مقالة منهجية

التصنيع القائم على إعادة الدمج للنواقل الفيروسية الهندسية للبحث والعلاج

DOI:

10.3791/68988

⸱

سبتمبر 26, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CEINGE Biotecnologie Avanzate Franco Salvatore S.C.aR.L., 2Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 3ImGen-T Srl

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتيح إعادة الدمج ، وهي طريقة هندسة وراثية بوساطة إعادة التركيب ، تعديلات دقيقة للجينوم الفيروسي دون الاعتماد على الهضم الأنزمي. هذا النهج ضروري للبحث الأساسي ، مثل عمليات الحذف المستهدفة ، ولتطوير فيروسات هندسية تستخدم في علاجات الأورام والعلاج الجيني واللقاحات الجينية ، مما يوسع الإمكانيات في كل من البحث والتطبيقات السريرية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أكد الطلب المتزايد على النواقل الفيروسية المهندسة في كل من البحوث الأساسية والانتقالية الحاجة إلى طرق مرنة وسريعة وقابلة للتطوير لتوليد فيروسات الحمض النووي المؤتلفة. الاستراتيجيات التي تعتمد على هضم إنزيم التقييد وربطه مقيدة بالقيود المعتمدة على التسلسل وخطوات الاستنساخ التي تستغرق وقتا طويلا. هنا ، نصف طريقة الهندسة الوراثية بوساطة إعادة التركيب (إعادة الجمع) التي تتحايل على هذه القيود من خلال تمكين تعديلات دقيقة وسلسة للجينومات الفيروسية في الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية (BACs). يسمح هذا النهج بحذف العناصر الوراثية المشفرة أو غير المشفرة أو إدخالها أو استبدالها بكفاءة ، مما يوفر منصة قوية لتطوير النواقل الفيروسية عالية الإنتاجية. تعتبر إعادة الدمج ذات قيمة خاصة في تطبيقات البحث الأساسية ، مثل حذف أو طفرة الجينات الفيروسية للتحقيق في وظيفتها. والأهم من ذلك ، أن هذه المنهجية تتيح توليد عشرات الفيروسات المؤتلفة التي تشفر حمولات تحفيز مناعي أو علاجية مميزة بالتوازي ، مما يجعلها مناسبة بشكل استثنائي للتقييم السريع قبل السريري للتركيبات الجديدة. في حين أن هذه التكنولوجيا يمكن تنفيذها لأي غرض علمي ، تركز هذه المقالة على تطبيق إعادة الدمج في مجالين محددين: توليد فيروسات حال الأورام على أساس فيروس الهربس البسيط ، وتطوير ناقلات الفيروسات الغدية غير المتماثلة لنقل الجينات. في الختام ، تقدم إعادة الدمج نهجا متعدد الاستخدامات لهندسة الجينوم الفيروسي ، مما يسرع بشكل كبير من خط الأنابيب من التصميم إلى الاختبار الوظيفي. تمتد أهميته من علم الفيروسات الأساسي إلى الطب الانتقالي لتلبية الاحتياجات البحثية والسريرية المتطورة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ظهرت النواقل الفيروسية كأدوات قوية في العلاج الجيني ، والعلاج الفيروسي حال الأورام ، وتطوير اللقاح الجيني نظرا لقدرتها الطبيعية على توصيل المادة الوراثية إلى الخلايا المضيفة. إنها تستفيد من آليات الانتحاء والنقل الطبيعية للفيروسات ، مما يسهل التعبير الجيني العابر وطويل الأجل. إنهم قادرون على البقاء على قيد الحياة في البيئة خارج الخلية ، والارتباط بمستقبل خلوي معين (يحدد الانتعار الفيروسي) وتعزيز استيعابهم ، واختطاف آلية التعبير الجيني للخلية المضيفة ودفع التعبير عن جيناتهم الخاصة ، وتجنب أجهزة الاستشعار المرتبطة بالغشاء وداخل الخلايا للذراع المناعي الفطري1،2. بهذه الطريقة ، بعد العدوى الفيروسية المنتجة ، تحول الفيروسات الخلايا إلى مصانع ذرية فيروسية تنشر فيروسات جديدة في الكائن الحي ، مما يتسبب في النهاية في حدوث مرض.

يمكن تحويل الفيروسات من النوع البري إلى أداة للتكنولوجيا الحيوية عن طريق الهندسة الوراثية: يمكن التلاعب بجينومها بسهولة للاحتفاظ بقدرة التحويل والحصول على نتيجة سريرية. بناء على تطبيقها السريري ، يمكن تصميم النواقل الفيروسية للاحتفاظ (جزئيا على الأقل) أو استئصالها في كفاءتها المتماثلة لتوليد نواقل مختصة بالنسخ المتماثل أو غير مختصة في النسخ المتماثل3،4.

