مقالة منهجية

الكشف عن سلوك التجمع العرضة للتجمع في خلايا سرطان الثدي الطفرة P53 V157F باستخدام فلورة ثيوفلافين T متعددة النقاط

DOI:

10.3791/68921

⸱

ديسمبر 30, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, I-Shou University, 2School of Chinese Medicine for Post Baccalaureate, I-Shou University, 3Department of Medical Science and Biotechnology, I-Shou University, 4Department of Biomedical Engineering, I-Shou University, 5Department of Pathology, E-Da Hospital, 6Department of Physical Therapy, I-Shou University, 7Department of Occupational Therapy, I-Shou University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر خلايا سرطان الثدي Hs578T التي تحمل طفرة P53 V157F تألق أعلى بشكل ملحوظ من ثيوفلافين T مقارنة بخلايا MCF7، مما يشير إلى تحسن تجمع البروتينات. تحسن قياسات التألق متعدد النقاط دقة الكشف والموثوقية في تحديد التجمعات الغنية بصفائح β، مما يؤكد أهمية طفرات p53 المعرضة للتجمع في أبحاث السرطان وتطوير استراتيجيات علاجية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلعب مثبط الورم p53، المشفر بواسطة جين TP53 ، دورا مركزيا في الحفاظ على الاستقرار الجيني. توجد طفرات TP53 ، وخاصة متغيرات النقاط الساخنة، في حوالي 50٪ من سرطانات الإنسان وقد تؤدي إلى فقدان الوظائف المثبطة للأورام أو اكتساب خصائص اكتساب الوظيفة، بما في ذلك التجمع في هياكل شبيهة بالبريونات.

في هذه الدراسة، قمنا بتقييم ميل التجمع لطفرة P53 V157F في خلايا سرطان الثدي Hs578T مقارنة بخلايا MCF7 التي تعبر عن النوع البري p53. تم تقييم تجميع البروتين باستخدام صبغة ثيوفلافين تي (ThT) تلاها قياس كمية الفلورة في اختبارات الصفائح ذات 96 بئر. تم صبغ الخلايا بمحلول ThT/Hoechst، وغسلها وتحليلها باستخدام قارئ ميكروبليت تحت معايير إثارة/انبعاث محددة. كشف التحليل الكمي باستخدام قراءات الفلورة ذات النقطة الواحدة والأربع نقاط أن خلايا Hs578T أظهرت زيادة بنسبة 3.20 إلى 4.26 ضعف في شدة فلورة ThT مقارنة ب MCF7، مما يشير إلى مستويات مرتفعة بشكل ملحوظ من التجمعات الغنية بصفائح β أو شبيهة بالأميلويدات. أكدت القياسات متعددة النقاط الانتشار والمستمر لمجموعات البروتين على سطح البئر. تدعم هذه النتائج استخدام قراءة الألواح متعددة النقاط للكشف بدقة عن تجمع البروتينات في الاختبارات المعتمدة على الخلايا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جين TP53، الذي يشفر بروتين مثبط الورم p53، متحور في حوالي 50٪ من سرطانات الإنسان 1,2. هذه الطفرات لا تلغي فقط وظائف مثبطة الأورام ل p53، بل في بعض متغيرات النقاط الساخنة تعزز أيضا تكوين تجمعات شبيهة بالبريونات 3,4. هذه الأشكال المجمعة من p53 المتغير تكتسب غالبا خصائص اكتساب الوظيفة، بما في ذلك زيادة المقاومة للعلاجات المضادة للسرطان 5,6. لذلك، فإن تحديد أي طفرات النقاط الساخنة p53 عرضة للتجمع أمر بالغ الأهمية لتوجيه تطوير استراتيجيات علاجية فعالة في سرطانات p53-طفرة 7,8.

في دراساتنا السابقة، لاحظنا أن طفرات p53 المحددة في سرطان الخلايا الحرشفية للرأس والرقبة (HNSCC) وخطوط خلايا سرطان الثدي تظهر إشارات تلوين قوية لثيوفلافين تي (ThT)، مما يشير إلى وجود بروتينات مجمعة. ThT هو صبغة بنزوثيازول ترتبط تحديدا بهياكل الأميلويد الغنية بصفائح β، مما ينتج فلورة محسنة عند الارتباط9. على سبيل المثال، أظهر خط خلية ديترويت 562 HNSCC، الذي يحمل طفرة p53 R175H، إشارات فلورية قوية ل ThT10. وبالمثل، أظهرت خطتان أخريان من خلية HNSCC، TW01 وHONE-1، وكلاهما يحمل طفرة P53 R280T، تلوينا بارزا في ThT11. في هذه الحالات، كانت إشارات ThT متزامنة مع p53، مما يدعم وجود p53 المجمع10,11.

