يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

الدور الوقائي للكلوثو في إصابة خلايا القلب الناتجة عن نقص الأكسجين وإعادة الأكسجين من خلال تنظيم سلسلة إشارات NF-κb

304 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68946

⸱

ديسمبر 5, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Jinan Lixia District People's Hospital, 2Department of Nuclear Medicine, Jinan Central Hospital, 3Department of Infectious Diseases, Jinan Central Hospital, 4Department of Coronary Heart Diseases, Jinan Central Hospital

في هذه المقالة

ملخص

يقوم هذا البروتوكول بتقييم الدور الوقائي لفرط تعبير كلوثو في خلايا عضلة القلب H9C2 تحت إعادة الأكسجين بسبب نقص الأكسجين باستخدام اختبارات جزيئية ووظيفية.

الملخص

هدفت هذه الدراسة إلى دراسة الدور الوقائي للكلوثو في خلايا عضلة القلب التي تتعرض لإصابة نقص الأكسجة/إعادة الأكسجة (H/R). تم إنشاء نموذج H/R في المختبر باستخدام سرطانات القلب الجرذية H9C2، والتي تم نقلها بواسطة ناقلات فيروسات لينتيفيروسية تعبر بشكل مفرط عن الكلوثو. تم تقسيم الخلايا إلى ست مجموعات تجريبية: ضابطة، H/R، مجموعة تحكم سلبية (NC)، فرط التعبير في كلوثو، PDTC (مثبط NF-κB)، ومجموعة مركبة عولجت بالكلوثو والبوليسكاريد (LPS). تم تحديد مستويات تعبير كلوثو بواسطة PCR الكمي في الوقت الحقيقي وإزالة الصبغ الغربي. تم قياس قدرة الخلايا على قيد الحياة باستخدام اختبار MTT، بينما تم تقييم موت المبرمج باستخدام قياس تدفق الخلايا الخلوي. تم تحليل تعبير البروتينات المشاركة في مسار إشارة NF-κB بواسطة البلوتينغ الغربي، وتم تقييم التعبير الخلوي للسيتوكينات المؤيدة للالتهابات من خلال التلوين المناعي الفلوري. أدى فرط تعبير كلوثو إلى رفع مستويات الكلوثو بشكل ملحوظ في خلايا H9C2 وأدى إلى تحسين قدرة الخلايا، وتقليل موت المبرمج، وانخفاض التعبير الخلوي عن السيتوكينات المؤيدة للالتهابات مقارنة بمجموعة H/R. كشف تحليل ويسترن بلوت أن فرط التعبير عن كلوثو، بالإضافة إلى علاج PDTC، كبح تنشيط مسار NF-κB، كما يتضح من انخفاض نسبة p-P65/P65 وزيادة مستويات p-IκBα/IκBα. تم عكس هذه التأثيرات جزئيا عند العلاج المشترك مع LPS. تشير هذه النتائج إلى أن الكلوثو يمنح حماية قلبية ضد الإصابة الناتجة عن H/R من خلال تعديل إشارات NF-κB، وتقليل الالتهاب، وتعزيز بقاء الخلايا. يوفر هذا البروتوكول طريقة قابلة للتكرار لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء إصابة نقص التروية القلبية-إعادة التروية والإمكانات العلاجية للكلوتو في التهاب القلب.

المقدمة

احتشاء عضلة القلب الحاد (AMI) يحدث بشكل رئيسي بسبب نقص التروية يليه إعادة التروية، مما دفع إلى أبحاث موسعة حول آليات نقص الأكسجة/إعادة الأكسجة في عضلة القلب (H/R) 1,2,3. جانب محوري من إصابة عضلة القلب هو الاستماتة الخلوية، التي تساهم بشكل كبير في التقدم المرضي لمرض AMI 4,5.

