يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إنشاء وصيانة عضيات سرطان البروستاتا المشتقة من المريض: بروتوكول تجريبي مفصل

1.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68912

⸱

نوفمبر 14, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Jiangnan University Medical Center (Wuxi No. 2 People's Hospital), 2Wuxi School of Medicine, Jiangnan University

في هذه المقالة

ملخص

لا يزال عدم تجانس سرطان البروستاتا ومقاومة العلاج تحديا. نصف بروتوكولا لتوليد العضيات المشتقة من المريض (PDOs) التي تحافظ على خصائص الورم الأبوي الرئيسية. يدعم هذا النموذج الموحد فحص الأدوية وتطورات الطب الدقيق.

الملخص

سرطان البروستاتا (PCa) هو ورم خبيث غير متجانس للغاية وسبب رئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان لدى الرجال ، مع تحديات سريرية كبيرة في معالجة مقاومة العلاج وتطور المرض. النماذج قبل السريرية الحالية ، مثل خطوط الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) والطعم الغريب المشتق من المريض (PDXs) ، لها قيود في تلخيص تعقيد PCa بأمانة ، بما في ذلك عدم تجانس الورم ، والإشارات المعتمدة على مستقبلات الأندروجين (AR) ، والتفاعلات البيئية الدقيقة. لمعالجة هذه الفجوة ، تقدم هذه الدراسة بروتوكولا قويا وقابلا للتكرار لإنشاء العضيات المشتقة من المريض (PDOs) التي تحافظ على السمات الوراثية والفينوتية والنسيجية للأورام الأبوية. تتيح هذه الطريقة زراعة العضيات من كل من PCa الموضعية والمتقدمة ، مما يوفر نموذجا ذا صلة بيولوجيا لدراسة آليات المرض ، والاستجابة للأدوية ، واكتشاف المؤشرات الحيوية. توضح النتائج قدرة البروتوكول على توليد العضيات من مجموعة متنوعة من العينات السريرية ، مع تطبيقات في فحص الأدوية عالية الإنتاجية والطب الدقيق. من خلال تقديم سير عمل موحد يعالج التحديات التقنية الرئيسية ، تسلط هذه الدراسة الضوء على أهمية PDOs كأدوات متعددة الاستخدامات للنهوض بأبحاث سرطان البروستاتا وتطوير استراتيجيات علاجية أكثر فعالية.

المقدمة

لا يزال سرطان البروستاتا (PCa) أحد أكثر الأورام الخبيثة انتشارا لدى الرجال في جميع أنحاء العالم ، ويأتي في المرتبة الثانية بعد سرطان الرئة في الوفيات المرتبطة بالسرطان. وفقا للدراسات الوبائية الحديثة ، فإن معدل الإصابة العالمي بسرطان البروستاتا في ارتفاع مطرد ، ومن المتوقع أن يرتفع عدد الحالات الجديدة لسرطان البروستاتا سنويا من 1.4 مليون في عام 2020 إلى 2.9 مليون بحلول عام 2040. على الرغم من التقدم في الكشف المبكر وتطوير علاجات جديدة ، بما في ذلك العلاج بالحرمان من الأندروجين (ADT) والعوامل المستهدفة ، لا يزال سرطان البروستاتا يمثل تحديا سريريا كبيرا نظرا لطبيعته غير المتجانسة والتطور الحتمي لمقاومة العلاج ، لا سيما في المراحلالمتقدمة 2. يمثل سرطان البروستاتا المقاوم للإخصاء (CRPC) ، الذي يظهر بعد فشل ADT ، شكلا مميتا من المرض ، يتميز بنتائج ضعف البقاء على قيد الحياة وخيارات علاجية محدودة3. لذلك فإن فهم الآليات الجزيئية التي تقود تطور المرض ومقاومته أمر بالغ الأهمية لتحديد الأهداف العلاجية الجديدة وتحسين نتائج المرضى.

يعد تطوير نماذج ما قبل السريرية التي تحاكي بدقة تعقيد سرطان البروستاتا البشري أمرا بالغ الأهمية لتطوير البحث في هذا المجال. على الرغم من استخدامها على نطاق واسع ، تفشل مزارع الخلايا ثنائية الأبعاد التقليدية في تلخيص عدم التجانس الخلوي ، وبنية الورم ، والبيئة المكروية التي لوحظت في الجسم الحي4. نتيجة لذلك ، فإن الفائدة الانتقالية لهذه النماذج محدودة ، لا سيما لدراسة تطور الورم ، ومقاومة الأدوية ، والتفاعلات الديناميكية بين الخلايا السرطانية والبيئة المكروية للورم5. في المقابل ، ظهرت الطعوم الغريبة المشتقة من المريض (PDXs) والثقافات العضوية كأدوات أكثر تعقيدا تسد الفجوة بين خطوط الخلايا التقليدية والأورام السريرية4،5،6.

أحدثت أنظمة الزراعة العضوية ثورة في نمذجة السرطان. هذه الهياكل ثلاثية الأبعاد (3D) مشتقة من أنسجة المريض ويمكن أن تحتفظ بالخصائص النسيجية والجينومية والنمطية للورم الأصلي7،8،9،10. الأهم من ذلك ، أن عضيات سرطان البروستاتا تحافظ على السمات الحاسمة لعدم تجانس المرض ، بما في ذلك إشارات AR ، ومقاومة العلاج ، وعدم الاستقرار الجيني ، مما يجعلها أدوات مثالية للبحث الانتقالي11. بالمقارنة مع نماذج PDX ، تعتبر المواد العضية أكثر فعالية من حيث التكلفة وقابلية للتطوير وقابلية للتلاعب الجيني ، مما يسهل فحص الأدوية عالية الإنتاجية ، واكتشاف المؤشرات الحيوية ، والدراسات الوظيفية. أظهرت المنصات العضية بالفعل نتائج واعدة في الأورام الخبيثة الأخرى ، بما في ذلك سرطانات القولون والمستقيم والثدي والبنكرياس ، مما يؤكد قدرتها على علم الأورام الشخصي4،12.

