إجراء مرن لأداء أسماك التيلومير والتألق المناعي في الخلايا التي تعبر عن البروتينات الفلورية

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة للجمع بين أسماك التيلومير (الأصلية أو المتناسخة) مع التألق المناعي و / أو تصور بروتين الفلورسنت.

الملخص

لطالما كان تصور التيلوميرات باستخدام التهجين الفلوري في الموقع (TelFISH) أداة أساسية في تجارب بيولوجيا التيلومير. يعد الجمع بين TelFISH والتألق المناعي (IF) أيضا طريقة راسخة (IF-TelFISH) ، على سبيل المثال ، في تحديد البؤر الناجمة عن الخلل الوظيفي في التيلومير ، حيث يتم توطين التيلوميرات بشكل مشترك مع 53BP1. في الآونة الأخيرة ، أصبحت أسماك التيلومير الأصلية (nTelFISH) أداة مهمة لفحص الإطالة البديلة للتيلوميرات ، وهي آلية صيانة التيلومير المستخدمة في بعض الخلايا السرطانية. يعد التعبير عن البروتينات الفلورية أيضا أداة أساسية في بيولوجيا الخلية ، مما يسمح بتصور البروتينات والهياكل التي قد تظل غير قابلة للاكتشاف بطرق أخرى. نظرا لأن مخازن FISH المؤقتة تفسد البروتينات ، فإن إجراء الفحص في الخلايا ذات البروتين الفلوري المعبر عنه (FP) يؤدي إلى فقدان إشارة FP. طريقة لدمج IF و telomere FISH في الخلايا مع بروتين فلوري معببر يحافظ على إشارة FP حتى بعد وصف FISH هنا. يتم توفير بدائل لتغيير طبيعة أسماك التيلومير وأسماك التيلومير الأصلية بالاقتران مع العديد من سيناريوهات IF و FP. مجتمعة ، يوفر هذا البروتوكول إطارا مرنا لاستكشاف بيولوجيا التيلومير في كل من الخلايا الطبيعية والسرطانية.

المقدمة

يجب أن تتعامل الكائنات الحية ذات الكروموسومات الخطية مع مشكلتين. أولا ، بسبب مشكلة النسخ المتماثل النهائي ، تتآكل نهايات الكروموسومات قليلا في كل مرة يتم فيها تكرار الحمض النووي. ثانيا ، يجب أن تكون الخلايا قادرة على التمييز بين نهايات الحمض النووي الطبيعية وفواصل الحمض النووي. تطورت التيلوميرات كحل لهذه المشاكل. من خلال عمل البروتين النووي الريبي تيلوميراز ، يتم إطالة الكروموسومات عن طريق إضافة التكرارات الترادفية القصيرة - TTAGGG في البشر. ترتبط هذه التكرارات بمركب المأوى ، الذي يخفي نهاية الكروموسوم عن آلية إصلاح تلف الحمض النووي الخلوي¹. تؤدي التيلوميرات القصيرة أو المختلة وظيفيا إلى الشيخوخة الخلوية والأنماط الظاهرية للشيخوخة² ، في حين أن الهروب من أزمة التيلومير يعد معلما رئيسيا في تكوين الأورام³. لهذه الأسباب ، تحظى بيولوجيا التيلومير بأهمية خاصة في فهم صحة الإنسان ومرضه.

لطالما كان تهجين التيلومير الفلوري في الموقع (FISH) طريقة مهمة لتصور التيلوميرات في خلايا الطور البيني أو انتشر الطور⁴. لعقود من الزمان ، تم إقران التيلومير FISH بتلوين التألق المناعي 53BP1 (IF) لتحديد البؤر الناجمة عن الخلل الوظيفي في التيلومير (TIFs) ، وهي علامة على التيلوميرات المختلة وغير المغطى^5،6. وبالمثل ، فإن السمة المميزة للأورام التي تستخدم الإطالة البديلة للتيلوميرات (ALT) لصيانة التيلومير هي ارتباط التيلوميرات بأجسام PML النووية لتشكيل أجسام PML المرتبطة ب ALT أو APBs⁷. يمكن فحص APBs عن طريق إقران أسماك التيلومير مع تلطيخ PML IF. وبالتالي ، فإن IF-FISH هي أداة راسخة في بيولوجيا التيلومير.

هنا ، تم توسيع استخدام IF-FISH بطريقتين. أولا ، يتم إجراء IF-FISH على الخلايا ذات البروتينات الفلورية المعبر عنها (FP). أصبح التعبير عن البروتينات الموسومة بالفلورسنت أداة منتشرة في كل مكان في بيولوجيا الخلية. قد يكون التعبير عن بروتين موسوم هو الخيار الوحيد لتصور البروتين الذي لا توجد له أجسام مضادة جيدة. على سبيل المثال ، يكشف كروموجسم الأكتين النووي المعبر عنه الموسوم ب GFP (nAC-GFP) عن ديناميكيات الأكتين^{النووي 8}. فتح هذا الكاشف فرصا جديدة في استكشاف الأكتين النووي ، والذي كان يعتبر ذات يوم موضوعا مثيرا للجدل. في حين أن FPs مثل GFP و mCherry عادة ما تحافظ على نشاط التألق بعد التثبيت ، فإن الفورماميد في مخازن تهجين FISH سيجعلها مظلمة⁹. للتحايل على هذه المشكلة ، يقدم هذا البروتوكول ابتكار "معزز" مضاد ل FP الموسوم بالفلوروفور في الخطوة الثانوية من تلطيخ IF. لا يتأثر سطوع الفلوروفور بالفورماميد ، مما يسمح بأسماك IF-FP.