في خلايا سرطان الثدي، أظهر MDA-MB-231 (طفرة p53 R280K) وT47D (طفرة P53 L194F) أيضا تلوين ThT قوي مع تداخل واضح بين p53/ThT12. وعلى النقيض من ذلك، أظهرت خلايا MCF7، التي تعبر عن النوع البري p53، وخلايا MDA-MB-468 (طفرة p53 R273H) إشارات ThT ضعيفة فقط12. وبالمثل، أظهرت خلايا OECM-1 HNSCC التي تحمل طفرة p53 V173L مستويات منخفضة من صبغة ThT10.

مقارنة بطرق الكشف عن تجميع البروتينات الأخرى - مثل اختبارات مصيدة المرشح، المجهر الإلكتروني الناقل (TEM)، أو التلوين المناعي باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالتجميع - يقدم تحليل الفلورة عدة مزايا. إنه غير مدمر، سريع، وقابل للتطبيق على الخلايا الحية والثابتة دون معالجة مكثفة. بينما تلتقط اختبارات فخ المرشح التجمعات غير القابلة للذوبان بشكل فعال، إلا أنها تتطلب إزالة طبيعة قاسية وغير مناسبة للاستخدام في الخلايا الحية13. يوفر TEM تصورا مباشرا لشكل الألياف لكنه يتطلب جهدا كبيرا ومنخفض الإنتاجية14. يتيح التلوين المناعي المجمع الاكتشاف في الموقع باستخدام الأجسام المضادة المعتمدة على التشكل، رغم أن توفر الأجسام المضادة ونوعيتها قد يحدامن 15. على النقيض من ذلك، يوفر الفلورة ThT - خاصة عند دمجه مع قراءة الألواح متعددة النقاط - نهجا بسيطا وكمية وموثوقا مكانيا للكشف عن البنى الغنية بالصفائح β أو شبيهة بالأميلويدات.

الاعتبارات العملية أيضا أساسية لإمكانية التكرار. يرتبط فلورة ThT بشكل خطي بتركيز الأميلويد عبر نطاق تركيز واسع (0.2-500 ميكرومول)، وعادة ما يتم تحقيق ذروة الإشارة عند 20-50 ميكرومول، حسب البروتين، رغم أن التألق الذاتي يمكن أن يظهر عند ≥5 ميكرومول، وقد تؤثر التركيزات الأعلى على حركيات التجمع16. لذلك، يوصى عموما بتركيز ThT عامل حول 10-20 ميكرومولار لموازنة الحساسية مع تقليل التأثيرات المحتملة على عمليات التجميع16. في بروتوكولنا، يتم تخفيف مخزون 1000 مرة من ThT (12. mM) بنسبة 1:1000 لإنتاج تركيز عمل يقارب 12. ميكرومو، والذي يقع ضمن هذا النطاق الموصى به.

يرتبط ThT بشكل مفضل بهياكل الأميلويد الغنية بصفائح β، وهي سمة مميزة للألياف الأميلويدية. تنشأ هذه الخصوصية من تفاعل الصبغة مع البنية المتقاطعة β لألياف الأميلويد، حيث توفر الأسطح التي تتكون من β خيوطا مواقع ارتباط ل ThT. وبالتالي، قد لا يكتشف ThT بفعالية تجمعات أخرى غير مطوية أو غير أميلويدية لا تظهر هذه البنية الغنية بالصفائح β17. لذلك، بينما تعد ThT أداة قيمة لتحديد ألياف الأميلويد، ينصح باستخدام طرق تحقق تكميلية - مثل التزامن مع التألق المناعي p53 أو الأساليب الفيزيائية الحيوية - للتحقق من هوية وخصوصية التجمعات المكتشفة10,18.

تشير دراسات التنبؤ الهيكلي إلى أن طفرة p53 V157F تتبنى شكلا أكثر عرضة للتجمع من بروتين النوعالبري 19. في هذه الدراسة، قارنا إشارات فلورية ThT بين خلايا سرطان الثدي Hs578T، التي تحمل طفرة p53 V157F المعرضة للتجمع، وخلايا سرطان الثدي MCF7 التي تعبر عن النوع البري p53. باستخدام اختبار تلوين ThT متعدد النقاط يعتمد على قارئ اللوحات، سعينا لتقييم ميل التجمع ل p53 V157F مقارنة بالنوع البري p53.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. بذر الخلايا

  1. لتقييم بقاء الخلية، اخلط 10 ميكرولتر من تريبان بلو مع 10 ميكرولتر من الخلايا المعلقة في محلول ملحي مخزن الفوسفات (DPBS) من دولبيكو في أنبوب طرد مركزي دقيق وامزج جيدا.
  2. تحميل 10 ميكرولتر من الخليط على شريحة عداد، ثم عد الخلايا الحية باستخدام عداد خلايا آلي.
  3. استنادا إلى عدد القابلية للحياة، يتم زرع 30,000 خلية صالحة لكل بئر في صفيحة زراعة مكونة من 96 بئرا، مع بئر واحد مخصص كجهاز تحكم غير مصبوغ وتستخدم الآبار الثلاثة المتبقية للتلوين.

2. الحضانة

  1. ضع لوحة الزراعة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون وحضانة لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية.

3. تحضير مخزون تلوين جديد (1000x)

  1. ازن 0.02 جرام (20 ملغ) من مسحوق ThT واذيبه في 5.0 مل من الماء منزوع الأيون. اخلط جيدا حتى يذوب المسحوق تماما.
    ملاحظة: ينتج هذا التحضير محلول مخزون ThT بقوة 1000 ضعف تركيز نهائي 4 ملغ/مل، ما يعادل 12.5 ملليمولين (وزن جزيئي ل ThT ~318.85 جرام/مول). محلول بمقدار 4 ملغ/مل يساوي 4 جم/لتر. بقسمة 4 جم/لتر على 318.85 جم/مول يعطي 0.0125 مول/لتر، أو ~12.5 ملميول.

4. تحضير مخزن تلوين ThT باستخدام صبغة نووية مضادة

  1. جهز محلول التلوين بإضافة التالي إلى 1 مل من 1x DPBS وامزجه بلطف لضمان التجانس.
    1. أضف 1 ميكرولتر من مخزون ThT الطازج الجاهز 1000 مرة، مما يعطي تركيز ThT النهائي 12.5 ميكرومولار (1x).
    2. أضف 1 ميكرولتر من محلول مخزون Hoechst 33342 بقوة 1 ملغ/مل، مما يعطي تركيزا نهائيا ~1 ميكروغرام/مل (=1.6 ميكرومول).

5. التلوين

  1. أزل وسط الزراعة من كل بئر. أضف 100 ميكرولتر من محلول التلوين المحضر ThT/Hoechst إلى كل بئر صبغ. أضف 100 ميكرولتر من 1x DPBS إلى التحكم غير المصبوغ.

6. الحضانة

  1. ضع الطبق في مكان مظلم بدرجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة.

7. الغسيل

  1. قم بسحب أو تخلص من محلول التلوين من كل بئر بحذر، مع الحرص على عدم إزعاج طبقة الخلية الأحادية.
  2. أضف 100 ميكرولتر من 1× DPBS لكل بئر وترك نقع لطيف اختياري لمدة 30 ثانية.
  3. قم بسحب محلول الغسيل DPBS بحذر أو تخلص منه.
  4. كرر عملية الغسل بإضافة 100 ميكرولتر من المحلول الجديد 1x DPBS إلى كل بئر، مع السماح مرة أخرى بنقع لطيف اختياري لمدة 30 ثانية، ثم تخلص من محلول الغسيل DPBS.
  5. بعد الغسل الثاني، أضف 100 ميكرولتر من 1x DPBS طازج إلى كل بئر.

8. قياس الفلورة

  1. قبل قراءة إشارة الفلورة، قم بإزالة الغطاء من صفيحة 96 بئر. قياس التألق باستخدام إحدى طريقتين: قراءة نقطة واحدة أو قراءة أربع نقاط.
  2. ضع لوحة ال 96 بئر في قارئ ميكرولوح صغير، وقس التألق باستخدام الإعدادات التالية: الفلورة ThT: الإثارة عند 450 نانومتر، الانبعاث عند 490 نانومتر؛ هوشت 33342 فلورة: الإثارة عند 360 نانومتر، الانبعاث عند 460 نانومتر؛ إعدادات القراءة: الاهتزاز: 5 ثوان قبل القراءة؛ اتجاه القراءة: أعلى القراءة؛ زمن التكامل: 140 مللي ثانية؛ ارتفاع القراءة: 1.00 مم؛ النقاط لكل نقطةل: 1 (نقطة نهاية) أو 4 (مسح البئر); إعداد مسح البئر: (إعداد الكثافة: 2؛ تباعد النقاط: 2.5).