ومع ذلك ، فإن إنشاء عضيات سرطان البروستاتا (PCOs) والحفاظ عليها يمثل تحديات تقنية فريدة. تعتمد ظهارة البروستاتا بطبيعتها على إشارات الأندروجين ودعم المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، مما يستلزم ظروف ثقافة متخصصة. علاوة على ذلك ، يظهر سرطان البروستاتا مجموعة واسعة من السلوكيات السريرية ، من الأورام الموضعية الحساسة للهرمونات إلى CRPC شديد العدوانية والمقاومة للعلاج ، مما يزيد من تعقيد تطوير الأنظمة العضوية القابلة للتكرار11،12. يجب أن تعالج البروتوكولات الناجحة لتوليد متلازمة تكيس المبايض هذه التعقيدات البيولوجية من خلال تحسين الخطوات الرئيسية ، بما في ذلك معالجة الأنسجة ، والهضم الأنزيمي ، وتضمين ECM ، والمكملات بعوامل النمو الحرجة والهرمونات والجزيئات الصغيرة. هذه البروتوكولات ضرورية لضمان إخلاص العضيات لأورام الوالدين وتسهيل تطبيقها في التحليلات النهائية.

في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكولا مفصلا وقابلا للتكرار لإنشاء وصيانة أجهزة تنمية نفط عمان على المدى الطويل. يمتد سير عملنا إلى العملية برمتها ، من اكتساب الأنسجة ومعالجة الخزعة والعينات الجراحية إلى المرور العضوي والحفظ بالتبريد والإنعاش (الشكل 1). تم تحسين هذا البروتوكول للحفاظ على السلامة المظهرية والجينومية لأنسجة سرطان البروستاتا ، مما يتيح أنظمة زراعة ثلاثية الأبعاد قوية مناسبة لمجموعة واسعة من التطبيقات ، بما في ذلك التنميط الجيني ، واختبار الاستجابة للأدوية ، والمقايسات الوظيفية. والجدير بالذكر أن طريقتنا تعالج العقبات التقنية الشائعة ، مثل انخفاض معدلات النجاح في الزراعة العضوية ، والنمو دون المستوى الأمثل ، والصعوبات في المرور اللاحق ، وتوفر إرشادات موحدة ، وبالتالي تسهيل التكاثر عبر المختبرات.

إن تطوير نماذج عضوية موثوقة لسرطان البروستاتا له أهمية هائلة لكل من البحث الأساسي والانتقالي13. توفر هذه الأنظمة منصة قوية لفك رموز آليات المرض ، وتحديد الأهداف العلاجية الجديدة ، وتطوير مناهج الطب الدقيق المصممة خصيصا للمرضى الفرديين. من خلال معالجة الفجوات التقنية الحالية وتوفير بروتوكول شامل ، يهدف عملنا إلى تسريع اعتماد التكنولوجيا العضوية في أبحاث سرطان البروستاتا ودعم الجهود العالمية لمكافحة هذا المرض الصعب14.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت مراجعة هذه الدراسة والموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات الطب في مستشفى ووشى رقم 2 للشعب (رقم الموافقة: Y-38 (2023)). قدم جميع المشاركين استمارات موافقة مكتوبة مستنيرة. خضعت بيانات المريض لإلغاء تحديد الهوية لضمان حماية الخصوصية وفقا للمعايير الأخلاقية.