الفيروسات المختصة بالنسخ المتماثل مخصصة بشكل أساسي لأغراض الفيروسات الحالة للأورام. تسمح الخلايا السرطانية ، التي غالبا ما تكون ناقصة في الدفاعات المضادة للفيروسات1 ، بتكرار الفيروسات المؤتلفة الموهنة المصممة من خلال حذف جينات الضراوة. تتكاثر هذه الفيروسات بشكل انتقائي في الأورام مع الحفاظ على الأنسجة الطبيعية. مع تقدم فهم علم الفيروسات ، تم استبدال الفيروسات الموهنة بتعديلات جينوم أكثر دقة مصممة لتعزيز السلامة والفعالية العلاجية.

من بين مجالات الاهتمام التي تتطلب الهندسة الجزيئية الجراحية للجينومات الفيروسية ما يلي: أنا) فيروسات حال الأورام المشروطة بالتكاثر ، حيث يتم استبدال المروجين الفيروسيين بمحفزات مرتبطة بالورم (المحفزات الخلوية المفرطة في النسخ في الخلايا السرطانية) ، وبالتالي تقييد التعبير الجيني الفيروسي للخلايا المريضة5. ب) الفيروسات ذات الانتحاء المتغير6،7 ، حيث يمكن تعديل البروتينات السكرية المغلفة التي تحدد العدوى أو استبدالها بشظايا الأجسام المضادة أو الروابط التي تستهدف البروتينات المفرط في التعبير عنها على الخلايا السرطانية8،9. ثالثا) الفيروسات المسلحة. يؤدي موت الخلايا السرطانية الناجم عن الفيروسات الحالة للأورام إلى موت الخلايا المناعية (ICD) ، والذي يتميز بإطلاق الوسطاء الالتهابيين1،10 ومستضدات الورم11. تعزز هذه الإشارات التعرف الفعال على مستضدات الورم من قبل الجهاز المناعي ، واستعادة المراقبة12وتمكين الجمع بين مثبطات نقاط التفتيش المناعية13،14،15 والعلاجات المناعية الأخرى مثل العلاجات واللقاحات القائمة على الحمض النووي الريبي16.

دعما لهذا التأثير العلاجي المناعي ، يمكن تشفير الجينات التحويلية ذات الأهمية داخل الجينوم الفيروسي ، وبالتالي استغلال الفيروس ليس فقط لنشاطه حال الأورام ولكن أيضا لتعزيز إمكاناته العلاجية المناعية من خلال الإنتاج في الموقع للحمولات ذات الصلة3،7،17،18،19. قد تشتمل هذه الحمولات على السيتوكينات والكيموكينات والأجسام المضادة وجينات الانتحار والمستضدات3،20. يتطلب الإدخال الدقة ، مع تفضيل المناطق بين الجينات من الجينوم الفيروسي لتقليل اضطراب الجينات الفيروسية والحفاظ على التكاثر والفعالية7. لذلك ، فإن التقنيات التي تمكن من فحص كل من مواقع الإدخال المثلى والجينات المحورة ذات الأهمية ضرورية.

من ناحية أخرى ، في سياق الفيروسات غير المتماثلة ، المستخدمة للعلاج الجيني أو كأدوات للقاحات الجينية ، من المهم أن يقوم الناقل الفيروسي بتوصيل الجين المعدل (إما عابر أو طويل الأمد) دون التكاثر في الخلية المضيفة لتجنب السمية21. تتميز نواقل الفيروسات الغدية بكفاءة نقل عالية ، وتعبير قوي عن الجينات المعدلة ، والقدرة على إصابة كل من الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة3. وقد جعلتها هذه الخصائص الأولى في فئتها لتطوير لقاحات جينية، بما في ذلك لقاحات الأمراض المعدية الناشئة، مثل كوفيد-19، فضلا عن العلاجات البديلة للجينات22. المثال الأكثر شهرة على ناقل الفيروسات الغدية الذي وصل إلى السوق هو لقاح أكسفورد-أسترازينيكا COVID-19 ، المعروف بالاسم التجاري Covishield أو Vaxzevria ، بناء على فيروس الشمبانزي الغدي المعدل ، ChAdOx1 ، الذي يشفر لبروتين سبايك من SARS-CoV-2. عند حقنه عن طريق الحقن العضلي ، يكون Covishield قادرا على اختراق الخلايا داخل الخلايا والحث على التعبير عن بروتين Spike ، مما يهيئ الجهاز المناعي لتكوين استجابة مناعية ضده3.

