تتيح خطوط الخلايا المقاومة للأدوية فهم آليات مقاومة العلاج والتقييم غير السريري للمركبات الجديدة والأدوية المعاد توجيهها والعلاجات المركبة. تقدم هذه الورقة بروتوكولا لإنشاء خطوط خلايا مقاومة عن طريق تعريض خطوط الخلايا الأم للزيادات التدريجية في تركيز الدواء المستهدف.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تطوير خطوط الخلايا المقاومة للأدوية للإجراءات التجريبية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعد تطوير خطوط الخلايا المقاومة للأدوية أمرا ضروريا لفهم آليات مقاومة الأدوية وتحديد استراتيجيات التغلب على فشل العلاج في علاج السرطان. تتيح نماذج المقاومة التقييم قبل السريري للمركبات الجديدة والأدوية المعاد توجيهها والعلاجات المركبة. لتوليد خلايا مقاومة ، تتعرض خطوط الخلايا السرطانية الأبوية بشكل متكرر لتركيزات متزايدة بشكل تدريجي من الدواء المستهدف على مدى عدة أسابيع. يتم اختيار الخلايا التي تعيش وتتكاثر في كل مرحلة وتوسيعها وتعريضها لجرعات أعلى من الأدوية. يتم تأكيد تطور المقاومة من خلال تحديد ومقارنة قيم التركيز المثبط نصف الحد الأقصى (IC50) بين الخلايا الأبوية والخلايا المقاومة باستخدام فحوصات بقاء الخلية وتحليل الانحدار غير الخطي. تشير قيم IC50 المتزايدة بشكل كبير إلى التكيف الناجح مع ضغط الدواء وتطور المقاومة. تتوفر خطوط الخلايا المقاومة للأدوية هذه للتحليل الشامل ، مثل المصفوفة الدقيقة والتسلسل أحادي الخلية ، بالإضافة إلى العديد من التجارب في المختبر أو في الجسم الحي . توفر هذه النماذج أدوات قيمة للتحقيق في الاستراتيجيات العلاجية المحتملة للتغلب على مقاومة الأدوية.
المقدمة
العلاج الكيميائي هو خيار العلاج الأكثر استخداما للسرطانات الموضعية غير القابلة للجراحة أو العلاج الإشعاعي أو السرطانات النقيلية. تستخدم الأدوية الموجهة جزييئيا والعلاج الكيميائي كعلاجات أولية للعديد من الأورام الخبيثة ، وفعاليتها معترف بها على نطاق واسع. تظهر بعض أنواع السرطان مقاومة لبعض الأدوية منذ بداية العلاج، مما يجعل العلاج غير فعال. ومع ذلك ، في الحالات الأكثر شيوعا ، يصبح العلاج الذي كان فعالا في البداية غير فعال بسبب تطور مقاومة الأدوية ، مما يؤدي إلى تطور السرطان.
تحدث مقاومة الأدوية بسبب كل من الطفرات الجينية أو الاستجابة اللاجينية في الخلايا السرطانية التي تحفز التعبير عن المنتجات الجينية التي تتهرب من الأدوية أو تساعد على نموالخلايا 1،2. علاوة على ذلك ، في كثير من الحالات ، تتطور هذه المقاومة إلى مقاومة للأدوية المتعددة ، حيث تصبح الخلية السرطانية مقاومة للأدوية المتعددة3،4. لذلك ، فإن تحديد آليات مقاومة الأدوية وتطوير استراتيجيات للتغلب عليها أمر مهم للغاية لتقدم علاج السرطان.
كثيرا ما تستخدم خطوط الخلايا المقاومة للأدوية نماذج لدراسة آليات المقاومة العلاجية وتلعب دورا مهما في كل من التجارب في المختبر وفي الجسم الحي 5. هذه النماذج هي أدوات أساسية لاكتساب فهم أعمق لمسارات عمل الأدوية ، وتحديد المؤشرات الحيوية التي تؤثر على الفعالية العلاجية ، وإيجاد استراتيجيات علاجية لمنع تكوين مقاومة الأدوية. تتمثل العملية الأساسية لإنشاء خط خلوي مقاوم للأدوية في إحداث المقاومة عن طريق تعريض خط الخلية لمستويات متزايدة من الدواء المستهدف3،6.
يعد التركيز المستخدم ومدة التعرض للدواء من المكونات الحاسمة لهذه العملية. في كل مستوى تركيز ، يتم تضخيم المجموعة الفرعية من الخلايا التي تبقى على قيد الحياة ثم تعرضها للتركيز التالي للدواء بطريقة متكررة. في النهاية ، يتم اشتقاق خط خلوي مقاوم للأدوية يحتوي على تركيز مثبط نصف أقصى (IC50) للدواء مقارنة بخط الخلايا الأبوية. يوضح هذا التقرير بالتفصيل إجراءات توليد خط خلوي مقاوم للباكليتاكسيل (DU145-TxR) من خط خلايا سرطان البروستاتا البشري DU145 ، باستخدام طريقة تدريجية مع التعرض المتقطع للأدوية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. مقايسات زراعة الخلايا وقابلية الخلية
ملاحظة: باكليتاكسيل دواء مضاد للسرطان وسام للخلايا. عند التعامل معها ، ارتد ثوبا ونظارات واقية وقفازات ، واعمل داخل خزانة أمان لمنع استنشاقها في الجسم. DMSO ليس شديد السمية للخلايا ، ولكن عندما يتلامس مع الجلد أو الأغشية المخاطية ، تزداد نفاذية الأدوية الذائبة ، لذا ارتد ثوبا ونظارات واقية وقفازات عند التعامل معها.
- زراعة خلايا DU-145 في طبق استزراع خلوي مقاس 10 سم باستخدام وسط كامل (RPMI-1640 + 1٪ بنسلين ستربتومايسين [قلم-عقد] + 10٪ مصل بقري جنيني [FBS]) في حاضنة 37 درجة مئوية عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 حتى 80٪ ملتقاء.
- استنشق وسط المزرعة ، واغسله ب DPBS ، وأضف 0.05٪ تربسين ، واتركه في الحاضنة لمدة 5 دقائق.
- بعد النقر والتأكيد بالفحص المجهري على أن الخلايا منفصلة عن اللوحة وتطفو ، أضف 1 مل من الوسط الكامل لإيقاف عمل التربسين.
- احسب عدد الخلايا وبذرها بكثافة 1.0 × 104/99 ميكرولتر لكل بئر في وسط كامل في كل بئر من صفيحة 96 بئرا. احتضن لمدة 2 ساعة للسماح للخلايا بالالتصاق بالجزء السفلي من اللوحة. يجب أن تكون الخلايا مطلية بثلاث نسخ أو أربع مرات لكل مجموعة اختبار.
- اضبط باكليتاكسيل و DMSO لإضافتهما إلى كل بئر. تأكد من أن كمية DMSO المضافة إلى كل بئر هي نفسها ، وأن التركيز النهائي ل DMSO لا يزيد عن 1٪.
- لإجراء ذلك واتباع بروتوكولنا ، ابدأ ب 10 ملي مولار باكليتاكسيل في DMSO وأضف 87.2 ميكرولتر من DMSO إلى 12.8 ميكرولتر من هذا الدواء في أنبوب للحصول على 100 ميكرولتر من باكليتاكسيل عند 1,280 ميكرومتر.
- انقل 50 ميكرولتر من هذا المحلول إلى أنبوب آخر وقم بتخفيفه إلى نصف القوة باستخدام 50 ميكرولتر من DMSO (640 ميكرومتر).
- كرر هذا الإجراء لإجراء التخفيف التسلسلي وتحضير محاليل باكليتاكسيل بتركيزات 0 (DMSO فقط) و 0.1 و 0.5 و 1 و 2 و 4 و 10 و 20 و 40 و 80 و 160 و 320 و 620 و 1,280 ميكرومتر.
ملاحظة: يجب تخزين باكليتاكسيل المخفف ب DMSO مجمدا لإعادة استخدامه في التجارب اللاحقة (لتقليل دورات التجميد والذوبان ، قم بتخزينه في aliquots).
- خفف 1 ميكرولتر من محلول باكليتاكسيل المحضر مسبقا ب 9 ميكرولتر من الوسط الكامل في أنبوب منفصل ، وأضف 1 ميكرولتر من هذا إلى كل بئر بعد ساعتين من بذر الخلايا. ستكون تركيزات باكليتاكسيل في كل بئر 0 ، 0.1 ، 0.5 ، 1 ، 2 ، 4 ، 10 ، 20 ، 40 ، 80 ، 160 ، 320 ، 620 ، و 1،280 نانومتر ، مع احتواء كل بئر على 100 ميكرولتر من الوسط.
ملاحظة: عند تحديد تركيز الأدوية المستخدمة في فحوصات صلاحية الخلية ، تحقق من قيم IC50 المنشورة في الأوراق السابقة وتأكد من أن التركيز يقع ضمن النطاق3. كان تركيز DMSO في كل بئر 0.1٪ طوال الوقت (أقل من 1٪ مرغوب فيه). - احتضان لمدة 48 ساعة. أضف 10 ميكرولتر من كاشف تكاثر الخلايا WST-1 إلى كل بئر (100 ميكرولتر من وسط الاستزراع) واحتضانه لمدة 0.5 إلى 4.0 ساعة إضافية.
ملاحظة: يعتمد وقت الحضانة الأمثل على خط الخلية وكثافة الخلية. في هذه الدراسة ، قمنا بزراعة الخلايا لمدة 1.5 ساعة تقريبا. إذا كان وقت الحضانة قصيرا جدا أو طويلا جدا ، فسيكون امتصاص كل بئر منخفضا جدا أو مرتفعا جدا في الخطوة التالية. نتيجة لذلك ، لن يكون من الممكن تأكيد الاختلاف في صلاحية الخلية. وبالتالي ، بالنسبة للاختبار الأولي ، يجب على المرء اختبار عدة أوقات حضانة لتأكيد وقت الحضانة المناسب. - قم بقياس امتصاص WST-1 باستخدام قارئ صفيحة دقيقة.
ملاحظة: الامتصاص المستهدف هو 450 نانومتر (يوصى ب 420-480 نانومتر) ، وامتصاص الخلفية 650 نانومتر (يوصى ب 600 نانومتر أو أعلى).
2. حساب صلاحية الخلية والتركيز المثبط نصف الحد الأقصى (IC50)
- احسب صلاحية الخلية من الامتصاص. الامتصاص (A450nm-A650nm).
صلاحية الخلية (٪) = [(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100
مثل: امتصاص العينة (الخلايا المعالجة بالدواء)
أب: امتصاص فارغ (متوسط فقط ، بدون خلايا)
التيار المتردد: التحكم في الامتصاص (الخلايا غير المعالجة بالأدوية) - لخص صلاحية الخلية المحسوبة في القسم السابق في برنامج جدول بيانات.
- احسب وسجل IC50 للخلايا الأبوية عن طريق تحليل الانحدار غير الخطي.
ملاحظة: غالبا ما يكون النموذج اللوجستي رباعي المعلمات (4PL) طريقة حساب مناسبة. تتوفر أدوات حساب IC50 عبر الإنترنت7. ومع ذلك ، لا ينبغي استخدام نموذج 4PL عندما تكون فعالية المركب خارج نطاق التركيز ، ولا يمكن للبيانات أن تمثل بشكل كامل المقاربات السفلية والعلوية للمنحنى السيني.- لتجنب مثل هذه الزيادة ، قم بقياس صلاحية الخلية عند أكبر عدد ممكن من نقاط التركيز. إذا تعذر الحصول على منحنى سيني ، فاستخدم وضعا من معلمتين أو ثلاث معلمات بقيم دنيا وقصوىثابتة 7.
- إذا لم تكن تستخدم برامج حسابية أو برامج إحصائية، بما في ذلك تلك المتوفرة على الويب، فاستخدم الصيغة التالية:
IC50 = ((50-ج) (ب-أ) + أ (د-ج))/(د-ج)
ج: أدنى قيمة بين تركيزات الدواء المقاسة بصلاحية خلية ≤50٪
ب: أعلى قيمة بين تركيزات الدواء المقاسة ببقاء الخلية >50٪
ج: صلاحية الخلية في B
د: صلاحية الخلية في أ
ملاحظة: تفترض هذه الصيغة أن الرسم البياني بين النقطتين اللتين تحدد قيمة IC50 هو خط مستقيم.
3. التعرض للمخدرات
ملاحظة: تظهر نظرة عامة على الإجراءات الموضحة في هذا القسم في الشكل 1.
- خلايا الوالدين البذور على ألواح زراعة الخلايا (2.0 × 106 خلايا / طبق لأطباق 100 مم).
- أضف باكليتاكسيل بتركيز مثبط للخلية ~ 10-20٪ (IC10-20 ، ~ 0.5 نانومتر في هذه الحالة) إلى الوسط والثقافة في حاضنة لمدة يومين.
- استبدلها بوسط خال من باكليتاكسيل واحتضانها لعدة أيام.
- بمجرد أن تنمو الخلايا وتصبح ملتقية بنسبة 80٪ ، قم بتمريرها إلى لوحة زراعة خلية جديدة. حفظ الخلايا المتبقية بالتبريد.
- أضف باكليتاكسيل إلى الخلايا التي تم تمريرها بتركيز ~ 1.5-2.0 ضعف تركيز البداية (0.75-1 نانومتر). احتضان في حاضنة لمدة 2 أيام.
- استبدلها بوسط خال من باكليتاكسيل واحتضانها لعدة أيام.
- إذا نمت الخلايا بشكل مشابه ، كرر الخطوات 3.4-3.6 ، مع زيادة تركيز التعرض للباكليتاكسيل خطوة بخطوة.
ملاحظة: يمكن للمجرب ضبط الزيادة في تركيز الدواء (1.5-2.0 ضعف) بحرية ، ويجب تكرار التجربة بهذا التركيز. نوصي بتجميد الخلايا وتخزينها في كل مرة يتم فيها زيادة تركيز الدواء. إذا استمر تركيز باكليتاكسيل في الزيادة ، فقد لا يتعافى تكاثر الخلايا ، وقد تموت الخلايا. في مثل هذه الحالات ، قم بإذابة الخلايا التي تكاثرت بتركيز قبل الموت ، وتقليل زيادة الباكليتاكسيل إلى 1.1-1.5 ضعف (يوصى ب 1.2 ضعف) ، وكرر الثقافة. - قم بزيادة مقاومة خط الخلية للدواء تدريجيا ثم احسب وسجل IC50 باستخدام WST-1 والبرامج كما هو موضح في القسم 2.
ملاحظة: إذا لوحظت زيادة في IC50 بمقدار 3-5 أضعاف على الأقل ، فيمكن تحديد أن السلالة عبارة عن خط خلوي مقاوم للأدوية.
4. الحفاظ على مقاومة الأدوية
- للحفاظ على النمط الظاهري المقاوم لخط الخلايا المقاوم للأدوية ، احتضن بتركيز دواء IC10-20.
ملاحظة: يوصى بقياس IC50 في مقايسة بقاء الخلية بشكل دوري ، حيث قد تتغير مقاومة الأدوية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام هذه الطريقة ، أمضينا سابقا 9 أشهر في إنشاء خلايا DU145 المقاومة للباكليتاكسيل (DU145-TxR) بنجاح. أظهرت نتائج مقايسة صلاحية الخلية أن قيمة IC50 من باكليتاكسيل لخط الخلية الأم DU145 كانت 1.1 نانومتر ، في حين أن قيمة IC50 ل DU145-TxR كانت أعلى بمقدار 149.6 مرة من قيمة خط الخلية الأصلي (IC50: 164.6 نانومتر) (الجدول 1 والشكل 2). تشير هذه النتيجة إلى أن DU145-TxR قد اكتسب مقاومة عالية جدا للأدوية.
لوحظ مورفولوجي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يعد تطوير خطوط الخلايا السرطانية المقاومة للأدوية طريقة راسخة للتحقيق في سمية الأدوية وآليات المقاومة ، ولكن التحدي الأول الذي يواجهه الباحثون هو اختيار نموذج مناسب للتعبير عن المقاومة. تتمثل إحدى الطرق الشائعة لإنشاء خطوط خلايا مقاومة للأدوية في المختبر في تعريض خط الخلية للدواء المستهدف ، ولكن من الضروري التفكير في كيفية ضبط تركيز التعرض (تدريجيا أو دفعة واحدة) وما إذا كان يجب تحديد فترة خالية من الأدوية (نبضية أو مستمرة).
تشبه طريقة النبض ، مع فترة خالية من...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب محتمل في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة P01 CA093900.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.05٪ Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 10 مل ماصة مصلية يمكن التخلص | منها فيشر علمية | 13-678-11E | |
| طبق 100 مم | كورنينج | 353003 | |
| 15 مل أنبوب مخروطي | كورنينج | 352097 | |
| 2.0 مل قوارير مبردة | Corning | 431386 | |
| 96 لوحة | ثقافة خلية جيدةكورنينج | 353072 | |
| غرفة عد الخلايا الشريحة | Invitrogen | C10228 | |
| كاشف انتشار الخلايا WST-1 | سيجما | 5015944001 | |
| الطرد المركزي 5702 R | eppendorf | ||
| عدد لا يحصى II | Invitrogen | خلية عداد | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد ؛ | سيجما | D2650 | |
| DPBS | Gibco | D4W2J | |
| DU145 | ATCC | HTB-81 | خط خلايا سرطان البروستاتا |
| EVOS FLc | Thermo Fisher Scientific | Digital مقلوب | |
| مجهر FBS | Gibco | A5670701 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| Penicillin & ndash ؛ ستربتومايسين | Invitrogen | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Synergy H1 | BioTek | Microplate | |
| Reader محلول Trypan Blue 0.4٪ | Invitrogen | 15250061 |
المراجع
- Zahreddine, H., Borden, K. L. Mechanisms and insights into drug resistance in cancer. Fron Pharmacol. 4, 28(2013).
- Emran, T. B., et al. Multidrug resistance in cancer: understanding molecular mechanisms, immunoprevention and therapeutic approaches. Fron Oncol. 12, 891652(2022).
- Takeda, M. The establishment of two paclitaxel-resistant prostate cancer cell lines and the mechanisms of paclitaxel resistance with two cell lines. Prostate. 67 (9), 955-967 (2007).
- Abelman, R. O., et al. TOP1 mutations and cross-resistance to antibody-drug conjugates in patients with metastatic breast cancer. Cli Cancer Res. 31 (10), 1966-1974 (2025).
- McDermott, M. In vitro development of chemotherapy and targeted therapy drug-resistant cancer cell lines: a practical guide with case studies. Fron Oncol. 4, 40(2014).
- Breen, L., Murphy, L., Keenan, J., Clynes, M. Development of taxane resistance in a panel of human lung cancer cell lines. Toxico In Vitro. 22 (5), 1234-1241 (2008).
- Bioquest, A. A. IC50 calculator. , AA Bioquest. https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator (2025).
- Kawai, H. Characterization of non small-cell lung cancer cell lines established before and after chemotherapy. Lun Cancer. 35 (3), 305-314 (2002).
- Berendsen, H. H., et al. Characterization of three small cell lung cancer cell lines established from one patient during longitudinal follow-up. Cance Res. 48 (23), 6891-6899 (1988).
- Sakai, W. Functional restoration of BRCA2 protein by secondary BRCA2 mutations in BRCA2-mutated ovarian carcinoma. Cance Res. 69 (16), 6381-6386 (2009).
- Schnepp, P. M., et al. Single-cell transcriptomics analysis identifies nuclear protein 1 as a regulator of docetaxel resistance in prostate cancer cells. Mo Cancer Res. 18 (9), 1290-1301 (2020).
- Grigoreva, T., Sagaidak, A., Novikova, D., Tribulovich, V. New insights into chemoresistance mediated by Mdm2 inhibitors: the benefits of targeted therapy over common cytostatics. Biomedicines. 12 (3), 547(2024).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