1. جمع العينات

  1. اكتساب الأنسجة
    1. التحضير قبل أخذ العينات
      1. معايير الشمول: تأكد من أن جميع المشاركين لديهم تشخيص مؤكد لسرطان البروستاتا ، على النحو الذي يحدده الفحص المرضي أو التصويري. اشتقاق عينات الورم من الاستئصال الجراحي أو الخزعة أو العينات السريرية الأخرى. تأكد من أن جميع المشاركين يبلغون من العمر 18 عاما أو أكثر وليس لديهم أي أورام خبيثة أخرى ، لاستبعاد التداخل المحتمل من السرطانات الأخرى في دراسة سرطان البروستاتا. من جميع المشاركين، جمع الموافقة الخطية المستنيرة للمشاركة في الدراسة والسماح باستخدام عيناتهم في البحث العلمي.
      2. معايير الاستبعاد: استبعاد المرضى الذين لا تحتوي عيناتهم على ما يكفي من أنسجة الورم للزراعة أو التحليل. استبعاد المرضى الذين يسحبون موافقتهم أو غير قادرين على تقديم العينات المطلوبة أثناء الدراسة.
    2. عينات خزعة إبرة البروستاتا الأساسية: استخدم إبرة خاصة للحصول على عينات من أنسجة البروستاتا. ضع الأنسجة على الفور في محلول الحفظ (DMEM / F-12 المتقدم (adDMEM / F-12) محلول مثبط متوسط + صخور (تخفيف 1: 2000)) ونقله إلى المختبر على الجليد ، مما يضمن التسليم في غضون 24 ساعة.
      ملاحظة: استهداف أنسجة سرطان البروستاتا بدقة وإجراء أخذ عينات متعددة المواقع عبر مناطق تشريحية مختلفة. قم بإجراء 1-2 ثقب لكل موقع ، ينتج عن كل منها عينات أساسية ≥ 1 سم.
    3. عينات استئصال البروستاتا الجذري: بعد الجمع ، ضع العينات بسرعة في محلول الحفظ (adDMEM / F-12 متوسط + محلول مثبط الصخور (تخفيف 1: 2000)) ونقلها على الجليد ، مما يضمن تسليمها إلى المختبر في غضون 24 ساعة.
      ملاحظة: يمكن الحصول على المزيد من شظايا الأنسجة من خلال استئصال البروستاتا الجذري15.
      اجمع عينات ≥ قطر 1 جرام (≈ 5 مم) ، مما يقلل من التلوث بالأنسجة الطبيعية. التنسيق قبل الجراحة مع الأطباء لتحديد: 1) لب الورم; 2) الأنسجة المحيطة بالورم. 3) التحكم العادي. إعطاء الأولوية للشظايا الصلبة مع تغير اللون الرمادي والأصفر. في حالة عدم الغيب ، قم بتنفيذ أخذ عينات عشوائية منهجية. ارجع إلى الجدول 1 للحصول على معلومات جمع العينات.
  2. تجهيز العينات
    1. وضع العلامات والتصنيف: قم بتسمية عينات الأنسجة التي تم جمعها بوضوح (بما في ذلك اسم المريض ورقم الاستشفاء واسم الأنسجة وموقع الأنسجة ونوع الأنسجة).
    2. الحفظ بالتبريد: معالجة عينات الأنسجة على الفور (≤ 12 ساعة بعد الجمع). ضع العينات في محلول حفظ مبرد مسبقا (4 درجات مئوية) (adDMEM / F-12 متوسط + محلول مثبط للصخور (تخفيف 1: 2000)) وقم بتخزينها عند 4 درجات مئوية. تابع المزيد من الخطوات التجريبية في غضون 4-6 ساعات للحصول على أفضل النتائج.
  3. النقل والتخزين
    1. نقل سلسلة التبريد: نقل عينات الأنسجة إلى المختبر في ظروف درجات الحرارة المنخفضة.
    2. تسجيل العينة: عند الوصول إلى المختبر ، قم بالتحقق من معلومات العينة وتسجيلها بالتفصيل ، بما في ذلك المعلومات الشخصية الأساسية للمريض ونوع الأنسجة والاسم وموقع أخذ العينات.
  4. استلام المختبر والتفتيش :
    1. فحص العينة: افتح العينات في خزانة السلامة الحيوية وافحص بحثا عن أي خسارة أو تلوث أو تشوهات مرئية.
    2. تشريح العينة: استخرج العينة وضعها في طبق مزرعة. استخدم مقص الأنسجة أو مشرط لتقسيم العينة إلى قطع صغيرة (حوالي 1-3 مم مكعب) لاستخدامها في التجارب اللاحقة.

