يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تصوير الكالسيوم في الجسم الحي وخارج الجسم الحي لخلية عصبية الدائرة الشمية في يرقة ذبابة الفاكهة السوداء الطورية الثالثة

1.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68956

⸱

أكتوبر 31, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Nevada, Reno, 2Integrative Neuroscience Program, University of Nevada, Reno, 3Molecular Biosciences Program, University of Nevada, Reno, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada, Reno

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نقدم بروتوكولات تصوير الكالسيوم للخلايا العصبية الشمية لليرقات ذبابة الفاكهة ، باستخدام مادة لاصقة للأنسجة الموضعية لتثبيت الحركة. تعزز هذه الطريقة الاستقرار ، مما يسهل التجارب الموثوقة في الجسم الحي وخارج الجسم الحي. تحلل نصوص R المخصصة إشارات الكالسيوم ، مما يوفر منصة فعالة للبحث الفيزيولوجي العصبي التفصيلي.

الملخص

يعد تصوير الكالسيوم أمرا بالغ الأهمية لدراسة الديناميكيات العصبية ووظائف الدماغ. ومع ذلك ، فإن الطرق الحالية لتصوير الكالسيوم في يرقات ذبابة الفاكهة تمثل تحديا بسبب القطع الأثرية الحركية واحتياجات المعدات المتخصصة. هنا ، نقدم طريقة عملية ومنخفضة التكلفة لإجراء تصوير الكالسيوم في الجسم الحي وخارج الجسم الحي في يرقات ذبابة الفاكهة الثانوية ، باستخدام مادة لاصقة للأنسجة الموضعية لتثبيت العينات. كما نقدم نصوص R مخصصة وإطارا لتحليل البيانات ، مما يسهل قياسات تغيرات الكالسيوم في ظل ظروف تجريبية مختلفة. باستخدام هذا النهج ، نجحنا في تسجيل عابرات الكالسيوم في زوج من الخلايا العصبية للجهاز العصبي المركزي اليرقات مع الحد الأدنى من القطع الأثرية للحركة ، مما يدل على قابلية التكاثر عبر المستحضرات. هذه الطريقة متوافقة مع الأنظمة متحد البؤر القياسية لقرص الغزل ويمكن تكييفها مع إعدادات DIY أو الفوتون التجارية ، مما يجعلها في متناول المختبرات ذات الموارد المختلفة. قد يزيد هذا النهج من إمكانية الوصول إلى دراسات تصوير الكالسيوم لليرقات ويمكن تكييفه لفحص تأثيرات كل من المحفزات الخارجية ، مثل الروائح ، والمحفزات الداخلية ، مثل المعدلات العصبية.

المقدمة

يعد فهم ديناميكيات الكالسيوم في الخلايا العصبية أمرا بالغ الأهمية لكشف الآليات المعقدة الكامنة وراء الإشارات العصبية ووظائف المخ ، حيث تلعب أيونات الكالسيوم دورا محوريا في تعديل النشاط العصبي ودفع الاستجابات الخلوية للمنبهات. يمكن مراقبة ديناميكيات الكالسيوم العصبية عبر تصوير الكالسيوم ، والذي يوفر رؤى في الوقت الفعلي حول الإشارات بوساطة الكالسيوم عبر مجموعة واسعة من الكائنات الحية ، بما في ذلك يرقة ذبابة الفاكهة . تبرز يرقة ذبابة الفاكهة كنظام نموذجي قوي لدراسة وظيفة الدائرة الكامنة وراء السلوك. إنها واحدة من ثلاثة كائنات حية فقط تم إنشاء شبكة دماغية كاملة بدقة متشابكة1. اليرقة قابلة لمجموعة من الأدوات المتطورة التي تتيح تصوير الخلايا العصبية ومعالجتها في كل من مستويات الدماغ بأكمله والخلايا العصبية المفردة2،3.

كانت القدرة على قياس ديناميكيات الكالسيوم في الخلايا العصبية اليرقات ذبابة الفاكهة عبر تصوير الكالسيوم أمرا بالغ الأهمية للنهوض بأبحاث علم الأعصاب4. سمحت التطورات الحديثة في تصوير الكالسيوم بقياس ديناميكيات الكالسيوم على مستوى نقاط الاشتباك العصبي المفردة في اليرقة5 إلى التسجيلات متعددة الخلايا العصبية في اليرقات الحرة6. يمكن إجراء تصوير الكالسيوم في الجسم الحي ، حيث يتم التقاط أحداث الكالسيوم في ظل سياقات فسيولوجية طبيعية لليرقةبأكملها 4،7،8،9 أو خارج الجسم الحي ، حيث يتم تسجيل أحداث الكالسيوم في أنسجة اليرقات التشريح المحفوظة في ظل ظروف فسيولوجية محاكاة10. بشكل عام ، استخدم الباحثون تكرارات مختلفة لطريقة تصوير الكالسيوم في يرقات ذبابة الفاكهة للكشف عن الآليات الأساسية للدوائر العصبية والأحاسيس والتعلم والذاكرة والسلوك8،11،12،13،14،15،16،17. ومع ذلك ، فإن دراسات تصوير الكالسيوم لليرقات محدودة بسبب الحاجة إلى معدات متخصصة ومشاكل في تفسير البيانات بسبب القطع الأثرية الحركية.

هنا ، نقدم منهجية فعالة من حيث التكلفة وسهلة التنفيذ لكل من تصوير الكالسيوم في الجسم الحي وخارج الجسم الحي في يرقات ذبابة الفاكهة السوداء الجادة الثالثة. نقوم بتصوير ديناميكيات الكالسيوم في Keystone-LN ، وهي خلية عصبية مثبطة للدائرة الشمية18،19 ، داخل مستحضرات اليرقات الكاملة لعرض تصوير الكالسيوم في الجسم الحي ، وفي أدمغة اليرقات التشريح لعرض تصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي . تظل اليرقات الكاملة والأدمغة المشرحة قابلة للحياة ومستجيبة لمدة 10-15 دقيقة تقريبا في ظل ظروف التصوير لدينا ، مما يسمح بالحصول على تجارب تحفيز متعددة لكل عينة. لمواجهة التحدي المتمثل في تثبيت عينات اليرقات أو الأنسجة الكاملة مع الحفاظ على بقاء الأنسجة وتقليل التباين التجريبي ، قمنا بتحسين استخدام GLUture ، وهو مادة لاصقة للأنسجة الموضعية cyanoacrylate متوافقة حيويا.

بالمقارنة مع طرق تثبيت اليرقات التقليدية ، مثل تضمين الاغاروز أو تثبيته ، فإن هذا النهج القائم على المادة اللاصقة يقلل من القطع الأثرية للحركة مع الحفاظ على بقاء الأنسجة20،21. بالنسبة لأنظمة التصوير ثنائية الفوتون، يقلل إعداد القرص الدوار من تكاليف الأجهزة ويحسن إمكانية الوصول إلى المختبرات المحدودة الموارد. أخيرا ، نصف مناهج التصوير المباشرة ، إلى جانب نصوص R المطورة خصيصا لتحليل البيانات. قد يزيد نهجنا من إمكانية الوصول إلى دراسات تصوير الكالسيوم لليرقات ويمكن تكييفه لفحص تأثيرات كل من المحفزات الخارجية ، مثل الروائح ، والمحفزات الداخلية ، مثل المعدلات العصبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تحضير يرقات ذبابة الفاكهة الثانوية لتصوير الكالسيوم

  1. حافظ على الذباب على طعام الذباب القياسي (انظر جدول المواد) عند 25 درجة مئوية ، مع رطوبة نسبية بنسبة 50-60٪ ودورة ضوئية / داكنة لمدة 12 ساعة.
  2. للتعبير عن البروتين الفلوري الأحمر (RFP) لتحديد الخلايا العصبية و GCaMP6f (مؤشر الكالسيوم) في الخلايا العصبية (الخلايا) ذات الأهمية ("X") ، الإناث البكر المتقاطعات من خط X-Gal4 مع الذكور الذين يحملون UAS-GCaMP6f و UAS-tdTomato22.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام خط Keystone-Gal4 لدفع التعبير عن tdTomato و GCaMP6f في زوج واحد من الخلايا العصبية المحلية المثبطة (Keystone-LNs) في دماغ اليرقات18،19.
  3. بعد السماح للذباب والإناث بالتزاوج ووضع البيض لمدة 48 ساعة ، انقل البالغين إلى قارورة جديدة.
  4. استخرج يرقات الطور الثالث (بعد حوالي 120 ساعة من وضع البيض) عن طريق تعويمها على محلول سكروز بنسبة 15٪. استخدم ماصة دقيقة P1000 لنقل اليرقات العائمة إلى دورق زجاجي سعة 1,000 مل.
  5. اغسل اليرقات 3-4 مرات عن طريق استبدال الماء الموجود في الدورق ب 800 مل من الماء المقطر العذب في كل مرة. اترك اليرقات ترتاح لمدة 10 دقائق قبل متابعة بقية البروتوكول.

2. بروتوكول الجوع ليرقات ذبابة الفاكهة من الطور الثالث (إذا تم اختبار الظروف الجائعة مقابل الظروف غير الجائعة)

  1. قم بإعداد غرفتي تغذية عن طريق وضع مربع صغير من مناديل المختبر في أطباق بتري مقاس 6 سم. للظروف غير الجائعة ، أضف 350 ميكرولتر من محلول السكروز 0.2 M ؛ لظروف الجوع ، أضف 350 ميكرولتر من الماء المقطر.
  2. انقل عددا متساويا من اليرقات المغسولة إلى كل غرفة تغذية. اترك اليرقات تتغذى على السكروز (غير الجائع) أو الماء المقطر (الجائع) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

3. تصوير الكالسيوم في الجسم الحي

ملاحظة: يجب إجراء جميع التجارب التي تنطوي على لاصق الأنسجة باستخدام ممارسات السلامة المختبرية القياسية. مطلوب معدات الحماية الشخصية (PPE) ، بما في ذلك قفازات النتريل ومعطف المختبر ونظارات السلامة أو واقي الوجه ؛ يجب تجنب القفازات القطنية بسبب التفاعلات الطاردة للحرارة مع السيانوأكريلات. تجنب ملامسة المادة اللاصقة للجلد أو العينين أو الأغشية المخاطية. في حالة الترابط الجلدي ، انقع المنطقة في الماء الدافئ والصابون وافصلها برفق ؛ في حالة التعرض للعين ، اشطفها بالماء الفاتر لمدة ≥5 دقيقة واطلب العناية الطبية الفورية. يجب إبعاد المادة اللاصقة عن اللهب المكشوف والحرارة العالية ، لأن المادة اللاصقة المعالجة قد تطلق أبخرة مزعجة إذا تم حرقها. قم بتخزين المادة اللاصقة عند درجة حرارة ≤30 درجة مئوية ، بعيدا عن الرطوبة وأشعة الشمس المباشرة ، في وعاء محكم الغلق عندما لا يكون قيد الاستخدام.

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت لتصوير الكالسيوم بالتركيبة التالية: كلوريد الصوديوم 110 ملي ، KCl 5.4 ملي ، CaCl2 1.2 ملي ، MgCl2 0.8 ملي ، D-glucose 10 ملي ، و HEPES 10 ملليمتر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية عندما لا يكون قيد الاستخدام.
    ملاحظة: المحلول الملحي المعدل الذي يحتوي على 110 ملي كلوريد الصوديوم هو تركيبة مقبولة على نطاق واسع لتشريح الجهاز العصبي المركزي لليرقات وتصويرها ويقع ضمن النطاق النموذجي المستخدم في دراسات الفيزيولوجيا الكهربية والتصوير (≈108-128 ملي كلوريد الصوديوم) 23،24،25،26.
  2. على زجاج غطاء مجهر مقاس 24 × 50 مم (1.5 مم) ، قم بإنشاء بئر باستخدام الفازلين الموزع من حقنة.
  3. ضع قطرة صغيرة من لاصق الأنسجة الموضعية (60٪ 2-أوكتيل و 40٪ n-butyl cyanoacrylate) في وسط زجاج الغطاء. انشر المادة اللاصقة بالتساوي في طبقة رقيقة وموحدة باستخدام قضيب زجاجي.
  4. انقل يرقة واحدة بعناية إلى المادة اللاصقة باستخدام فرشاة أو سلك رفيع. اضغط برفق على الجانب البطني من اليرقة على المادة اللاصقة. اترك المادة اللاصقة تجف ، مع التأكد من أن اليرقة مشدودة تماما.
  5. بمجرد تثبيت اليرقة ، ضع زجاج الغطاء على مرحلة المجهر المقلوب (الشكل 1 أ).

4. تصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت لتشريح اليرقات بالتركيبة التالية: كلوريد الصوديوم 110 ملي ، KCl 5.4 ملي ، كلوريد الكالسيوم2 0.3 ملي مولار ، MgCl2 0.8 ملي ، D-glucose 10 ملي ، و HEPES 10 ملليمتر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية عندما لا يكون قيد الاستخدام.
  2. تشريح تشريح الدماغ كما وصفه إيشيموتو وسانو10. لفترة وجيزة ، باستخدام فرشاة أو سلك رفيع ، انقل يرقة واحدة إلى طبق بتري 3.5 سم مع طبقات من المطاط الصناعي من السيليكون في الأسفل.
  3. تحت مجهر التشريح ، ضع اليرقة بحيث يكون جانبها البطني متجها لأعلى وحدد موقع الدماغ. باستخدام مقص التشريح ، قم بعمل قطع حوالي ثلث الطريق إلى أسفل الطرف الأمامي لليرقة. قم بعمل قطع آخر في خطافات الفم. حافظ على الدماغ أثناء إزالة خطافات الجسم والفم (مقتبس من بروتوكول Janelia Flylight27).
  4. تحديد مجموعة الأعصاب المحتوية على الخلايا العصبية الحركية من الحبل البطني. باستخدام الملقط ، اسحب الدماغ برفق بعيدا عن بقية اليرقة المقطوعة. تقليم أي أنسجة زائدة من الدماغ.
    ملاحظة: يمكن أن يتسبب التعامل مع القوة المفرطة برفق في تلف الأنسجة لأن الدماغ هش.
  5. قم بإعداد غطاء زجاجي مجهري بمادة لاصقة الأنسجة لتصوير الكالسيوم كما هو موضح في الخطوات من 3.2 إلى 3.3.
  6. باستخدام ماصة صغيرة P10 ، قم بشفط الدماغ المقطوع بعناية باستخدام 5 ميكرولتر من محلول التشريح من طبق بتري. طرد الدماغ ببطء على المادة اللاصقة. قبل أن يجف المادة اللاصقة ، قم بتوجيه الدماغ في وضع الجانب الظهري لأعلى (بحيث يكون فصي الدماغ متجهين لأسفل والحبل البطني الظهري متجها لأعلى).
  7. باستخدام الماصة الدقيقة P200 ، انقل 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتصوير الكالسيوم فوق دماغ اليرقات الثابت على زجاج الغطاء.
  8. ضع زجاج الغطاء مع الدماغ على المجهر المقلوب ، متصلا بوحدة ماسح ضوئي متحد البؤر للقرص الدوار وكاميرا CCD لتصوير الكالسيوم (الشكل 1 ب).
    ملاحظة: بالنسبة للاستعدادات خارج الجسم الحي ، تأكد من توجيه الدماغ بشكل صحيح بينما لا يزال الغراء مبللا. للحصول على جودة صورة مثالية ، ضع الدماغ بحيث يكون عائد الاستثمار الأقرب إلى هدف المجهر وتجنب وضع الغراء الزائد بالقرب من عائد الاستثمار.

5. بروتوكول التصوير

  1. افتح البرنامج لتصوير الكالسيوم باستخدام المجهر متحد البؤر. التقط الصور باستخدام هدف 10x/1.4 NA مع تبديل المرشح بين ليزر GFP (الإثارة 488 نانومتر، الشدة 70٪، الانبعاث 525 نانومتر/50 م، OD8) وليزر RFP (الإثارة 561 نانومتر، شدة 50٪، الانبعاث 610 نانومتر/75 م، OD8). اضبط التعريض الضوئي بين 100 مللي ثانية و 1,000 مللي ثانية ، والكسب بنسبة 50٪ من قيمة التعريض الضوئي المقابلة ، وعامل تجميع 2 أثناء التقاط الصورة.
  2. اضبط المجهر على تكبير 10x وحدد موقع الدماغ تحت إضاءة المجال الساطع.
  3. حدد الخلايا العصبية ذات الأهمية من خلال البحث عن إشارة tdTomato باستخدام ليزر RFP (ضبط الإثارة على 561 نانومتر).
    ملاحظة: حدد التشبع وتقليل جاما لتعيين قيمة التعريض الضوئي الصحيحة.
  4. بمجرد تحديد منطقة الاهتمام (ROI) ، قم بالتبديل إلى ليزر GFP (ضبط الإثارة على 488 نانومتر) لالتقاط إشارات GCaMP6f. تأكد من أن كل من إشارات tdTomato و GCaMP تتداخل مع بعضها البعض قبل التقاط صور المكدس لكلتا القناتين.
    ملاحظة: اضبط إعدادات الصورة لتسجيلات المكدس tdTomato وGCaMP6f لزيادة التألق.
  5. التقط تسجيلين منفصلين من السلسلة الزمنية لإشارات tdTomato و GCaMP6f في وقت واحد بمعدل 0.5 إطار / ثانية (بإجمالي دقيقتين).
    ملاحظة: يظل دماغ اليرقات التشريح قابلا للحياة لمدة 10 دقائق تقريبا في ظل ظروف التخزين المؤقت هذه. بعد هذا الوقت ، سوف تتحلل الإشارات.
  6. بمجرد أن تصبح العينة جاهزة للتصوير ، التقط تسجيلين منفصلين من السلسلة الزمنية لإشارات tdTomato و GCaMP6f في وقت واحد بمعدل 0.5 إطار / ثانية (ليصبح المجموع دقيقتين).
    ملاحظة: يظل دماغ اليرقات التشريح قابلا للحياة لمدة 10 دقائق تقريبا في ظل ظروف التخزين المؤقت هذه. بعد هذا الوقت ، سوف تتحلل الإشارات.
    ملاحظة: أثناء إجراء التحليل الكمي ، نوصي بزيادة طاقة الليزر وضبط كسب تعرض الكاشف حسب الحاجة مع الحفاظ على قياس الكثافة الخطية.

6. معالجة البيانات وتحليلها

  1. افتح واستورد مكدسات إشارات tdTomato وGCaMP6f إلى ImageJ (NIH)28.
  2. لتحديد منطقة الاهتمام الصحيحة (ROI) ، ادمج إشارات tdTomato و GCaMP6f لتأكيد التحديد المشترك. بعد التحقق ، قم بتقسيم قناتي tdTomato و GCaMP6f.
  3. في القائمة العلوية، حدد الإضافات | جديد ، وانقر فوق وحدات الماكرو لبدء ماكرو جديد. بعد ذلك، قم باستيراد وحدات الماكرو المخصصة المستندة إلى عائد الاستثمار إلى ImageJ. حدد مكدس GCaMP6f واضغط على تشغيل لتحليل الكالسيوم.
  4. معالجة إشارات التألق باستخدام ماكرو ImageJ مخصص (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging). يقوم الماكرو أولا بإنشاء إسقاطات الحد الأقصى للشدة، ويقوم بتصحيح الحركة باستخدام المكون الإضافي StackReg (وضع التسجيل الصلب )29، ويطبق تصحيح التبييض.
  5. ستظهر نافذة منبثقة "الإجراء المطلوب" تطلب تحديد عائد الاستثمار اليدوي ، مما يسمح للمستخدمين برسم عائد استثمار واسع يدويا. انقر فوق موافق لمتابعة التحليل. لإجراء تصحيح الحركة ، تأكد من أن الصندوق المستطيل يغطي عائد الاستثمار بالكامل في جميع الإطارات لتصحيح الحركة بدقة مع الاحتفاظ بالشكل المكاني المحلي وعائد الاستثمار عبر الإطارات.
    ملاحظة: تم تسجيل التسجيلات في ImageJ باستخدام StackReg. عندما كانت الحركة داخل المستوى كبيرة (الإزاحة التراكمية XY > 1 ميكرومتر) أو أدى الانجراف المحوري Z إلى فقدان التركيز ، أصبح التسجيل غير موثوق به ، أو فقدت العينة بالكامل من نافذة التصوير. وبالتالي ، تم تمييز العينات التي تظهر انجرافا شديدا أو إشارات كالسيوم متناقصة (>30٪) تلقائيا واستبعادها من التحليل النهائي لضمان قياسات دقيقة لنشاط الخلايا العصبية. تتوافق هذه العتبات مع ممارسات مراقبة الجودة المطبقة بشكل شائع في دراسات تصوير الكالسيوم30،31،32،33. كما كفل الاستبعاد استخدام التسجيلات المستقرة فقط مع عابرات الكالسيوم المرتبطة بالتحفيز الموثوقة للتحليلات.
  6. للتحليل ، قم باستخراج آثار التألق من عائد الاستثمار الدائري المحدد يدويا ، مسترشدا بالارتباط التلقائي للبكسل ؛ ستشمل عائد الاستثمار هذه مجال الخلايا العصبية الأساسية بأكمله.
    1. استخرج بيانات شدة التألق الخام لاثنين من الفلوروفورات: GCaMP6f / GFP و tdTomato / RFP ، باستخدام وحدات الماكرو المخصصة في ImageJ (v1.54p) (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging ، انظر جدول المواد).
    2. قم بتطبيق نافذة منزلقة بعائد استثمار 20 × 20 بكسل وحجم خطوة 10 بكسل عبر مجال الرؤية. لكل عائد استثمار ، سيحسب الماكرو: (1) الكثافة عبر جميع الإطارات ، (2) فرق تذبذب خط الأساس (أي الفرق بين قيم الكثافة القصوى والدنيا خلال أول 10 إطارات) ، و (3) الحد الأقصى لتغيير شدة الإطار إلى الإطار (ΔF). سيتم التخلص من عائد الاستثمار الذي يظهر تقلبات الشدة أقل من 10 وحدات ، وسيتم اختيار قيم ΔF الأكثر حدة فقط لمزيد من التحليل.
    3. تطبيع آثار التألق باستخدام الطرق التالية:
      1. تطبيع Fmax و Fmin: احسب Δ الطبيعي باستخدام الصيغة:
        figure-protocol-1
        حيث F هو التألق الخام في كل نقطة زمنية ، فإن Fmin هو الحد الأدنى من التألق (خط الأساس) ، و Fmax هو الحد الأقصى للمضان أثناء التسجيل.
      2. تطبيع ΔF / F 0: بالإضافة إلى ذلك ، قم بإجراء تطبيع ΔF / Fo ، حيث يتم تحديد Fo (خط الأساس) بواسطة أول 10 إطارات لكل تسجيل ، باستخدام الصيغة:
        figure-protocol-2
        حيث Ft هي التألق في الوقت t ، و F0 هي قيمة خط الأساس المحسوبة من أول 10 إطارات.
  7. بعد استخراج إشارات GCaMP6f ، انقر بزر الماوس الأيسر وحدد الكل والقص واللصق لنقل جميع القيم إلى جدول بيانات Excel جديد. في شريط القائمة العلوي، حدد البيانات | النص إلى الأعمدة. ستظهر نافذة منبثقة للمعالج "تحويل النص إلى عمود". في الخطوة 1، حدد محدد، ثم انقر فوق التالي. في الخطوة 2، ضمن المحددات، حدد علامة التبويب والفاصلة، ثم انقر فوق التالي. في الخطوة 3، حدد إنهاء.
    اختياري: لرسم إشارات الكالسيوم التي تم تسويتها، قم بتمييز Fnorm_FminFmax، وحدد مخطط التبعثر.
  8. ابحث عن ملف .csv يتم إنشاؤه يحتوي على: (1) قيم التألق الخام F ، (2) ΔF / Fo ، و (3) Fnorm (شدة التألق الطبيعية). قم بتنظيم مجموعة البيانات النهائية في أربعة أعمدة: (1) الوقت (الأطر) ، (2) حالة العينة (جائعا أو مغذيا) ، (3) معرف النسخ المتماثل (عينة فردية) ، و (4) الكثافة الطبيعية (قيم Fnorm مدرجة من 0 إلى 1).
  9. أخيرا ، قم بإجراء تحليل البيانات والتصور في R باستخدام البرامج النصية R المخصصة (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging. انظر جدول المواد).
    1. قم باستيراد البرنامج النصي R المخصص إلى مشروع R جديد. تأكد من تثبيت حزم R المطلوبة، بما في ذلك ggplot2 وdplyr وreadr، وتحديثها قبل تشغيل التحليل.
    2. بدءا من السطر 1 من البرنامج النصي R المخصص ، اضغط على تشغيل باستمرار لإجراء تحليل الكالسيوم. تأكد أيضا من أن الإخراج يتضمن خرائط حرارية توضح شدة الكالسيوم الطبيعية لأول 30 إطارا و 60 إطارا وجميع إطارات تسجيل السلاسل الزمنية ومخططات مربعة لإظهار متوسط الشدة الطبيعية.
    3. تقييم أهمية شدة الكالسيوم الطبيعية باستخدام اختبار Mann-Whitney U .

7. التخلص من النفايات وإزالة التلوث

  1. بعد التجارب ، قم بإزالة الحطام الإجمالي من الأدوات والأسطح تحت الماء الجاري ، ثم قم بتطهيره بنسبة 70٪ إيثانول أو 10٪ مبيض متبوعا بالماء المعقم. العمل على سطح مطهر, وغسل اليدين بعد إزالة القفازات; لا تأكل أو تشرب في المختبر.
  2. ضع أنسجة اليرقات والمستهلكات الملوثة في أكياس المخاطر البيولوجية والأوتوكلاف قبل التخلص منها.
  3. تخلص من النفايات اللاصقة المعالجة بالكامل في القمامة العامة ؛ يجب جمع المواد اللاصقة غير المعالجة والمستهلكات الملوثة في حاوية نفايات كيميائية خطرة محكمة الغلق وتحمل علاماتها.
  4. ضع جميع الأدوات الحادة (الشفرات والإبر والزجاج المكسور) في حاوية أدوات شدة مقاومة للثقب.
  5. اجمع المذيبات القابلة للاشتعال (الإيثانول والأسيتون) في حاويات نفايات قابلة للاشتعال وتحمل ملصقات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لإظهار نهج تصوير الكالسيوم اليرقات ، قمنا بتطبيقه بنجاح على كل من المستحضرات داخل الجسم الحي وخارج الجسم الحي ليرقات ذبابة الفاكهة (الشكل 2 والشكل 3 ، الفيديو 1 ، الفيديو 2 ، الفيديو 3 ، والفيديو 4). قمنا بقياس ديناميكيات الكالسيوم في الطور الثالث ذبابة الفاكهة يرقات تعبر عن GCaMP6f و Td-Tomato في زوج واحد من Keystone-LNs في دماغ اليرقات18،<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا ، نصف نهجا لكل من تصوير الكالسيوم في الجسم الحي وخارج الجسم الحي في ذبابة الفاكهة السوداء يرقات الطور الثالث. قمنا بتصوير ديناميكيات الكالسيوم في Keystone-LN ، وهي خلية عصبية محلية مثبطة في يرقة ذبابة الفاكهة . قمنا بقياس ديناميكيات الكالسيوم Keystone-LN في مستحضرات اليرقات الكاملة (في الجسم الحي) وفي المستحضرات التشريحية لدماغ اليرقات (خارج الجسم الحي) (الشكل 1).

أجرينا سا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

نحن ممتنون للدكتور جيفري هاربر ، الذي جعل المجهر متحد البؤر للقرص الدوار في مختبره متاحا لنا لهذه التجارب. نحن ممتنون لهدية خط الطيران: ث ؛ UAS-GCaMP6f / CyO ، تبكي. UAS-tdTomato من الدكتور جونغ هوان كيم. تم دعم هذا العمل بأموال من المؤسسة الوطنية للعلوم تحت أرقام الجوائز 2341202 و 2129234. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام Biorender.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الفلاي ستوكس & صيانة
طعام ذباب النوترفلايجينيسي ساينتيفك66-112
UAS-GCaMP6f، tdTomatoهدية من الدكتور جي إتش كيم 
w;; كايستون-جال4 (GMR27F08-GAL4)BDSC49232
كواشف الجوع البروتوكولي
طبق بتري بسمك 6 سمجينيسي ساينتيفك32-106G
سكروزميليبور سيغماS0389-500G
المواد المخزنة للتصوير والتشريح
كلوريد الكالسيومجي. تي. بيكر، أفانتور ساينسزJT1311-1CAS: 1311-01، 500 جرام
D-(+)-جلوكوزثيرمو فيشر العلميA16828.36CAS: 50-99-7، 500 جرام
حمض هيبيس-2-[4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-بيبرازينيل]-حمض الإيثانيسلفونيكجي. تي. بيكر، أفانتور ساينسزJT4018-1CAS: 4018-01، 100 جرام
كلوريد المغنيسيومVWR97064-150CAS: 7786-30-3، 100 جرام
كلوريد البوتاسيومثيرمو فيشر العلميJ64189.36CAS: 7447-40-7، 500 جرام
كلوريد الصوديومEMD ميليبور سيغماEMD-SX0420-1CAS: 7647-14-5، 500 جرام
الأدوات والكواشف للتشريح
مخزن التشريحالتركيب مقدم في النص
أطباق أوليمبوس بتري، 60 × 15مم مهواةجينيسي ساينتيفك32-105
قاعدة سيلغارد 184 إيلاستومرعلوم المجهر الإلكتروني24236-10A
عامل معالجة قاعدة سيلغارد 184 إيلاستومرعلوم المجهر الإلكتروني24236-10B
ملقط بأسلوب 5، EMSعلوم المجهر الإلكتروني78320-5
مقص زنبرك فاناس - حافة قطع 3 ممأدوات العلوم الدقيقة15000-00
معدات التصوير وتركيب المواد
وحدة الماسح الكونفوكاليوكوغاواCSU-W1متصل بالمجهر
مخزن التصويرالتركيب مقدم في النص
المجهر المقلوبلايكا مايكروسيستمزDMi8 متصل بوحدة ماسح ضوئي كونفوكال قرصي دوارة وكاميرا CCD
زجاج غطاء المجهر، 24 مم × 50 مم، # 1.5 سمكشركة غلوب ساينتيفيك إنك.1415-15
لاصق موضعي من MWI بيطري GLUTUREفيشر ساينتيفكNC0632797
هلام البترول النقيوولغرينز912556
روابط للموارد المتاحة للجمهور
بيورياندرhttps://www.biorender.com/
ImageJالمؤسسه912556https://imagej.net/ij/
فيديو بروتوكول جانيليا فلايلايتhttps://www.janelia.org/https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o
ماثيو لاب على Githubhttps://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging

المراجع

  1. Winding, M., et al. The connectome of an insect brain. Science. 379 (6636), eadd9330(2023).
  2. Eschbach, C., Zlatic, M. Useful road maps: studying Drosophila larva's central nervous system with the help of connectomics. Curr Opin Neurobiol. 65, 129-137 (2020).
  3. Aimon, S., Grunwald Kadow, I. C. Studying complex brain dynamics using Drosophila. J Neurogenet. 34 (1), 171-177 (2020).
  4. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
  5. Fukumasu, K., Nose, A., Kohsaka, H. Extraction of bouton-like structures from neuropil calcium imaging data. Neural Netw. 156, 218-238 (2022).
  6. Yamaguchi, A., et al. Multi-neuronal recording in unrestrained animals with all acousto-optic random-access line-scanning two-photon microscopy. Front Neurosci. 17, 1135457(2023).
  7. Marescotti, M., Lagogiannis, K., Webb, B., Davies, R. W., Armstrong, J. D. Monitoring brain activity and behaviour in freely moving Drosophila larvae using bioluminescence. Sci Rep. 8 (1), 9246(2018).
  8. Si, G., et al. Structured odorant response patterns across a complete olfactory receptor neuron population. Neuron. 101 (5), 950-962.e7 (2019).
  9. Ji, H., Han, C. Larvaspa, a method for mounting Drosophila larva for long-term time-lapse imaging. J Vis Exp. (156), e60792(2020).
  10. Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in Drosophila. J Vis Exp. (136), e57701(2018).
  11. Maier, G. L., Komarov, N., Meyenhofer, F., Kwon, J. Y., Sprecher, S. G. Taste sensing and sugar detection mechanisms in Drosophila larval primary taste center. Elife. 10, (2021).
  12. Carreira-Rosario, A., York, R. A., Choi, M., Doe, C. Q., Clandinin, T. R. Mechanosensory input during circuit formation shapes Drosophila motor behavior through patterned spontaneous network activity. Curr Biol. 31 (23), 5341-5349.e4 (2021).
  13. Yoon, Y., et al. System level analysis of motor-related neural activities in larval Drosophila. J Neurogenet. 33 (3), 179-189 (2019).
  14. Vaadia, R. D., et al. Characterization of proprioceptive system dynamics in behaving Drosophila larvae using high-speed volumetric microscopy. Curr Biol. 29 (6), 935-944.e4 (2019).
  15. Utashiro, N., Williams, C. R., Parrish, J. Z., Emoto, K. Prior activity of olfactory receptor neurons is required for proper sensory processing and behavior in Drosophila larvae. Sci Rep. 8 (1), 8580(2018).
  16. Gillespie, J. M., Hodge, J. J. CASK regulates CaMKII autophosphorylation in neuronal growth, calcium signaling, and learning. Front Mol Neurosci. 6, 27(2013).
  17. Francis, J., et al. Inhibitory circuit motifs in Drosophila larvae generate motor program diversity and variability. PLoS Biol. 23 (4), e3003094(2025).
  18. Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. Elife. 5, (2016).
  19. Odell, S. R., et al. Internal state affects local neuron function in an early sensory processing center to shape olfactory behavior in Drosophila larvae. Sci Rep. 12 (1), 15767(2022).
  20. Worrell, J. W., Levine, R. B. Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ. J Neurophysiol. 100 (2), 868-878 (2008).
  21. Marley, R., Baines, R. A. Dissection of third-instar Drosophila larvae for electrophysiological recording from neurons. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (9), (2011).
  22. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  23. Held, M., et al. Aminergic and peptidergic modulation of insulin-producing cells in Drosophila. Elife. 13, (2025).
  24. Kim, S. M., Wang, J. W. Calcium imaging of pheromone responses in the insect antennal lobe. Methods Mol Biol. 1068, 179-187 (2013).
  25. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol [A]. 175 (2), 179-191 (1994).
  26. Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J Neurosci. 24 (10), 2496-2505 (2004).
  27. Larval Dissection. , Howard Hughes Medical Institute. https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o (2019).
  28. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: an open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  29. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  30. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  31. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  32. De Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nat Neurosci. 23 (1), 138-151 (2020).
  33. Zhang, Y., et al. Imaging sensory transmission and neuronal plasticity in primary sensory neurons with a positively tuned voltage indicator. Nat Commun. 16 (1), 6396(2025).
  34. Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search. Cell. 145 (1), 133-144 (2011).
  35. Slankster, E., et al. Mechanism underlying starvation-dependent modulation of olfactory behavior in Drosophila larva. Sci Rep. 10 (1), 3119(2020).
  36. Lehnert, B. P., Baker, A. E., Gaudry, Q., Chiang, A. S., Wilson, R. I. Distinct roles of TRP channels in auditory transduction and amplification in Drosophila. Neuron. 77 (1), 115-128 (2013).
  37. Murthy, M., Turner, G. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 140-148 (2013).
  38. Giovannucci, A., et al. CaImAn: an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, (2019).
  39. Cao, G., et al. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154 (4), 904-913 (2013).
  40. Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

يرقة ذبابة الفاكهة (Drosophila)التصوير الحيالتصوير خارج الجسمالمجهر confocal ذو القرص الدوارتصحيح الحركةفلورة GCaMP6fتثبيت الأنسجةتحليل منطقة الاهتمام (ROI)
تصوير الكالسيوم في الجسم الحي وخارج الجسم الحي لخلية عصبية الدائرة الشمية في يرقة ذبابة الفاكهة السوداء الطورية الثالثة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.