ثانيا ، يتم إجراء IF بالاقتران مع Native Telomere FISH (nTelFISH) ، وهو تشخيص مهم لحالة ALT. عند تغيير طبيعة FISH ، يجب على المرء استخدام بعض الطرق لإذابة خيوط الحمض النووي¹⁰ (على سبيل المثال ، الحرارة أو القلويات) ، مما يسمح بوصول المسبار إلى الحمض النووي الذي عادة ما يكون مزدوج الشريطة. في المقابل ، لا تتضمن FISH الأصلية خطوة تغيير الطبيعة ، لذلك يمكن للمسبار الوصول فقط إلى الحمض النووي الذي تقطعت به السبل بالفعل. يكتشف التيلومير الأصلي FISH على وجه التحديد تكرارات التيلومير أحادية الشريطة على شكل حرف C ، وهي سمة مميزة أخرى ل ALT في الخلايا^{السرطانية 11،12}. يتيح لنا اقتران هذا الاختبار مع تلطيخ IF-FP معالجة أسئلة جديدة في فهم آلية ALT ، والتي تعتبر الآن مرشحا قويا لعلاجات الأورام المستهدفة.

يمكن استخدام البروتوكول الموضح هنا بأسلوب "اختر مغامرتك الخاصة" لتلطيخ أي مزيج من IF و FP وأسماك التيلومير الأصلية أو المتغيرة للطبيعة. نظرا لأن البروتوكول قابل للتكوين بدرجة كبيرة ، يمكن أن يختلف التوقيت بشكل كبير. بشكل عام ، مطلوب وقت عملي في أربعة أيام ، ولكن هذه الأيام قد لا تكون متسلسلة. وترد تقديرات الوقت اللازم لإكمال سير عمل نموذجي لتغيير طبيعة FISH في الشكل 1. لا يلزم تهجين الأسماك الأصلية بين عشية وضحاها ، لذلك يمكن للمرء أن يقضي على خطوة بين عشية وضحاها (الجمع بين اليوم 2 واليوم 3) إذا كان من الممكن قضاء يوم طويل على مقاعد البدلاء.

يستوعب المجهر متحد البؤر النموذجي تصوير أربع قنوات ملونة: تقريبا ، الأزرق ، الأخضر ، الأحمر ، والأحمر البعيد. تم عرض أربعة أمثلة على مجموعات الألوان الأربعة المحتملة ، لكن التباديل المحتملة لا حصر لها. من الممكن استخدام اثنين من الأجسام المضادة IF أو اثنين من FPs المعبر عنها بنجاح متساو. البروتوكول مباشر وقوي. أي جسم مضاد ينتج نتائج IF جيدة من تلقاء نفسه مناسب. بينما يتم تضمين مجسات التيلومير فقط ل FISH هنا ، فإن تغيير طبيعة FISH باستخدام مسبار السنترومير ينتج عنه أيضا نتائج جيدة. وبالتالي ، يوفر هذا البروتوكول درجة واسعة من المرونة للإجابة على الأسئلة المهمة في علم الأحياء النووي.

البروتوكول

قبل البدء ، ضع في اعتبارك المجهر ، وخط الخلايا الذي يعبر عن FP ، والمجسات والأجسام المضادة المتاحة. يستخدم اللون الأزرق عادة لصبغة الحمض النووي مثل DAPI ، حيث أن الفلوروفورات الزرقاء ليست ساطعة بشكل عام. يمكن استخدام الأجسام المضادة الثانوية الزرقاء إذا لزم الأمر. إذا كانت الخلايا تعبر عن GFP ، فيمكن استخدام مسبار FISH الموسوم بالفلوروفور الأحمر جنبا إلى جنب مع جسم مضاد ثانوي ل IF الموسوم ب AF-647. بدلا من ذلك ، لتصوير الخلايا التي تعبر عن mCherry ، يمكن اختيار جسم مضاد ثانوي IF الموسوم ب AF-488 ومسبار FISH المسمى ب AF-647. يتم عرض أمثلة على أربع مجموعات ممكنة من IF-FP-FISH في الشكل 2 ، والغرض منها هو أن يكون دليلا لتشجيع مرونة التصميم التجريبي. من المهم اختيار الأسماك الأصلية أو المتغيرة ، حيث لا يمكن الجمع بين هذه الأساليب. يتم تضمين طريقة موثوقة لأغطية الغسيل الحمضي للسماح بالالتصاق الخلية هنا. يمكن إكمال ذلك في أي وقت قبل الاستخدام ، ويمكن تخزين أغطية معقمة إلى أجل غير مسمى. الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. الغسيل الحمضي للأغطية

ملاحظة: يجب تنظيف الأغطية الزجاجية وغسلها بالحمض للسماح للخلايا المستنبتة بالالتصاق. للنمو في ألواح 12 بئرا ، تعتبر أغطية مستديرة مقاس 18 مم مثالية. استشر المنشأة الأساسية للفحص المجهري لتحديد ما إذا كانت قسيمات الغطاء # 1 أو # 1.5 مفضلة. الأوقات المحددة لتنظيف أغطية الغطاء ليست حرجة ، ولكن لا تتوقف في الغسيل الحمضي.

1. استخدم ملقط الغطاء (الشكل 3 أ) لوضع أغطية في الرفوف حتى لا تتلامس أسطحها. ضع أغطية إضافية قطريا لزيادة السعة إذا لزم الأمر (الشكل 3 ب). ضع عدة رفوف بشكل مريح في طبق التلوين (الشكل 3 ج).
2. املأ طبق التلوين بالماء وكمية صغيرة من المنظفات. اخفض الرفوف برفق مع الغطاء في الطبق.
3. قم بتقليب الأغطية في الماء والصابون لمدة 30 دقيقة باستخدام الروك أو المغذيات.
4. ارفع رفوف الأغطية من طبق التلوين. تخلص من الماء والصابون.
5. اشطف طبق التلوين واملأه بالماء منزوع الأيونات. أعد رفوف الأغطية إلى الماء النظيف وضعها على كرسي هزاز لتقليبها برفق لمدة 5 دقائق.
6. كرر الشطف بتغييرين إضافيين من الماء النظيف منزوع الأيونات ، ليصبح المجموع ثلاث مرات شطف.
7. ارفع رفوف الأغطية من طبق التلوين. أضف 1 نيوتروليدن حمض الهيدروكلوريك إلى الطبق.
   تنبيه: حمض الهيدروكلوريك مادة كاوية. تعامل مع غطاء الدخان واستخدم معدات الحماية الشخصية. قم بخفض الغطاء المرتفع بعناية في المحلول الحمضي. تأكد من أن 1 N HCl يغطي الغطاء بالكامل. ضع الغطاء على طبق التلوين.
8. ضع طبق التلوين الذي يحتوي على الغطاء والمحلول الحمضي في خزان جهاز صوتي للحمام. سونيكات لمدة 15 دقيقة عند 55 درجة مئوية.
9. اترك الأغطية في الحمام الحمضي طوال الليل.
10. قم بإزالة رفوف الغطاء بعناية من طبق التلوين في اليوم التالي. تخلص من 1 N HCl وفقا لبروتوكولات السلامة المؤسسية.
11. اشطف طبق التلوين واملأه بالماء منزوع الأيونات. أعد رفوف الأغطية إلى الماء النظيف وضعها على كرسي هزاز لتقليبها برفق لمدة 5 دقائق.
12. كرر الشطف بتغييرين آخرين من الماء النظيف منزوع الأيونات ، ليصبح المجموع ثلاث مرات غسل.
13. ارفع رفوف الأغطية من طبق التلوين. أفرغ الطبق واملأه بنسبة 70٪ من الإيثانول. أعد رفوف الأغطية إلى الطبق وحركها برفق لمدة 5 دقائق.
14. ارفع رفوف الأغطية من طبق التلوين. أفرغ الطبق واملأه بالإيثانول بنسبة 100٪. أعد رفوف الأغطية إلى الطبق وحركها برفق لمدة 5 دقائق.
15. خذ الطبق الذي يحتوي على 100٪ من الإيثانول والأغطية إلى غطاء لزراعة الأنسجة. في غطاء المحرك ، قم بإزالة رفوف الأغطية من الطبق واتركها تجف في الهواء.
16. أفرغ الطبق وأعد رفوف الأغطية إليه. يحفظ مع الغطاء للحفاظ على العقم. طبق التلوين ليس محكم الإغلاق. إذا تركت الغطاء في الإيثانول ، فسوف يتبخر في النهاية. ستظل أغطية قابلة للاستخدام.

2. خلايا الطلاء على أغطية

ملاحظة: يتطلب التعامل مع أغطية الغطاء. من الأسهل البدء بلوحة مكونة من 6 آبار حتى تثق في ذلك. عند استخدام صفيحة مكونة من 6 آبار ، ضاعف أحجام الغسيل المعطاة لألواح 12 بئرا.

1. زراعة خلايا صحية ومتنامية تعبر عن البروتين ذي الأهمية الموسومة ب GFP أو mCherry (العديد من FPs الحمراء أو الخضراء مناسبة ؛ انظر الملاحظات في جدول المواد). تستخدم خلايا الساركوما العظمية U2OS ، التي تستخدم ALT لصيانة التيلومير ، في الأمثلة الموضحة.
   1. استخدم الخلايا أو خطوط الخلايا المنقولة بشكل عابر مع تعبير FP مستقر. إذا كانت التجربة تتطلب علاجا من العقاقير أو تعداء ، ففكر في التقاء المطلوب عند التثبيت (عادة 70٪ -80٪) ، ومدة العلاج ، ومعدل نمو الخلية لحساب العدد المناسب من الخلايا لكل غطاء.
2. قم بإعداد أغطية في غطاء مزرعة الأنسجة للحفاظ على العقم. إلى كل بئر من طبق 12 بئرا ، أضف 1 مل من PBS المعقم. باستخدام ملقط الغطاء ، ضع غطاء نظيفا ومغسولا بالحمض في كل بئر. حرك برفق باليد لبضع ثوان.
3. شفط PBS. أضف 1 مل من PBS المعقم الطازج لكل بئر. ضع الطبق جانبا.
4. (اختياري) قم بتغطية الغطاء بالفبرونيكتين لتحسين التصاق الخلايا. ستلتصق العديد من خطوط الخلايا الملتصقة جيدا بالأغطية المغسولة بالحمض عند طلاؤها لمدة 18 ساعة على الأقل قبل التثبيت. إذا كانت الخلايا لا تلتصق جيدا أو تتطلب تثبيتا بعد فترة وجيزة من الطلاء ، فقم بتغطية الغطاء لتعزيز الالتصاق.
   1. تحضير محلول 5 ميكروغرام / مل من الفبرونيكتين في PBS المعقم.
   2. استنشق PBS من الغطاء. ضع برفق ما يقرب من 300 ميكرولتر من محلول الفبرونيكتين على كل غطاء ، لتشكيل قطرة يحتفظ بها التوتر السطحي.
   3. احتضان لعدة ساعات عند 37 درجة مئوية أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   4. اشطفها عدة مرات باستخدام PBS ، مع الاحتفاظ بغطاء الغطاءات في تغيير نهائي ل PBS. ضع الطبق جانبا أثناء تحضير الخلايا.
   5. إذا كان الفيبرونيكتين غير مناسب ، ففكر في بولي إل ليسين أو كولاجين أو جيلاتين كبدائل.
5. قم بتربسين الخلايا وتخفيف عدد مناسب في 12 مل من وسط الاستزراع بناء على التصميم التجريبي وكثافة الخلية المرغوبة عند التثبيت.
6. قم بشفط PBS من الغطاء وأضف 1 مل من تعليق الخلية لكل بئر.
7. ضع الخلايا في الحاضنة.
8. عالج الخلايا كما هو مطلوب بالأدوية أو siRNAs أو الكواشف الأخرى وفقا للتصميم التجريبي. تنمو إلى التقاء المطلوب.

3. تلطيخ IF-FP

ملاحظة: طوال البروتوكول ، لا تدع أغطية الجفاف. ينصح بالماصة بيد واحدة وشفط المحاليل باليد الأخرى حتى تخرج الغطاء من المحلول لأقل وقت ممكن. محاليل الماصة برفق على جدار البئر ، وليس مباشرة على الغطاء. تعامل مع الغطاء بإحكام ولكن برفق باستخدام الملقط. من السهل كسر الغطاء عن طريق الإمساك به بقوة كبيرة. في البداية ، خطط لتغطية مكررة في حالة الكسر. مع الخبرة ، تصبح أغطية المكسورة أمرا نادرا. لا يمكن التقاط أغطية من بئر جاف. يجب تغطية أغطية الغطاء في مخزن مؤقت ليتم التقاطها.

1. قم بإزالة الوسائط وإصلاح الخلايا باستخدام المثبت الذي تختاره. شطف الخلايا قبل التثبيت ليس ضروريا. استخدم 1 مل لكل بئر في طبق 12 بئرا أو 2 مل لكل بئر في طبق 6 آبار.
   1. الخيار 1: استخدم 4٪ الفورمالديهايد في PBS.
      تنبيه: الفورمالديهايد سام. تعامل مع القفازات وتخلص منها بشكل صحيح. تحضير طازجة باستخدام 16٪ فورمالديهايد خال من الميثانول و 10x مرق PBS. إصلاح لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   2. الخيار 2: استخدم 4٪ فورمالديهايد في مخزن الهيكل الخلوي مع السكروز (CBS).
      ملاحظة: يفضل هذا المخزن المؤقت للحفاظ على بنية الهيكل الخلوي¹³. يحتوي CBS على تركيز نهائي يبلغ 10 ملي مولار MES درجة الحموضة 6.1 ، و 138 ملي مولار KCl ، و 3 ملي مولار MgCl₂ ، و 2 ملي مولار EGTA ، و 0.32 م سكروز. لتحضير المثبت ، اصنع مخزون CBS 2x مع 20 ملي MES درجة الحموضة 6.1 ، 276 ملي KCl ، 6 ملي MgCl₂ ، 4 ملي EGTA. تحضير مخزون منفصل 1.28 متر من السكروز. قم بتخزين كلا المخزونين في 4 درجات مئوية. للحصول على مثبت عمل طازج ، امزج حجما واحدا من الفورمالديهايد الخالي من الميثانول بنسبة 16٪ ، ومخزون سكروز واحد ، و 2 مجلد 2x مخزون CBS. إصلاح لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   3. الخيار 3: الإصلاح مع -20 درجة مئوية الميثانول. موصى به لأهداف الأجسام المضادة للحمض النووي (على سبيل المثال ، ssDNA ، G-quadruplexes ، هجينة الحمض النووي الريبي). إصلاح لمدة 5 دقائق عند -20 درجة مئوية.
2. الطموح المثبت والتخلص منه وفقا للسياسات المؤسسية.
3. اشطف الغطاء عدة مرات باستخدام PBS.
   1. نقطة التوقف: يمكن تخزين أغطية الغطاء الثابتة في PBS عند 4 درجات مئوية لعدة أيام مع الحد الأدنى من فقدان الإشارة. لتخزين أطول ، قم بتجفيف الإيثانول بنسبة 100٪ (دقيقتان في 70٪ إيثانول ، دقيقتان في 90٪ إيثانول ، تخزينه في 100٪ إيثانول) ، وأغلق اللوحة بغشاء المختبر ، واحفظها عند -20 درجة مئوية. يمكن تخزين أغطية الغطاء بهذه الطريقة لأسابيع إلى شهور. عندما تكون جاهزا للتلطيخ ، أعد ترطيب أغطية الغطاء (دقيقتان في 90٪ إيثانول ، دقيقتان في 70٪ إيثانول ، 15 دقيقة في PBS) وانتقل إلى الخطوة التالية.
4. تخلل الغطاء في 0.5٪ Triton X-100 في PBS لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بتنفيذ هذه الخطوة في اللوحة.
5. اشطف الغطاء عدة مرات باستخدام PBS.
6. تحضير الغرفة المرطبة (الشكل 3 د). ضع مناشف ورقية مبللة في قاع الغرفة. لإنشاء دعم للتلطيخ ، قم بتسمية الجزء العلوي من الغطاء من لوح مكون من 12 بئرا ليتوافق مع أغطية.
   1. قم بتغطية الغطاء بغشاء المختبر حتى تظل الملصقات مرئية. تأكد من أن الحجرة محكمة الغلق بغطاء محكم. قم بتغطيتها بورق الألمنيوم إذا لزم الأمر (الشكل 3 ه).
7. قطرات الماصة 75 ميكرولتر من 100 ميكروغرام/مل RNase A في PBS على الدعامة الملصقة. التقط كل غطاء برفق وامسح الحافة على أنسجة المختبر لإزالة المخزن المؤقت الزائد. اقلب الغطاء على قطرات RNase A (جانب الخلية لأسفل). ضع الدعامة في الغرفة المرطبة وأغلق الغطاء. احتضان لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
8. أضف PBS طازجا إلى الطبق المكون من 12 بئرا. أعد الغطاء إلى اللوحة ، بحيث يكون جانب الخلية لأعلى. اشطفها عدة مرات باستخدام PBS.
9. كتلة لمدة 30 دقيقة أو أكثر في درجة حرارة الغرفة. امسح محلول RNase من الدعامة المغطاة بالفيلم. قطرات الماصة 75 ميكرولتر من مصل الحمير بنسبة 20٪ في PBS على الفيلم. اقلب الغطاء على المخزن المؤقت للحجب (جانب الخلية لأسفل).
10. تحضير الجسم المضاد الأساسي.
    1. استخدم 75 ميكرولتر لكل غطاء غطاء. قم بإعداد 10٪ إضافية للسماح بحدوث خطأ في سحب العينات.
    2. تمييع الجسم المضاد في مصل الحمير بنسبة 5٪. تحديد تخفيفات الأجسام المضادة تجريبيا. التخفيف 1: 100 هو نقطة انطلاق معقولة.
    3. أثناء الحظر ، قم بإعداد دعم ثان مسمى لحضانة الأجسام المضادة الأولية. قم بتغطية الغطاء بغشاء وضع 75 ميكرولتر قطرات من الجسم المضاد المخفف في أماكن محددة.
11. في نهاية خطوة الحجب ، قم بنقل الغطاء إلى قطرات الجسم المضاد (جانب الخلية لأسفل). ضع الدعامة في الغرفة المرطبة ، وأغلق الغطاء ، واحتضن لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
12. أضف PBS طازجا إلى الطبق المكون من 12 بئرا. أعد الغطاء إلى اللوحة ، بحيث يكون جانب الخلية لأعلى. يغسل في PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة مع الهزاز.
13. أثناء الغسيل النهائي ، قم بإعداد الأجسام المضادة الثانوية.
    1. استخدم 75 ميكرولتر لكل غطاء غطاء. قم بإعداد 10٪ إضافية للسماح بحدوث خطأ في سحب العينات.
    2. يوصى بتخفيف 1: 400 للأجسام المضادة الثانوية الفلورية والأجسام المضادة المعززة GFP / RFP. اضبط حسب الحاجة بناء على الخبرة مع الهدف.
    3. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في مصل الحمير بنسبة 5٪. ضع قطرات 75 ميكرولتر على البقع المناسبة على الدعامة الملصقة.
14. بعد الغسيل، انقل الغطاء إلى قطرات الأجسام المضادة الثانوية (جانب الخلية لأسفل). احتضان لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة في الغرفة المرطبة محكمة الغلق.
15. أضف PBS طازجا إلى الطبق المكون من 12 بئرا. أعد الغطاء إلى اللوحة ، بحيث يكون جانب الخلية لأعلى. يغسل في PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة مع الهزاز.

4. إعادة التثبيت والتجفيف

1. تحضير 4٪ فورمالديهايد في PBS في درجة حرارة الغرفة لإعادة التثبيت. استخدم الفورمالديهايد لهذه الخطوة ، حتى لو تم استخدام الميثانول للتثبيت الأولي. قم بإزالة غسل PBS النهائي وأعد إصلاح الخلايا لمدة 15 دقيقة مع هزاز لطيف.
2. استنشاق المثبت والتخلص منه وفقا للسياسات المؤسسية.
3. اشطف الغطاء عدة مرات باستخدام PBS.
4. جفف الغطاء وجففه بالهواء للتحضير للتهجين:
   1. احتضان 70٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة.
   2. احتضان في 90٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة.
   3. احتضان في 100٪ إيثانول لمدة 2 دقيقة.
   4. بعد الإيثانول بنسبة 100٪ ، ضع الغطاء بحيث يكون جانب الخلية لأعلى على ورق الترشيح الملصق للحفاظ على الاتجاه. اتركها تجف في الهواء تماما أثناء تحضير مسبار FISH.

5. الأسماك (الخيار 1): تغيير طبيعة الأسماك

1. قم بإعداد دعامتين من رقائق الألومنيوم (انظر الشكل 3F).
   1. قم بطي قطعة من رقائق الألومنيوم إلى أرباع لإنشاء أربع طبقات. تأكد من أن الجانب الباهت متجها للخارج.
   2. قم بقص الرقاقة المطوية لتناسب غطاء لوح 12 بئرا. باستخدام منديل المختبر ، افركي ورق القصدير على الجزء الداخلي من الغطاء بحيث تنقش حواف الغطاء نمطا على الرقاقة. سيؤدي ذلك إلى إنشاء حواف تمنع الأغطية من الانزلاق إلى بعضها البعض خلال الخطوات اللاحقة.
   3. قم بإعداد اثنين من هذه الدعم. يمكن مسحها وإعادة استخدامها في تجارب لاحقة.
2. قم بتخفيف مسبار 10 ميكرومتر 1:50 في محلول التهجين (70٪ فورماميد منزوع الأيونات ، 10 ملي تريس ، درجة الحموضة 7.4 ، 0.5٪ 10× محلول حجب روش). استخدم 75 ميكرولتر من هذا المسبار المخفف لكل غطاء وقم بإعداد 10٪ إضافية للتعويض عن فقدان سحب العينات. يجب أن يكون تركيز المسبار النهائي 200 نانومتر.
3. سخن كتلة حرارية إلى 90 درجة مئوية وجهاز تدوير حراري إلى 85 درجة مئوية.
4. قم بتغيير طبيعة الغطاء: ضع أغطية مجففة بالهواء بحيث تكون الخلية لأعلى على أحد دعامات الرقائق المعدة. ضع ورق القصدير برفق على كتلة التدوير الحراري وأغلق الغطاء. احتضن لمدة 5 دقائق لتغيير طبيعته.
5. في نفس الوقت ، قم بتسخين المسبار المخفف في كتلة الحرارة عند 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
6. الماصة 75 ميكرولتر قطرات من المسبار المشوه على دعامة الرقائق الثانية المحضرة. تأكد من أن الجانب الباهت من الرقاقة متجها لأعلى للسماح بقطرات جيدة التكوين. إذا كان الجانب اللامع لأعلى ، فسوف ينتشر المسبار ويفقد التوتر السطحي.
7. اقلب الغطاء المشوه على قطرات المسبار ، ووضعها في جانب الخلية لأسفل.
8. انقل دعامة القصدير مع المسبار والأغطية إلى كتلة التدوير الحراري المضبوطة على 85 درجة مئوية واحتضانها لمدة 5 دقائق. استخدم ملعقة للمساعدة في النقل. تحرك بحذر لتجنب ارتطام أو تحريك الغطاء.
9. انقل الرقاقة مع أغطية ومسبار في غرفة رطبة. غطيها بالغطاء واحتضنها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.

6. الأسماك (الخيار 2): الأسماك الأصلية

1. قم بتخفيف مسبار 10 ميكرومتر 1: 200 في محلول التهجين (70٪ فورماميد منزوع الأيونات ، 10 ملي تريس ، درجة الحموضة 7.4 ، 0.5٪ 10× محلول حجب روش). تركيز المسبار النهائي هو 50 نانومتر. استخدم 75 ميكرولتر لكل غطاء وقم بإعداد 10٪ إضافية للسماح بحدوث خطأ في سحب العينات.
2. ضع 75 ميكرولتر قطرات من المسبار المخفف على البقع المخصصة على الدعامة المغطاة بالفيلم.
3. اقلب الغطاء المشوه على قطرات المسبار سعة 75 ميكرولتر ، ووضعها على جانب الخلية لأسفل.
4. ضع الدعامة في غرفة رطبة وأغلق الغطاء. احتضن لمدة 45 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. يمكن تمديد الحضانة إلى الليل إذا كنت تفضل ذلك.

7. الغسيل والتركيب

ملاحظة: يعتمد وسيط التركيب الأمثل على الفتحة العددية لهدف المجهر. استشر المرفق الأساسي للفحص المجهري المحلي للحصول على التوصيات. قد يكون أحد الخيارات المناسبة هو ProLong Glass مع NucBlue ، الذي يحتوي على معامل انكسار يبلغ 1.52. ومع ذلك ، قد يكون وسيط التركيب البديل أكثر ملاءمة اعتمادا على المجهر الموجود في متناول اليد.

1. أعد الغطاء إلى اللوحة المكونة من 12 بئرا للغسيل. اقلبها بحيث تكون في جانب الخلية لأعلى.
2. يغسل 3× 10 دقائق في 70٪ فورماميد/10 ملي تريس ، درجة الحموضة 7.5.
   تنبيه: الفورماميد سام. التخلص منها وفقا للسياسات المؤسسية.
3. يغسل 3× 5 دقائق في مادة تي إن تي (0.05 م تريس / 0.15 م كلوريد الصوديوم / 0.05٪ توين -20 ، درجة الحموضة 7.5).
4. اشطفها عدة مرات في PBS. إذا لم يتم تضمين بقعة الحمض النووي في وسط التركيب ، ففكر في إضافة DAPI في الغسيل النهائي. للتلطيخ باستخدام DAPI ، أضف 300 نانومتر DAPI إلى PBS ، ضعه على أغطية ، واحتضن لمدة 5 دقائق. التخلص من حل DAPI وفقا للإرشادات المؤسسية.
5. قم بتركيب أغطية على شرائح زجاجية باستخدام قطرة من وسط التركيب. اقلب الغطاء على القطرة: جانب الخلية لأسفل.
6. اترك وسط التركيب يشفى طوال الليل قبل التصوير.

النتائج

تظهر النتائج النموذجية من هذا البروتوكول في الشكل 4. إذا تم تنفيذها بشكل صحيح ، الحفاظ على مورفولوجيا الخلية بشكل جيد ، وستكون إشارات الفلورسنت مشرقة. يجب أن يكشف تغيير طبيعة التيلومير FISH عن نمط من عشرات النقاط في كل نواة تمثل كل تيلومير (انظر الشكل 4 ، المثالان 1 و 2). يجب أن تكون بؤر التيلومير موجودة بشكل حصري تقريبا في النواة ، على الرغم من أن تلطيخ التيلومير السيتوبلازمي يحدث أحيانا ، خاصة في خطوط الخلايا ALT. تميل إشارات التيلومير الناتجة إلى أن تكون ساطعة للغاية ، لدرجة أنه يجب توخي الحذر لمنع نزيف إشارة التيلومير في قنوات الكشف الأخرى. في خطوط الخلايا ALT ، غالبا ما تتجمع التيلوميرات في أجسام PML¹⁴ ، مما يؤدي إلى بؤر أقل مما هو متوقع عادة. يمكن ملاحظة هذا التجميع في الشكل 4 ، المثال 2.

في خطوط الخلايا التي تستخدم ALT لصيانة التيلومير ، يكتشف التيلومير الأصلي FISH ssDNA التيلوميري الذي يعد السمة المميزة ل ALT^11،12. ليس من المتوقع أن تحتوي كل نواة على تيلومير ssDNA ، ولا أن يكون هناك أكثر من عدد صغير من النقاط في نواة واحدة (انظر الشكل 4 ، المثالان 3 و 4). لن تكون إشارة التيلومير الأصلية FISH ساطعة مثل تغيير طبيعة أسماك التيلومير. يعد خط خلايا الساركوما العظمية U2OS عنصرا إيجابيا جيدا في الأسماك الأصلية. لا يتوقع ملاحظة ssDNA التيلوميري في خطوط الخلايا مع التيلوميرات التي يحتفظ بها التيلوميراز.

لكل من تغيير الطبيعة والأسماك الأصلية ، فإن التألق النووي القوي مصطنع. إذا لوحظت إشارة نووية مفرطة ، فحاول استخدام محلول جديد من RNase A ، أو تمديد علاج RNase^{A 15} (خطوة البروتوكول 3.8). بالنسبة لتجارب التيلومير الأصلية FISH باستخدام خلايا ذات حالة ALT غير معروفة ، يتم استخدام خط خلية ALT إيجابي مثل U2OS لمعايرة إعدادات الكشف.

يمكن مقارنة ملاحظات FPs في تجارب IF-FP-FISH بسهولة مع تجارب تصوير الخلايا الحية للتحقق من صحتها. إذا لوحظت تناقضات ، فحاول تغيير ظروف التثبيت. قد يكون التثبيت في المخزن المؤقت CSB (خطوة البروتوكول 3.1.2) مفيدا للحفاظ على الهياكل الخلوية ، مما يكشف عن توطين FP أكثر دقة¹³.

يختلف تلطيخ التألق المناعي بشكل كبير وفقا للبروتين المهم. يجب مقارنة نتائج IF مع العينات المعدة بدون FISH لتقييم تأثير بروتوكول FISH على توطين وشدة البروتين المعني. بشكل عام ، تعد تجارب IF-FP-FISH مناسبة لحساب البؤر ، ولكن قد لا تكون الشدة كمية⁶.

الشكل 1: مثال على سير العمل مع المدد المقدرة. قد تكون هناك حاجة إلى يوم إضافي إذا تم إجراء حضانة الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها. في حالة الأسماك الأصلية ، يتم الجمع بين اليومين 2 و 3 في بعض الأحيان ، على الرغم من أن هذا يؤدي إلى وقت طويل على مقاعد البدلاء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: أمثلة على التركيبات التجريبية الناجحة المستخدمة مع التصوير بأربعة ألوان. يوضح المثالان 1 و 2 تغيير طبيعة أسماك التيلومير ، بينما يستخدم 3 و 4 أسماك أصلية. لاحظ أن هذا البروتوكول مفيد سواء كان تلميع بروتينين مستهدفين (مثال 1) ، والجمع بين FP واحد وصبغة IF واحدة (المثالين 2 و 4) ، أو اثنين من FPs (المثال 3). النتائج التمثيلية لهذه التجارب مذكورة في الشكل 4. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: المعدات المستخدمة في هذا البروتوكول. (أ) ملقط الغطاء. بينما يمكن استخدام الملقط المستقيم للتعامل مع أغطية الغطاء ، فإن ملقط الغطاء المائل يجعل المهمة أسهل بكثير. (ب) أغطية أرفف للغسيل. لاحظ أنه بالإضافة إلى الأرفف بشكل مستقيم ، يتم أيضا وضع أغطية بزاوية بين الأخاديد المجاورة لزيادة السعة. (ج) أربعة رفوف من أغطية في طبق تلطيخ. يحتوي طبق تلطيخ زجاجي على العشرات من أغطية الأرفف وهو منيع لغسل حمض حمض الهيدروكلوريك. (د) غرفة رطبة مجهزة. الجزء الخارجي مغطى بورق الألمنيوم لخلق بيئة مظلمة ، مع الحفاظ على الفلوروفورات. توفر المناشف الورقية المبللة في الأسفل الرطوبة. (ه) الغرفة المرطبة المختومة. الغطاء المحكم ضروري لمنع الجفاف. (و) صنع دعم رقائق الألومنيوم. يساعد نقش الحواف على الرقاقة المشذبة على منع الغطاء من الانزلاق إلى بعضها البعض أثناء خطوة تغيير الطبيعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: النتائج التمثيلية لتجارب التصوير رباعي القنوات ، بما في ذلك IF و FISH و FPs المعبر عنها. تصور اللوحات النتائج الفعلية للتجارب الموضحة في الشكل 2. يصبغ DAPI الحمض النووي ، ويسلط nAC-GFP الضوء على تيلوميرات علامة TelFISH و TRF2-mCherry ، وعلامات تلطيخ مناعية PML أجسام PML النووية ، و nTelFISH يكشف عن ssDNA التيلوميري. جميع الخلايا هي خلايا الساركوما العظمية U2OS. تم التقاط الصور على مجهر متحد البؤر مع قدرة فائقة الاستبانة. تم الحصول على صور المثال 1 باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر بالمسح بالليزر. تم الحصول على جميع الصور الأخرى باستخدام الفحص المجهري للإضاءة المنظمة. تمثل جميع أشرطة المقياس 5 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

لطالما كانت التجارب التي تستخدم IF-FISH الدعامة الأساسية في مجال التيلومير كمقايسة لإجهاد التيلومير أو الكشف عن ALT^5،6،16. هنا ، يتم تمديد البروتوكول ليشمل بروتين الفلورسنت. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم خيار التيلومير الأصلي FISH كمقايسة ALT^{متعامدة 11}. هذا البروتوكول سهل التنفيذ وينتج نتائج مرضية بشكل موثوق.

من خلال العمل على أغطية مع قطرات من الأجسام المضادة أو مجسات PNA ، تم تصميم هذا البروتوكول ليكون مقتصدا. استخدام القطرات يحافظ على الكواشف القيمة. في المقابل ، فإن البدائل مثل الشرائح ذات الغرف باهظة الثمن وتوفر مرونة أقل. في حين أن التعامل مع قسائم التغطية يتطلب ممارسة لتطوير الكفاءة ، فإن توفير التكاليف يجعل استثمار الوقت مفيدا. وتجدر الإشارة إلى أنه لا ينصح بقطرات الكاشف التي يزيد حجمها عن 75 ميكرولتر. تتسبب القطرات الكبيرة ببساطة في انزلاق الأغطية ولا تحسن النتائج.

يعد التعبير عن nAC-GFP أداة لا غنى عنها لتصور الأكتين النووي^{f-actin 8} ، كما هو موضح في الشكل 4. توجد العديد من الكواشف الأخرى الموسومة والتي قد تساعد في الإجابة على الأسئلة البيولوجية المهمة. على سبيل المثال ، يمكن استخدام نظام البلازميد FUCCI لتصور دورة الخلية ، ويمكن دمج استخدام هذا البروتوكول مع التيلومير FISH¹⁷. قد يستخدم نهج مختلف لفحص دورة الخلية جسم كروموسوم PCNA للحصول على معلومات دورة الخلية¹⁸. اعتمادا على السؤال المطروح ، تتوفر العديد من الكواشف التي تحمل علامة FP تجاريا.

هنا ، يتم توضيح هذا البروتوكول باستخدام أسماك التيلومير ، ولكن تم تحقيق نتائج ناجحة أيضا باستخدام سنترومير FISH ، باستخدام مسبار PNA بنفس التركيز. من الممكن مضاعفة مسبار سنترومير المسمى FAM باستخدام مسبار تيلومير مسمى Cy3 ، على سبيل المثال. من المهم التأكيد على أنه من غير المرجح أن يعمل البروتوكول مع DNA أحادي الموضع FISH. لفحص موضع واحد ، من الضروري هضم البروتياز للعينة ، ومن الواضح أن هذا الهضم غير متوافق مع اكتشاف IF أو FP¹⁹. ومع ذلك ، فقد تحقق النجاح في الجمع بين IF و mRNA FISH مع نهج مماثل. من الواضح أنه يجب حذف خطوة علاج RNase في هذا السيناريو.

أخيرا ، من الواضح أن أسماك التيلومير الأصلية أصبحت بسرعة اختبارا أساسيا لحالة ALT^20،21 . على عكس مقايسة الدائرة C ل ALT ، وهي²² قائمة على السكان ، يوفر FISH التيلومير الأصلي قراءة ALT على المستوى الخلوي ، مما يسمح بالكشف الحساس عن التغييرات في ديناميكيات ALT. من خلال توحيد أسماك التيلومير الأصلية مع تعبير IF و FP ، يمكن الكشف عن رؤى مهمة حول آلية ALT. بمرور الوقت ، نأمل أن تؤدي هذه الأفكار إلى علاجات مستهدفة للأورام التي تعتمد على ALT لصيانة التيلومير.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
10 ٪ توين -20	بيو راد	1610781	تجاهل إذا كان الحل غائما.
10x PBS	جيبكو	70011044	لإعداد المخازن المؤقتة المثبتة وغيرها من استخدام التثبيت اللاحق
لوحات زراعة الخلايا 12 بئرا	نوك	150628
16٪ فورمالديهايد خالي من الميثانول	علم الحرارة	28908
5 م كلوريد الصوديوم	ميليبور سيجما	ط6546
الخلايا الملتصقة ، مثل خلايا الساركوما العظمية U2OS	ATCC	إتش تي بي -96
صندوق محكم الغلق للغرفة المرطبة	ميبال	106415032500	سيعمل أي صندوق محكم الإغلاق مناسب ، لكن احذر من الصناديق ذات القيعان غير المستوية.
ألكونوكس	ميليبور سيجما	Z742914
رقائق الألومنيوم	فيشر العلمية	01-213-100
وسط زراعة الخلايا المناسب ، على سبيل المثال McCoy's 5A	جيبكو	16600082	بالنسبة إلى U2OS ، أضف 15٪ FBS
مسبار سنترومير (FAM)	السيرة الذاتية للسلطة الوطنية الفلسطينية	إف 3001	تتوفر العديد من الفلوروفورات
بلازميد ChromoTek Nuclear Actin-Chromobody (TagGFP)	بروتين تك	ACG-N
أغطية الغطاء	أدوات العلوم الجميلة	11251-33
رفوف Coverslip	ميليبور سيجما	Z688568
دابي	إنفيتروجين	D21490	اختياري ، في حالة عدم احتواء وسيط التثبيت على بقعة DNA
مصل الحمير	جاكسون إيمونوريسيرتش	017-000-121
إيجا تي إي تي إي	بيو وورلد	40520008	0.5 م المحلول الرقم الهيدروجيني 8.0
ايثانول	وارنر جراهام	200 دليل
مصل الأبقار الجنينية	جيبكو	A5670801
فيبرونيكتين	ميليبور سيجما	إف 0635	للطلاء الاختياري للأغطية
فورماميد	ميليبور سيجما	47671-250 مل - ف.
أغطية زجاجية ألمانية	إنشومينتس وارنر	64-0714	CS-18R15 (# 1.5 سمك ، تأكد من أن هذا مناسب لمجهرك)
GFP الداعم	بروتين تك	gb2AF488	يعترف ب GFP / mClover / YFP / Venus وغيرها. اطلع على معلومات المنتج للحصول على قائمة شاملة
طبق تلطيخ زجاجي مع غطاء	ميليبور سيجما	900203
منظف بالموجات فوق الصوتية ساخن مع مؤقت رقمي	برانسون	CPX-952-218R	يشتمل طراز صوتات الحمام هذا على حرارة ولكن ليس لديه طاقة أو كثافة قابلة للتكوين.
حمض الهيدروكلوريك	ميليبور سيجما	258148	حمض الهيدروكلوريك المركز هو 12 N.  أضف 20 مل من حمض الهيدروكلوريك المركز إلى 220 مل من الماء منزوع الأيونات مقابل 1 نيوتن حمض الهيدروكلوريك
محلول كلوريد المغنيسيوم	ميليبور سيجما	63069	حل 1 م
مس	ميليبور سيجما	475893
ميثانول	ميليبور سيجما	179337
بارافيلم	الولايات المتحدة الأمريكية العلمية	3023-4526
كلوريد البوتاسيوم	ميليبور سيجما	ص 9541
الأجسام المضادة الأولية  الماوس المضادة PML	سانتا كروز	SC-377390
الأجسام المضادة الأولية  أرنب مضاد ل 53BP1	نوفوس	ملحوظة 100-904
الأجسام المضادة الأولية  أرنب مضاد ل PML	أالنسيلنة	أ 1184
إطالة الزجاج باستخدام NucBlue	إنفيتروجين	ص 36981
RFP الداعم	بروتين تك	ربي 2 أف 568	يتعرف على mRFP / mCherry / mKate2 / mPlum. اطلع على معلومات المنتج للحصول على قائمة شاملة
الحمض النووي الريبي أ	ميليبور سيجما	RNASEA-RO
حل حجب روش	ميليبور سيجما	11096176001
الأجسام المضادة الثانوية مثل AF488 المضادة للفأر	إنفيتروجين	أ - 11001	أو ما شابه ذلك
الأجسام المضادة الثانوية مثل AF594 المضادة للأرانب	إنفيتروجين	أ 11012	أو ما شابه ذلك
الأجسام المضادة الثانوية مثل AF647 المضادة للفأر	إنفيتروجين	أ -21235	أو ما شابه ذلك
ملعقه	فيشر العلمية	10257402
PBS معقمة	جيبكو	14190144	لتحضير الأغطية
سكروز	ميليبور سيجما	س 0389
مسبار TelC (Cy3)	السيرة الذاتية للسلطة الوطنية الفلسطينية	إف 1002	تتوفر العديد من الفلوروفورات
مسبار TelG (AF647)	السيرة الذاتية للسلطة الوطنية الفلسطينية	إف 1014	تتوفر العديد من الفلوروفورات
قاعدة تريس	ميليبور سيجما	648311	تحضير محلول 1 متر في الماء ، وضبط الرقم الهيدروجيني باستخدام حمض الهيدروكلوريك
تريتون X-100	ميليبور سيجما	X100
التربسين-EDTA (0.25٪) ، فينول أحمر	جيبكو	25200072
مجهر زايس إليرا	زييس		أو ما شابه ذلك