2. الإجراءات التجريبية

  1. تحضير معلقات خلايا الأنسجة الأولية
    1. الحفظ: ضع كتل الأنسجة المجمعة في أنابيب طرد مركزي مخروطية معقمة سعة 50 مل ، مما يضمن تصنيف الأنسجة حسب النوع. قم بتسمية كل أنبوب بشكل مناسب. أضف محلول الحفظ (adDMEM / F-12 متوسط + محلول مثبط الصخور (تخفيف 1: 2000)) إلى كل أنبوب حتى يتم غمر الأنسجة تماما. قم بتخزين العينات في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى مزيد من المعالجة.
      ملاحظة: يجب أن تشمل أنواع الأنسجة كلا من الأنسجة الورمية والأنسجة غير السرطانية. يجب أن تتضمن ملصقات العينة عادة رقم السجل الطبي.
    2. فصل الأنسجة: باستخدام ملاقط معقمة ، انقل عينات أنسجة سرطان البروستاتا إلى طبق ثقافة متوسط الحجم. اغسل الأنسجة 2-3 مرات ب 2 مل من محلول ملحي بالفوسفات (D-PBS) من دولبيكو لإزالة الدم والحطام. قم بإزالة الأنسجة الدهنية والعضلات والمكونات الأخرى غير الظهارية بعناية باستخدام ملاقط ذات رؤوس دقيقة ، مع الاحتفاظ بالمناطق الظهارية فقط. بعد ذلك ، قم بفرم الأنسجة التي تم تنظيفها إلى أجزاء صغيرة بحجم 1-3 مم مكعب تقريبا باستخدام المقص.
      ملاحظة: تعد الإزالة الكاملة للمكونات غير الظهارية أمرا بالغ الأهمية للتطبيقات النهائية ، حيث أن تلويث الأنسجة اللحمية أو الدهنية قد يقلل من كفاءة وخصوصية عزل الخلايا. الحفاظ على ظروف معقمة طوال العملية لتقليل مخاطر التلوث الميكروبي.
    3. هضم الأنسجة: نقل قطع الأنسجة المحضرة إلى أنابيب معالجة الأنسجة. أضف محلول هضم أنسجة الورم (الجدول 2) إلى كل أنبوب. قم بتنشيط جهاز الهضم (جهاز تحضير التعليق أحادي الخلية) باستخدام برنامج تفكك الأنسجة متوسطة الصلابة للتفكك الأنزيميكي الميكانيكي.
      ملاحظة: بروتوكول الهضم هو كما يلي: الدوران الأمامي عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 3 ثوان ، والدوران العكسي عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 3 ثوان ، والدوران الأمامي عند 300 دورة في الدقيقة لمدة 4 ثوان ، والدوران العكسي عند 300 دورة في الدقيقة لمدة 4 ثوان ، والدوران الأمامي عند 600 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوان ، والدوران العكسي عند 600 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوان ، والدوران الأمامي عند 400 دورة في الدقيقة لمدة 3 ثوان ، الدوران العكسي عند 400 دورة في الدقيقة لمدة 3 ثوان. يشكل هذا التسلسل دورة واحدة ، والتي يجب تكرارها ثلاث مرات. بعد الانتهاء من الدورتين الأوليين ، استمر في الدوران البطيء عند 20 دورة في الدقيقة لمدة 25 دقيقة تقريبا. يمكن تعديل المدة بناء على الظروف التجريبية. هضم الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة إلى 1 ساعة.
    4. إنهاء الهضم: أضف حجما مساويا أو مزدوجا من وسيط adDMEM/F-12 المكمل بFBS إلى معلق الخلية لإنهاء النشاط الأنزمي.
      ملاحظة: إذا بقيت بقايا غير مهضومة ، اجمع المادة الطافية ، وأضف إنزيمات هضمية جديدة إلى البقايا ، واستمر في الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة إضافية. راقب العملية بشكل دوري ، واجمع بين معلقات الخلايا من خطوتي الهضم.
    5. الترشيح: قم بترطيب مصفاة خلية 100 ميكرومتر مسبقا مع 1 مل من وسط adDMEM / F-12 ، ثم قم بتصفية تعليق الخلية. اشطف أنبوب معالجة الأنسجة ومصفاة الخلية مرتين باستخدام 5 مل من وسط adDMEM / F-12 المكمل بمحلول مثبط الصخور (تخفيف 1: 2000). اجمع المرشح في أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 50 مل. مرر التعليق عبر مصفاة 70 ميكرومتر واجمع جميع معلقات الخلايا في أنبوب جديد سعة 50 مل.
      ملاحظة: يمكن تعديل عدد خطوات الترشيح وحجم مسام المصافي وفقا لخصائص العينة.
    6. تحلل خلايا الدم الحمراء: جهاز طرد مركزي معلق الخلية الذي تم جمعه عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية. تخلص بعناية من المادة الطافية ، ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في 2 مل من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء. احتضان المعلق على الجليد لمدة 2-3 دقائق.
      ملاحظة: يمكن تعديل وقت الحضانة لتحلل خلايا الدم الحمراء بناء على كفاءة التحلل. قد تؤدي الحضانة المطولة إلى زيادة موت الخلايا. يوصى بمراقبة العينة تحت المجهر لضمان التحلل الكامل لخلايا الدم الحمراء دون تلف مفرط لأنواع الخلايا الأخرى.
    7. إنهاء التحلل: أضف 6 مل من وسط adDMEM / F-12 مكملا بمحلول مثبط للصخور (تخفيف 1: 2000) إلى تعليق الخلية. انقلي الخليط إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية. تخلص من الطواقي. اغسل حبيبات الخلية 1-2 مرات بنفس الوسط المكمل وانقل معلق الخلية النهائي إلى أنبوب Eppendorf سعة 1.5 مل.
    8. تقييم الجدوى: امزج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع حجم متساو من محلول التريبان الأزرق وراقب صلاحية الخلية تحت المجهر.
      ملاحظة: إذا لوحظت كميات كبيرة من الخلايا الميتة أو الحطام ، فقم بإجراء طرد مركزي منخفض السرعة عند 50 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية لإزالتها قبل متابعة العد.
    9. عد الخلايا: أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط adDMEM / F-12 ، وقم بتخفيف المعلق حسب الحاجة (عادة في تخفيف 1:20) ، وضع 6 ميكرولتر من المعلق المخفف على مقياس الخلايا لحساب الخلايا تحت المجهر.
    10. مجموعة الحبيبات الخلية: جهاز طرد مركزي عند 200 × جم ، 25 درجة مئوية ، لمدة 5 دقائق. اجمع حبيبات الخلية النهائية في أنبوب Eppendorf سعة 1.5 مل.

3. إنشاء عضوي من معلقات الخلايا الأولية

  1. البذر: حدد الحجم المطلوب من هلام المصفوفة بناء على عدد الخلايا. باستخدام أطراف الماصة المبردة مسبقا (المخزنة عند -20 درجة مئوية) ، انقل بعناية الحجم المناسب من هلام المصفوفة إلى حبيبات الخلية. اخلطي خليط الخلايا الهلامية على الثلج برفق ، وتجنب تكوين فقاعات الهواء لضمان البذر الموحد والسلامة المثلى لجل المصفوفة.
    ملاحظة: قم بإذابة جل المصفوفة عند 4 درجات مئوية طوال الليل قبل الاستخدام. تأكد من أن جميع أدوات المناولة، بما في ذلك أطراف الماصات والأنابيب، مبردة مسبقا لمنع التبلور المبكر.
  2. الطلاء: قم بتوزيع خليط هلام المصفوفة الخلوية على لوح زراعة منخفض الالتصاق مكون من 24 بئرا ، مع تطبيق ما يقرب من 30 ميكرولتر لكل قطرة. تأكد من أن كل قطرة تحتوي على أكثر من 10,000 خلية لدعم تكوين هيكل ثلاثي الأبعاد (3D) فعال.
    ملاحظة: تجنب التخفيف المفرط لجل المصفوفة. للحفاظ على السلامة الهيكلية ودعم تكوين الثقافة ثلاثية الأبعاد ، يجب أن يشكل هلام المصفوفة أكثر من 70٪ من الحجم الكلي للخليط. العضيات المشتقة من عينات الخزعة البشرية واستئصال البروستاتا متكافئة بطبيعتها ، وتختلف بشكل أساسي في إنتاج الخلايا القابلة للحياة ، وتم تطبيق كثافات بذر متطابقة في هذا البروتوكول.
  3. الحضانة: ضع لوحة الاستزراع في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 5 دقائق ، مما يسمح لهلام المصفوفة بالتصلب الأولي. اقلب اللوحة واتركها لمدة 20 دقيقة للحفاظ على هلام المصفوفة في شكل ثلاثي الأبعاد. أضف 800-1000 ميكرولتر من وسط الاستزراع (الجدول 3) إلى كل بئر. استبدل وسط الاستزراع كل 2-3 أيام.
    ملاحظة: تأكد من عدم إزعاج هلام المصفوفة أثناء خطوة الانعكاس للحفاظ على الهيكل ثلاثي الأبعاد.