أشارت الدراسات الحديثة إلى تورط العامل النووي كابا B (NF-κB) في مسار الإشارات في إصابة عضلة القلب من خلال تعديله للاستجابات الالتهابية للمحفزات مثل الدهون البوليسكاريد (LPS)6,7,8. يحدث تنشيط NF-κB عبر آليتين مميزتين: المساران القانونيان وغير القانونيتين9. في المسار القانوني، يعتمد التنشيط على التحلل الناتج عن الفسفرة لمثبط كابا B ألفا (IκBα)10. ومع ذلك، تم الإبلاغ أيضا أن فسفرة وحدة NF-κB p65 يمكن أن تؤدي إلى موت المبرمج، وربما بشكل مستقل عن تحلل IκBα11. كلوثو، وهو بروتين عابر للغشاء أحادي المرور، ينظم أيض الفوسفات والكالسيوم ويثبط إشارات الإنسولين 12,13,14. تشير الأدلة الناشئة إلى أن كلوثو يمارس تأثيرات مثبطة على تنشيط NF-κB في أنسجة متنوعة، بما في ذلك الكلى والحصين وخلايا الشيخوخة، مما يخفف من الالتهاب وتلف الأنسجة 15,16,17. على الرغم من هذه التطورات، لا يزال دور كلوثو في الالتهاب الدماغي الداخلي وتفاعله المحتمل مع مسار NF-κB أثناء إصابة الهر/ريد عضلة القلب غير مستكشف إلى حد كبير.

من منظور منهجي، يوفر نموذج H/R في المختبر باستخدام سرطانات القلب الجرذية H9C2 عدة مزايا مقارنة بالنماذج الحيوانية، بما في ذلك شد الأكسجين المسيطر عليه، وقابلية التكرار، وتقليل التباين. علاوة على ذلك، فإن فرط التعبير عن كلوثو الوسيط بالعدس الطويل يتيح تعديلا مستقرا وفعالا لتعبير الجينات، مما يسمح بتحقيق مباشر لتأثيره الوظيفي. تجعل هذه الأساليب البروتوكول عمليا وفعالا من حيث التكلفة ومتاحا للدراسات الميكانيكية، مع تجنب التحديات الأخلاقية واللوجستية للتجارب في الواقع .

من الناحية العملية، تستخدم خلايا H9C2 على نطاق واسع في أبحاث القلب والأوعية الدموية لأنها تحتفظ بالعديد من خصائص شبيهة بخلايا عضلة القلب، رغم أنها لا تحاكي بشكل كامل النمط الظاهري لخلايا عضلة القلب الناضجة. الحالة المختارة من H/R (نقص الأكسجين 5 ساعات متبوعا بإعادة الأكسجة لمدة ساعة) تقع ضمن نطاق يستخدم عادة لنمذجة إصابة نقص التروية في المختبر. وبالمثل، فإن نقل الفيروسات العدسية مع تعدد العدوى (MOI) حوالي 100 هو نهج قياسي لتحقيق تعبير مفرط فعال مع سمية خلوية قابلة للإدارة. بينما تعزز هذه الميزات قابلية تطبيق البروتوكول، يجب الاعتراف بقيود مثل إعادة ملخص البيئة الحية غير الكاملة. لذلك، تهدف الدراسة الحالية إلى استكشاف كيفية حماية كلوثو لخلايا عضلة القلب من إصابة H/R ووضع بروتوكول قابل للتكرار لتقييم تفاعله مع إشارات NF-κB.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بخط الخلايا القلبية العضلية للفئران H9C2 (ATCC، CRL-1446) وفقا للوائح السلامة الحيوية المؤسسية. لم يشارك أي من أو البشر بشكل مباشر في هذه الدراسة. يوضح الشكل 1 سير العمل الرسومي لخط أنابيب التصميم والتحليل التجريبي. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. زراعة الخلايا

تم حفظ خط الخلايا القلبية العضلية للفئران H9C2 (ATCC، CRL-1446) في النيتروجين السائل باستخدام وسط تجميد مكون من وسط النسر المعدل (DMEM، عالي الجلوكوز، 4.5 جرام/لتر) من دولبيكو مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و10٪ ثنائي ميثيل كبريتسي (DMSO). للاسترجاع، تم إذابة القوارير المجمدة بسرعة في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 2-3 دقائق ثم نقلت فورا إلى DMEM المدفئ مسبقا. تم تجهيز وسط الزراعة ب 10٪ FBS، و100 U/mL بنسلين، و100 ميكروغرام/مل ستريبتوميسين، و3.7 جرام/لتر بيكربونات الصوديوم، و1 ملليمول بيروفات الصوديوم. تم الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تم استخدام خلايا H9C2 بين المقطعين 6 و20 في جميع التجارب. لم تستخدم الممرات المبكرة (P20) لتجنب الانجراف الظاهري المرتبط بالمسار.

2. التعبير المفرط عن كلوثو في الخلايا H9C2 في اللينتيفيروس

تم تطبيق ناقل فيروسي عدسي من الجيل الثالث يعطل ذاتيا، يشفر جين كلوتو (Kl) الطويل بالكامل تحت سيطرة محفز EF1α لإثبات فرط التعبير في خلايا H9C2. احتوى التركيب على مراسل P2A-EGFP للتصور، وعناصر عنصر التنظيم بعد النسخ (WPRE) ومسار البوليبورين المركزي (cPPT) لاستقرار النسخ، وشريط مقاومة للبورومايسين مدفوع بمحفز PGK للاختيار. تم إنتاج جزيئات اللينتيفيروس في HEK293T الخلايا عن طريق التوصيل المشترك للبلازميد الناقل مع بلازميدات psPAX2 (gag/pol/rev) وpMD2.G (VSV-G) بنسبة 4:3:1 باستخدام البولي إيثيلينين (PEI؛ الحمض النووي: PEI = 1:3، مع الصفراء). تم جمع المواد الفائقة عند 48 ساعة و72 ساعة، وتصفيت بالطرد المركزي عند 3000 × جرام لمدة 10 دقائق، ثم تصفيت عبر غشاء PES بحجم 0.45 ميكرومتر، وتركيزها بواسطة الطرد المركزي الفائق عند 25000 × جرام لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية. تم إعادة تعليق الحبيبات الفيروسية في PBS يحتوي على ألبومين مصل البقري (BSA) بنسبة 1٪، وتم تحديد عيارات الوظيفة (TU/mL) عن طريق تقليل العدوى بالتخفيف في HEK293T الخلايا مع قراءة EGFP بعد 72 ساعة. تم زرع خلايا H9C2 في صفائح ذات 6 آبار بمقدار 2 × 10إلى 5 خلايا في كل بئر، مما أدى إلى تقارب 60٪ عند التقاء الطيران. تمت إضافة جزيئات اللينتيفيروس بمعدل تعدد عدوى (MOI) يبلغ 100 في 1 مل من وسط الزراعة الطازج مع إضافة بوليبرين (8 ميكروغرام/مل) لتعزيز كفاءة العدوى. تمت إزالة اللقاح بعد 12 ساعة واستبداله ب 2 مل من الوسط الكامل. بعد 72 ساعة من العدوى، تم التحقق من كفاءة النقل بواسطة فلورة EGFP تحت مجهر فلوري. لتثبيت خطوط الخلايا المستقرة، تم تطبيق بوروميسين (2 ميكروغرام/مل، معيارة مسبقا) لمدة 3-5 أيام بدءا من 48 ساعة بعد العدوى، مع تغييرات في الوسط كل 48 ساعة. تم تأكيد الإفراط في التعبير عن كلوتو بواسطة RT-qPCR وتحليل المناعة المفرطة. تم إجراء جميع إجراءات الفيروسات العدسية تحت احتواء مستوى السلامة البيولوجية 2 (BSL-2)، وتم تعطيل جميع النفايات الفيروسية باستخدام 10٪ مبيض لمدة لا تقل عن 30 دقيقة قبل التخلص منها.

3. مجموعات التجارب

تم زرع خلايا H9C2 في صفائح ذات 6 آبار (مساحة نمو 9.6 سم²) عند 3 × 10⁵ خلايا لكل بئر، مما أدى إلى تلاقي حوالي 70٪-80٪ بعد 24 ساعة، وهو الكثافة المطلوبة لمعالجة نقص الأكسجين/إعادة الأكسجة (H/R) والاختبارات اللاحقة. بعد التعلق الليلي، تم توزيع الخلايا إلى ست مجموعات تجريبية: (1) مجموعة الضابطة، التي لم تتلق علاجا إضافيا؛ (2) مجموعة H/R، التي خضعت لنقص الأكسجين/إعادة الأكسجة (H/R) في غرفة نقص الأكسجة المعيارية المغلقة، تلتها التعرض ل5 ساعات من نقص الأكسجين (1٪ O₂، 94٪ N₂، 5٪ CO₂) وساعة واحدة من إعادة التروية (5٪ CO₂)، كما وصف سابقا18؛ (3) مجموعة التحكم السلبي (NC)، حيث تم نقل الخلايا بناقل فارغ قبل 24 ساعة من علاج H/R؛ (4) مجموعة كلوثو، حيث تم نقل الخلايا بناقلات فيرولة عدسية ترمز إلى كلوتو قبل 24 ساعة من علاج H/R؛ (5) مجموعة علاج بيروليدين ثنائي الكاربامات (PDTC)، التي عولجت بمثبط مسار NF-κB بجرعة 200 ملغ/لتر PDTC لمدة 24 ساعة قبل علاج H/R19؛ (6) مجموعة كلوثو + LPS، حيث تم نقل الخلايا بواسطة ناقلات فيروسات عدسية ترمز إلى كلوثو ثم عولجت بعديلة السكريات الدهنية بجرعة 1 ملغ/لتر لمدة 24 ساعة قبل علاج H/R20.

4. qRT-PCR

تم زرع خلايا H9C2 في صفائح ذات 6 آبار بكثافة 1 × 10⁶ خلايا لكل بئر. بعد العلاج، تم عزل الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام بروتوكول استخراج الفينول-كلوروفورم. باختصار، أضيف 1 مل من المادة الكيميائية لكل بئر، تلاها استخراج الكلوروفورم، وترسيب الأيزوبروبانول، والغسل بنسبة 75٪ إيثانول. تم تجفيف حبيبة RNA بالهواء وإذابتها في ماء خال من RNase. تم تحديد تركيز ونقاء الحمض النووي الريبي الطيفيا فوتومترية. لتخليق cDNA، تم نسخ 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة نسخ عكسي تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة، بما في ذلك إزالة الحمض النووي الجيني وتحضير الريشة العشوائية بالسداسي. تم إجراء PCR الكمي في الوقت الحقيقي في نظام PCR في الوقت الحقيقي مع كيمياء SYBR Green تحت الشروط التالية: إزالة الطبيعة الأولية عند 95 °م لمدة 30 ثانية، تليها 40 دورة من 95 °م لمدة 5 ثوان و60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. تم تصميم تسلسلات البرايمر باستخدام برايمر-بلاست (NCBI) وتم تصنيعها بواسطة مورد تجاري: (1) كلوثو: F 5′-TAAGGTTCAAGTATGGAGAC-3′، R 5′-GGGCGTTCACTTATTTAT-3′؛ (2) β-أكتين (التحكم الداخلي): F 5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′، R 5′-GGGGTGTGTGAAGGGTCTCAAAA-3′. تم حساب مستويات التعبير النسبية باستخدام طريقة 2^-ΔΔCT، وتم تأكيد خصوصية التضخيم بواسطة قمة منحنى انصهار واحدة.

5. البقعة الغربية

تم استخراج البروتينات من خلايا H9C2 باستخدام محلول اختبار التكرار المناعي الإشعاعي (RIPA) (200 ميكرولتر لكل بئر من صفيحة مكونة من 6 آبار) مع إضافة مزيج مثبط للبروتياز على الثلج. تم قياس تركيزات البروتين بواسطة اختبار حمض البيسينكونينيك (BCA)، وتم تحميل كميات متساوية من البروتين (20-30 ميكروغرام) لكل مسار على جل SDS-PAGE بنسبة 10٪ للفصل الكهربائي. تم نقل البروتينات إلى أغشية ثنائي فلوريد البوليفينيليدين (PVDF) باستخدام نظام نقل رطب عند 100 فولت لمدة 90 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم حجب الأغشية بحليب خالي من الدهون بنسبة 5٪ تم تحضيره في TBST لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم حضنها طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ضد كلوتو (1:500)، فوسفو-p65 (1:500)، p65 (1:500)، فوسفو-IκBα (1:500)، IκBα (1:500)، و β-أكتين (1:1000). بعد ثلاث غسلات باستخدام TBST، تم حضن الأغشية بأجسام مضادة ثانوية متقاربة مع بيروكسيداز الفجل الحار (HRP) (1:1000) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم تصور نطاقات البروتين باستخدام نظام كشف لميض كيميائي معزز، وتم قياس شدة الإشارة باستخدام برنامج ImageJ باستخدام إعدادات عتبة متطابقة.

6. اختبار MTT

تم زرع خلايا H9C2 في صفائح بئر 96 بكثافة 2 × 10³ خلية لكل بئر في 100 ميكرولتر من وسط كامل وحضنتها طوال الليل للسماح بالالتصاق. تمت إضافة حجم 10 ميكرولتر من محلول MTT (5 ملغ/مل في PBS) إلى كل بئر وحضنه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية تحت ظروف رطبة مع 5٪ CO₂. بعد الحضانة، تمت إزالة المادة الفائقة بعناية، وأضيف 100 ميكرولتر من كبريتات ثنائي ميثيل (DMSO) لإذابة بلورات الفورمازان، تليها الحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع هز لطيف. ثم تم قياس الامتصاص عند 490 نانومتر باستخدام قارئ الميكرولوتين. كانت النتيجة البصرية المتوقعة ظهور بلورات فورمازان بنفسجية في خلايا قابلة للحياة قبل إضافة DMSO، ومحلول بنفسجي متجانس بعد الذوبان.

7. قياس خلوية التدفق

تم جمع الخلايا بعد 24 ساعة من العلاج بواسطة التربسينزيشن وجمعها بالطرد المركزي عند 1,500 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم إعادة تعليق حبيبة الخلية في 100 ميكرولتر من 1× ارتباط (10 ملليمولار HEPES، 140 ملليمولار NaCl، 2.5 ملليمولار CaCl₂، الرقم الهيدروجيني 7.4). تم خلط Annexin V-APC ويوديد البروبيديوم (PI) بنسبة 1:2 لتحضير محلول تلوين بسعة 15 ميكرولتر، والذي أضيف إلى تعليق الخلية. تم حضن الخليط لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد الحضانة، أضيف 400 ميكرولتر من نفس مخزن الربط، وتم تحليل العينات فورا باستخدام جهاز قياس تدفق خلوي. تم جمع ما مجموعه 10,000 حدث لكل عينة. تم تحليل البيانات باستخدام برنامج FlowJo. تم تجميع الخلايا أولا بناء على التشتت الأمامي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC) لاستبعاد الحطام، تلاها بوابات ربعية بين Annexin V مقابل PI لتمييز الخلايا الحية (Annexin V-/PI-)، والخلايا الاستماتية المبكرة (Annexin V+/PI-)، والخلايا الموتية المتأخرة/النخرية (Annexin V+/PI+). أشار التصبغ الإيجابي V/PI السلبي إلى الاستماتة المبكرة، بينما أشار التصبغ المزدوج الإيجابي من Annexin V/PI إلى موت المبرمج المتأخر أو النخر.

8. التألق المناعي

تم زرع خلايا H9C2 على ألواح زجاجية معقمة في صفائح ذات 6 آبار بكثافة 1 × 10⁵ خلية لكل بئر وخضعت للمعالجات. تم تثبيت الخلايا ب 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ونفرت بنسبة 0.1٪ ترايتون X-100 في PBS لمدة 10 دقائق، وتم حجبها بألبومين مصل البقري 5٪ (BSA) في PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تم حضنة كوفرسليب خلال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ضد TNF-α (1:200)، IL-1β (1:200)، وIL-6 (1:100). بعد ثلاث غسلات في PBS، تم حضن الخلايا بأجسام مضادة ثانوية موسومة ب فيكوإيريثرين (PE) (1:500) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. تم صبغ النوى بمادة DAPI لمدة 5 دقائق. تم تركيب الألواح المغلقة على شرائح زجاجية مع وسط تثبيت مضاد للتلاشي، وتم رؤية إشارات الفلورة باستخدام مجهر فلوري. تم تحليل الصور باستخدام ImageJ (الإصدار 1.54). الفلورة الحمراء تشير إلى تعبير السيتوكينات، بينما يشير الفلورة الزرقاء إلى النوى.

9. التحليل الإحصائي

تم تحليل جميع البيانات باستخدام برنامج SPSS. تعبر النتائج كمتوسط ± انحراف معياري (SD) من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل. للمقارنات الجماعية المتعددة، تم تطبيق تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) يليه اختبار توكي بعد الاختبار. تم اعتبار قيمة P < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يحسن التعبير الزائد من كلوثو بقاء الخلايا ويخفف من الإصابة الالتهابية الناتجة عن NF-κB

لتأكيد كفاءة توصيل الجينات، تم قياس تعبير كلوثو على مستويين mRNA والبروتين. أظهرت الخلايا التي تفرط في التعبير عن كلوثو زيادة قوية مقارنة بكل من نقص الأكسجة/إعادة الأكسجين (H/R) ومجموعة التحكم السلبية (p < 0.05؛ الشكل 2A,B). وظيفيا، أدى التعبير الزائد في كلوثو إ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الدراسة، تم دراسة الدور الوقائي للكلوثو في خلايا عضلة القلب المعرضة لإصابة نقص الأكسجة/إعادة الأكسجين (H/R)، وجد أن فرط التعبير عن كلوثو يحسن بشكل كبير من حيوية الخلايا، ويقلل من موت المبرمات، ويثبط التعبير الالتهابي للسيتوكينات. وقد رافقت هذه التأثيرات انخفاض في فسفرة p65 وزيادة فسفرة IκBα، مما يشير إلى أن تثبيط إشارات NF-κB يساهم في النمط الظاهري الوقائي. أدى التثبيط الدوائي ل NF-κB بواسطة PDTC إلى تأثيرات مشابهة لتأثيرات الإفراط في التعبير عن كلوثو، في حين أن التحفيز باستخدام L...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4٪ بارافورمالديهيدبايوشاربXG1050
محلول التلوين APC/PI من Annexin Vعلم اللابE-CK-A217
مجموعة تخليق cDNAتشياغن205410
حل DAPIBioFroxx1155MG010
دولبيكو' النسر المتوسط المعدل (DMEM)هايكلونSH30243.01B
مجموعة كاشف الكشف عن ECLميلونبيوMA0186-1
مزود طاقة الرحلان الكهربائي (POWER PAC 200)بيو-رادباور باك 200
مصل الأبقار الجنيني (FBS)فيفا سيلC04001-500، C04002-500
مقياس التدفق الخلوي (Gallios)بيكمان كولترجاليوس
مجهر الفلورة (BK6000)تشونغتشينغ أوبتكBK6000
مذيب فورمازانسولاربيولوجياM1020
الجسم المضاد IgG مضاد للأرانب الماصن ب HRPبيثيلA120-101P
LPS (NF-& kappa؛ منشط مسار B)سيغما-ألدرتشL2630
قارئ الميكروبليت (موديل K3)الترموK3
غرفة الحاضنة المعيارية (غرفة نقص الأكسجين)بيلوبس-روثنبرغMIC-101
حل MTTكايمان21795
PDTC (NF-& kappa؛ مثبط مسار B)سيغما-ألدرتشP8765
الجسم المضاد IgG مضاد للماعز المكون ب PE-concongatedالبيوسbs-0295G-PE
بوليبرين (هيكساديميثرين بروميد)إنفيتروجينX2351
غشاء PVDFميركISEQ00010
رابيت أنتي-رات IL-1&بيتا؛ الأجسام المضادةبيوربيتorb378927
الأجسام المضادة IL-6 من الأرنب المضادة للفئرانزين بيو384702
رابيت أنت-رات آي&كابا؛ Bα الأجسام المضادةبيوربيتorb223182
الأجسام المضادة للجرذان كلوثوبيوربيتorb333711
الأجسام المضادة للأرنب المضادة للفئران p65بيوربيتorb229138
أرنب مضاد الفئران فوسفو-آي&كابا؛ Bα الأجسام المضادةبيوربيتorb223035
أرنب مضاد للفئران فوسفو-NF-& كابا؛ الجسم المضاد B p65بيوربيتorb304662
الأرنب المضاد للفئران TNF-α الأجسام المضادةبيوربيتorb106548
الأجسام المضادة للأرنب المضادة للفئران وبيتا؛ الأكتينهوابيوET1702
نظام PCR الكمي في الوقت الحقيقي (LightCycler 96)روشلايت سايكلر96
مخزن تحليل RIPAمرداMO52447
مجموعة تحضير الجل SDS-PAGEعلم اللابE-IR-R305
مجموعة كواشف تريزولتقنيات الحياة15596-018

المراجع

  1. SupplemenDong, G., et al. Rg1 prevents myocardial hypoxia/reoxygenation injury by regulating mitochondrial dynamics imbalance via modulation of glutamate dehydrogenase and mitofusin 2. Mitochondrion. 26, 7-18 (2016).
  2. Liu, J., et al. Rhein protects the myocardiac cells against hypoxia/reoxygenation-induced injury by suppressing GSK3β activity. Phytomedicine. 51, 1-6 (2018).
  3. Yang, H., Wang, C., Zhang, L., Lv, J., Ni, H. Rutin alleviates hypoxia/reoxygenation-induced injury in myocardial cells by up-regulating SIRT1 expression. Chem Biol Interact. 297, 44-49 (2019).
  4. Liang, W., Guo, J., Li, J., Bai, C., Dong, Y. Downregulation of miR-122 attenuates hypoxia/reoxygenation (H/R)-induced myocardial cell apoptosis by upregulating GATA-4. Biochem Biophys Res Commun. 478 (3), 1416-1422 (2016).
  5. Zhang, R. -Y., Qiao, Z. -Y., Liu, H. -J., Ma, J. -W. Sonic hedgehog signaling regulates hypoxia/reoxygenation-induced H9C2 myocardial cell apoptosis. Exp Ther Med. 16 (5), 4193-4200 (2018).
  6. Chen, H., Zhang, R. -Q., Wei, X. -G., Ren, X. -M., Gao, X. -Q. Mechanism of TLR-4/NF-κB pathway in myocardial ischemia reperfusion injury of mouse. Asian Pac J Trop Med. 9 (5), 503-507 (2016).
  7. Wang, R., et al. Leonurine alleviates LPS-induced myocarditis through suppressing the NF-κB signaling pathway. Toxicology. 422, 1-13 (2019).
  8. Luo, M., et al. Ginsenoside Rg1 attenuates cardiomyocyte apoptosis and inflammation via the TLR4/NF-κB/NLRP3 pathway. J Cell Biochem. 121 (4), 2994-3004 (2020).
  9. Yoon, S., et al. NF-κB and STAT3 cooperatively induce IL6 in starved cancer cells. Oncogene. 31 (29), 3467-3481 (2012).
  10. Yu, H., Lin, L., Zhang, Z., Zhang, H., Hu, H. Targeting NF-κB pathway for the therapy of diseases: mechanism and clinical study. Signal Transduct Target Ther. 5 (1), 209(2020).
  11. Bu, Y., et al. Targeting NF-κB RelA/p65 phosphorylation overcomes RITA resistance. Cancer Lett. 383 (2), 261-271 (2016).
  12. Xu, Y., Sun, Z. Molecular basis of Klotho: from gene to function in aging. Endocr Rev. 36 (2), 174-193 (2015).
  13. Urakawa, I., et al. Klotho converts canonical FGF receptor into a specific receptor for FGF23. Nature. 444 (7120), 770-774 (2006).
  14. Degaspari, S., et al. Altered KLOTHO and NF-κB-TNF-α signaling are correlated with nephrectomy-induced cognitive impairment in rats. PLoS One. 10 (5), e0125271(2015).
  15. Teocchi, M. A., Ferreira, A. ÉD., de Oliveira, E. P. L., Tedeschi, H., D'Souza-Li, L. Hippocampal gene expression dysregulation of Klotho, nuclear factor kappa B and tumor necrosis factor in temporal lobe epilepsy patients. J Neuroinflammation. 10 (1), 53(2013).
  16. Salminen, A., Kauppinen, A., Kaarniranta, K. Emerging role of NF-κB signaling in the induction of senescence-associated secretory phenotype (SASP). Cell Signal. 24 (4), 835-845 (2012).
  17. Feng, X., Luo, Q., Wang, H., Zhang, H., Chen, F. MicroRNA-22 suppresses cell proliferation, migration and invasion in oral squamous cell carcinoma by targeting NLRP3. J Cell Physiol. 233 (9), 6705-6713 (2018).
  18. Benoist, L., et al. Stimulation of P2Y11 receptor protects human cardiomyocytes against hypoxia/reoxygenation injury and involves PKCε signaling pathway. Sci Rep. 9 (1), 11613(2019).
  19. Zhang, J. -J., et al. Pyrrolidine dithiocarbamate inhibits nuclear factor-κB pathway activation, and regulates adhesion, migration, invasion and apoptosis of endometriotic stromal cells. Mol Hum Reprod. 17 (3), 175-181 (2011).
  20. Zeng, Y., et al. Klotho inhibits the activation of NLRP3 inflammasome to alleviate lipopolysaccharide-induced inflammatory injury in A549 cells and restore mitochondrial function through SIRT1/Nrf2 signaling pathway. J Physiol Investig. 66 (5), 335-344 (2023).
  21. Jin, M., et al. Klotho ameliorates cyclosporine A-induced nephropathy via PDLIM2/NF-κB p65 signaling pathway. Biochem Biophys Res Commun. 486 (2), 451-457 (2017).
  22. Wu, C., et al. The function of miR-199a-5p/Klotho regulating TLR4/NF-κB p65/NGAL pathways in rat mesangial cells cultured with high glucose and the mechanism. Mol Cell Endocrinol. 417, 84-93 (2015).
  23. Kwon, H. -J., et al. Stepwise phosphorylation of p65 promotes NF-κB activation and NK cell responses during target cell recognition. Nat Commun. 7 (1), 11686(2016).
  24. Shi, H., Berger, E. A. Characterization of site-specific phosphorylation of NF-κB p65 in retinal cells in response to high glucose and cytokine polarization. Mediators Inflamm. 2018, 3020675(2018).
  25. Chen, G., et al. α-Klotho is a non-enzymatic molecular scaffold for FGF23 hormone signalling. Nature. 553 (7689), 461-466 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

فرط تعبير البروتين كلوثومسار إشارات NF-KappaBخلايا H9C2لطخة ويسترنقياس التدفق الخلويحيوية الخلاياالسيتوكينات المسببة للالتهاباتنقص تروية عضلة القلب
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.