9. تحليل البيانات

  1. احسب تجميع البروتينات كما يلي:
    figure-protocol-1
  2. قم بتطبيع شدة الفلورة ThT عن طريق ضبط النسبة في خلايا MCF7 على 1 (التحكم الأساسي).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لدراسة وجود تجمعات بروتينية غنية بصفائح β في خلايا سرطان الثدي، خضعت خطوط خلايا MCF7 وHs578T لتلوين ThT تلاها قياس كمية الفلورة. كما هو موضح في الشكل 1، تم زرع الخلايا في أربعة آبار من صفيحة مكونة من 96 بئرا، مع بئر واحد تم تصنيفه كنقطة تحكم غير مصبوغة. تم تلوينها ب ThT في الآبار الثلاثة المتبقية وفقا للبروتوكول القياسي. تم قياس الفلورة باستخدام طريقتين: (1) قراءة نقطة واحدة تأخذ من مركز كل بئر، و(2) قراءة من أربع نقاط يتم الحصول عليها من خلال متوسط الإشارات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عند زرع الخلايا في صفائح بسعة 96 بئرا، غالبا ما يكون من الصعب تحقيق توزيع منتظم عبر سطح البئر، لأن هز أو نقر اللوحة بلطف لتوزيع الخلايا ليس دائما ممكنا. يمكن أن يؤدي هذا التوزيع غير المتساوي إلى تباين في شدة الإشارة عبر البئر. كشفت قراءة التألق متعدد النقاط عن تفاوت كبير بين المناطق المختلفة داخل نفس البئر، مما أبرز هذا التحيز وإمكانية حدوث نتائج مضللة عند قياس نقطة واحدة فقط. لذا فإن الاعتماد على نقطة قراءة مركزية واحدة قد يقلل من تباين الإشارة ويخفي الفروق الدقيقة في فلورة ThT بين خطوط...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون بكل امتنان المساعدة الفنية التي قدمها مختبر الطب الأساسي في كلية الطب، جامعة إي-شو. وقد تم دعم هذا العمل بمنح من مستشفى إي-دي إي [EDAHJ114001 إلى سي.-سي.سي.] والمجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا في تايوان [NSTC 112-2813-C-214-032-B إلى B.-H. C]

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
صفيحة زراعة ب 96 بئرببساطةPC396-0100
الانزلاق المضادإنفيتروجينC10228
عداد الخلايا الآلي كونتيسة الثانية فلوريداثيرمو فيشر ساينتفيك AMQAF1000
dPBSببساطةCC704-0500
أنبوب إيبندورفببساطةPC101-5000
هوشت 33342AAT Bioquest17530
سبيكترا ماكس iD3الأجهزة الجزيئية735-0391 
ثيوفلافين تيسيغما-ألدرتشT3516
تريبان بلوإنفيتروجينT10282

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Binayke, A., Mishra, S., Suman, P., Das, S., Chander, H. Awakening the "guardian of genome": Reactivation of mutant p53. Cancer Chemother Pharmacol. 83 (1), 1-15 (2019).
  2. Chen, C. C., et al. A simple and affordable method to create nonsense mutation clones of p53 for studying the premature termination codon readthrough activity of ptc124. Biomedicines. 11 (5), 1310(2023).
  3. Rangel, L. P., Costa, D. C., Vieira, T. C., Silva, J. L. The aggregation of mutant p53 produces prion-like properties in cancer. Prion. 8 (1), 75-84 (2014).
  4. Kim, S., An, S. S. Role of p53 isoforms and aggregations in cancer. Medicine (Baltimore). 95 (26), e3993(2016).
  5. Zhou, G., et al. Gain-of-function mutant p53 promotes cell growth and cancer cell metabolism via inhibition of ampk activation. Mol Cell. 54 (6), 960-974 (2014).
  6. Zhang, C., et al. Gain-of-function mutant p53 in cancer progression and therapy. J Mol Cell Biol. 12 (9), 674-687 (2020).
  7. De Oliveira, G. aP., et al. The status of p53 oligomeric and aggregation states in cancer. Biomolecules. 10 (4), 548(2020).
  8. Wang, H., Guo, M., Wei, H., Chen, Y. Targeting p53 pathways: Mechanisms, structures, and advances in therapy. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 92(2023).
  9. Sulatskaya, A. I., Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K. Interaction of thioflavin t with amyloid fibrils: Stoichiometry and affinity of dye binding, absorption spectra of bound dye. J Phys Chem B. 115 (39), 11519-11524 (2011).
  10. Cai, B. H., et al. Nampt inhibitor and p73 activator represses p53 r175h mutated HNSCC cell proliferation in a synergistic manner. Biomolecules. 12 (3), 438(2022).
  11. Cai, B. H., et al. Chlorophyllides repress gain-of-function p53 mutated hnscc cell proliferation via activation of p73 and repression of p53 aggregation in vitro and in vivo. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871 (3), 167662(2025).
  12. Wu, K. -Y., et al. Synergistic anticancer activity of hsp70 inhibitor and doxorubicin in gain-of-function mutated p53 breast cancer cells. Biomedicines. 13 (5), 1034(2025).
  13. Nasir, I., Linse, S., Cabaleiro-Lago, C. Fluorescent filter-trap assay for amyloid fibril formation kinetics in complex solutions. ACS Chem Neurosci. 6 (8), 1436-1444 (2015).
  14. Goldsbury, C., et al. Amyloid structure and assembly: Insights from scanning transmission electron microscopy. J Struct Biol. 173 (1), 1-13 (2011).
  15. Kayed, R., et al. Fibril specific, conformation dependent antibodies recognize a generic epitope common to amyloid fibrils and fibrillar oligomers that is absent in prefibrillar oligomers. Mol Neurodegener. 2, 18(2007).
  16. Xue, C., Lin, T. Y., Chang, D., Guo, Z. Thioflavin t as an amyloid dye: Fibril quantification, optimal concentration and effect on aggregation. R Soc Open Sci. 4 (1), 160696(2017).
  17. Biancalana, M., Koide, S. Molecular mechanism of thioflavin-t binding to amyloid fibrils. Biochim Biophys Acta. 1804 (7), 1405-1412 (2010).
  18. Yang-Hartwich, Y., et al. P53 protein aggregation promotes platinum resistance in ovarian cancer. Oncogene. 34 (27), 3605-3616 (2015).
  19. Lei, J., et al. Insights into allosteric mechanisms of the lung-enriched p53 mutants v157f and r158l. Int J Mol Sci. 23 (17), 10100(2022).
  20. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
  21. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochem Biophys Rep. 26, 100987(2021).
  22. Yoshimura, Y., et al. Distinguishing crystal-like amyloid fibrils and glass-like amorphous aggregates from their kinetics of formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (36), 14446-14451 (2012).
  23. Yang, D. S., et al. Mesoscopic protein-rich clusters host the nucleation of mutant p53 amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (10), e2015618118(2021).
  24. Hackl, E. V., Darkwah, J., Smith, G., Ermolina, I. Effect of acidic and basic ph on thioflavin t absorbance and fluorescence. Eur Biophys J. 44 (4), 249-261 (2015).
  25. Bom, A. P., et al. The p53 core domain is a molten globule at low ph: Functional implications of a partially unfolded structure. J Biol Chem. 285 (4), 2857-2866 (2010).
  26. Ano Bom, A. P., et al. Mutant p53 aggregates into prion-like amyloid oligomers and fibrils: Implications for cancer. J Biol Chem. 287 (33), 28152-28162 (2012).
  27. Muller, P., Ceskova, P., Vojtesek, B. Hsp90 is essential for restoring cellular functions of temperature-sensitive p53 mutant protein but not for stabilization and activation of wild-type p53: Implications for cancer therapy. J Biol Chem. 280 (8), 6682-6691 (2005).
  28. Arsic, N., et al. Δ133p53β isoform pro-invasive activity is regulated through an aggregation-dependent mechanism in cancer cells. Nat Commun. 12 (1), 5463(2021).
  29. Zhao, L., Punga, T., Sanyal, S. Delta133p53alpha and delta160p53alpha isoforms of the tumor suppressor protein p53 exert dominant-negative effect primarily by co-aggregation. Elife. 14, RP106469(2025).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

P53 T TP53 Hs578T

مقالات ذات صلة