4. تمرير عضوي

  1. جمع وتحضير العضيات: باستخدام طرف ماصة مبرد مسبقا ، قم بتعطيل هلام المصفوفة ميكانيكيا لتفتيت العناقيد العضوية. اشطف كل بئر 1-2 مرات باستخدام adDMEM / F-12 متوسط + محلول مثبط الصخور (تخفيف 1: 2000). انقل العناقيد المجزأة جنبا إلى جنب مع وسط الاستزراع إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية وتخلص من المادة الطافية.
    ملاحظة: عندما يصل قطر العضيات إلى 100 ميكرومتر (عادة في يوم الاستزراع 14). إذا كان الحجم المتوسط المفرط يتداخل مع الاضطراب الميكانيكي ، فقم بشفط جزء من الوسط قبل تفكيك المجموعات. بالنسبة لهلام المصفوفة المتبقي الذي يلتصق بسطح اللوحة، اكشطه برفق باستخدام طرف الماصة واشطفه 2-3 مرات باستخدام محلول adDMEM/F-12 المتوسط + مثبط الصخور (تخفيف 1:2000). يجب تجميع جميع الشطف مع المجموعة الأولية للحصول على أقصى إنتاجية.
  2. التفكك العضوي: أعد تعليق الحبيبات الناتجة في 2 مل من محلول الإنزيم المؤتلف الذي يشبه التربسين المسخن مسبقا. قم بإشعال الماصة لأعلى ولأسفل لبدء التفكك ، ثم احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة. راقب التفكك تحت المجهر كل 5 دقائق حتى تهيمن مجموعات الخلايا الصغيرة (حوالي 5-6 خلايا لكل مجموعة) على الحقل ، ثم انتقل إلى الخطوة التالية.
    ملاحظة: يعد إنهاء الهضم في الوقت المناسب أمرا بالغ الأهمية لتجنب الإفراط في التفكك والحفاظ على بقاء الخلايا. تضمن الملاحظة المجهرية المتكررة توقف الهضم في الوقت الأمثل لتكوين العناقود.
  3. إنهاء عملية الهضم: قم بإنهاء عملية الهضم بإضافة حجم متساو أو مزدوج من وسط adDMEM / F-12 المكمل بمصل أبقار الجنين (FBS) لإخماد النشاط الأنزمي. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية وتخلص من المادة الطافية.
  4. إزالة هلام المصفوفة: أعد تعليق الحبيبات في 2 مل من محلول استعادة الخلايا واحتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 20-40 دقيقة لإذابة هلام المصفوفة المتبقي. قم بجهاز الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية ، وكرر الغسيل مرتين باستخدام وسيط adDMEM / F-12 للتخلص من مكونات المصفوفة المتبقية. انقل الحبيبات النهائية إلى أنبوب Eppendorf المعقم سعة 1.5 مل لمزيد من المعالجة.
    ملاحظة: تعتبر الحضانة ذات درجة الحرارة المنخفضة أمرا بالغ الأهمية لإزالة بلمرة هلام المصفوفة الفعالة مع الحفاظ على سلامة الخلية. قلل من الوقت خارج البيئة الباردة لمنع إعادة التبلور المبكر.
  5. البذر والاستزراع: استمر في إعادة زرع المجموعات العضوية المنفصلة باتباع الإجراءات الموضحة في الخطوات 3.1-3.3. ضمان كثافة الخلايا المناسبة ونسبة هلام المصفوفة لإصلاح الهيكل ثلاثي الأبعاد الأمثل.
    ملاحظة: تتوفر بروتوكولات مفصلة للحفظ بالتبريد العضوي والذوبان وإعادة التضمين والمعالجة النسيجية عند الطلب.