هناك حاجة واضحة لتعديل الجينومات الفيروسية دون تقييدها بمواقع التعرف على إنزيم التقييد. من بين الفيروسات الحالة للأورام ، توفر النواقل القائمة على فيروس الهربس البسيط -1 (HSV-1) مزايا فريدة ، بما في ذلك القدرة اللايتية والسلامة وحجم الجينوم الكبير ، مما يسمح بإدخال جينات معدلة وراثيا كبيرة أو عناصر وراثية متعددة23،24. بالإضافة إلى فيروس الهربس البسيط ، تظهر العديد من الفيروسات الأخرى وعدا علاجيا ، كما تمت مراجعته مؤخرا في Sasso et al.3. بدلا من ناقل عالمي "الأفضل في فئته" ، فإن المنصات الفيروسية المختلفة مناسبة للاحتياجات العلاجية المميزة3. في الوقت الحالي ، لا تزال أنظمة إعادة التركيب المتجانسة في البكتيريا أو استنساخ الخميرة والبكتيريا الهجينة هي البدائل الأكثر شيوعا لإنزيمات التقييد ، ولكنها شاقة ومتعددة الخطوات وغير فعالة25.

البديل الناشئ هو استخدام كريسبر / كاس9 ، الذي تم تطبيقه مؤخرا لهندسة جينومات الفيروسات ، بما في ذلك فيروس اللقاح (VV) ، وفيروس الهربس البسيط ، ونواقل الفيروسات الغدية. يجذب Cas9 تعطيل الجينات عبر طفرات indel ولكنه يصبح أقل عملية عندما تكون هناك حاجة إلى تخفيضات متعددة لحذف أجزاء الجينوم أو إدخال جين معدلة عبر الحمض النووي للمتبرع. علاوة على ذلك ، فإن التحرير محدود بتصميم gRNA ، والتأثيرات غير المستهدفة في كل من الجينومات الفيروسية والمضيفة ، والاعتماد على تسلسل PAM في المناطق ذات الأهمية25.

مع وضع ذلك في الاعتبار ، ومن خلال مثالين يعتمدان على فيروس الهربس البسيط والفيروس الغدي ، توضح هذه المقالة طريقة إعادة الدمج ، والتي يمكن تطبيقها على نطاق واسع - من الفيروسات إلى العاثيات ، والبلازميدات المعقدة ، والأنظمة التجريبية المتنوعة. إعادة الدمج (الهندسة الجينية المتجانسة بوساطة إعادة التوليف) هي تقنية هندسة وراثية في الجسم الحي ، تستخدم بشكل أساسي في الإشريكية القولونية ، والتي تستغل بروتينات إعادة تركيب العاثيات المعتمدة على درجة الحرارة لتحفيز إعادة التركيب المتماثل بين عناصر الحمض النووي مع أقل من 30 نقطة أساس من التماثل26. يسمح هذا النهج بإدخال أو حذف أو تعديل دقيق للتسلسلات دون الاعتماد على مواقع التقييد أو حجم الحمض النووي. في هذه المخطوطة ، نصف نسخة تستند إلى بكتريا قولونية المحفزة للحرارة SW102 ، على الرغم من توفر سلالات بديلة ذات أنظمة محفزة محددة27.

تبدأ إعادة الدمج بإعداد الخلايا البكتيرية ذات الكفاءة الكهربائية من خلال صدمة درجة حرارة خاضعة للرقابة لتنشيط آلية إعادة تركيب العاثيات. ثم يتم تثقيب جزيئات الحمض النووي التي تحمل أذرع التماثل المناسبة. قد تكون هذه الحمض النووي مزدوج الشريطة (dsDNA) ناتج عن الهضم المقيد أو تفاعل البوليميراز المتسلسل أو الحمض النووي أحادي الشريطة (ssDNAs) مثل قليل النوكليوتيدات. يتيح وجود تسلسلات متجانسة مع بروتينات إعادة التركيب النشطة إنشاء جزيئات DNA جديدة مع التعديل المطلوب.

تتيح تقنية إعادة الجمع للاستنساخ الجزيئي الهندسة الوراثية الدقيقة ويتم تطبيقها في سياقات متنوعة ، بما في ذلك إدخال علامات قابلة للتحديد أو غير قابلة للتحديد في البلازميدات والحمض النووي للكروموسومات البكتيرية والكروموسومات الاصطناعية البكتيرية (BACs). تعتبر BACs ذات قيمة خاصة لاستنساخ الأجزاء الجينومية الكبيرة ، بما في ذلك الفيروسات الغدية والحمض النووي لفيروس الهربس البسيط ، مما يتيح الإنتاج السريع للنواقل الفيروسية. بالإضافة إلى التطبيقات الانتقالية ، تدعم إعادة الدمج أيضا البحث الأساسي من خلال السماح بالحذف المستهدف أو التعديل أو الاستبدال للجينات الفيروسية أو مجالات البروتين. إعادة الدمج لها بعض القيود: أذرع التماثل القصيرة تعيق إعادة التركيب في المناطق المتكررة. قد تؤدي الركائز المضخمة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في بعض الأحيان إلى إدخال طفرات. ويجب معرفة تسلسل المنطقة المستهدفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كشرط أساسي لإعادة الدمج ، يجب أن تتوفر سلالة بكتيرية بارعة (على سبيل المثال ، SW102) مع جينوم BAC ذي الاهتمام. على الرغم من أن إعادة الدمج هي طريقة عالية الكفاءة لإثراء المستعمرات التي خضعت للتعديل المطلوب ، إلا أننا هنا نصف استراتيجية إعادة الدمج المكونة من خطوتين ، يشار إليها باسم الخطوتين الأولى والثانية (الشكل 1). في الخطوة الأولى ، يتم إدراج شريط تعبير يحتوي على علامات الاختيار الإيجابية والسلبية في موضع الاهتمام. في الخطوة الثانية ، يتم استبدال هذا الكاسيت بالتعديل الجيني الفعلي المخصص للجينوم النهائي. تشمل علامات الاختيار المستخدمة في هذه الدراسة مقاومة الأمبيسلين (AmpR) ، ونشاط بيتا جالاكتوزيداز (β-غال) ، وجين sacB . ومع ذلك ، يمكن استخدام أي مزيج من علامات الاختيار الإيجابية والسلبية ، اعتمادا على الاحتياجات المحددة لمجموعة البحث.

1. أدخل شريط التحديد في المنطقة المستهدفة

  1. يوم 0
    1. خلايا Streak SW102 التي تحتوي على BAC المطلوب على LB Agar + مضاد حيوي (يوجد جين مقاومته في BAC (على سبيل المثال ، الكلورامفينيكول 12.5 ميكروغرام / مل). قم بزراعتها طوال الليل في الحاضنة عند 32 درجة مئوية.
      ملاحظة: تجنب درجات الحرارة > 32 درجة مئوية لمنع تحريض جينات إعادة الدمج خلال هذه المرحلة.
  2. اليوم 1
    1. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم درج التحديد AmpR/LacZ/SacB. استخدم البادئات الأمامية والخلفية التي تحتوي في نهاية 3 'على التسلسل لتلدين وتضخيم كاسيت الاختيار وفي نهاية 5 '30-80 نقطة أساس التي تمثل أذرع التماثل للمنطقة الجينومية الفيروسية المراد تعديلها (الجدول 1).
      ملاحظة: يمكن طلب كاسيت الاختيار ، بالإضافة إلى الملحق ، بسهولة كتركيبات اصطناعية من مزودين متخصصين. ومع ذلك ، يجب توخي الحذر لتجنب وجود محفزات مكررة أو منهيات أو عناصر وراثية أخرى إما داخل BAC (التحكم في جينات BAC) أو في الجينوم الفيروسي لمنع أحداث إعادة التركيب غير المرغوب فيها.
    2. تأكد من هوية ونقاء جزء تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاجاروز (حيث أن كاسيت AmpR / LacZ / SacB هو 3,400 نقطة أساس ، قم بتشغيل هلام الاغاروز 1٪) وأن قيم 260/230 و 260/280 تتماشى مع الحمض النووي النقي.
    3. في فترة ما بعد الظهر ، قم بتلقيح مستعمرة SW102 واحدة في 5 مل من LB واحتضان طوال الليل عند 32 درجة مئوية.
  3. اليوم 2
    1. تلقيح 1-2 مل من المزرعة الليلية في 100 مل من رطل طازج. قم بزراعة البكتيريا إلى OD600 من 0.55-0.7 ، وقياس OD600 بانتظام حتى لا تفوت المرحلة الأسية.
    2. قم بإعداد حمام مائي إلى 42 درجة مئوية للحث وتبريده إلى 4 درجات مئوية ~ 250 مل من ddH2O المعقم للغسيل.
    3. بمجرد وصول المزرعة إلى OD المطلوب ، انقل 50 مل إلى أنبوب مخروطي نظيف واحتضن عند 42 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 15 دقيقة. قم بتضمين تحكم سلبي غير مستحث.
      ملاحظة: ستؤدي هذه الخطوة إلى تحفيز بروتينات لامدا الحمراء.
    4. اترك الأنابيب في الثلج لمدة 10 دقائق ، ثم جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 3,200 × جم عند 4 درجات مئوية (كل من 42 درجة مئوية المستحثة وغير المستحثة).
    5. تخلص من المادة الطافية ، أضف 40 مل من ddH 2 O المعقم المثلج البارد ،وأعد تعليق الحبيبات (كل من 42 درجة مئوية المستحثة وغير المستحثة).
    6. قم بالطرد المركزي مرة أخرى لمدة 8 دقائق (انظر الخطوة 1.3.4) وكرر خطوة الغسيل (الخطوة 1.3.5) والطرد المركزي. كرر خطوة الغسيل حتى يصبح الطافي صافيا مثل الماء (بدون تعكر ومعلقات) (2-4 غسل).
    7. بعد الطرد المركزي الأخير ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من البارد المثلج ، المعقمddH 2O (كلاهما 42 درجة مئوية المستحثة وغير المستحثة).
    8. انقل حصة من الكريات المعلقة (50 ميكرولتر من HSV-1 و 25 ميكرولتر من Adeno) إلى أنابيب مبردة مسبقا سعة 1.5 مل (كلاهما مستحث 42 درجة مئوية وغير مستحث). أضف 50-400 نانوغرام من منتج PCR المنقى (لا تتجاوز 5 ميكرولتر). دوامة الأنابيب واحتضان على الثلج لمدة 5 دقائق.
    9. انقل المزيج من الخطوة السابقة إلى كوفيت مبرد مسبقا وقم بالتركيب الكهربائي عند 2.50 كيلو فولت (2,500 فولت ، 0.2 سم كوفيت) (كلاهما مستحث 42 درجة مئوية وغير مستحث).
    10. بعد التثقيب الكهربائي ، اسمح للبكتيريا بالتعافي في 1 مل من LB لمدة 1.5 ساعة عند 32 درجة مئوية. أضف 1 مل من الجنيه إلى الكوفيت لتنظيفه وجمع كل شيء.
    11. انشر كميات مختلفة من البكتيريا (10 ، 50 ، 200 ميكرولتر) على LB Agar + Ampicillin (100 ميكروغرام / مل) و X-Gal (20 ميكروغرام / مل) و IPTG (0.5 ملي مولار) واتركها تنمو بين عشية وضحاها (ON) عند 32 درجة مئوية.
    12. قم بإعداد الألواح باستخدام AMP / X-Gal (نفس التركيز كما في الخطوة 1.3.11) وألواح السكروز5.
  4. اليوم 3
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، من المتوقع أن تكون المستعمرات قد نمت وأن تبدو زرقاء ، ولكن فقط على الألواح التي تم فيها إحداث البكتيريا عند 42 درجة مئوية وتم طلاؤها بالكهرباء مع الملحق الذي يحتوي على كاسيت الاختيار. بمجرد تحديد ذلك ، من الضروري التحقق من سلامة كاسيت الاختيار في بعض المستعمرات.
    1. حدد اللوحات من ON حيث تكون المستعمرات <50 لتجنب اختيار مستعمرتين أو أكثر. اختر عدة مستعمرات (عادة ما تكون 8-10 كافية لتحديد مستعمرة واحدة مناسبة على الأقل) وقم بتخفيفها في حوالي 50 ميكرولتر من H2O. تلقيح المستعمرات المفردة الزرقاء في 50 ميكرولتر من H2O وخطوطها على كل من الصفائح الانتقائية السالبة (LB Agar / Sucrse / Chloramphenicol) والإيجابية (LB Agar / Ampicillin / Chloramphenicol / X-Gal / IPTG) (نفس التركيز كما في الخطوتين 1.1.2 و 1.3.11) (الشكل 2).
      ملاحظة: من المتوقع العثور على 20-100 مستعمرة على اللوحة ، حيث تم نشر 50 ميكرولتر. ومع ذلك ، إذا كان عدد المستعمرات أقل ، فهذا لا يعني بالضرورة أن إعادة التركيب معرضة للخطر.
    2. قم بتلقيح الماء من الخطوة 1.4.1 في 5 مل من LB واحتضان الألواح وثقافة LB طوال الليل عند 32 درجة مئوية (الشكل 2).
  5. يوم 4
    1. حدد فقط المستعمرات الزرقاء التي نمت على ألواح Amp / X-Gal ولم تنمو على ألواح السكروز (الشكل 3). بالنسبة لهذه المستنسخة الموجبة (الجدول 2) ، انقل 500 ميكرولتر من المزرعة الليلية إلى 50 مل من رطل طازج.
  6. اليوم 5
    1. لكل استنساخ إيجابي ، قم بإعداد طعنة من الجلسرين واستخراج وعزل بلازميد BAC (midiprep).
    2. بعد استخراج BAC ، قم بإجراء مراقبة الجودة للتحقق مما إذا كانت إعادة التركيب قد حدثت بشكل صحيح. قم بإجراء تسلسل Sanger لموقع الإدخال. إذا كان كل شيء يبدو صحيحا ، فتابع القسم الثاني.

2. استبدل كاسيت التحديد بالتعديل المطلوب

  1. يوم 0
    1. خط الاستنساخ الإيجابي على LB agar. احتضن طوال الليل عند 32 درجة مئوية.
  2. اليوم 1
    1. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم الإدخال / التعديل. استخدم البادئات الأمامية والخلفية التي تحتوي في نهاية 3 'على التسلسل لتلدين وتضخيم كاسيت الاختيار وفي نهاية 5 'نفس أذرع التماثل 30-80 نقطة أساس المستخدمة في الخطوة 1.3.1 (الجدول 1).
    2. تأكد من هوية ونقاء جزء تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز وأن قيم 260/230 و 260/280 تتماشى مع الحمض النووي النقي.
    3. تلقيح مستعمرة واحدة في 5 مل من رطل واحتضان طوال الليل عند 32 درجة مئوية.
  3. اليوم 2
    1. انقل 2 مل من المزرعة الليلية إلى 100 مل من الرطل وتنمو عند 32 درجة مئوية حتى يصل OD600 إلى 0.55-0.7 (في ~ 2.5-3 ساعات). قم بإعداد حمام مائي إلى 42 درجة مئوية للحث وتبريده إلى 4 درجات مئوية ~ 250 مل من ddH2O المعقم للغسيل.
    2. بمجرد الوصول إلى OD المطلوب ، انقل 50 مل من المزرعة إلى أنبوب مخروطي واحتضان في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للحث على بروتينات إعادة تركيب λ-phage. احتفظ بأنبوب آخر سعة 50 مل عند 32 درجة مئوية كعنصر تحكم غير مستحث.
    3. بعد الحث الحراري ، ضع الأنابيب على الجليد لمدة 10 دقائق.
    4. جهاز طرد مركزي لمدة 8 دقائق عند 3,200 × جم عند 4 درجات مئوية (كل من 42 درجة مئوية المستحثة وغير المستحثة).
      ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا ، اعمل على الجليد للحفاظ على كفاءة خلية SW102.
    5. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات ب 40 مل من الماء المبرد مسبقا عن طريق التحريك برفق.
    6. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 3,200 × جم عند 0-4 درجة مئوية.
    7. كرر خطوة الغسيل (الخطوة 2.3.5) مرة واحدة.
    8. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات برفق في 100 ميكرولتر من الماء.
    9. انقل كمية من الكريات المعلقة (50 ميكرولتر من HSV-1 و 25 ميكرولتر من Adeno) إلى أنابيب مبردة مسبقا سعة 1.5 مل (كلاهما مستحث 42 درجة مئوية وغير مستحث). أضف 50-400 نانوغرام من منتج PCR المنقى (لا تتجاوز 5 ميكرولتر). قم بتدوير الأنابيب واحتضان الثلج لمدة 5 دقائق.
    10. انقل المزيج من الخطوة السابقة إلى كوفيت مبرد مسبقا وقم بالتركيب الكهربائي عند 2.50 كيلو فولت (كل من 42 درجة مئوية المستحثة وغير المستحثة).
    11. اسمح للخلايا بالتعافي في 5 مل من وسط LB لمدة 4-5 ساعات عند 32 درجة مئوية مع الاهتزاز.
      ملاحظة: وقت التعافي أطول مما كان عليه في خطوة إعادة الدمج الأولى للسماح بتدهور بروتين SacB المتبقي بعد استبدال الكاسيت.
    12. طبق كميات مختلفة (50 ، 200 ، 500 ميكرولتر) من الاستزراع على أطباق LB agar Petri التي تحتوي على السكروز و X-Gal و IPTG (نفس التركيز كما في الخطوتين 1.1.2 و 1.3.11). احتضن طوال الليل عند 32 درجة مئوية.
  4. اليوم 3
    1. فحص عدد كبير من المستعمرات (20-100) لزيادة احتمالية تحديد المستنسخة الإيجابية التي خضعت بنجاح لإعادة التركيب مع الجزء الذي يحمل التعديل المطلوب وكاسيت الاختيار. قم بإجراء فحص من المستوى الأول باستخدام كولوني PCR. استخدم طبق بتري مع شبكة ؛ اختر مستعمرات من ربع معين وقم بتسميتها (الشكل 4).
      ملاحظة: يتضمن النهج الفعال بشكل خاص استخدام زوج من البادئات حيث يتم تلدين أحد التمهيدي خارج المنطقة المستهدفة (على الجينوم الفيروسي) والآخر داخل الجزء المعاد تجميعه (الشكل 5).
    2. تحقق من وجود وحجم أمبليكون تفاعل البوليميراز المتسلسل بواسطة هلام الاغاروز (1.5٪).
    3. اختر من الربع الصحيح المستنسخة الموجبة وقم بالتلقيح في 100 مل من LB. احتضن طوال الليل عند 32 درجة مئوية.
  5. اليوم 4:
    1. قم بإجراء ميديبرب لاستخراج البلازميد من الثقافات البكتيرية.
    2. هضم البلازميد بإنزيمات التقييد وتشغيل هلام الاغاروز لتحليل نمط الهضم.
    3. إذا كان نمط الهضم صحيحا ، فاستمر في تسلسل المنطقة المعدلة من الجينوم الفيروسي.
    4. بعد التأكد من الهوية الجزيئية للنسخ المستنسخة المؤتلفة ، تابع تعداء وإنقاذ الجسيمات الفيروسية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توليد فيروس الهربس المحلل للأورام المرمز ل IL12
كما هو موضح في القسم التمهيدي من هذا العمل ، فإن أحد التطبيقات المحتملة لإعادة الدمج هو إدخال الجينات المعدلة ومنشطة المناعة في جينوم الفيروسات الحالة للأورام ، بهدف تعزيز إمكاناتها في العلاج المناعي. أدناه ، نقدم مثالا على مثل هذا التطبيق باستخدام ناقل حال الأورام يعتمد على HSV-1. على وجه التحديد ، تبحث هذه الدراسة في تأثير إدخال الجينات المعدلة وراثيا في موضع بين الجينات داخل منطقة Us1-Us2 من جينوم HSV-1. في الواقع ، يمكن أن تكون عمليات الإدخال داخل ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم بروتوكول "إعادة التركيب" (الهندسة الجينية المتماثلة بوساطة إعادة التوصيف) استراتيجية من خطوتين: أولا ، دمج كاسيت الاختيار في الموضع الجيني محل الاهتمام ، وثانيا ، استبدال هذا الكاسيت بالتعديل المطلوب (الشكل 1).

تشمل علامات الاختيار المستخدمة مقاومة الأمبيسلين (AmpR) ، وبيتا جالاكتوزيداز (β-غال) ، و sacB. يتيح AmpR الاختيار القائم على مقاومة المضادات الحيوية ، ويسمح β جالون بالفحص الأزرق / الأبيض ، ويمنح sacB حساسية السكروز ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين مصالح مالية أو غير مالية ذات صلة للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل: PRIN 2022-MUR Italy ، Grant 20224NCSN5 (PreMeRetHOn). POR Campania: piattaforma per lo sviluppo di nuove tecnologie vaccinali. PNRR CN3 المركز الوطني للعلاج الجيني والأدوية القائمة على تقنية الحمض النووي الريبي. PNRR PE13 إجراءات بحثية أساسية وانتقالية لصحة واحدة تلبي الاحتياجات غير الملباة بشأن الأمراض المعدية الناشئة. يشكر المؤلفون خدمة التوليف Geneart لتوفير الحمض النووي المخصص. كما يعرب المؤلفون عن خالص امتنانهم لميشيل فينيروسو ، التي ساهمت في الانتهاء بنجاح من هذه الدراسة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأمبيسيلينأيأيالصف الجزيئي
لكي يقوم oligo بتضخيم Il-12: < / em> CTGGCTAGCGTTTAA
ACGGGCCCTCTAGACTCG
AGCGGCCGCACGCCACCA
TGTGTCCTCAGAAGCTAACC		أيأيHPLC منقى
من أجل oligo to amplofy AmpR / LacZ / SacB   ؛ كاسب: CTGGCTAGCGTTTAAA
CGGGCCCTCTAGACTCGAG
CGGCCGCACGCCACCACC
CCTATTTGTTTTTTTC		أيأيHPLC منقى
IPTGأيأيالصف الجزيئي
أجار LB
LB متوسط
Phusion Hot Start II بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة   ؛ثيرمو ساينتفيكإف 549 إس
القس oligo لتضخيم Il12: GGCAACTAGAAGGCA
CAGTCGAGGCTGATCAGC
GGTTTAAACTTAAGCTTTC
AGGCGGAGCTCAGATAG 		أيأيHPLC منقى
القس oligo إلى amplofy AmpR / LacZ / SacB   كاسب: GGCAACTAGAAGGCAC
AGTCGAGGCTGATCAGC
GGTTTAAACTTAAGCTTT
TATTTGTTAACTGTTAATTG 		أيأيHPLC منقى
كاسيت اختيار SacB / AmpR / LacZهذه المخطوطة--
سكروزأيأيالصف الجزيئي
SW102 مع BAC-HSV-1 أو BAC-Advهذه المخطوطة--
التربتونأيأيالصف الجزيئي
ويزارد SV جلبروميجاأ 9281
إكس غالأيأيالصف الجزيئي
مستخلص الخميرةأيأيالصف الجزيئي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers (Basel). 12 (11), 3407(2020).
  2. Froechlich, G., et al. The common H232 STING allele shows impaired activities in DNA sensing, susceptibility to viral infection, and in monocyte cell function, while the HAQ variant possesses wild-type properties. Sci Rep. 13 (1), 19541(2023).
  3. Sasso, E., et al. New viral vectors for infectious diseases and cancer. Semin Immunol. 50 (1), 101430(2020).
  4. Ma, C. C., Wang, Z. L., Xu, T., He, Z. Y., Wei, Y. Q. The approved gene therapy drugs worldwide: from 1998 to 2019. Biotechnol Adv. 40 (3-4), 107502(2020).
  5. Sasso, E., et al. Replicative conditioning of herpes simplex type 1 virus by survivin promoter, combined to ERBB2 retargeting, improves tumour cell-restricted oncolysis. Sci Rep. 10 (1), 4307(2020).
  6. Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. Int J Mol Sci. 22 (2), 477(2021).
  7. De Lucia, M., et al. Retargeted and multi-cytokine-armed herpes virus is a potent cancer endovaccine for local and systemic anti-tumor treatment. Mol Ther Oncolytics. 19 (1), 253-264 (2020).
  8. Sasso, E., et al. One-step recovery of scFv clones from high-throughput sequencing-based screening of phage display libraries challenged to cells expressing native claudin-1. Biomed Res Int. 2015 (1), 703213(2015).
  9. Rusciano, G., Sasso, E., Capaccio, A., Zambrano, N., Sasso, A. Revealing membrane alteration in cells overexpressing CA IX and EGFR by surface-enhanced Raman scattering. Sci Rep. 9 (1), 1832(2019).
  10. Lin, D., Shen, Y., Liang, T. Oncolytic virotherapy: basic principles, recent advances and future directions. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 156(2023).
  11. Troise, F., et al. Prime and pull of T cell responses against cancer-exogenous antigens is effective against CPI-resistant tumors. Mol Ther Oncolytics. 32 (1), 200760(2024).
  12. Shalhout, S. Z., Miller, D. M., Emerick, K. S., Kaufman, H. L. Therapy with oncolytic viruses: progress and challenges. Nat Rev Clin Oncol. 20 (3), 160-177 (2023).
  13. Sasso, E., et al. Massive parallel screening of phage libraries for the generation of repertoires of human immunomodulatory monoclonal antibodies. MAbs. 10 (7), 1060-1072 (2018).
  14. Vetrei, C., et al. Novel combinations of human immunomodulatory mAbs lacking cardiotoxic effects for therapy of TNBC. Cancers (Basel). 14 (1), 121(2021).
  15. Zambrano, N., et al. High-throughput monoclonal antibody discovery from phage libraries: challenging the current preclinical pipeline to keep the pace with the increasing mAb demand. Cancers (Basel). 14 (5), 1325(2022).
  16. Froechlich, G., Sasso, E. We ARE boosting translation: AU-rich elements for enhanced therapeutic mRNA translation. Mol Ther Nucleic Acids. 36 (2), 102531(2025).
  17. Gentile, C., et al. Generation of a retargeted oncolytic herpes virus encoding adenosine deaminase for tumor adenosine clearance. Int J Mol Sci. 22 (24), 13521(2021).
  18. Finizio, A., et al. Integrating system biology and intratumor gene therapy by trans-complementing the appropriate co-stimulatory molecule as payload in oncolytic herpes virus. Cancer Gene Ther. 31 (9), 1335-1343 (2024).
  19. Tripodi, L., et al. Systems biology approaches for the improvement of oncolytic virus-based immunotherapies. Cancers (Basel). 15 (4), 1297(2023).
  20. Wang, H., et al. Cytokine-armed oncolytic herpes simplex viruses: a game-changer in cancer immunotherapy. J Immunother Cancer. 12 (5), e008025(2024).
  21. D'Alise, A. M., et al. Adenovirus encoded adjuvant (AdEnA) anti-CTLA-4, a novel strategy to improve adenovirus based vaccines against infectious diseases and cancer. Front Immunol. 14 (1), 1156714(2023).
  22. Wold, W. S., Toth, K. Adenovirus vectors for gene therapy, vaccination and cancer gene therapy. Curr Gene Ther. 13 (6), 421-433 (2013).
  23. Goins, W. F., Huang, S., Cohen, J. B., Glorioso, J. C. Engineering HSV-1 vectors for gene therapy. Methods Mol Biol. 1144 (1), 63-79 (2014).
  24. De Chiara, A., et al. Peptide nucleic acid-mediated circularization of target RNA as tool to inhibit translation. Int J Biol Macromol. 308 (1), 142230(2025).
  25. Wang, L., Chen, Y., Liu, X., Li, Z., Dai, X. The application of CRISPR/Cas9 technology for cancer immunotherapy: current status and problems. Front Oncol. 11 (1), 704999(2022).
  26. Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., Court, D. L. Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering. Nat Protoc. 4 (2), 206-223 (2009).
  27. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33 (4), e36(2005).
  28. Zhang, W., et al. High-throughput cloning and characterization of emerging adenovirus types 70, 73, 74, and 75. Int J Mol Sci. 21 (17), 6370(2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة