Method Article

تحقيق جمع بيانات تخطيطية عالية الجودة باستخدام مجهر إلكتروني النقل بجهد 200 كيلو فولت مع نظام العدسات المكثفة المزدوجة

DOI:

10.3791/68965

⸱

February 6th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Center for Reproductive Medicine, State Key Laboratory of Female Fertility Promotion, Peking University Third Hospital, 2Medical and Health Analysis Center, Peking University Health Science Center, 3Beijing Key Laboratory of Collaborative Innovation in Frontier Technologies for Population Quality, 4Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح التصوير المقطعي الإلكتروني التصوير على مستوى قريب من الذرة للعضيات والخلايا والجزيئات الكبيرة داخل الأنسجة في عينات بيولوجية بالتبريد. تحقيق هذه الدقة يتطلب ظروف تصوير محكمة للغاية. هنا، باستخدام مجهر إلكتروني ناقل بجهد 200 كيلو فولت مع نظام عدسات مكثف ذو مرحلتين كمثال، نوضح كيفية جمع بيانات التصوير المقطعي الإلكتروني عالي الجودة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

برز التصوير المقطعي بالتبريد والإلكترونات (cryo-ET) كتقنية قوية لتوضيح هياكل العضيات الخلوية ومجمعات البروتينات الكبيرة في بيئاتها الأصلية. على عكس المجهر الإلكتروني التقليدي في درجة حرارة الغرفة، يقلل التجميد من الضرر الناتج عن الإشعاع والتحضير إلى الهياكل الداخلية. علاوة على ذلك، وعلى عكس تحليل الجسيمات المفردة (SPA)، يقلل التجميد من الحاجة إلى التنقية المتكررة، مما يحافظ على أكثر المعلومات الهيكلية أصالة للعينات. لتحقيق تصوير عالي الدقة، يفرض التصوير بالتجميد أيضا متطلبات صارمة على ظروف التصوير في جهاز TEM. على الرغم من التحسن المستمر في كفاءة اكتساب بيانات التجميد وظهور العديد من منصات البرمجيات، فإن معظم الحلول مملوكة للبائع، وخاصة بالبائع، ومرتبطة ارتباطا وثيقا بنماذج المجهر الإلكتروني المحددة، مما يؤدي إلى تكاليف تنفيذ مرتفعة. في هذه الدراسة، قمنا بتثبيت البرنامج مفتوح المصدر SerialEM على مجهر إلكتروني بجهد 200 كيلو فولت (Glacios 2 cryo-TEM) مع نظام عدسات مزدوج المكثف وأجرينا معايرة شاملة لتمكين جمع بيانات مقطعية عالية الجودة. باستخدام الأبوفيريتين كنموذج نموذجي، نصف سير العمل بأكمله - من تحضير عينات البرود إلى جمع بيانات ET بالتجميد الآلي، يليه إعادة بناء التصوير المقطعي وتحليل التصوير الفرعي. تقدم هذه الطريقة حلا فعالا من حيث التكلفة ومتاحا لجمع بيانات التجميد عبر ET، خاصة للمختبرات التي تستخدم مجاهر جلاسيوس التي لا تتوفر فيها برامج خاصة بها.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

برز التصوير المقطعي بالتبريد الإلكتروني (cryo-ET) كتقنية قوية لدراسة البنى الطبيعية للمركبات الجزيئية الكبيرة والعضيات الخلوية في الموقع. ميزة رئيسية للتجميد الجريء مقارنة بتحليل الجسيمات الأحادية (SPA) هي قدرته على تجنب خطوات التنقية المفرطة، مما يحافظ على الحالة الأصلية للجزيئات الحيوية المستهدفة ضمن سياقها البيولوجي. حاليا، يمكن دراسة طيف واسع من العينات — بما في ذلك العضيات المنقاة 1,2,3,4، وصفائح أغشية الخلايا، والمجمعات الجزيئية الكبيرة5، والفيروسات6، والصفائح الخلوية7، وأقسام الأنسجة 8,9,10 — بواسطة ET-التجميد الجليد. نظرا لتنوع أنواع العينات والأهداف التجريبية، تختلف استراتيجيات جمع البيانات بشكل كبير ويجب تكييفها بعناية لكل من العينة وتكوين الجهاز المحدد.

يعد جمع البيانات خطوة حاسمة في سير عمل التجمد وET، حيث تؤثر جودة البيانات وكفاءة الاكتساب بشكل مباشر على المعالجة اللاحقة والنجاح العام للتجربة التجريبية. لتلبية المتطلبات التجريبية المتطورة، تم تطوير عدة منصات لجمع البيانات. من بين أكثر هذه التطبيقات استخداما التصوير المقطعي التجاري وبرنامج SerialEM 11,12,13 مفتوح المصدر. يقدم التصوير المقطعي واجهة متكاملة وسهلة الاستخدام مع منحنى تعلم منخفض، لكنه أقل مرونة ويتطلب رخصة تجارية. على النقيض من ذلك، سيريال إيم هو حزمة مجانية مفتوحة المصدر تدعم سير العمل المعتمد على واجهة المستخدم الرسومية (GUI) وسير العمل المعتمد على السكريبت، مما يوفر مرونة وتوسعة أكبر.

جمع البيانات المموجرافية من الصفائح المجمدة يطرح تحديات فريدة. الصفائح عالية الجودة يصعب تحضيرها، كما أن عدم استقرارها الميكانيكي وحساسيتها العالية للإشعاع الإلكتروني يعقدان جمع البيانات أكثر. لمعالجة هذه التحديات، طور فابيان آيزنشتاين سير عمل PACEtomo14، وهو تحسين ل SerialEM يقدم تحول الصورة الشعاعية لالتقاط عدة صور مصورة في كل سلسلة إمالة، مما يقلل من تكرار التركيز وتعديلات التتبع. تعظم هذه الاستراتيجية كمية البيانات القابلة للاستخدام من كل قسم مع تقليل التعرض غير الضروري للإلكترونات. تتوفر وظيفة مماثلة أيضا في برنامج Tomography5 التجاري.

في المقابل، جمع البيانات من العضيات المثبتة بالتجميد أو صفائح الغشاء يكون أكثر بساطة عموما، حيث يتم تحضير هذه العينات عادة على شبكات كربونية مثقوبة، مما يوفر مساحة واسعة للتركيز والتتبع15,16. في مثل هذه الحالات، توفر سير العمل المدمجة لاستحواذ Cryo-ET في SerialEM - التي يمكن الوصول إليها مباشرة عبر واجهة المستخدم - خيارا مريحا وخاليا من البرمجة النصية، وهو مناسب بشكل خاص للمبتدئين أو المختبرات الصغيرة. ومع ذلك، من منظور الكفاءة، نوصي باستراتيجيات تحريك صورة الشعاع كلما أمكن.

نظرا للتكلفة العالية لمجاهر الإلكترون الكريو، فإن تحسين استراتيجيات جمع البيانات لتعظيم استخدام الأدوات أمر ضروري. يوفر جهاز TEM بجهد 200 كيلو فولت مزود بنظام عدسات مكثف ذو مرحلتين اختراق إلكترونات أقل قليلا للعينات السميكة مقارنة بجهاز 300 كيلوفولت، لكنه يظل قابلا تماما للاستخدام في التجميد الهوائي عند معايرته بشكل صحيح. ومع ذلك، فإن نطاق ظروف الشعاع المتوازي الضيق نسبيا وحجم البقعة الثابت عبر التكبيرات يجعله أقل ملاءمة عموما للتجميد عالي الدقة ما لم يكن النظام محسنا بدقة.

نظام المجهر الإلكتروني لدينا مجهز بكاميرا فالكون 4i للكشف المباشر عن الإلكترونات، والتي توفر مزايا كبيرة في قدرة العد بإلكترون واحد والتصوير المستمر عالي السرعة. للاستفادة الكاملة من أداء هذا الكاشف، يجب تشغيل TEM في ظروف تصوير محسنة جيدا. بالنسبة لأجهزة TEM التي تستخدم نظام مكثف ذو مرحلتين، فإن المعايرة الدقيقة لظروف الإضاءة للضوء المتوازي تعد عاملا مهما في تحسين جودة التصوير 17,18. في أنظمة المكثفات الحديثة ذات المرحلتين، يجب أن تتزامن نقطة التركيز لعدسة المكثف في المرحلة الثانية مع المستوى البؤري الأمامي للعدسة العلوية لضمان أن يكون المسار البصري المتقاطعة مع مستوى العينة متوازيا. تعد ظروف الضوء المتوازية المحددة، وذلك ضروريا، لضمان بقاء قيم الإضاءة المنخفضة والتكبير متسقة في المواقع المحلية في الصور المجمعة.

في هذه الدراسة، ركزنا على إنشاء سير عمل عالي الجودة للتجميد باستخدام الأبوفيرتين كنموذج نموذجي. نظرا لأن نظام المجهر الإلكتروني الناقل بجهد 200 كيلوفولت غير مرخص لبرنامج التصوير المقطعي التجاري، قمنا بتثبيت ومعايرة منصة SerialEM مفتوحة المصدر بدلا من ذلك. من خلال تحسين معلمات الشعاع المتوازي بعناية لنظام عدسات المكثف ذو المرحلتين في المجهر، حققنا جمع بيانات التصوير الموجه الآلي عبر واجهة SerialEM الرسومية - دون الحاجة إلى سكريبتات بايثون أو تكوين معقد. يوفر هذا النهج حلا سهل الاستخدام وفعالا من حيث التكلفة لجمع بيانات التجميد الكهربائي الفعال على أجهزة 200 كيلوفولت مثل ال Glacios.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير وتحميل عينات التبريد

  1. لتحضير فيتروبوت، قم بتشغيله واضبط درجة الحرارة على 10 درجات مئوية. اضبط الرطوبة على 100٪. استبدل ورق الفلتر.
  2. ضع شبكة كمومية من ورق الكربون مكون من 300 شبكة R1.2/1.3 في نظام تفريغ التوهج. اضبط ظروف التفريغ التوهج على 15 مللي أمبير لمدة 60 ثانية مع ضغط فراغ 0.39 مللي بار، شحنة سالبة. قم بتفريغ التوهج لتحويل سطح الشبكة.
  3. اضبط معايير فيتروبوت كما يلي: زمن البقعة: 3 ثوان، وقت الانتظار: 0 ثانية، قوة البقعة: 2، درجة الحرارة: 8 درجات مئوية، الرطوبة: 90٪.
  4. حضر الإيثان السائل في كوب إيثان ملفوف بالنيتروجين السائل عن طريق التبريد بالنيتروجين السائل.
  5. ضع 3 ميكرولتر من عينة الأبوفيرتين على شبكة التفريغ المتوهج. قم فورا بتزجيج العينة في مادة الإيثان السائل
  6. انقل العينة من الإيثان إلى صندوق تخزين مبرد مسبقا في النيتروجين السائل. تم الآن الانتهاء من تحضير العينة بالتجميد.
    تحذير: يجب اتباع بروتوكولات السلامة التالية بدقة عند التعامل مع النيتروجين السائل والإثان: يلزم استخدام معدات الحماية الشخصية (مثل القفازات المبردة والنظارات الواقية) لمنع قضمة الصقيع أثناء العمليات؛ قبل تكثف الإيثان، تأكد من أن كوب الاستقبال خال من النيتروجين السائل لتجنب الرش الناتج عن الغليان السريع؛ بعد الاستخدام، يغلق الصمامات الرئيسية وصمامات تنظيم الضغط في نظام غاز الإيثان لمنع التسرب؛ يجب التخلص من بقايا الإيثان والنيتروجين السائل في معدات التهوية المخصصة داخل غرفة التحضير بعد تحضير العينة.

2. تحديد ظروف الضوء المتوازي للمجهر الإلكتروني

  1. قبل تنفيذ محاذاة الشعاع المتوازي، قم أولا بضبط المعلمات التالية في المنظار: المرحلة على ارتفاع غير مركزي، عدسة الهدف عند التركيز، ميل شعاع nP ppX/ppY، نقطة محور خالية من الغيبوبة X/Y، غيبوبة، وستيجما.
  2. باستخدام شبكة متقاطعة، تأكد من أن العينة على ارتفاع غير مركزي وبتركيز مناسب بتكبير SA 73,000× (بدون مرشح طاقة) في وضع المجس النانو.
  3. التحول إلى وضع الحيود (طول الكاميرا: D750 مم) وأدخل فتحة العدسة الموضوعية 100 ميكرومتر (الشكل 1A، 1B).
  4. انقر على تبويب التعديل لفتحة الهدف واستخدم مقابض X و Y متعددة الوظائف لتحريك فتحة الهدف خارج المركز بحيث تتداخل حافة الفتحة مع حلقات الحيود الذهبية وتغطي جزئيا البقعة المركزية (الشكل 1C).
  5. أظهر مستوى البؤرة الخلفي للعدسة الموضوعية عن طريق ضبط تركيز الحيود باستخدام مقبض التركيز حتى يصبح حافة فتحة العدسة الموضوعية حادة قدر الإمكان (الشكل 1D).
  6. اضبط شدة الشعاع (قوة C2) حتى يتم تقليل عرض حلقات الحيود الذهبية.
  7. مركز فتحة العدسة الهدفية. زد طول كاميرا الحيود حتى يصبح البقعة المركزية مرئية فقط (الشكل 1E).
  8. انقر على تبويب الحيود في لوحة Stigmator واستخدم مقابض X و Y متعددة الوظائف لضبط شكل النقطة المركزية أثناء الدوران فوق وتحت نقطة التقاطع لجعل الشعاع دائريا (الشكل 1F).
  9. اضبط شدة الشعاع حتى يتم تقليل النقطة المركزية. هذا سيخلق ظروف إضاءة متوازية. نظرا لأن ظروف الإضاءة المتوازية قد تختلف حسب أحجام البقع المختلفة، قم بتوثيق إعدادات C2 المقابلة لكل حجم بقعة شائع الاستخدام لتسهيل التكوين السريع خلال التجارب المستقبلية.
    ملاحظة: حجم النقطة المستخدم أثناء جمع البيانات يعتمد على التكبير وإعداد فتحة C2؛ نحتاج إلى التأكد من أن التصوير يتم بأفضل معدل جرعة للكاميرا.

3. جمع بيانات التصوير المقطعي الإلكتروني عالي الجودة لعينات الأبوفيرتين

ملاحظة: يوضح هذا القسم إجراء موحد لجمع البيانات المقطعية عالية الإنتاجية، مناسب لكل من المستخدمين ذوي الخبرة والباحثين الجدد.

  1. لقص الشبكة وتحميل عينة التجميد المحضرة في المجهر الإلكتروني، ضع الحلقة في أداة المحاذاة، مع وضع الشبكة المحضرة في مركز الحلقة O. استخدم قلم الزنبرك لتثبيت حلقة C على حلقة O، وتثبيت العينة بينهما.
  2. أدخل الأوتوغرايد عموديا في فتحة الكاسيت، ثم انقله إلى الكوب النانوي عبر محطة العمل، ثم حملها في المجهر الإلكتروني.
  3. لالتقاط مونتاج كامل للشبكة بأكملها باستخدام SerialEM، قم بتشغيل برنامج SerialEM. فعل وضع الجرعة المنخفضة. حدد وضع البحث عند تكبير 115×.
    ملاحظة: يستخدم تكبير البحث عادة للحصول على خرائط ذات مساحة كبيرة. يتم ضبط هذا التكبير على أدنى مستوى ممكن لتسريع عملية الخرائط، مع ضمان دقة خياطة الصورة.
  4. افتح ملف الملاح. اذهب إلى Navigator > Montaging & Grids > قم بإعداد مونتاج كامل. في مربع الحوار، قم بتعيين استخدام وضع البحث؛ احفظ الصور بصيغة bin4. انقر على ابدأ تحت ضوابط المونتاج.
  5. لمعايرة حقول البحث والعرض، في وضع البحث، حدد موقعا واضحا جدا (الشكل 2A). انقر على إضافة علامة في الملاح. انقر على "اذهب إلى العلامة " للانتقال إلى موقع العلامة.
  6. انتقل إلى وضع العرض (2600×) وابحث عن نفس المعلم. انقر على المعلم. اذهب إلى Navigator، ثم اضغط Shift to Marker لمحاذاة الحقول (الشكل 2B). باتباع التعليمات في مربع الحوار، يتم تعيين إزاحات الشعاع من كلا التكبيرين لجميع العلامات في خريطة البحث، وتحفظ قيم الإزاحة (الشكل 2C).
    ملاحظة: عادة ما يتم ضبط تكبير العرض على أدنى تكبير في المنطقة المحددة (SA) لضمان أن العرض والسجل في نفس الوضع، مما يسهل عملية التمركز أثناء تبديل التكبير.
  7. لمعايرة حقول العرض والتسجيل (الشكل 3). في وضع العرض، حدد موقعا واضحا جدا. انتقل إلى وضع التسجيل (120k×). استخدم الفأرة لمركز المعلم في وضع التسجيل.
    ملاحظة: إعداد تكبير السجل يعتمد على دقة الهدف المقدرة (حيث تكون دقة الهدف ضعف حجم البكسل) وحجم العينة.
  8. عد إلى وضع العرض والتقط صورة. اسحب الجسم المستهدف تحت تكبير العرض إلى مؤشر التصويب الذي يمثل مركز مجال الرؤية باستخدام زر الفأرة الأيمن.
  9. انقر على Set بجانب Shift في قسم إزالة التركيز لمحاذاة الحقول.
  10. لاختيار مربع الهدف والتقاط خريطة متوسطة التكبير ، 5.1 في المونتاج الكامل، انقر على إضافة مضلع لتحديد المنطقة المراد التقاطها. بعد تحديد المنطقة، انقر على إيقاف الإضافة لإنهاء الاختيار.
  11. كرر الخطوة 3.10 لجميع المناطق المطلوبة. لكل مضلع في الملاح، تحقق من خيارات الحصول (A) وملف جديد عند العناصر.
  12. في مربع الحوار الذي يظهر بعد اختيار ملف جديد في العنصر، اختر التالي: صور مونتاجية؛ تركيب مونتاج إلى مضلع؛ أغلق الملف عندما يفترض فتح الملف الجديد التالي. اضغط موافق.
  13. في مربع الحوار الجديد، اختر التالي: نقل المرحلة بدلا من تغيير الصورة؛ استخدم معايير العرض في وضع الجرعة المنخفضة. احفظ الصورة في الموقع المحدد.
  14. لالتقاط خريطة التكبير المتوسط، في قائمة الملاح، اضغط على الحصول عند العناصر. تحقق من الخيارات التالية: الحصول على صورة أو مونتاج وحفظه؛ اصنع خريطة الملاح.
  15. في قسم الإجراء الأساسي، تحقق من وضع استخدام العرض لالتقاط الصور. في قسم المهام قبل أو بعد المرحلة الابتدائية، تحقق من المركز الأولي الأولي. انقر على GO لبدء التقاط خريطة التكبير المتوسط.
  16. لاختيار نقاط على خريطة التكبير المتوسط. افتح خريطة التكبير المتوسط في واجهة Navigator. انقر على إضافة نقطة ثم انقر بزر اليسار على الكائنات المستهدفة في الخريطة.
  17. كرر ذلك للحصول على جميع النقاط المطلوبة. بعد اختيار جميع النقاط، اضغط على إيقاف الإضافة لإنهاء الاختيار.
  18. لمحاذاة الفتحة، استخدم المحاذاة المباشرة في واجهة المجهر لضبط إمالة الشعاع nP ppX/ppY ونقطة المحور الخالية من الغيبوبة X/Y، مما يقلل من اهتزاز نقطة الشعاع في مجال الرؤية.
  19. نفذ نطاق النغمة باستخدام سكريبت من مكتبة سكريبت SerialEM (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47).
  20. لبدء جمع بيانات التصوير المقطعي، في واجهة الملاح، حدد العائد على الاستثمار وتحقق من سلسلة الميول. في مربع الحوار، اختر صور الإطارات؛ اختر موقع تخزين البيانات.
  21. في حوار الإعدادات، اضبط نطاق درجات من -50° إلى 50°. اضبط زيادة القاعدة إلى 2.5°، وزاوية البداية إلى 0°، وفعل مخطط الجرعة المتماثل.
    ملاحظة: إعدادات الجرعة لكل ميل، ونطاق زاوية الإمالة، وخطوة الإمالة تتبع عموما المبادئ الموضحة أدناه: يتم الحفاظ على الجرعة الإجمالية عند حوالي 100 إلترح/أوغو مربع. يتم اختيار نطاق الإمالة لضمان بقاء العينة إلى حد كبير دون عوائق حتى عند أعلى زاوية إمالة، مما يسمح بنقل وتصوير إلكترونيات كافية. إذا كان نطاق الميل كبيرا نسبيا (مثلا أكثر من ±60°)، يمكن ضبط خطوة الإمالة على 3°. بالنسبة لنطاق ميل أصغر (مثلا حوالي ±50°)، يمكن تقليل خطوة الإمالة إلى 2.5° أو 2° لضمان بقاء الجرعة الكلية حوالي 100 e⁻/Ų. وهذا مهم بشكل خاص في مجاهر 200 كيلو فولت، حيث يكون تلف الإشعاع أكثر وضوحا مقارنة بمجاهر 300 كيلو فولت، مما يجعل من الضروري تجنب الجرعة الكلية المفرطة.
  22. في قسم التحكم في شدة الشعاع أو التعريض، تحقق من الحفاظ على شدة الشعاع. اضبط هدف إزالة التركيز على -3 ميكرومتر واضبط تردد التركيز التلقائي على مرة واحدة لكل ميل.
  23. تحقق من التوقف إذا كان المحاذاة التلقائية تتغير بأكثر من 60٪ من حجم الصورة، وقم بتعيين تتبع قبل وبعد.
  24. لبدء جمع البيانات، في Navigator، اضغط على الحصول على العناصر (Items). في الإجراء الأساسي، تحقق من هدف إعادة التركيز في دورة التركيز التلقائي، انتظار الانحراف، وTS.
  25. اضبط نطاق إزالة التركيز من -3.5 إلى -4.5 ميكرومتر، على 4 خطوات. تحت القسم العام، قم بتفعيل إغلاق صمامات الأعمدة في الطرف. في قسم المهام قبل أو بعد الأساسي، قم بتمكين إعادة المحاذاة إلى العنصر وقم بدقة بالمركزية الزائدة قبل الأساسي.

4. المتوسط الفرعي للأبوفيرتين

  1. قم بتصحيح الحركة وتقدير CTF باستخدام Warp19. إجراء محاذاة الميل المقطعي باستخدام AreTomo320.
  2. تنفيذ إعادة بناء التصوير المقطعي وفك الالتفاف باستخدام الالتواء. قم باختيار الجسيمات المعتمدة على القوالب باستخدام PyTom21.
  3. قم بإجراء التحسين الأولي باستخدام RELION 522. إجراء تحسين عالي الدقة باستخدام M23.
  4. تحديد الهيكل النهائي بمعالجة ثماني سلاسل ميل، تليها اختيار 5,939 جسيما وتحسين تكراري، محققا دقة نهائية قدرها 2.8 أونغروميت (الشكل 4).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد محاذاة دقيقة للشعاع المتوازي، أجرينا جمع بيانات التصوير المقطعي للأبوفيرتين باستخدام وظيفة الواجهة الرسومية ل SerialEM. أسفرت المعالجة اللاحقة باستخدام Warp وAreTomo وPyTom وRELION وغيرها من البرامج ذات الصلة عن بنية نهائية بدقة 2.8 أنجلوست. تظهر هذه الدقة بشكل كاف الجودة العالية لبياناتنا، حيث وصلت إلى مستوى يمكن تحقيقه حاليا بواسطة التصوير الفرعي بمتوسط دقة عالية نسبيا. كما هو موضح في الشكل 4، تظهر النتائج المحذفة والمعاد بناؤها (الشكل 4A) بوضوح البنية العامة والتوزيع المكاني للأبوفيريتين. تم إجراء المتوسط الفرعي على جسيمات مستخرجة من ثماني سلاسل ميل محاذية ومعاد بناؤها، مما أدى إلى بناء بدقة 2.8 أنغوستروم (الشكل 4B). منحنى ارتباط صدفة فورييه (FSC) المقابل معروض في الشكل 4C.

figure-results-1
الشكل 1: تحديد حالة الإضاءة المتوازية باستخدام نظام عدسات المكثف الثاني. (أ) نمط الحيود في وضع الحيود بدون فتحة. (ب) نمط الحيود بعد إدخال فتحة هدف بحجم 100 ميكرومتر. (ج) إزاحة الفتحة من مركز الحيود لرؤية حدة الحواف بشكل أفضل. (د) حافة فتحة العدسة المركزة وحلقات الحيود المحسنة عن طريق ضبط تيارات العدسة الموضوعية وC2. (ه) نقطة الحيود المركزية البيضاوية التي تتطلب تصحيحا عبر لوحة الستيجماتور. (و) نقطة الحيود المركزية الدائرية والمصغرة التي تشير إلى تحسين الإضاءة المتوازية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: عملية محاذاة التكبير من العالي إلى المنخفض من البحث (115×) إلى العرض (2600×). (أ) صورة وضع البحث مع وضع العلامة (السهم الأحمر) على حافة الثقب. (ب) عرض صورة وضع العلامة (السهم الأحمر) موضوعة في نفس موقع الكائن كما في (أ). يتم النقر على خيار التحويل إلى العلامة في الملاح. (ج) في نافذة المنبثقة، يتم تعيين إزاحات الشعاع من كلا التكبيرين لجميع العلامات في خريطة البحث، ويتم حفظ قيم الإزاحة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: عملية محاذاة التكبير من العالي إلى المنخفض من العرض (2600×) إلى السجل (120k×). (أ) في وضع التسجيل، يكون الجسم المستهدف في مركز مجال الرؤية (دائرة حمراء متقطعة تبرز الكائن المستهدف). (ب) صورة ملتقطة في وضع العرض، حيث لا يتوافق الجسم المستهدف مع مؤشر التصويب الأحمر (دائرة متقطعة بخط حمراء تبرز الجسم الهدف وعلامة التصويب الحمراء). (ج) يتم سحب الكائن المستهدف إلى مركز مؤشر التصويب الأحمر عن طريق النقر بزر الفأرة الأيمن وتحريكه، ثم الضغط على زر التعيين الموجود بجانب زر التحول (يبرز الزر مربع متقطع أحمر). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: تحديد بنية الأبوفيريتين. (أ) التصوير الهيكلي. خريطة الدقة المحلية لمتوسط التصوير الفرعي النهائي. يبدو الملمس موحدا، مع ميزات نانوية مرتبة ومتكررة عبر مجال الرؤية بأكمله. (ب) الرسم الكمي المحلول مكانيا. خريطة دائرية بلون زائف لنفس المنطقة أو منطقة نانوية ذات صلة. تتراوح الألوان من الأزرق/الأخضر إلى الأصفر/الأحمر، والتي تتوافق مع القيم الرقمية المعروضة على مقياس الألوان أدناه (حوالي 2.5 إلى 3.5 بوحدات عشوائية). يشير توزيع الألوان غير المتجانس إلى التغير المكاني في خاصية مقاسة (على سبيل المثال، الارتفاع، السمك، معامل الانكسار، أو الاستجابة الميكانيكية/البصرية) عبر العينة. (ج) التوصيف الطيفي أو الوظيفي الشامل. منحنى ارتباط القشرة فورييه (FSC) المستخدم في تقدير الدقة. الدقة النهائية 2.8 Å تشير إلى الخط المتقطع عند FSC = 0.143. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجب تكييف إجراءات تحضير العينات بالتجميد وجمع بيانات التصوير المقطعي الإلكتروني لتناسب نوع العينة المحدد. الاستراتيجية التجريبية الموضحة هنا مناسبة جدا للجزيئات الكبيرة البيولوجية، ومجمعات البروتين، والعضيات الصغيرة. يمكن تزجيج هذه العينات مباشرة على شبكات الكهرباء الكهرومغناطيسية، وضمنها سمكها الصغير نسبيا يؤدي إلى انتقال إلكترونيات فعال والحصول على صور عالية التباين. من الناحية المثالية، يجب ألا يتجاوز سمك العينة 200 نانومتر.

بالنسبة للعينات المجمدة بالغوص، يفضل عموما البعد العرضي الإضافي أقل من 10 ميكرومتر لتقليل تكوين الجليد البلوري، مما قد يضر بسلامة الهيكل. بالنسبة للعينات الأكبر، يمكن أن يؤدي التجميد عالي الضغط أو إضافة مواد الحماية بالتجميد مثل الجلسرول إلى المخزن إلى تأخير تكوين نوى الجليد23. ومع ذلك، لتلبية متطلبات السماكة في TEM، غالبا ما يكون من الضروري زيادة الترقيق. من بين طرق التخفيف المتاحة، يعد طحن شعاع الأيون المركز (FIB)24الأكثر اعتمادا بسبب دقته وضرره الطفيف، مما ينتج صفائح مناسبة للتجميد عالي الدقة.

أثناء جمع بيانات الصفائح، من الضروري تعظيم استخدام اللاميلا. يمكن أن يقلل تطبيق اكتساب تحويل الصورة الشعاعية من الحاجة إلى تكرار التركيز وخطوات التتبع، مما يزيد من سرعة جمع البيانات. على الرغم من عدم شرحها بالتفصيل هنا، إلا أن هذه التقنية قد وصفت بشكل موسع في منهجية PACEtomo.

حاليا، تشمل الخيارات البرمجية الشائعة لجمع بيانات التصوير المقطعي (Thermo Fisher Scientific) وSerialEM. التصوير المقطعي هو حل تجاري محدود في التخصيص، بينما SerialEM، الذي طوره ديفيد ماسترونارد في جامعة كولورادو بولدر، هو برنامج مفتوح المصدر يدعم الأتمتة القائمة على السكريبت. ومع ذلك، يتطلب الاستفادة الكاملة من قدرات SerialEM منحنى تعلم كبير. في هذه الدراسة، نقدم سير عمل مبسط يستفيد من واجهة SerialEM الرسومية، مما يلغي الحاجة إلى البرمجة البرمجية أو التكوينات المعتمدة على بايثون مع تمكين جمع البيانات الليلة دون مراقبة.

من التحديات الشائعة التي تواجهها أثناء جمع البيانات المقطعية باستخدام هذه الطريقة التتبع غير الدقيق، مما قد يؤدي إلى سلاسل ميلان غير مكتملة مع زوايا مفقودة أو يعقد المحاذاة اللاحقة. للتخفيف من هذه المشكلات، يجب تحسين معلمات التتبع بناء على تباين العينة وثبات مرحلة الإمالة. تشمل الاستراتيجيات الفعالة ضبط زمن التعريض في مواقع التتبع لضمان وضوح الصورة، والفصل الفعلي بين مواقع التتبع والتركيز لتقليل الضرر التراكمي للإشعاع، وتقليل تكبير التتبع عندما يكون استقرار المرحلة ضعيفا لتسهيل مطابقة الأنماط بشكل موثوق. معا، تعد هذه التعديلات ضرورية لتحقيق أداء تتبع قوي عبر ظروف تجريبية متنوعة. في هذا العمل، نستخدم الأبوفيرتين كنموذج نموذجي. تحت فرضية اختبار وتصحيح الضوء المتوازي، نستخدم الوظائف المدمجة في SerialEM لجمع بيانات عالية الجودة ل ET بالتجميد وإجراء حسابات تحت التوموغرام على عينات الفيريتين، مما يحصل في النهاية على البنية النهائية عند 2.8 أنغسترومتر.

تم تطوير هذه الطريقة لتوسيع تطبيق المجاهر الإلكترونية بجهد 200 كيلوفولت على مجاهر التجميد عالية الدقة. تحقيق هذه الدقة يعتمد بشكل أساسي على الحصول على بيانات تصوير عالية الجودة، والتي تتطلب بدوره ظروف إضاءة دقيقة. لهذا الغرض، قمنا بمحاذاة إضاءة متوازية دقيقة كخطوة تحضيرية حاسمة. تم تصميم إجراء المحاذاة الموضح هنا خصيصا لأجهزة TEM المجهزة بنظام عدسات مكثفين، مثل Thermo Fisher Scientific Talos Arctica وGlacios. على عكس الأجهزة التي تحتوي على عدسة مكثف ثالثة (C3)، تقيد هذه الأنظمة شرط الإضاءة المتوازية بقيمة إثارة محددة واحدة لعدسة C2. هذا القيد المتأصل يتطلب محاذاة دقيقة للغاية لشعاع الإلكترونات لوضع الصورة المصدر في المستوى البؤري الأمامي للعدسة العلوية - وهو شرط أساسي لأداء تصوير مثالي. تظهر نتائج معالجة البيانات اللاحقة أنه، بعد هذا المحاذاة، فإن جودة جمع البيانات التي تم تحقيقها باستخدام هذا المجهر بجهد 200 كيلو فولت للعينات المختبرة تكاد تكون مماثلة لتلك المتوقعة عادة من جهاز بجهد 300 كيلوفولت.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن ممتنون لمنشأة Cryo-EM في مركز العلوم الصحية بجامعة بكين لتوفير هذه الأجهزة. وقد دعم هذا العمل البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2023YFC2705902)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في جمهورية الصين الشعبية (32470880 و 32500722 و 32500737)، ومؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (7262143)، والمشاريع السريرية الرئيسية لمستشفى بكين الثالث (BYSYZD2023033)، ومشروع الطب السريري بالإضافة إلى علماء إكس-يونغ في جامعة بكين (PKU2025PKULCXQ037)، والمركز الوطني للأبحاث السريرية للتوليد وأمراض النساء (جامعة بكين الثالثة مستشفى (BYSYSZKF2023019).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
شبكة ANTCryoTM nitiناجينغدينغشين M04240922Aيستخدم في تحضير عينات التجميد
الأبوفريتينبيورتوسBP17854-00Aيستخدم في تحضير عينات التجميد
شبكة الشبكات المتقاطعةأجار ساينتيفكAGS106يستخدم لتحديد ظروف الضوء المتوازي
غلاسيوس2ثيرمو فيشر9959084يستخدم لجمع بيانات التومو
ورق فلتر رقم 2، 55 ممواتمان10311807ورق المسح
توهج PELCOتيد بيلا91000-01020يستخدم لتفريغ التوهج
شبكة التيار السائق الكميالكومانتيفولايدN1-C14nCu30-01يستخدم في تحضير عينات التجميد
فيتروبوت مارك IV ثيرمو فيشر230101164يستخدم في تحضير عينات التجميد

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zheng, W., Chai, P., Zhu, J., Zhang, K. High-resolution in situ structures of mammalian respiratory supercomplexes. Nature. 631 (8019), 232-239 (2024).
  2. Wang, C., et al. Structure and topography of the synaptic V-ATPase-synaptophysin complex. Nature. 631 (8022), 899-904 (2024).
  3. Mühleip, A., et al. ATP synthase hexamer assemblies shape cristae of Toxoplasma mitochondria. Nat Commun. 12 (1), 120(2021).
  4. Mühleip, A., et al. Structural basis of mitochondrial membrane bending by the I-II-III2-IV2 supercomplex. Nature. 615 (7954), 934-938 (2023).
  5. Huang, Y., Zhang, Y., Ni, T. Towards in situ high-resolution imaging of viruses and macromolecular complexes using cryo-electron tomography. J Str Biol. 215 (3), 108000(2023).
  6. Yao, H., et al. Molecular architecture of the SARS-CoV-2 virus. Cell. 183 (3), 730-738.e13 (2020).
  7. Schuller, A. P., et al. The cellular environment shapes the nuclear pore complex architecture. Nature. 598 (7882), 667-671 (2021).
  8. Cheng, A., et al. High-resolution single-particle cryo-electron microscopy using beam-image shift. J Struct Biol. 204 (2), 270-275 (2018).
  9. Xu, J., et al. In situ structural insights into the excitation-contraction coupling mechanism of skeletal muscle. Sci Adv. 10 (12), eadl1126(2024).
  10. Creekmore, B. C., Kixmoeller, K., Black, B. E., Lee, E. B., Chang, Y. W. Ultrastructure of human brain tissue vitrified from autopsy revealed by cryo-ET with cryo-plasma FIB milling. NatComm. 15 (1), 2660(2024).
  11. Mastronarde, D. N. SerialEM: Software for automated microscopy (Version 4.0). , University of Colorado Boulder. https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ (2020).
  12. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J Struct Biol. 152, 36-51 (2005).
  13. Mastronarde, D. N. SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position. Microsc Microanal. 9 (S2), 1182CD(2003).
  14. Eisenstein, F., et al. Parallel cryo electron tomography on in situ lamellae. Nat Meth. 20 (1), 131-138 (2023).
  15. Wan, W., et al. Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid. Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).
  16. Li, S., et al. Acidic pH-Induced Conformations and LAMP1 Binding of the Lassa Virus Glycoprotein Spike. PLoS Pathog. 12 (2), e1005418(2016).
  17. Eyidi, D., Hebert, C., Schattschneider, P. Short note on parallel illumination in the TEM. Ultramicroscopy. 106, 1144-1149 (2006).
  18. Glaeser, R. M., Typke, D., Tiemeijer, P. C., Pulokas, J., Cheng, A. Precise beam-tilt alignment and collimation are required to minimize the phase error associated with coma in high-resolution cryo-EM. J Struct Biol. 174, 1-10 (2011).
  19. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Meth. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  20. Zheng, S., et al. AreTomo: An integrated software package for automated marker-free, motion-corrected cryo-electron tomographic alignment and reconstruction. J Struct Biol X. 6, 100068(2022).
  21. Hrabe, T., et al. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. J Struct Biol. 178 (2), 177-188 (2012).
  22. Burt, A., et al. An image processing pipeline for electron cryo-tomography in RELION-5. FEBS Open Bio. 14 (11), 1788-1804 (2024).
  23. Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nat Meth. 18 (2), 186-193 (2021).
  24. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (12), 4449-4454 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryo Electron TomographyTomographic Data CollectionTransmission Electron MicroscopeDual Condenser LensSerialEM SoftwareCryo Sample PreparationTomogram ReconstructionSub Tomogram AnalysisApoferritin ModelHigh Resolution Imaging

Related Articles