5. الحفظ بالتبريد العضوي

  1. مجموعة العضويات: قم بإزالة لوحة الاستزراع من الحاضنة وفصل مجاميع الهيدروجيل العضوي ميكانيكيا باستخدام طرف ماصة مبردة مسبقا. انقل الركام المنفصل مع وسط الاستزراع إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل. اشطف الآبار 2-3 مرات باستخدام وسيط adDMEM / F-12 ، مع الجمع بين الغسالات والتعليق الأساسي. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية ، وتخلص من المادة الطافية.
    ملاحظة: لضمان أقصى إنتاجية ، قم بتعطيل الركام العضوي برفق دون التسبب في تلف مفرط. يجب دمج جميع الغسالات مع المجموعة الأولية لتقليل فقدان العضيات أثناء عملية التجميع.
  2. التفكك الأنزمي: أضف 2-4 مل من محلول الإنزيم المؤتلف الذي يشبه التربسين المسخن مسبقا إلى الحبيبات العضوية في أنبوب مخروطي واخلط المعلق برفق. احتضان التعليق عند 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة. راقب عملية التفكك مجهريا كل 5 دقائق.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، قم بعمل ماصة برفق للمساعدة في تقسيم المجموعات الكبيرة إلى مجاميع أصغر (حوالي 5-6 خلايا لكل مجموعة). مطلوب أوقات هضم أقصر للحفظ بالتبريد لمنع الإفراط في التفكك وفقدان صلاحية الخلية. تضمن الملاحظة المتكررة إنهاء عملية الهضم في المرحلة المناسبة للحفاظ على سلامة الأعضيات.
  3. إنهاء الهضم: أضف حجما مساويا أو أكبر من وسط adDMEM/F-12 المكمل بFBS لإيقاف النشاط الأنزيمي. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
    ملاحظة:إذا كانت الحبيبات خالية من هلام المصفوفة المتبقي, انتقل إلى الخطوة 5.5 للحفظ بالتبريد. إذا استمر تلوث هلام المصفوفة ، فتابع الخطوة 5.4.
  4. إزالة جل المصفوفة (اختياري): اتبع الإجراء الموضح في الخطوة 4.4 لإزالة جل المصفوفة. أعد تعليق الحبيبات في 2 مل من محلول استرداد الخلايا واحتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 20-40 دقيقة. قم بجهاز الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية ، وكرر عملية الغسيل 1-2 مرات لضمان إزالة جل المصفوفة بالكامل.
    ملاحظة: تعد إزالة هلام المصفوفة المتبقي أمرا بالغ الأهمية لضمان حفظ الخلايا المنفصلة فقط بالتبريد. قد تؤثر إزالة الجل غير المكتملة على قابلية وسلامة العضيات الهيكلية عند الذوبان.
  5. الحفظ بالتبريد: أعد تعليق حبيبات الخلية في 1.5 مل من وسط التجميد العضوي عن طريق سحب العينة اللطيف لضمان تعليق متساو. انقل المعلق إلى مبرد واحفظه في درجة حرارة -80 درجة مئوية لحفظه على المدى القصير. بعد 24 ساعة ، انقل القوارير إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل.
    ملاحظة: تأكد من خلط وسط الحفظ بالتبريد جيدا مع الخلايا لمنع التجمد غير المتكافئ ، مما قد يؤدي إلى تلف الخلايا. يجب نقل القوارير إلى النيتروجين السائل على الفور بعد فترة التخزين قصيرة الأجل لضمان الحفاظ على المدى الطويل ومنع تدهور الخلايا.

6. الانتعاش العضوي

  1. إذابة العضيات المحفوظة بالتبريد: قم بإزالة المبردات التي تحتوي على عضويات من النيتروجين السائل أو التخزين -80 درجة مئوية. اغمر القارورة على الفور في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وحركه برفق حتى تذوب المحتويات تماما. بمجرد اكتمال الذوبان، انقل المعلق العضوي إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل باستخدام طرف ماصة مبرد مسبقا (-20 درجة مئوية).
    ملاحظة: الذوبان السريع والمنتظم أمر بالغ الأهمية لتقليل تلف الخلايا الناجم عن البرد. استخدم أطراف الماصة المبردة مسبقا لمنع الاحترار المبكر وإصلاح هلام المصفوفة أثناء النقل.
  2. إزالة واقي من التبريد: أضف بعناية 1-2 مل من وسط adDMEM / F-12 على طول جدار الأنبوب المخروطي لتخفيف واقي التبريد تدريجيا. تخلط بلطف عن طريق الانعكاس. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
    ملاحظة: تجنب سحب الماصات القوي أو الدوامة في هذه المرحلة، لأن التحولات التناضحية المفاجئة والإجهاد الميكانيكي يمكن أن يضر بصلاحية الأشكال العضوية للخطر. يقلل نهج التخفيف البطيء من الصدمة الخلوية.
  3. الغسيل والتعليق: أضف 1 مل من وسط adDMEM / F-12 الطازج إلى الحبيبات. أعد تعليق الخلايا برفق باستخدام طرف ماصة مبرد مسبقا (-20 درجة مئوية) لمنع التصاق جل المصفوفة المبكر. انقل المعلق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
    ملاحظة: يعد الحفاظ على درجة حرارة منخفضة أثناء الغسيل أمرا ضروريا لمنع إعادة التجميع الناجم عن الحرارة لمكونات هلام المصفوفة ، مما قد يعيق الإصلاح العضوي اللاحق.
  4. الجمع: جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية. كرر خطوة الغسيل 2-3 مرات لضمان الإزالة الكاملة لبقايا واقيات التبريد والملوثات.
  5. البذر والثقافة: أعد تعليق حبيبات الخلية النهائية في وسط الزراعة العضوية المحضر وفقا للاحتياجات التجريبية. تابع البذر باتباع البروتوكول الموضح في الخطوات 3.1-3.3 ، مما يضمن نسبة هلام المصفوفة المناسبة وكثافة الخلايا لدعم إعادة إنشاء الهيكل ثلاثي الأبعاد.
    ملاحظة: تعتمد صلاحية الخلايا بعد الذوبان وتعافيها بشكل كبير على التعامل اللطيف ، والتخفيف المناسب للواقيات بالتبريد ، وإعادة التأسيس الفوري لبيئة هلام مصفوفة ثلاثية الأبعاد داعمة.

7. معالجة ما قبل التحليل لتوصيف العضوية

  1. حصاد الأعضيات: قم بفصل الركام ميكانيكيا عندما تصل أقطار العضوية إلى 70-100 ميكرومتر ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على وسط للثقافة اللاحقة. اشطف الآبار 2-3 مرات باستخدام وسط adDMEM / F-12 وامزج الغسالات مع التعليق العضوي. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية ، وتخلص من المادة الطافية.
    ملاحظة: بالنسبة للتجمعات الصغيرة (على سبيل المثال ، 1-2 آبار) ، استخدم أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل لضمان التعامل الفعال وتقليل فقد العينة. كن حذرا لتجنب تعطيل الهياكل العضوية أثناء التفكك.
  2. إعادة التعليق: أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط adDMEM / F-12 ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية وتخلص من المادة الطافية.
    ملاحظة: تأكد من إعادة تعليق الحبيبات تماما قبل الطرد المركزي لمنع التكتل وتسهيل المعالجة الموحدة في الخطوات اللاحقة.
  3. الغسيل والتثبيت: أضف 1 مل من D-PBS إلى الحبيبات واخلطها برفق عن طريق سحب العينة أو الانعكاس. قم بالطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية ، وتخلص من المادة الطافية ، وكرر خطوة الغسيل 1-2 مرات. ثبت الحبيبات ب 1-2 مل من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) واحتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: قم بتنفيذ خطوات الغسيل بعناية لضمان الإزالة الشاملة للوسط المتبقي والملوثات الأخرى. يعد التثبيت في البارافورمالديهايد أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على مورفولوجيا العضوية للتحليل اللاحق.
  4. الغسيل بعد التثبيت: قم بالطرد المركزي للعينات عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية. اغسل العينات الثابتة 2-3 مرات باستخدام D-PBS ، واخلطها برفق عن طريق النقر بالإصبع أو الانعكاس اللطيف لضمان التوزيع السليم لمخزن الغسيل ومنع فقدان العضيات.
    ملاحظة: يعد الغسيل السليم بعد التثبيت أمرا ضروريا لإزالة البارافورمالديهايد الزائد وتقليل تلطيخ الخلفية في التطبيقات النهائية ، مثل الكيمياء المناعية.
  5. إعادة تثبيت الإيثانول: أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من مزيج الإيثانول بنسبة 70٪ برفق عن طريق النقر بالإصبع ، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
    ملاحظة: يساعد تثبيت الإيثانول في هذه المرحلة في الحفاظ على سلامة العضوية وإعداد العينات للتضمين أو المعالجة الإضافية. تأكد من تعليق موحد في الإيثانول لتجنب التثبيت غير المتساوي.
  6. إزالة هلام المصفوفة (اختياري): إذا بقي هلام المصفوفة المتبقي في الحبيبات ، فاتبع البروتوكول الموضح في الخطوة 4.4 لإزالته. تتضمن هذه الخطوة تعليق الحبيبات في محلول استعادة الخلية والاحتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 20-40 دقيقة ، متبوعا بالطرد المركزي والغسلات المتعددة لضمان إزالة الجل بالكامل.
    ملاحظة: تعتبر إزالة هلام المصفوفة مهمة بشكل خاص للتحليل النسيجي أو التصوير النهائي ، حيث قد يتداخل الجل المتبقي مع تقسيم الأنسجة وتحليلها.
  7. تضمين الاغاروز: تحضير حوالي 6 مل من 2٪ agarose عن طريق الذوبان عند 96 درجة مئوية أثناء تثبيت الإيثانول العضوي. امزج 100 ميكرولتر من الاغاروز المذاب مع الحبيبات العضوية ، مما يضمن الحد الأدنى من تكوين فقاعة الهواء. انقلي الخليط إلى قالب ، وتصلبه عند 4 درجات مئوية ، ثم اخلطيه لتضمين البارافين.
    ملاحظة: أطراف ماصة دافئة مسبقا (ذات نهايات مشذبة) لمنع الانسداد. يسهل تضمين الاغاروز الحفاظ على الهيكل العضوي مع السماح بسهولة التعامل والتقسيم. تجنب تكوين الفقاعات أثناء الخلط لضمان التضمين المتساوي وتقسيم الأنسجة الأمثل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

سمات النمو المورفولوجية والديناميكية للعضيات المشتقة من سرطان البروستاتا المشتقة من المريض
تم إنشاء عضيات سرطان البروستاتا المشتقة من المريض بنجاح من أنسجة الورم الطازجة التي تم جمعها أثناء الإجراءات السريرية. لوحظ عادة التكوين العضوي الأولي في غضون 5-7 أيام من الاستزراع (الشكل 2). تحت الفحص المجهري للمجال الساطع ، أظهرت العضيات سمات مورفولوجية مميزة ، وشكلت كروية مدمجة ومحددة جيدا أو هياكل شبيهة بالغدد. أظهرت العضيات المشتقة من عينات الس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يمثل إنشاء PDOs ل PCa تقدما حاسما في النمذجة قبل السريرية ، حيث يوفر مزايا كبيرة مقارنة بمزارع الخلايا ثنائية الأبعاد التقليدية و PDXs16. تتيح الطريقة المقدمة في هذه الدراسة توليد العضيات التي تلخص بأمانة الخصائص النسيجية والوراثية والنمطية للورم الأصلي. من خلال الحفاظ على عدم تجانس الورم ، بما في ذلك إشارات AR والبنية الخلوية ، توفر العضيات منصة أكثر صلة بيولوجيا لدراسة تطور سرطان البروستاتا ، ومقاومة العلاج ، والاستجابات العلاجية الشخصية17

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يقر المؤلفون بامتنان بدعم المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 82172831) ومشروع البحث الرئيسي للجنة الصحة وتنظيم الأسرة بمقاطعة جيانغسو (المنحة رقم X20240121).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
A 83-01توكريس2939
adMEM/F12جيبكو12634010
خزانة السلامة البيولوجيةشركة جينان شينبيشي للتكنولوجيا الحيوية المحدودة
حل استعادة الخلاياكورنينغ354253
جهاز الطرد المركزيشركة شنتشن رويوودي لايف تكنولوجي المحدودةM1416R
أنابيب الطرد المركزيشركة نانجينغ للأبحاث الحيوية المحدودة
كولتركس باثكلير بي إمR& D3533-010-02
طب الدماغ الحيوي منخفض عامل النمو من Cultrex، النوع الثانيR& D3533-005-02
حاويات الزراعة (ألواح منخفضة الالتصاق ب24 بئئر)الترمونونك-174930-ZX
DHTISOREAG521-18-6
التوازن الإلكترونيشركة نانجينغ للأبحاث الحيوية المحدودة
مصل الأبقار الجنينيجيبكو10099141
جلوتامين بلس-200 ملي ميلارR& DB90210
هيبسR& D1254/10
حاضنة زراعة الخلايا المرطبة (37&°؛ C، 5٪ ثاني أكسيد الكربون)شركة شنغهاي هيتيان العلمية للأدوات المحدودةHY-160SY
صندوق الثلجشركة نانجينغ للأبحاث الحيوية المحدودة
أطباق الثقافة متوسطة الحجمالأبسينABS7005
ملحق N21-MAX Media (50X)R& DAR008
N-أستيل سيستينسيغماA9165-5G
نيكوتيناميدR& D3533-010-02
نورموسينإنفيفوجينant-nr-2
جهاز التوصيل بمساعدة المصبشركة نانجينغ لأدوات النقاط الساخنة العلمية المحدودة
الماصاتشركة نانجينغ لأدوات النقاط الساخنة العلمية المحدودة
بريموسينإنفيفوجينANT-PM-2
rhEGFR& D236-EG-01M
rhFGFR& D233-FB-025
rhFGF-10R& D345-FG-025
rhNogginR& D6057-NG-100
rhR-سبوندين 1R& D4656-RS-100
SB 202190توكريس1264
جهاز تحضير التعليق أحادي الخليةالدفع الخلفيDSC-400
مقص الأنسجة/مشرطشركة نانجينغ للأبحاث الحيوية المحدودة
تريبل إكسبريسجيبكو126A04013
مجموعة تفكك الأورام، بشريميلتيني بيوتيك130-095-929
الملقطشركة نانجينغ للأبحاث الحيوية المحدودة
حمام الماءشركة تشانغتشو تشونغجي لتصنيع الأدوات التجريبية المحدودةHH-600
Y-27632 ديهيدروكلوريدR& D1254/10

المراجع

  1. James, N. D., et al. The lancet commission on prostate cancer: planning for the surge in cases. Lancet. 403 (10437), 1683-1722 (2024).
  2. Knutson, T. P., et al. AR alterations inform circulating tumor DNA detection in metastatic castration resistant prostate cancer patients. Nat Commun. 15 (1), 10648(2024).
  3. Haffner, M. C., et al. Framework for the pathology workup of metastatic castration-resistant prostate cancer biopsies. Clin Cancer Res. 31 (3), 466-478 (2025).
  4. Fang, Z., Li, P., Du, F., Shang, L., Li, L. The role of organoids in cancer research. Exp Hematol Oncol. 12 (1), 69(2023).
  5. Sachs, N., Clevers, H. Organoid cultures for the analysis of cancer phenotypes. Curr Opin Genet Dev. 24, 68-73 (2014).
  6. Zhou, L., Zhang, C., Zhang, Y., Shi, C. Application of organoid models in prostate cancer research. Front Oncol. 11, 736431(2021).
  7. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  8. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
  9. Puca, L., et al. Patient-derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nat Commun. 9 (1), 2404(2018).
  10. Pamarthy, S., Sabaawy, H. E. Patient-derived organoids in prostate cancer: improving therapeutic efficacy in precision medicine. Mol Cancer. 20 (1), 125(2021).
  11. Karkampouna, S., et al. Patient-derived xenografts and organoids model therapy response in prostate cancer. Nat Commun. 12 (1), 1117(2021).
  12. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nat Protoc. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  13. Neal, J. T., Kuo, C. J. Organoids as models for neoplastic transformation. Annu Rev Pathol. 11, 199-220 (2016).
  14. Waseem, M., Wang, B. D. Organoids: an emerging precision medicine model for prostate cancer research. Int J Mol Sci. 25 (2), (2024).
  15. Moschovas, M. C., Patel, V. Neurovascular bundle preservation in robotic-assisted radical prostatectomy: how I do it after 15,000 cases. Int Braz J Urol. 48 (2), 212-219 (2022).
  16. Li, Y., Qin, M., Liu, N., Zhang, C. Organoid development and applications in gynecological cancers: the new stage of tumor treatment. J Nanobiotechnology. 23 (1), 20(2025).
  17. Xiang, D., et al. Building consensus on the application of organoid-based drug sensitivity testing in cancer precision medicine and drug development. Theranostics. 14 (8), 3300-3316 (2024).
  18. Van Hemelryk, A., et al. Patient-derived xenografts and organoids recapitulate castration-resistant prostate cancer with sustained androgen receptor signaling. Cells. 11 (22), 3632(2022).
  19. Zhao, H., et al. Patient-derived bladder cancer organoids as a valuable tool for understanding tumor biology and developing personalized treatment. Adv Sci (Weinh). 12 (13), e2414558(2025).
  20. Polak, R., Zhang, E. T., Kuo, C. J. Cancer organoids 2.0: modelling the complexity of the tumour immune microenvironment. Nat Rev Cancer. 24 (8), 523-539 (2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

العضوانيات المشتقة من المرضىزراعة العضوانياتهضم أنسجة الورمالتضمين في هلام المصفوفةصيانة العضوانياتفحص العقاقيرالطب الدقيقتعبير مستقبلات الأندروجيناكتشاف المؤشرات الحيوية
إنشاء وصيانة عضيات سرطان البروستاتا المشتقة من المريض: بروتوكول تجريبي مفصل
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.