال للمخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الاغاروزلونزا للعلوم البيولوجية50004لطلاء أطباق بتري
الأزرق Alcian 8G  سيجما ألدريتشأ 3157لتلطيخ الغضاريف
كلوريد الكالسيوم ثنائي الهيدراتسيجما ألدريتش12022لصنع المخازن المؤقتة
كاميراأوليمبوسموانئ دبي 28للحصول على الصور
دابيروش لعلوم الحياة10236276001لوضع العلامات على النوى
ايثانولهانيويل32221مذيب للبقعة الزرقاء alcian
فيجيالإصدار: ImageJ 1.54f
ملقطدومونتدومونتلإجراء التشريح
الجلسرينMP الطب الحيوي193996لعمل غسيل وتركيب عينات   ؛
بيروكسيد الهيدروجينMP الطب الحيوي194057لصنع محلول التبييض
كلوريد المغنيسيوم سداسي هيدراتالعلوم البيولوجية للساردSBRC0217لصنع المخازن المؤقتة
كبريتات المغنيسيوم سباعي الهيدراتسيجما ألدريتشإم 2773لصنع المخازن المؤقتة
MS-222 (تريكائين)سيجما ألدريتشأ 5040لتخدير اليرقات
كلوريد البوتاسيومسيجما ألدريتشص 9541لصنع المخازن المؤقتة
هيدروكسيد البوتاسيومسيجما ألدريتش484016لصنع المخازن المؤقتة
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةسيجما ألدريتشص 0662لصنع المخازن المؤقتة
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتشط3014لصنع المخازن المؤقتة
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدةسيجما ألدريتش71640لصنع المخازن المؤقتة
المجسمأوليمبوسSZX61لإجراء التشريح
توين -20هيميدياTC287المنظفات المستخدمة في نفاذية الخلايا

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Establishing neural crest identity: a gene regulatory recipe. Development. 142 (2), 242-257 (2015).
  2. Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Dev Dyn. 249 (1), 88-111 (2020).
  3. Hammond, N. L., Dixon, M. J. Revisiting the embryogenesis of lip and palate development. Oral Dis. 28 (5), 1306-1326 (2022).
  4. Mork, L., Crump, G. Zebrafish craniofacial development: a window into early patterning. Craniofacial development. Yang, C. , Academic Press. 235-269 (2015).
  5. Swartz, M. E., SheehanRooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).
  6. Selleri, L., Rijli, F. M. Shaping faces: genetic and epigenetic control of craniofacial morphogenesis. Nat Rev Genet. 24 (9), 610-626 (2023).
  7. Beaty, T. H., et al. Evidence for geneenvironment interaction in a genome wide study of nonsyndromic cleft palate. Genet Epidemiol. 35 (6), 469-478 (2011).
  8. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nat Rev Genet. 12 (3), 167-178 (2011).
  9. Reynolds, K., Kumari, P., Sepulveda Rincon, L., Gu, R., Ji, Y., Kumar, S., Zhou, C. J. Wnt signaling in orofacial clefts: crosstalk, pathogenesis and models. Dis Model Mech. 12 (2), dmm037051(2019).
  10. Raterman, S. T., Metz, J. R., Wagener, F. A. D. T. G., Von den Hoff, J. W. Zebrafish models of craniofacial malformations: interactions of environmental factors. Front Cell Dev Biol. 8, 600926(2020).
  11. Walker, M., Kimmel, C. A twocolor acidfree cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
  12. Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nat Genet. 40 (3), 290-298 (2008).
  13. Melvin, V. S., Feng, W., HernandezLagunas, L., Artinger, K. B., Williams, T. A morpholinobased screen to identify novel genes involved in craniofacial morphogenesis. Dev Dyn. 242 (7), 817-831 (2013).
  14. Spoorendonk, K. M., Hammond, C. L., Huitema, L. F. A., Vanoevelen, J., SchulteMerker, S. Zebrafish as a unique model system in bone research: the power of genetics and in vivo imaging. J Appl Ichthyol. 26, 219-224 (2010).
  15. Farmer, D. T., et al. A comprehensive series of Irx cluster mutants reveals diverse roles in facial cartilage development. Development. 148 (16), dev197244(2021).
  16. Rochard, L., Monica, S. D., Ling, I. T. C., Kong, Y., Roberson, S., Harland, R., Halpern, M., Liao, E. C. Roles of Wnt pathway genes wls, wnt9a, wnt5b, frzb and gpc4 in regulating convergentextension during palate morphogenesis. Development. 143 (14), 2541-2547 (2016).
  17. Liu, S., Narumi, R., Ikeda, N., Morita, O., Tasaki, J. Chemicalinduced craniofacial anomalies caused by disruption of neural crest cell development in a zebrafish model. Dev Dyn. 249 (7), 794-815 (2020).
  18. Zinck, N., FranzOdendaal, T. A. Accurate wholemount bone and cartilage staining requires acidfree conditions. Anat Rec. 304 (5), 958-960 (2021).
  19. Stenzel, A., et al. Distinct and redundant roles for zebrafish her genes during mineralization and craniofacial patterning. Front Endocrinol. 13, 1033843(2022).
  20. Tomasiewicz, H. G., Hesselbach, R., Carvan, M. J., Goldberg, B., Berg, C. A., Petering, D. H. Zebrafish as a model system for environmental health studies in the grad classroom. Zebrafish. 11 (4), 384-395 (2014).
  21. Cubbage, C. C., Mabee, P. M. Development of the cranium and paired fins in the zebrafish Danio rerio (Ostariophysi, Cyprinidae). J Morphol. 229 (2), 121-160 (1996).
  22. Schindelin, J. Fiji: an opensource platform for biologicalimage analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Tuckett, F., MorrissKay, G. Alcian Blue staining of glycosaminoglycans in embryonic material: effect of different fixatives. Histochem J. 20 (3), 174-182 (1988).
  24. Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140 (1), 76-81 (2013).
  25. Goodwin, A. F., et al. From bench to bedside and back: improving diagnosis and treatment of craniofacial malformations utilizing animal models. Craniofacial development. Yang, C. , Academic Press. 459-492 (2015).
  26. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196(2012).
  27. Ding, J., et al. Using alizarin Red staining to detect chemically induced bone loss in zebrafish larvae. J Vis Exp. (178), e63251(2021).
  28. Klingenberg, C. P., Barluenga, M., Meyer, A. Shape analysis of symmetric structures: quantifying variation among individuals and asymmetry. Evolution. 56 (10), 1909-1920 (2002).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة