مقايسة تدفق الفوسفوليبيد عالية الكثافة الخاصة بالبروتين الدهني

Edward  B. Neufeld; Masaki Sato; Alan T. Remaley

doi:10.3791/68947

مقالة منهجية

مقايسة تدفق الفوسفوليبيد عالية الكثافة الخاصة بالبروتين الدهني

DOI:

10.3791/68947

⸱

سبتمبر 30, 2025

Edward B. Neufeld^*¹ , Masaki Sato^*¹ , Alan T. Remaley¹

¹Lipoprotein Metabolism Laboratory, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف بروتوكولات قياس كمية الفوسفوليبيد الفلوري التي تمت إزالتها على وجه التحديد من جزيئات المتبرع بالدهون بواسطة البروتين الدهني عالي الكثافة (HDL) الموجود في البلازما البشرية الكاملة أو المصل. لقد أظهرنا أن هذا المقياس لوظيفة HDL يتنبأ بأمراض القلب والأوعية الدموية الواقعة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد مستويات البروتين الدهني عالي الكثافة (HDL) - الكوليسترول (HDL-C) في البلازما حاليا مقياسا رئيسيا للتقييم السريري لمخاطر أمراض القلب والأوعية الدموية (CVD). تعد إزالة دهون البلاك بوساطة HDL من الخلايا والرواسب خارج الخلية في جدار الشرايين واحدة من العديد من الوظائف المضادة لتصلب الشرايين HDL والتي قد تفسر ارتباطها العكسي بمخاطر الأمراض القلبية الوعائية. أثبتت إزالة الكوليسترول الخلوي بوساطة HDL في المختبر مؤخرا أنها مؤشر أفضل لخطر الإصابة بالأمراض القلبية الوعائية من HDL-C.

يتكون HDL من مجموعة غير متجانسة من الجسيمات تؤدي وظائف مختلفة. تحتوي جزيئات HDL المشاركة في إزالة دهون البلاك تصلب الشرايين على بروتينات شحمية قابلة للتبادل ، معظمها من البروتين الشحمي A-I ، التي تنفصل عن الجسيم ثم تزيل دهون البلاك. يتكون HDL الناشئ عن طريق إذابة وإزالة كل من الدهون الفوسفورية والكوليسترول من مجالات غشاء البلازما الخلوية المتولدة من ABCA1 بواسطة البروتينات الشحمية القابلة للتبادل المشتقة من HDL. تلعب هذه العملية دورا مهما في كل من الوقاية والانحدار من البلاك تصلب الشرايين.

هنا ، نصف بروتوكول مقايسة تدفق الفوسفوليبيد الخالي من الخلايا والخاص ب HDL (HDL-SPE) ، والذي أظهرنا سابقا أنه يمكن أن يتنبأ بمخاطر الأمراض القلبية الوعائية الواقعة. يقيس هذا الاختبار على وجه التحديد إزالة البروتين الشحمي عالي الكثافة بوساطة البروتين الشحمي العالي للفوسفوليبيد الفلوري غير القابل للتبديل من جسيم مانح للدهون. أثبتت دراساتنا السريرية للحالات والشواهد أن مقايسة HDL-SPE تعمل بشكل جيد وربما أفضل من مقايسة قدرة تدفق الكوليسترول القائم على الخلايا "المعيار الذهبي" ، وهو اختبار شاق ومعقد تقنيا يستخدم غالبا الكوليسترول المشع.

الهدف من هذا البروتوكول هو تمكين الباحثين الأساسيين والسريريين على حد سواء من تقييم وظائف HDL في تعبئة الدهون ، باستخدام مقايسة بسيطة وموسعة وخالية من الخلايا وعالية الإنتاجية. يمكن استخدام هذا الاختبار من قبل الباحثين الأساسيين لاكتساب نظرة ثاقبة حول الآليات الكامنة وراء تدفق الدهون بوساطة HDL ولفحص العوامل العلاجية الجديدة التي تعزز وظائف HDL. يمكن أن يكون HDL-SPE أيضا بمثابة مقايسة تشخيصية مختبرية سريرية لتقييم مخاطر الأمراض القلبية الوعائية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقيس مقايسة تدفق الدهون الفوسفورية عالية الكثافة (HDL-SPE) وظائف HDL وهي مخصصة للاستخدام في البحوث الطبية الحيوية ومختبرات التشخيص السريري من أجل (1) اكتساب مزيد من الأفكار حول الآليات الكامنة وراء إزالة الدهون بوساطة HDL من آفات تصلب الشرايين ، (2) العمل كمنصة جديدة لتحسين التقييم السريري لمخاطر الأمراض القلبية الوعائية و (3) تطوير علاجات جديدة لعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية.

يعد كوليسترول الحميد (HDL-C) محددا مهما لخطر الإصابة بالأمراض القلبية الوعائية¹ ، ولكن فائدته تتعرض للخطر بقدر ما ترتبط المستويات المرتفعة من HDL-C (>80 مجم / ديسيلتر) بزيادة خطر الإصابة بالأمراض القلبية الوعائية²^،³^،⁴^،⁵. قد تمثل المستويات المرتفعة من HDL-C تراكم HDL المختل وظيفيا الذي لديه قدرة منخفضة على إزالة دهون البلاك الشريانية⁶.

كان اختبار قدرة تدفق الكوليسترول الخلوي (CEC) هو أول اختبار في المختبر تم تطويره لقياس وظيفة HDL. في هذا الاختبار ، يتم تحضين البلاعم المستزرعة (الفأر أو الإنسان) ، والتي عادة ما يتم تصنيفها ب ³H- أو كوليسترول الجسدي الفلوري ، بالبلازما أو المصل المستنفد من apoB. يتم حساب النسبة المئوية لتدفق الكوليسترول بناء على كمية التألق / النشاط الإشعاعي المرتبط بالخلايا والمتوسطة⁷^،⁸^،⁹. لقد ثبت أن اختبار CEC هو مؤشر أفضل على الأمراض القلبية الوعائية الواقعة من HDL-C⁷. اختبار CEC غير قابل للتحويل إلى مقايسة تشخيصية سريرية روتينية ويرجع ذلك أساسا إلى متطلباته لزراعة الخلايا والمدة الطويلة (على سبيل المثال ، أيام). علاوة على ذلك ، فإن مقايسة CEC محدودة بسبب تنوعها المتأصل (على سبيل المثال ، أنواع مختلفة من الخلايا ، وتقنيات وضع العلامات ، واستنفاد PEG للبروتينات الدهنية β ، مما يغير تكوين HDL¹⁰).

طورت العديد من المجموعات البحثية فحوصات تدفق الكوليسترول الحميد الخالية من الخلايا لاستخدامها كأدوات لاكتساب رؤى جديدة حول وظيفة HDL وللترجمة المحتملة إلى مقايسة تشخيصية سريرية لتقييم مخاطر الأمراض القلبية الوعائية بشكل أفضل¹¹^،¹². عادة ما تتضمن فحوصات التدفق هذه خطوات متعددة وتستخدم جسيما مانحا للدهون مكتوبا بكوليسترول فلوري ، ومثل مقايسة CEC ، فإنها تتطلب إما استنفاد البروتينات الدهنية β أو ، بدلا من ذلك ، التقاط الجسيمات المحتوية على apoA-I باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل apoA-I ، لقياس تدفق الكوليسترول البروتين الدهني عالي الكثافة في البلازما. على الرغم من أن هذه المقايسات البديلة قد تم التحقق من صحتها على أنها مرتبطة بدرجات متفاوتة بمخاطر الأمراض القلبية الوعائية ، فقد ثبت حتى الآن^{أن واحدا فقط 13} ، والذي يقيم سعر الصرف apoA-I ، يتنبأ بمخاطر الأمراض القلبية الوعائية^{الواقعة 14}. ومن المثير للاهتمام ، أن حركية تبادل apoA-I داخل وخارج البلازما HDL قد ثبت أنها مرتبطة بشكل مستقل ب CEC¹⁵ وتقل بشكل ملحوظ في المرضى الذين يعانون من متلازمة الشريان التاجي الحادة¹⁶. بالإضافة إلى ذلك ، ثبت أن العديد من البروتينات الشحمية القابلة للتبديل HDL تتوسط في كل من الكوليسترول والفوسفوليبيد من الخلايا المعبرة عن ABCA1 في المختبر¹⁷.

لقد طورنا نهجا بديلا لتقييم وظائف HDL¹⁸. يتطلب الاختبار البسيط والسريع والموثوق به الموصوف هنا مكونين فقط ، وهما عينات البلازما البشرية الكاملة (أو الحيوانية) أو عينات المصل (طازجة أو مذابة بالتجميد) ، وجسيم مانح مطلي بالدهون الفلورية. يقيس الفحص قدرة apoA-I وغيرها من البروتينات الشحمية القابلة للتبادل المرتبطة ب HDL في البلازما / المصل الكامل على إزالة فوسفاتيديل إيثانولامين الفلورية غير القابلة للتبديل وذات العلامات بمجموعة الرأس (PE) من جسيم مانح مغطى بالدهون¹⁸ (الشكل 1).

تتكون الجسيمات المانحة في هذا الاختبار من بلورات هيدرات سيليكات الكالسيوم (CSH) المغلفة بالكوليسترول ، والفوسفاتيديل كولين الفوسفوليبيد (PC) ، و PE الفلورية. ترتبط البروتينات الشحمية المرتبطة ب HDL القابلة للتبادل ، ومعظمها apoA-I ، المنبعثة من جزيئات HDL بجزيئات المتبرع ثم تنفصل عنها جنبا إلى جنب مع دهون الجسيمات المانحة ، بما في ذلك PE الفلورية. وبهذه الطريقة ، يكتسب HDL ، ولكن ليس البروتينات الدهنية الأخرى الموجودة في البلازما / المصل الكامل ، على وجه التحديد PE الفلوري من الجسيمات المانحة¹⁸^،¹⁹. يتم تحضين البلازما / المصل الكامل بجزيئات مانحة هيدرات سيليكات الكالسيوم المطلية بالدهون الفلورية (LC-CSH) والمحلول الملحي عند 37 درجة مئوية ، مع الاهتزاز لمدة 1 ساعة. منذ LC-CSH حول ضعف كثافة الماء, يتم فصل الجسيمات المانحة بسهولة عن البلازما عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة.

عادة ما يتم تطبيع النسبة المئوية لتدفق البولي إيثيلين المقاس في الدراسات السريرية عن طريق القسمة على قيمة مضان البولي إيثيلين المكتسب بواسطة HDL في المادة الطافية لخليط التفاعل لعينة سريرية على القيمة التي حصل عليها HDL في البلازما البشرية المرجعية للتحكم يتم إجراء التطبيع إلى البلازما المرجعية لتصحيح الاختلافات في تحضير الكاشف. بالنسبة للتطبيقات البحثية ، يمكن تحديد النسبة المئوية لتدفق البولي إيثيلين عن طريق حساب مضان البولي إيثيلين الطاف مقسوما على التألق الكلي (مضان البولي إيثيلين الطاف + مضان LC-CSH). يتم لصق قيم قياس الفلورسنت الطافي في قالب في ملفات جداول البيانات لحساب النسبة المئوية لتدفق PE (الجدول التكميلي 1 للقياسات الثلاثية والجدول التكميلي 2 للقياسات المكررة). يتم توفير التعليمات الخاصة بإجراء هذه الحسابات في جدول البيانات كملفات تكميلية (الملف التكميلي 1 ، الملف التكميلي 2 ، الملف التكميلي 3 ، الملف التكميلي 4 ، الملف التكميلي 5 ، الملف التكميلي 6 ، الملف التكميلي 7 ، والملف التكميلي 8) ، ويتم توفير مثال على الحساب كجدول تكميلي 3.

figure-introduction-1
الشكل 1: مقايسة HDL-SPE. يتم فحص تدفق الفوسفوليبيد الخاص ب HDL في ألواح 96 بئرا. بلورات هيدرات سيليكات الكالسيوم المالحة (الرمادي) المطلية بالدهون (LC-CSH) ، بما في ذلك فوسفاتيديل إيثانولامين غير القابل للتبديل المسمى بالليسامين رودامين (LRh-PE ؛ طبقات الغشاء الأحمر) ، وما يصل إلى 30 عينة بلازما / مصل كاملة (أصفر ؛ ثلاثي) يتم تحميلها على ألواح 96 بئرا. بعد الخلط لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في خلاط حراري, يتم طرد الألواح لفترة وجيزة لبيليه جزيئات المانحة LC-CSH. يتم نقل الكميات من المواد الطافية ، التي تحتوي على HDL المسمى على وجه التحديد ب LRh-PE ، إلى صفيحة سوداء تحتوي على منظفات (لإذابة Lh-Rh-PE) ومحلول ملحي. ثم يتم قياس مضان PE باستخدام مقياس الفلور. محلول ملحي (مكافحة سلبية; NC) ، لتصحيح الخلفية ، والبلازما البشرية السليمة المجمعة (التحكم الإيجابي ؛ PC) لتطبيع اللوحة ، يتم تحميلها بدلا من عينة البلازما / المصل في المجموعة الأخيرة من الآبار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم جمع الدم وفقا لقواعد إعلان هلسنكي لعام 1975 (https://www.wma.net/what-we-do/medical-ethics/declaration-of-helsinki/) ، المنقح في عام 2013 ، ويجب أن يتوافق مع المبادئ التوجيهية المؤسسية المتعلقة بالموافقة المستنيرة.

1. تحضير جزيئات الدهون المانحة الفلورية المسمى بالفوسفوليبيد

تشكيل فيلم الدهون
تنبيه: قم بإعداد وتوزيع محاليل المخزون في غطاء كيميائي. ارتد معطف مختبر وقفازات ونظارات واقية. تخلص من محاليل الكلوروفورم في النفايات الكيميائية العضوية ، ومحاليل Triton X-100 (بدون بلازما) في النفايات الكيميائية ، والمحاليل المحتوية على البلازما في النفايات الحيوية / النفايات الطبية.
1. قم بشراء محاليل مخزون الدهون في الكلوروفورم من بائع أو اصنعها في المختبر:
  25 مجم / مل: 1،2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC):
  10 مجم / مل: كوليسترول
  1 مجم / مل: 1،2-ديولويل-إس إن-جليسرو-3-فوسفوإيثانولاميني-ن- (ليسامين رودامين ب سلفونيل) [LRh-PE]
  ملاحظة: استخدم أنابيب زجاجية محكمة الغلق ذات علوية لولبية. غطاء الختم بشريط تفلون.
  يخزن في درجة حرارة -20^درجةمئوية.
2. تحديد المبلغ LC-CSH التي ستكون مطلوبة وإعداد العدد المناسب من الأنابيب الزجاجية.
  في غطاء الدخان الكيميائي ، أضف ما يلي إلى كل أنبوب زجاجي بورسليكات 10 مم 150 مم: 472 ميكرولتر من محلول مخزون DMPC (17.7 ميكرولتر ، 11.8 مجم) ، 339 ميكرولتر من محلول مخزون الكوليسترول (8.8 ميكرولتر ، 3.39 مجم) ، و 305 ميكرولتر من LRh-PE (200 نانومول ، 0.305 مجم). دوامة لفترة وجيزة للمزج.
3. في غطاء الدخان الكيميائي ، جفف خليط الدهون في أنبوب زجاجي تحت تيار لطيف من N₂ لمدة ساعة واحدة ، لتشكيل طبقة دهنية جافة في الجزء السفلي من الأنبوب.
  ملاحظة: يجب أن يتسبب تدفق N₂في حدوث تموج طفيف على سطح السائل.
4. للمقايسات التي تتطلب عدة لوحات 96 بئر على مدى أيام أو أسابيع, جعل دفعة كبيرة من LC-CSH التي يمكن أن تكون في أنابيب, أو استخدامها لصنع لوحات LC-CSH جاهزة للاستخدام, التي يتم تخزينها في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية. راجع الخطوات 2.2.1-2.2.2 أدناه.
طلاء هيدرات سيليكات الكالسيوم بغشاء دهني فلوري
تنبيه: ارتد معطفا مختبرا وقفازات وقناعا للوجه ونظارات واقية أثناء التعامل مع هيدرات سيليكات الكالسيوم.
1. أدخل مخروط ورق وزن في الأنبوب الزجاجي الذي يحتوي على الدهون المجففة. أضف 80 مجم من مسحوق هيدرات سيليكات الكالسيوم (CSH) (كاشف إزالة الدهون) إلى الأنبوب الزجاجي باستخدام مخروط ورق الوزن لتوجيه المسحوق إلى قاعدة الأنبوب. أضف على الفور 2 مل من المحلول الملحي العادي إلى الأنبوب الزجاجي الذي يحتوي على الدهون المجففة و CSH. قم بتغطية الجزء العلوي من الأنبوب بالبارافيلم.
2. دوامة باليد لإخراج الجزء الأكبر من الدهون من أسفل الأنبوب الزجاجي. أدخل الأنبوب الزجاجي في فتحة مصنوعة في منصة من الستايروفوم متصلة بالجزء العلوي من دوامة. قم بتثبيت الأنبوب على منصة الدوامة باستخدام شريط مقوى.
  ملاحظة: اضبط سرعة الدوامة مسبقا للسماح للخليط بالصعود في منتصف الطريق تقريبا إلى أعلى الأنبوب الزجاجي.
3. دوامة لمدة 10 دقائق. بعد الدوامة ، تأكد من عدم وجود دهون على جدار الأنبوب. إذا لزم الأمر ، قم بالدوامة يدويا حسب الحاجة حتى تختفي الدهون. انقل الحجم الكلي في الأنبوب الزجاجي إلى أنبوب بلاستيكي مخروطي سعة 15 مل ، باستخدام ماصة سعة 1 مل. اغسل جدران الأنبوب الزجاجي ب 3 مل من المحلول الملحي الإضافي وانقلها إلى نفس الأنبوب البلاستيكي المخروطي سعة 15 مل.
غسل LC-CSH
1. قم بالطرد المركزي للأنبوب البلاستيكي سعة 15 مل الذي يحتوي على CSH (LC-CSH) المطلي بالدهون لمدة دقيقتين عند 935 × جم عند 4 درجات مئوية لحبيبات الجزيئات المانحة. قم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق الشفط بالفراغ باستخدام طرف ماصة طويل ودقيق جدا.
2. ابدأ من الجزء العلوي من المادة الطافية وأثناء تحريك طرف الماصة ببطء على طول جانب الأنبوب، اقلب الأنبوب أثناء إزالة المادة الطافية. اترك كمية صغيرة (≈ 200 ميكرولتر) من المحلول الملحي لمنع الشفط العرضي ل LC-CSH من الحبيبات. أضف كمية كافية من المحلول الملحي لرفع الحجم الإجمالي إلى 5 مل.
3. كرر الخطوات 1.3.1-1.3.2 أربع مرات. بعد الغسيل النهائي ، أضف كمية كافية من المحلول الملحي لرفع الحجم النهائي إلى 2.5 مل.
  ملاحظة: تخزينها في مستحضرات LC-CSH في 4 درجة مئوية لمدة 2 أسابيع أو في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
تحضير دفعة كبيرة لألواح LC-CSH الجاهزة للاستخدام
ملاحظة: يتيح هذا النهج إعداد لوحات القياس ذات التكوين الكاشف الموحد من نفس دفعة LC-CSH ، وبالتالي تقليل تباين القياس بين الألواح.
1. إعداد 12 أنابيب LC-CSH (2.5 مل × 12 أنبوب) كما هو موضح في الخطوات 1.1.1-1.3.2 أعلاه. اجمع المحتوى الكامل لجميع الأنابيب ال 12 في أنبوب بلاستيكي مخروطي سعة 50 مل (حجم إجمالي 30 مل). دوامة بعناية للحصول على توزيع متجانس لجزيئات LC-CSH ، ووزع 6 مل في أنبوب مخروطي بلاستيكي سعة 15 مل. كرر أربع مرات لإنتاج ما مجموعه 5 أنابيب مخروطية البلاستيك ، كل منها يحتوي على 6 مل من LC-CSH.
2. سيوفر كل أنبوب ما يكفي من LC-CSH لصنع 5 لوحات LC-CSH جاهزة للاستخدام (تحتوي على 50 ميكرولتر لكل بئر لجميع الآبار ال 96 في لوحة واحدة). راجع الخطوات 2.2.1-2.2.2 أدناه.

2. حضانة عينات البلازما / المصل مع جزيئات دهون مانحة تحمل علامة فوسفوليبيد الفلورية (LC-CSH)

لوحات فردية للاستخدام الفوري.
1. ماصة 75 ميكرولتر من المحلول الملحي في كل بئر من صفيحة 0.3 مل سعة 96 بئر باستخدام أكبر عدد ممكن من الآبار حسب الحاجة لفحص مجموعة العينة. قم بسحب 100 ميكرولتر من المحلول الملحي في آبار التحكم السلبي الثلاثية (NC) ، و 75 ميكرولتر من المحلول الملحي في آبار التحكم الإيجابي المكررة (PC) (الشكل 2). استخدم ماصة متعددة الآبار للاستغناء عنها.
2. قبل الاستغناء عن LC-CSH, دوامة أنبوب مخزون البلاستيك 15 مل 3 مرات, 10 ثوان لكل منهما. باستخدام ماصة بئر واحدة ، قم بتوزيع 50 ميكرولتر من LC-CSH على طول الجانب الأيمن من الآبار المحتوية على المحلول الملحي. قم بتوزيع 50 ميكرولتر بسرعة لكل منها إلى 3 آبار فقط. كرر بروتوكول الدوامة قبل الاستغناء عن LC-CSH في الآبار 3 التالية.
  ملاحظة: هذا الإجراء أمر بالغ الأهمية لضمان تعليق LC-CSH الثقيل ، الذي يتدفق تلقائيا على الرواسب ، بشكل متجانس ، مما يسمح بصرف كميات متساوية لكل بئر.
3. قم بتدوير اللوحة المكونة من 96 بئرا بمقدار 180 درجة بحيث يكون الجانب الأيسر من الآبار الآن إلى اليمين. ماصة 25 ميكرولتر من عينات البلازما / المصل على طول الجانب الأيمن من البئر (الشكل 2). بالنسبة لآبار الكمبيوتر الشخصي ، أضف 25 ميكرولتر من البلازما / المصل القياسي القياسي القياسي البشري. الحجم الإجمالي لكل بئر للمقايسة هو 150 ميكرولتر.
  ملاحظة: يمنع هذا الإجراء التلوث المتبادل للبلازما / المصل مع LC-CSH ، حيث يتم الاستغناء عنها على جانبي الآبار.
4. أغلق اللوحة بإحكام بغشاء لاصق. احتضن اللوحة المختومة المكونة من 96 بئرا في الظلام لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية عند 1200 دورة في الدقيقة في خلاط حراري. بعد اكتمال الحضانة ، أخرج الطبق من الخلاط الحراري وضعه على الثلج. قم بالطرد المركزي للصفيحة لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية (لإيقاف تفاعل النقل) عند 935 جم لحبيبات الجزيئات المانحة.
لوحات LC-CSH جاهزة للاستخدام
1. للاستخدام ، قم بإذابة الألواح الجاهزة للاستخدام المجمدة (انظر الخطوات 1.4.1-1.4.2 لتحضير اللوحة) في البرد (4 درجات مئوية إلى 10 درجات مئوية) لمدة ساعتين (أو طوال الليل إذا لزم الأمر). جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية عند 935 × جم لتجميع كل المواد (125 ميكرولتر) معا. قم بإزالة الفيلم اللاصق بعناية حتى لا تتناثر محتويات الآبار.
2. قم بتوزيع 25 ميكرولتر من عينات البلازما / المصل ، والمحلول الملحي ، والبلازما البشرية المرجعية ، في ثلاث نسخ ، إلى الآبار المناسبة (الشكل 1) للوحة الجاهزة للاستخدام ، على الجليد ، وختمها بغشاء لاصق. احتضن 96 بئرا محكمة الغلق في الظلام لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية عند 1200 دورة في الدقيقة في خلاط حراري. أخرج الطبق من الخلاط الحراري وضعه على الثلج. قم بالطرد المركزي للوحة لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية (لإيقاف تفاعل النقل) عند 935 × جم (لحبيبات الجسيمات المانحة).

figure-protocol-1
الشكل 2: توزيع الكواشف في الآبار دون تلوث متبادل. الاستغناء عن البلازما / المصل و LC-CSH على الجدران المقابلة للآبار. يتم تقليل التلوث المتبادل إذا تم تدوير اللوحة بمقدار 180 درجة بعد الاستغناء عن LC-CSH لأول مرة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. قياس تدفق الفوسفوليبيد الفلوري إلى البلازما / مصل HDL

نقل إلى لوحة سوداء وقياس التألق
1. قم بإزالة الفيلم اللاصق بعناية حتى لا تزعج حبيبات LC-CSH.
  ملاحظة: في حالة حدوث اضطراب في الحبيبات ، قم بإجراء جهاز طرد مركزي مرة أخرى.
2. انقل 50 ميكرولتر من المادة الطافية من لوحة التفاعل المكونة من 96 بئرا إلى آبار صفيحة البوليسترين الأسود ذات القاع المسطح المكونة من 96 بئرا لقياسات التألق. استخدم ماصة متعددة الآبار.
  ملاحظة: لا تستنشق أي LC-CSH. إذا حدث هذا ، فقم بحقنه مرة أخرى في البئر وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى.
3. املأ الخزان بالمحلول الملحي العادي. أضف 50 ميكرولتر من المحلول الملحي إلى كل بئر باستخدام ماصة متعددة الآبار.
4. قم بإعداد 1٪ TX-100 عن طريق إضافة 90 مل من الماء المقطر إلى 10 مل من محلول مخزون Triton X-100 بنسبة 10٪ في قارورة Erlenmeyer بلاستيكية سعة 125 مل. املأ الخزان بنسبة 1٪ Triton-X 100.
5. أضف 100 ميكرولتر من 1٪ Triton X-100 في درجة حرارة الغرفة إلى كل بئر واخلطها عن طريق سحب العاصات برفق لأعلى ولأسفل 2-3 مرات باستخدام ماصة متعددة الآبار. تجنب تكوين الفقاعات. قم بتفجير أي فقاعات بالهواء من ماصة نقل 3 مل.
6. قياس مضان ليسامين رودامين باستخدام مقياس الفلور (إثارة 540 نانومتر / انبعاث 600 نانومتر).
حساب النسبة المئوية لتدفق PE
1. حساب تدفق PE
  1. ٪ تدفق PE = ([إجمالي البلازما الطافية أو إنفلونزا المصل - الأنفلونزا الطافية NC] / الأنفلونزا الكاملة)) × 100
    الأنفلونزا = وحدات التألق. NC = التحكم السلبي. نظرا لأنه يتم استخدام 50 ميكرولتر فقط من 150 ميكرولتر من خليط تفاعل الطاف لقياس التألق لكل بئر ، فمن الضروري تصحيح ما يلي:
  2. إجمالي الإنفلونزا الطافية / البئر = الإنفلونزا المقاسة 50 ميكرولتر (صفيحة سوداء) × 3
  3. إجمالي الإنفلونزا لكل خليط تفاعل 150 ميكرولتر / بئر = إجمالي الإنفلونزا المنبعثة من 50 ميكرولتر من LC-CSH.
    ملاحظة: يتم حساب مضان LC-CSH كما هو موضح أدناه (الخطوة 4.2.5).
2. حساب تدفق النسبة المئوية PE الطبيعي
  1. استخدم تدفق النسبة المئوية PE الطبيعي لتصحيح التباين بين المقايسات التي يتم إجراؤها في ظل ظروف مختلفة (أي التجربة التي أجريت في أيام مختلفة ، واختلافات الدفعات).
  2. استخدم هذه الصيغة لحساب النسبة المئوية لتدفق PE الطبيعي:
    التدفق الطبيعي ٪ PE = عينة الطافية٪ قيمة تدفق PE (FLU) / المادة الطافية للتحكم المرجعي الإيجابي٪ PE تدفق قيمة FLU.
  3. استخدم البلازما البشرية المجمعة المتطابقة من متبرعين أصحاء لديهم ملف تعريف دهني طبيعي كعنصر تحكم مرجعي. ليست هناك حاجة لحساب إجمالي الإنفلونزا الطافية / البئر لأن هذه القيمة هي نفسها لكل من العينة والمرجع.
  4. بالنسبة للعينات الثلاثية ، الصق البيانات الأولية التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.1.6 في جدول البيانات (الجدول التكميلي 1). بالنسبة للعينات المكررة ، الصق البيانات الأولية التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.1.6 في جدول البيانات (الجدول التكميلي 2).

4. منحنى معيار LC-CSH

ملاحظة: يستخدم المنحنى القياسي LC-CSH لحساب مقدار إشارة الفلورسنت PE الموجودة في حصة LC-CSH لكل بئر. عادة, 50 ميكرولتر من LC-CSH / يتم استخدام البئر. يمكن استخدام هذه القيمة لحساب تدفق ٪ PE إلى HDL في عينة طبيعية إلى إجمالي FLU (انظر الخطوة 3.2.1) الموجودة في خليط التفاعل.

٪ تدفق PE = ((وحدات مضان عينة الطافية [FLU] - الإنفلونزا المالحة الطافية) / (إجمالي LC-CSH FLU)) × 100.

التخفيف التسلسلي ل LC-CSH
1. قم بإعداد 10 أضعاف و 100 ضعف التخفيفات من مخزون LC-CSH (كما تم إعداده في الخطوات 1.1.1-1.3.3):
  تخفيف 10 أضعاف: 100 ميكرولتر من LC-CSH + 900 ميكرولتر من 1٪ Triton X-100
  تخفيف 100 ضعف: 100 ميكرولتر من LC-CSH المخفف 10 أضعاف + 900 ميكرولتر من 1٪ Triton X-100
2. قم بتوزيع عينات ثلاثية من 10 و 100 أضعاف مخفف LC-CSH في لوحة حضانة 96 بئرا للمنحنى القياسي (انظر الشكل 3).
3. أضف حجما كافيا من 1٪ Triton X-100 إلى الآبار التي تحتوي على LC-CSH ليصل إلى الحجم النهائي 200 ميكرولتر (انظر الجدول 1).
إذابة LC-CSH لقياس التألق
1. أغلق اللوحة بغشاء لاصق واحتضان لمدة ساعة واحدة عند 24 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 1200 دورة في الدقيقة. لوحة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية عند 935 × جم. قم بإزالة الفيلم اللاصق بعناية.
2. باستخدام ماصة متعددة الآبار ، امزج العينات عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 2-3x. انقل 100 ميكرولتر من LC-CSH لكل بئر إلى لوحة مسطحة القاع من البوليسترين الأسود سعة 96 بئرا لقياسات التألق ، باستخدام ماصة متعددة الآبار.
3. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر بنسبة 1٪ Triton-X في درجة حرارة الغرفة لكل بئر ، باستخدام ماصة متعددة الآبار. امزج عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل 2-3x.
4. قياس التألق باستخدام مقياس الفلور (إثارة 540 نانومتر / انبعاث 600 نانومتر).
5. الصق قيم التألق المقاسة باستخدام مقياس الفلور في قالب تحليل الانحدار الخطي في الجدول التكميلي 1 كما هو موضح في الملف التكميلي 3. يتم عرض التركيزات النهائية ل LC-CSH في لوحة قياس المنحنى القياسية في الجدول 2.

figure-protocol-2
الشكل 3: لوحة لمنحنى LC-CSH القياسي. يتم الاستغناء عن LRh-PE-المسمى LC-CSH المخفف بشكل متسلسل في لوحة 96 بئرا ، كما هو موضح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

التركيز النهائي	10 أضعاف مخفف	مخفف 100 أضعاف	1٪ تريتون X-100	مجموع
LC-CSH	LC-CSH	LC-CSH	منظف	حجم
(ميكرولتر / جيد)	(ميكرولتر)	(ميكرولتر)	(ميكرولتر)	(ميكرولتر)
10	100	0	100	200
5	50	0	150	200
2.5	25	0	175	200
1	0	100	100	200
0.5	0	50	150	200
0.25	0	25	175	200

الجدول 1: أحجام الكواشف المضافة إلى آبار لوحة الحضانة لمنحنى LC-CSH القياسي.

قابل للذوبان	ملح	مجموع	مضاف	قياس
LC-CSH	حجم	حجم	LC-CSH	LC-CSH
(ميكرولتر)	(ميكرولتر)	(ميكرولتر)	(ميكرولتر / جيد)	(ميكرولتر / جيد)
100	100	200	10	5
100	100	200	5	2.5
100	100	200	2.5	1
100	100	200	1	0.5
100	100	200	0.5	0.25
100	100	200	0.25	0.125

الجدول 2: أحجام الكواشف المضافة إلى آبار لوحة القياس للمنحنى القياسي LC-CSH.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطرق التحليلية

كما هو مذكور أعلاه ، يمكن تعديل تحليلات عينة HDL-SPE لتطبيقات مختلفة ، كما هو موضح أدناه. قبل إجراء الدراسات مع عينات البحث, LC-CSH التحقق من صحة المنحنى القياسي, التكاثر, ويتم إجراء فحوصات تركيز البلازما أولا من أجل إتقان التقنيات المطلوبة. أول, إجراء تحليل منحنى معيار LC-CSH لتقييم جودة الاستعدادات LC-CSH. بعد ذلك ، قم بإجراء مقايسة التكرار. أخيرا ، يجب إجراء فحص جرعة البلازما لتأكيد الخطية. بمجرد إنشاء CV٪ ≤ 5 في فحوصات التك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HDL-C هو محدد رئيسي يستخدم لتقييم مخاطر أمراض القلب والأوعية الدموية (CVD) سريريا وبالتالي الحاجة إلى خفض الدهون أو غيرها من العلاجات الوقائية المحتملة¹. لقد ثبت أن وظيفة HDL في تدفق الكوليسترول الخلوي في المختبر هي مؤشر أفضل لأمراض القلب والأوعية الدموية الواقعة من HDL-C⁷. لسوء الحظ ، فإن هذا الاختبار الخلوي غير قابل للتحويل إلى مقايسة مختبرية سريرية عالية الإنتاجية للاختبار التشخيصي الروتيني بسبب الطلب الطويل على الوقت لإجراء الف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

براءات الاختراع: US20220178953A1; WO2020185598A1 (E.B.N., M.S., A.T.R.)

يتم توظيف Masaki Sato من قبل شركة Eiken Chemical Co.، Ltd.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا البحث [جزئيا] من قبل برنامج البحوث الداخلية للمعاهد الوطنية للصحة (NIH). تعتبر مساهمات مؤلف (مؤلفي) المعاهد الوطنية للصحة من أعمال حكومة الولايات المتحدة. النتائج والاستنتاجات المقدمة في هذه الورقة هي نتائج المؤلف (المؤلفين) ولا تعكس بالضرورة وجهات نظر المعاهد الوطنية للصحة أو وزارة الصحة والخدمات الإنسانية الأمريكية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
1,2-ديميريستويل-إس-جليسترو-3-فوسفوكولين	أبحاث أفانتي	850345	14:0 PC (DMPC) كلوروفورم سولويتون
1,2-ديولويل-إس إن-جليسرو-3-فوسفوإينولانامين-ن- (ليسامين رودامين ب سلفونيل) (ملح الأمونيوم)	أبحاث أفانتي	810150-C	محلول الكلوروفورم LRh-PE
فيلم لاصق	أنظمة حيوية تطبيقية	4306311	فيلم لاصق شفاف من MicroAmp
شريط تفلون عالي الكثافة من شركة باي كوربوريشن بمقاس 1/2 بوصة × 520	حلول الفحص الطبي	86732
أنابيب زجاجية بوروسيليكات بحجم 20 مم ومؤد؛ 150 مم	فيشر ساينتيفك	14-961-33
الطرد المركزي	ثيرمو ساينتفيك	سلسلة سورفال إكس برو
الكلوروفورم	سيغما-ألدرتش	366927	مناسب ل HPLC ≥ 99.8%
مسحوق الكوليسترول	سيغما-ألدرتش	C8667	3&بيتا;-هيدروكسي-5-كوليستين، 5-كوليستين-3&بيتا؛-أول
ورق وزن جلاسين	كول-بالمر	UX-01338-02	للتعامل مع LC-CSH
صفيحة الحضانة	يو إس إيه ساينتيفيك	1402-9700	ألواح TempPlate 96 Semi Well Skirt 0.2mL وألواح PCR
عامل إزالة الدهون (LRA)	سوبيلكو	13358-U	LC-CSH
لوحة القياس	غراينر بيو-ون	655076	ميكروبلايت، PS، 96-بئر، F-BOTTOM (بئر المدخنة)، أسود؛ فلوتراك، الربط الطبي
مايكروسوفت إكسل	Microsoft 365 MSO	الإصدار 2507
رؤوس مضرب متعددة المرنة	فيشر ساينتيفك	50-550-206	لتناول السوبرينتنت أثناء غسلات LC-CSH
قارئ لوحات متعدد العلامات	بيركين إلمر	1420-050	عداد الملصقات المتعددة Victor3 Wallac1420
محلول ملحي عادي	جودة بيولوجية	114-055-101	لاستخدامات متعددة
بارافيلم	كول-بالمر	HS23452	لتغطية سطح الأنبوب الزجاجي أثناء الدوامة
قوارير إيرلينماير متعددة الكابونات	فيشر ساينتيفك	10-041-8	لحل 10٪ من تريتون-إكس
بلازما بشرية مجمعة (مشتقة من الدم) لي هيبارين)	شركة إنوفيتيف ريسيرش إنك	IPLAWBLIH	البلازما المرجعية، التحكم الإيجابي (PC)
أمببليفات السطح X 100	ثيرمو ساينتفيك	28314	10٪ ترايتون X-100، مخفف 10 مرات بالماء المقطر
خلاط حراري	إبندورف	5382000023	خلط الحرارة C مع كتلة حرارية بسعة 96 بئر
تمروبيكسر سمارتبلوك	إبندورف	5306000006	سمارت بلوك بسعة 96 بئر
ماصات النقل (3 مل، فالكون)	فيشر ساينتيفك	13-711-9CM	لإزالة الفقاعات من أعلى البئر
خلاط الدوامة	دايجر	3030A	حامل التثبيت لأنبوب زجاجي في الأعلى

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grundy, S. M., et al. 2018 AHA/ACC/AACVPR/AAPA/ABC/ACPM/ADA/AGS/APHA/ASPC/NLA/PCNA guideline on the management of blood cholesterol: A report of the american college of cardiology/american heart association task force on clinical practice guidelines. Circulation. 139 (25), e1082-e1143 (2019).
Zhong, S., et al. Increased coronary heart disease in Japanese-American men with mutation in the cholesteryl ester transfer protein gene despite increased HDL levels. J Clin Invest. 97 (12), 2917-2923 (1996).
Madsen, C. M., Varbo, A., Nordestgaard, B. G. Extreme high high-density lipoprotein cholesterol is paradoxically associated with high mortality in men and women: Two prospective cohort studies. Eur Heart J. 38 (32), 2478-2486 (2017).
Ko, D. T., et al. High-density lipoprotein cholesterol and cause-specific mortality in individuals without previous cardiovascular conditions: The CANHEART study. J Am Coll Cardiol. 68 (19), 2073-2083 (2016).
Liu, C., et al. Cholesterol efflux capacity is an independent predictor of all-cause and cardiovascular mortality in patients with coronary artery disease: A prospective cohort study. Atherosclerosis. 249, 116-124 (2016).
Rosenson, R. S., et al. Dysfunctional HDL and atherosclerotic cardiovascular disease. Nat Rev Cardiol. 13 (1), 48-60 (2016).
Khera, A. V., et al. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
Rohatgi, A., et al. HDL cholesterol efflux capacity and incident cardiovascular events. N Engl J Med. 371 (25), 2383-2393 (2014).
Sankaranarayanan, S., et al. A sensitive assay for ABCA1-mediated cholesterol efflux using bodipy-cholesterol. Journal of Lipid Research. 52 (12), 2332-2340 (2011).
Schachtl-Riess, J. F., et al. Lysis reagents, cell numbers, and calculation method influence high-throughput measurement of HDL-mediated cholesterol efflux capacity. J Lipid Res. 62, 100125(2021).
Harada, A., et al. Cholesterol uptake capacity: A new measure of HDL functionality for coronary risk assessment. J Appl Lab Med. 2 (2), 186-200 (2017).
Horiuchi, Y., et al. Validation and application of a novel cholesterol efflux assay using immobilized liposomes as a substitute for cultured cells. Biosci Rep. 38 (2), BSR20180144(2018).
Lorkowski, S. W., et al. A novel cell-free fluorescent assay for HDL function: Low apolipoprotein a1 exchange rate associated with increased incident cardiovascular events. J Appl Lab Med. 5 (3), 544-557 (2020).
Denimal, D. Rethinking 'good cholesterol' for cardiovascular risk stratification. QJM: An Int J Med. 117 (4), 243-245 (2023).
Borja, M. S., et al. HDL-apolipoprotein A-I exchange is independently associated with cholesterol efflux capacity. J Lipid Res. 56 (10), 2002-2009 (2015).
Borja, M. S., et al. HDL-apoa-I exchange: Rapid detection and association with atherosclerosis. PLoS One. 8 (8), e71541(2013).
Remaley, A. T., et al. Apolipoprotein specificity for lipid efflux by the human ABCAI transporter. Biochem Biophys Res Commun. 280 (3), 818-823 (2001).
Sato, M., et al. Cell-free, high-density lipoprotein-specific phospholipid efflux assay predicts incident cardiovascular disease. J Clin Invest. 133 (18), e165370(2023).
Neufeld, E. B., et al. ApoA-I-mediated lipoprotein remodeling monitored with a fluorescent phospholipid. Biology (Basel). 8 (3), 53(2019).
Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. J Lipid Res. 57 (4), 674-686 (2016).
Phillips, M. C. Molecular mechanisms of cellular cholesterol efflux. J Biol Chem. 289 (35), 24020-24029 (2014).
Oram, J. F., Yokoyama, S. Apolipoprotein-mediated removal of cellular cholesterol and phospholipids. J Lipid Res. 37 (12), 2473-2491 (1996).
Phillips, M. C. Is ABCA1 a lipid transfer protein. Journal of Lipid Research. 59 (5), 749-763 (2018).
Smith, J. D., et al. Abca1 mediates concurrent cholesterol and phospholipid efflux to apolipoprotein A-I. J Lipid Res. 45 (4), 635-644 (2004).
Ossoli, A., et al. Lipoprotein X causes renal disease in LCAT deficiency. PLoS One. 11 (2), e0150083(2016).
Martínez-Beamonte, R., et al. Effect of extra virgin olive oil high in bioactive compounds on atherosclerosis in apoe-deficient mice. Mol Nutr Food Res. , (2025).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HDL 1 Apolipoprotein A I

مقايسة تدفق الفوسفوليبيد عالية الكثافة الخاصة بالبروتين الدهني

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة