يتيح هذا البروتوكول تقييما سريعا وفعالا من حيث التكلفة للتركيب الميكروبي في منتجات الألبان من خلال الجمع بين الثقافات ومرض التصلب العصبي المتعدد. إنه يقدم نتائج تصنيف مماثلة لتسلسل 16S rRNA مع وقت استجابة أقصر من طرق الثقافة التقليدية.
مقالة منهجية
تقييم السلامة الميكروبية لمصانع الألبان باستخدام التنميط البروتيني البكتيري عبر نهج MALDI
يفتح في علامة تبويب جديدة
في هذه المقالة
ملخص
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
الملخص
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
نقدم بروتوكولا باستخدام طريقة تحديد الطيف الكتلي لوقت الطيران بامتصاص / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI-TOF MS ، المشار إليها فيما يلي باسم "MS") لمراقبة وجود الكائنات الحية الدقيقة في منتجات الألبان المختلفة (الزبدة ، جبن الموزاريلا ، الحليب ، الكريمة) باستخدام نهج البروتين ، وعلم الثقافة الحديثة ، وإجراءات تحضير العينات المختلفة التي يمكن دمجها في مختبرات مراقبة جودة سلامة الأغذية كوسيلة سريعة ، أداة موثوقة وقوية لمراقبة سلامة الميكروبات. ويشمل خطوة العزل الميكروبي ، واختيار المستعمرات المزروعة ، وإجراءات تحضير العينات (الخلايا السليمة ، والاستخراج الفوري وداخل الأنبوب) ، وتحديد معلمات تحليل التصلب العصبي المتعدد ، وتوليد وجمع أطياف التصلب العصبي المتعدد (بصمات البروتين) ، وأخيرا الحصول على التصنيف باستخدام منصة التصلب العصبي المتعدد ، متبوعا بتفسير البيانات وتصورها. توفر هذه الطريقة ، التي تم التحقق من صحتها من خلال العديد من الدراسات ، تحديدا أكثر موثوقية وفعالية من حيث التكلفة للكائنات الحية الدقيقة من الحليب مقارنة بأنظمة الاختبار الكيميائية الحيوية التجارية. إنه يبرز كتقدم واعد في علم الأحياء الدقيقة للأغذية ، حيث يلبي المتطلبات المتنوعة للمختبرات من خلال بروتوكولاته البسيطة وتقليل وقت التحليل بشكل كبير. يلبي البروتوكول المقدم احتياجات صناعة الأغذية من خلال توفير تحديد ميكروبي موثوق به في وقت استجابة مناسب (TAT) مناسب تماما لعمليات التصنيع.
المقدمة
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
الهدف العام من هذا البروتوكول هو توفير منهجية شاملة لمراقبة السلامة الميكروبية لمنتجات الألبان المختلفة ، بما في ذلك الزبدة والجبن والحليب والقشدة ، من خلال استخدام مرض التصلب العصبي المتعدد في التنميط البروتيني البكتيري. يهدف هذا النهج ، الذي يجمع بين الثقافات الحديثة وإجراءات تحضير العينات المحسنة ، إلى أن يكون أداة سريعة وموثوقة وقوية لمختبرات سلامة الأغذية ومراقبة الجودة. يأتي الأساس المنطقي وراء إنشاء هذه المنهجية وتطبيقها من قيود طرق تحديد الميكروبات القياسية. لسنوات عديدة ، اعتمدت مختبرات التشخيص البيطري والغذائي على الاختبارات الكيميائية الحيوية التقليدية التي تفحص نمو البكتيريا والتمثيل الغذائي على وسائط الزراعة التفاضلية متبوعة بالعديد من المقايسات الأنزيمية1. في حين أن هذه الطرق ، التي تستند في كثير من الأحيان إلى إرشادات قياسية مثل تلك الواردة في دليل بيرجي لعلم الجراثيم الحاسم ، غير مكلفة نسبيا ويمكن أن تنتج بيانات كمية ونوعية ، إلا أنها شاقة وتستغرق وقتا طويلا ، وتتطلب إعدادا مكثفا للوسائط ، وتخفيف العينات ، والطلاء ، والحضانة ، وعد المستعمرات ، والعزل ، وخطوات التوصيف التفصيلية2،3.
أدى إدخال الأنظمة التجارية شبه الآلية والآلية مثل مؤشر الملف التحليلي (API) و BBL Crystal و Vitek و Biolog MicroPlate إلى تبسيط تحديد الميكروبات باستخدام المقايسات الكيميائية الحيوية ، وبالتالي تقليل التكاليف وأوقات الاستجابة. ومع ذلك ، فإن هذه الأنظمة لها بعض العيوب ، مثل ضعف قابلية التكاثر ، ونقص الإدخالات في قواعد البيانات الخاصة بها ، والصعوبات في تحديد الاختلافات المظهرية بين السلالات ، خاصة بالنسبة للبكتيريا غير المخمرة أو السلالات داخل الأنواع ذات الاختلافات الكيميائية الحيوية الطفيفة ، مما قد يؤدي إلى نتائج غير صحيحة في المختبر 4. بالنظر إلى ذلك ، تطور مرض التصلب العصبي المتعدد كبديل قوي ، شائع حاليا في علم الأحياء الدقيقة السريري ويحظى بالاهتمام في مختبرات التشخيص البيطري وجودة الحليب. تم استكمال هذا النهج بسرعته ودقته وفعاليته من حيث التكلفة في الكشف عن العديد من الكائنات الحية الدقيقة1. أظهرت العديد من الدراسات أن مرض التصلب العصبي المتعدد يوفر تحديدا أكثر موثوقية للكائنات الحية الدقيقة من الحليب ، مما يوفر نتائج أسرع وأرخص من أنظمة الاختبار البيوكيميائية التجارية5،6،7. في حين أن الاختبارات البيوكيميائية قد تكون كافية لتحديد مستوى الجنس أو على مستوى المجموعة ، فإن التشخيص على مستوى الأنواع غالبا ما يتطلب طرقا أكثر تقدما مثل MS أو تسلسل 16S rRNA8. في الواقع ، يعتبر مرض التصلب العصبي المتعدد منصة واعدة لتحديد العزلات الميكروبية الغذائية المرنة والموثوقة ، وتلبية المتطلبات المتنوعة لمختبرات علم الأحياء الدقيقة للأغذية من خلال بروتوكولاتها البسيطة وتقليل وقت التحليل بشكل كبير ، وبالتالي تعزيز سلامة الأغذية4،5. التكاليف التشغيلية ضئيلة بسبب انخفاض استهلاك الكاشف ، وتسمح معالجة العينات بأتمتة أكبر وإنتاجية عالية8. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن فائدة هذه الطريقة تعتمد بطبيعتها على ظروف النمو الميكروبي المختارة (بما في ذلك نوع وسائط الاستزراع) وتغطية أنواع قاعدة البيانات المرجعية ، والتي يتم التعرف عليها على أنها العوامل الرئيسية التي تحد من فائدتها.
يلعب مرض التصلب العصبي المتعدد دورا مهما في علم الأحياء الدقيقة للأغذية من خلال تحديد والتمييز بين بكتيريا الأمراض المنقولة بالغذاء وحمض اللاكتيك (LAB) والبكتيريا المخمرة الأخرى9. تمتد فائدته إلى الثقافات الحديثة ، مما يتيح تحديد جميع المستعمرات الميكروبية المزروعة على وسائط الاستزراع وتسهيل الحصول على معلومات وحدة تشكيل المستعمرة (CFU)7. تم بالفعل تطبيق هذا النهج بنجاح لاكتشاف مجتمعات ميكروبية معقدة مثل تلك الموجودة في الأمعاء البشرية ، أو المتورطة في التهابات القدم السكرية ، أو المرتبطة بالمسالك البولية ، مما يؤدي إلى تنشيط الطرق المعتمدة على المزرعة في الممارسات الميكروبيولوجية10،11.
يتم تقديم هذا البروتوكول لتوجيه المختبرات في التنفيذ الفعال للتصلب العصبي المتعدد للتقييم الروتيني لسلامة الميكروبات في منتجات الألبان ، وتلبية حاجة الصناعة إلى تحديد ميكروبي موثوق به خلال وقت استجابة عملي (TAT) مناسب لعمليات التصنيع. يوضح البروتوكول بالتفصيل الخطوات الحاسمة ، بما في ذلك (1) العزل الميكروبي عن منتجات الألبان السائلة (الحليب والقشدة ومصل اللبن) والصلبة (الزبدة والجبن) باستخدام مجموعة مختارة من وسائط الاستزراع المناسبة (دي مان وروغوسا وشارب أجار - MRS أجار ، M-17 أجار ، توين 80 أجار لجميع الأغراض - أجار APT ، أجار اللاكتوز الأزرق الصيني - أجار CBL ، أجار عدد ألواح الحليب - MPCA ، أجار الصويا التريبتيك - TSA) وظروف الحضانة المصممة ؛ (2) إجراءات تحضير عينة موحدة لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد ، وتقديم خيارات مثل النقل المباشر للمستعمرة ، واستخراج حمض الفورميك على الهدف ، واستخراج بروتين الإيثانول / حمض الفورميك داخل الأنبوب لاستيعاب أنواع البكتيريا المختلفة وسير العمل المختبري ؛ و (3) تحليل MS المنهجي ، بما في ذلك معايرة الأداة ، وتحديد معلمات اكتساب الأطياف المثلى ، والمبادئ التوجيهية لتفسير البيانات ، بما في ذلك تقييم قيمة الدرجات وفحوصات الاتساق للتعيين التصنيفي الواثق. من خلال توفير نهج منظم ومعتمد ، يهدف هذا البروتوكول إلى تعزيز دقة وكفاءة المراقبة الميكروبية في صناعة الألبان ، مما يساهم في النهاية في تحسين جودة الغذاء والصحة العامة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.
1. عزل البكتيريا المرتبطة بمنتجات الألبان
- الحصول على المزارع البكتيرية من منتجات الألبان السائلة أو الصلبة
- اختيار وسائل الإعلام الثقافية
- للعزل البكتيري من عينات الألبان ، حدد وسائط الاستزراع وفقا للمجموعات الميكروبية المتوقعة ، بما في ذلك وسائط النمو العامة ، ووسائط البكتيريا سالبة الجرام ، وبكتيريا حمض اللاكتيك (LAB) ، والبكتيريا المكونة للأبواغ ، بالإضافة إلى الكائنات الحية الدقيقة بطيئة النمو أو الحساسة.
ملاحظة: لتحقيق أقصى قدر من التعافي لكل من الأنواع السائدة والنادرة ، يجب تلقيح وسائط متعددة بالتوازي. يتم تقديم مجموعة من أمثلة الوسائط لتحليل الميكروبيوم من عينات الألبان في الجدول 1.
- للعزل البكتيري من عينات الألبان ، حدد وسائط الاستزراع وفقا للمجموعات الميكروبية المتوقعة ، بما في ذلك وسائط النمو العامة ، ووسائط البكتيريا سالبة الجرام ، وبكتيريا حمض اللاكتيك (LAB) ، والبكتيريا المكونة للأبواغ ، بالإضافة إلى الكائنات الحية الدقيقة بطيئة النمو أو الحساسة.
- التلقيح والطلاء
- احصل على عينة تمثيلية من منتج الألبان واخلطها جيدا.
- انقل 1 مل (عينات سائلة: حليب ، كريمة ، لبن) أو 1 جم (عينات صلبة: جبن ، زبدة) من العينة إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 9 مل من وسط سائل معقم (ماء الببتون / محلول 0.85٪ كلوريد الصوديوم). بالنسبة للعينات الصلبة ، قم بتسخين الوسط السائل إلى 40-42 درجة مئوية قبل إضافة العينة.
- قم بتجانس العينة عن طريق الدوامة بقوة لمدة 30-60 ثانية. بالنسبة للعينات الدهنية أو الصلبة ، استمر في التجانس حتى يتم الحصول على تعليق موحد.
- قم بإعداد سلسلة من التخفيفات بعشرة أضعاف عن طريق أخذ 1 مل من المعلق ونقله إلى أنابيب متتالية تحتوي على 9 مل من المحلول المعقم. امزج كل تخفيف جيدا.
ملاحظة: اعتمادا على نوع العينة والمستوى المتوقع للتلوث الميكروبي ، قم بإعداد تخفيفات تتراوح من 10-1 إلى 10-6. بالنسبة لمعظم العينات ، ستكون التخفيفات حتى 10-3 كافية ؛ ومع ذلك ، عند تحليل الحليب الطازج أو الجبن الأزرق ، سيكون من الضروري تحضير المزيد من التخفيفات. لضمان العزل الدقيق وسهولة اختيار المستعمرة ، يجب أن يعطي تخفيف التلقيح الأمثل من 30-300 مستعمرة لكل طبق. يسمح هذا النطاق بالتمييز الواضح للمستعمرات الفردية ويقلل من مخاطر النمو المتداخل ، مما يسهل الحصول على الثقافات البكتيرية غير الملوثة والمتجانسة لتحليلها لاحقا. بالنسبة لبعض منتجات الألبان المصنعة (مثل اللبن الرائب) ، يمكن استخدام عينة طازجة غير مخففة (على سبيل المثال ، 0.1 مل) للطلاء المباشر. - خذ 0.1 مل من العينة أو تخفيفها وانقلها إلى سطح أطباق بتري المعدة مسبقا التي تحتوي على وسط أجار مناسب.
- انشر اللقاح بالتساوي على سطح أجار باستخدام موزع معقم. اترك اللقاح يمتص في الوسط لمدة 15 دقيقة ، ثم اقلب الألواح.
- حضانة المرض
- الحضانة الهوائية: لجميع العينات التي تم فحصها ، قم بتلقيح ألواح أجار APT و M-17 و CBL و MPCA و TSA ، واحتضان في ظل ظروف هوائية عند 37 درجة مئوية و 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. تم تحديد درجات حرارة الحضانة بناء على متطلبات النمو المثلى للمجموعات الميكروبية المختلفة الحاسمة لتقييم كل من الجودة الصحية (30 درجة مئوية للميزوفيل العام) وسلامة الصحة العامة (37 درجة مئوية لمسببات الأمراض المرتبطة بالإنسان والكائنات الحية المؤشرة) لمنتجات الألبان.
ملاحظة: إذا كان من المتوقع النمو المكثف للبكتيريا المكونة للأبواغ ، في حالة TSA ، يفضل وقت حضانة أقصر (~ 12 ساعة). - الحضانة اللاهوائية: لجميع العينات التي تم فحصها ، قم بتلقيح ألواح MRS Agar ، واحتضان في ظروف لاهوائية عند 37 درجة مئوية و 30 درجة مئوية لمدة 24-72 ساعة ، وفحص نمو الميكروبات كل يوم. تم تحديد درجات حرارة الحضانة كما هو مذكور في الخطوة 3.1.
ملاحظة: يمكن تحقيق ظروف الحضانة اللاهوائية عن طريق وضع الألواح في حاويات محكمة الإغلاق مع أكياس لاهوائية مولدة للغلاف الجوي ، والتي تقضي على الأكسجين وتوفر جوا مناسبا لنمو البكتيريا اللاهوائية.
- الحضانة الهوائية: لجميع العينات التي تم فحصها ، قم بتلقيح ألواح أجار APT و M-17 و CBL و MPCA و TSA ، واحتضان في ظل ظروف هوائية عند 37 درجة مئوية و 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. تم تحديد درجات حرارة الحضانة بناء على متطلبات النمو المثلى للمجموعات الميكروبية المختلفة الحاسمة لتقييم كل من الجودة الصحية (30 درجة مئوية للميزوفيل العام) وسلامة الصحة العامة (37 درجة مئوية لمسببات الأمراض المرتبطة بالإنسان والكائنات الحية المؤشرة) لمنتجات الألبان.
- الحصول على ثقافات نقية
- بعد الحضانة ، افحص الألواح واختر مستعمرات مفردة مزروعة بناء على خصائصها المورفولوجية (على سبيل المثال ، الحجم والشكل واللون والملمس).
- قم بتنقية المستعمرات المختارة عن طريق الاستزراع الفرعي (الخطوط) على نفس وسط الأجار باستخدام حلقة ميكروبية 1 ميكرولتر ونفس ظروف الحضانة.
- اختيار وسائل الإعلام الثقافية
| وسط الثقافة | تطبيق | حالة الثقافة |
| أجار الصويا التربتيكي (TSA) | وسيط عام لزراعة مجموعة واسعة من البكتيريا | 30-37 درجة مئوية ، 24-48 ساعة ، التمارين الهوائية |
| أجار الدم (BLA؛ مع 5٪ دم الأغنام) | إخصاب ، تمايز انحلال الدم ، مفيد للمكورات العقدية ، الليستيريا ، العصيات | 30-37 درجة مئوية ، 24-48 ساعة ، التمارين الهوائية |
| السيدة أجار (دي مان وروجوسا وشارب أجار) | انتقائي لملبنة وغيرها من مختبر إضافة 1٪ توين-80 لدعم نمو L. casei, L. delbrueckii, L. helveticus أو L. اسيدوفيلوس. | 30 درجة مئوية ، 48-72 ساعة ، لاهوائية أو ميكروهوائية |
| أجار M17 | انتقائي للمكورات العقدية ، العقدية الحرارية | 30 درجة مئوية ، 48-72 ساعة ، لاهوائية أو ميكروهوائية |
| أجار APT (توين 80 أجار لجميع الأغراض | انتقائي للمختبر وبعض البكتيريا المشقوقة | 30 درجة مئوية ، 48-72 ساعة ، لاهوائية أو ميكروهوائية |
| أجار شيدلر | انتقائي وتخصيب ، عزل اللاهوائية ، بما في ذلك البيفيدوباكتريا ، المطثية | 30-37 درجة مئوية ، 48-72 ساعة ، لاهوائية |
| CBL agar (أجار اللاكتوز الأزرق الصيني) | الوسط التفاضلي ، للبكتيريا القولونية وغيرها من البكتيريا المخمرة للاكتوز | 37 درجة مئوية ، 24-48 ساعة ، هوائية |
| عدد أطباق الحليب أجار (MPCA) | عالمي ، للعدد الإجمالي للبكتيريا الهوائية المتوسطة | 30-37 درجة مئوية ، 24-48 ساعة ، التمارين الهوائية |
الجدول 1: قائمة الوسائط المقترحة لتحليل الميكروبيوم لعينات الألبان بظروف استزراع محددة.
2. تحضير العينات البكتيرية لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد
- قبل البدء ، قم بإعداد حل مصفوفة MALDI
ملاحظة: مركب المصفوفة الأكثر استخداما هو HCCA ، حمض α-Cyano-4-hydroxycinnamic هذا المركب حساس للضوء ، لذا قم بإعداد المصفوفة وتخزينها في حاويات مظلمة أو بعيدا عن الضوء.- تحضير خليط المذيبات باستخدام النسب التالية: 50٪ أسيتونيتريل (درجة HPLC) ، 47.5٪ ماء (درجة HPLC) ، و 2.5٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA).
- قم بإذابة المصفوفة في خليط المذيبات إلى تركيز نهائي يبلغ حوالي 10 مجم / مل (أو حتى التشبع - حتى تظل البلورات غير المذابة مرئية).
- إذا لم يكن المحلول واضحا (تبقى البلورات) ، فقم بالطرد المركزي أو تصفية المحلول (على سبيل المثال ، من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر) للحصول على سائل صاف.
ملاحظة: يسمح بالتخزين في الثلاجة لفترات قصيرة ، بشرط أن يكون هناك عدد قليل من دورات التذويب.
- للتعرف على البكتيريا باستخدام مرض التصلب العصبي المتعدد، استخدم أحد إجراءات تحضير العينة الثلاث:
- النقل المباشر للمستعمرة - استخدم هذه الطريقة الأبسط والأسرع عند التعامل مع البكتيريا جيدة النمو وغير المقاومة للتحلل ، مثل معظم البكتيريا سالبة الجرام.
- باستخدام حلقة معقمة أو عود أسنان ، انقل كمية صغيرة (~ 1 ميكرولتر) من المستعمرة المزروعة إلى بقعة على صفيحة MALDI.
- قم بتشويه المادة البكتيرية مباشرة على مكان محدد على لوحة هدف MALDI لإنشاء طبقة رقيقة ومتساوية.
- بمجرد التجفاف ، قم بتراكب البقعة ب 1 ميكرولتر من محلول مصفوفة HCCA واتركها تجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة.
- على استخراج حمض الفورميك المستهدف - استخدم للبكتيريا التي يصعب التعرف عليها (على سبيل المثال ، الخميرة موجبة الجرام) التي تجعل جدرانها الخلوية من الصعب إطلاق البروتينات دون معالجة إضافية.
- التقط كمية صغيرة من الكتلة الحيوية البكتيرية من مستعمرة بكتيرية واحدة باستخدام حلقة ميكروبية يمكن التخلص منها أو عود أسنان معقم.
- قم بتشويه المادة البكتيرية مباشرة على مكان محدد على لوحة هدف MALDI لإنشاء طبقة رقيقة ومتساوية.
- قم بتراكب المادة البكتيرية الملطخة ب 1 ميكرولتر من محلول حمض الفورميك بنسبة 70٪ وجففها في الهواء في درجة حرارة الغرفة.
- بمجرد التجفاف ، قم بتراكب البقعة ب 1 ميكرولتر من محلول مصفوفة HCCA واتركها تجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة.
- استخراج البروتين في الأنبوب (طريقة الإيثانول / حمض الفورميك) - استخدم هذه الطريقة للكائنات الحية الدقيقة التي يصعب التعرف عليها ، بما في ذلك بعض البكتيريا والخمائر والبكتيريا الفطرية موجبة الجرام.
- باستخدام حلقة أو مسحة معقمة ، انقل 1-3 مستعمرات كاملة من لوحة زراعة أجار إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 300 ميكرولتر من الماء المعقم.
- أضف 900 ميكرولتر من الإيثانول المطلق لضبط تركيز الإيثانول النهائي إلى حوالي 75٪. امزج أو دوامة لبضع ثوان.
- قم بالطرد المركزي للعينة لمدة دقيقتين عند 15,000 × جم (درجة حرارة الغرفة).
- تخلص بعناية من المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخلية.
ملاحظة: في حالة السلالات المخاطية يوصى بالطرد المركزي الإضافي عند 4 درجات مئوية. - اترك أنبوب الحبيبات مفتوحا حتى يتبخر كل الإيثانول المتبقي (5-10 دقائق ، درجة حرارة الغرفة).
- أضف 20-50 ميكرولتر 70٪ حمض الفورميك (FA) إلى حبيبات الخلية المجففة. امزج عن طريق سحب العينة أو الدوامة حتى يتم تعليق الحبيبات بالكامل.
ملاحظة: يجب أن يكون الحجم متناسبا مع كمية المادة البيولوجية. - أضف حجما متساويا من الأسيتونيتريل (ACN) إلى معلق حمض الفورميك. تخلط بعناية.
- جهاز طرد مركزي عند 15,000 × جم لمدة دقيقتين (درجة حرارة الغرفة).
- نقل 1 ميكرولتر من المادة الطافية إلى مكان محدد على لوحة هدف MALDI.
- اترك البقعة تجف تماما في الهواء في درجة حرارة الغرفة.
- قم بتراكب بقعة العينة المجففة ب 1 ميكرولتر من محلول مصفوفة حمض α-Cyano-4-hydroxycinnamic (HCCA).
- اترك المصفوفة تجف تماما في الهواء في درجة حرارة الغرفة قبل تحليل التصلب العصبي المتعدد (الشكل 1).
ملاحظة: 70٪ حمض الفورميك: تآكل; يسبب الحروق. مقبض في غطاء الدخان. أسيتونيتريل: قابل للاشتعال وسام. يحفظ بعيدا عن اللهب وتجنب الاستنشاق / التلامس. حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA): قوي وتآكل ومتطاير. تجنب ملامسة الجلد / العين والاستنشاق. ارتد دائما معطفا للمختبر وقفازات مقاومة للمواد الكيميائية ونظارات واقية للسلامة. تعامل مع جميع الكواشف في غطاء الدخان لتجنب الاستنشاق. تجنب ملامسة الجلد والعين. العمل بعيدا عن اللهب المكشوف. اجمع نفايات المذيبات الحمضية والعضوية في حاويات متوافقة وذات علامات واضحة للتخلص منها بشكل صحيح.
- النقل المباشر للمستعمرة - استخدم هذه الطريقة الأبسط والأسرع عند التعامل مع البكتيريا جيدة النمو وغير المقاومة للتحلل ، مثل معظم البكتيريا سالبة الجرام.
الشكل 1: شجرة القرار التي تصور عملية اختيار إجراء تحضير العينة المناسب لتحديد العزلات البكتيرية عبر تقنية التصلب المتعدد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. اكتساب الأطياف وتحديد الميكروبات باستخدام تقنية التصلب العصبي المتعدد
- المعايره
ملاحظة: لتحديد الكتلة بدقة في مرض التصلب العصبي المتعدد، قبل تحليل العينات غير المعروفة، قم بمعايرة الجهاز باستخدام المعايير المناسبة. تعد المعايرة المناسبة للأداة أمرا بالغ الأهمية لتحديد هوية موثوقة.- إعداد بقع المعايرة على لوحة هدف MALDI تحتوي على 1 ميكرولتر من: (أ) معيار الاختبار البكتيري (BTS) ، الذي يحتوي على مستخلص من الإشريكية القولونية DH5 alpha ، ويغطي نطاق كتلي يتراوح من 3.6-17 كيلو دالتون (للنمط الحيوي MBT) ؛ (ب) معاير علم الأحياء الدقيقة الذي يحتوي على بكتريا قولونية ATCC 25922 مستخلص البروتين والريبونوكلياز والميوغلوبين ، ويغطي نطاقا كتليا يتراوح بين 3.6-17 كيلو دالتون (لنظام EXS2600). اتركه يجف في الهواء وتراكب بقع المعايرة المجففة ب 1 ميكرولتر من محلول مصفوفة HCCA ، على غرار تحضير العينة.
- قم بتحميل لوحة هدف MALDI التي تحتوي على العينات المحضرة وبقع المعايرة في الجهاز. قم بإجراء تحليل للبقع المعايرة باستخدام وضع المعايرة (تلقائي).
- تحقق من المعايرة للتأكد من أن دقة الكتلة ضمن الحدود المقبولة عبر (100 جزء في المليون) نطاق الكتلة المحدد (2-20 كيلو دالتون).
- اكتساب Spectra
ملاحظة: عند معايرة الجهاز، يتم الحصول على أطياف الكتلة من كل بقعة عينة محضرة.- معلمات الاقتناء العامة
- قم بتشغيل مطياف الكتلة في وضع الأيونات الموجبة الخطية.
- اضبط نطاق الكشف عن الكتلة من 2,000-20,000 م / z (2-20 كيلو دالتون).
- استخدم الإعدادات التالية الخاصة بالأداة
- جهد مصدر الأيونات: مصدر الأيون 1 (IS1) عند 20 كيلو فولت ، مصدر الأيون 2 (IS2) عند 18 كيلو فولت ، جهد العدسة عند 9 كيلو فولت. يمكن أن يصل جهد التسارع إلى 25 كيلو فولت.
- جهد الكاشف: اضبط على حوالي 2.65 كيلو فولت.
- إعدادات استخراج الأيونات النبضية: 100 نانوثانية ، وقت الاستخراج المتأخر ثابت عند 230 نانوثانية.
- إعدادات طاقة الليزر: اضبط يدويا للحصول على أفضل جودة طيف (في ضوء عدد الإشارات وشدة الإشارة) ، والتي تتراوح عادة من 40٪ إلى 65٪ من الحد الأدنى للطاقة المطلوبة.
- عدد اللقطات لكل طيف: احصل على عدد كاف من لقطات الليزر من مناطق مختلفة من كل بقعة لتوليد مجموع طيف مع نسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة (S / N) → (أ) متوسط 200 لقطة ، تم التقاطها في 50 خطوة من 4 مناطق مختلفة من كل بقعة أو (ب) الاستحواذ في 500 خطوة لقطة - 50 طلقة من عشرة مواضع مختلفة للنقطة المستهدفة باستخدام وضع AutoXecute .
- استراتيجية قياس العينة
- قم بقياس بقع متعددة لكل عزلة (2 بقعة لكل عزلة على الأقل).
- احصل على الأطياف في تكرار لكل بقعة لضمان اتساق ودقة النتائج → قياسها في تكرار ، بهدف عدد معين من الأطياف الإجمالية لكل عينة (4 أطياف لكل عينة → على الأقل من النسخ المتماثلة التقنية).
ملاحظة: ضع عينات بيولوجية (3 على الأقل) للحصول على التكرارات البيولوجية.
- معلمات الاقتناء العامة
4. تحديد الكائنات الحية الدقيقة وتحليل البيانات
ملاحظة: يحدث تحديد الكائن الحي من خلال مقارنة ملف تعريف البروتين الذي تم الحصول عليه ("بصمة" البروتين المحدد للكائن الحي الدقيق) مع قاعدة بيانات مرجعية ، ويتم استخدام الارتباط الناتج لكل من موضع الإشارة والشدة لتوليد قيمة مطابقة ، والتي تصف مستوى الثقة الذي تمت مطابقة الكائن الحي المدروس مع الكائن الحي الدقيق المرجعي المقابل له. تحديد الكائنات الحية الدقيقة من خلال مقارنة الأطياف المعالجة بقواعد البيانات المرجعية.
- معالجة الأطياف
- استخدم البرمجيات المناسبة لمعالجة الأطياف: (أ) تحليل مرن لأنظمة MALDI Biotyper أو (ب) EX-Accuspec لأنظمة EXS2600.
- تطبيق طريقة Savitzky-Golay كخوارزمية تجانس (العرض 2 م / z ، 10 دورات).
- قم بإجراء تصحيح خط الأساس لإزالة ضوضاء الخلفية باستخدام خوارزمية TopHat (عتبة S / N = 2 ، عرض مرشح TopHat 0.2 Da).
- استخدم وضع النقطة الوسطى كخوارزمية للكشف عن الذروة (عتبة S / N = 2).
- مقارنة قاعدة البيانات وتفسير الدرجات
- قم بتحميل أطياف الكتلة المعالجة للعزلات غير المعروفة إلى منصة MALDI لتحديد الميكروبات. بعد ذلك ، قم بتشغيل التعريف.
ملاحظة: تم استخدام البرنامج التالي في هذه الدراسات: الإصدار 4.1.100 من Biotyper ، الإصدار V1 من Ex-Accuspec. في حالة برنامج MALDI Biotyper ، يوصى بإنشاء الأطياف الرئيسية (MSPs) من الأطياف الخام لضمان أفضل موثوقية مطابقة. - تقييم نتائج تحديد الهوية وفقا للعتبات القياسية للشركة المصنعة.
ملاحظة: بالنسبة إلى MALDI Biotyper و EXS2600، تكون قيم الدرجات:
2.300-3.000: تحديد الأنواع المحتمل جدا.
2.000-2.299: تحديد الجنس الآمن ، تحديد الأنواع المحتملة ؛
1.700-1.999: تحديد الجنس المحتمل.
0.000-1.699: تحديد غير موثوق به.
أثناء تقييم نتيجة التحديد المستمدة من نتائج دعم منصة MALDI Biotyper باستخدام فئات الاتساق: أ- الأنواع المتسقة → أفضل تطابق وجميع المباريات الأخرى ذات قيمة الدرجات العالية المماثلة (>1.999) تشير إلى نفس النوع ؛ ب - الجنس متسق → أفضل تطابق والتطابقات الأخرى ذات قيم الدرجات المتشابهة (1.700 - 1.999) تشير إلى نفس الجنس ، ولكنها قد تختلف على مستوى الأنواع ؛ ج- لم يتم استيفاء متطلبات → الاتساق للأنواع أو تناسق مستوى الجنس.
- قم بتحميل أطياف الكتلة المعالجة للعزلات غير المعروفة إلى منصة MALDI لتحديد الميكروبات. بعد ذلك ، قم بتشغيل التعريف.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
النهج الثقافي
النهج الثقافي هو استراتيجية تهدف إلى تنويع ظروف زراعة الكائنات الحية الدقيقة إلى أقصى حد من أجل زيادة فرص عزل الأنواع النادرة أو التي يصعب زراعتها أو غير الموصوفة سابقا، من بين أمور أخرى. هذا يجعل من الممكن الحصول على صورة أوسع بكثير للتنوع البيولوجي للبكتيريا الموجودة في عينات مختلفة ، على سبيل المثال ، عينات الطعام. يمكن ملاحظة تنوع متزايد للكائنات الحية الدقيقة بالفعل في مرحلة التقييم البصري للمستعمرات ، والتي تختلف في التشكل و...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
يوفر البروتوكول المخصص لتحديد منتجات الألبان الميكروبية تقدما مهما مقارنة بالطرق التقليدية من خلال ضمان الإجماع الأمثل على السرعة والموثوقية والفعالية من حيث التكلفة. ومع ذلك، فإن بعض الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول تتطلب اهتماما دقيقا. أولا ، مرحلة العزل والثقافة أساسية. يجب أن تتطابق وسائط الاستزراع وظروف الحضانة مع التنوع والحمل الميكروبي المتوقع. يعد الحصول على الثقافات النقية أمرا بالغ الأهمية ، وغالبا ما يتطلب الاستزراع الفرعي لتجنب الملامح المختلطة التي تربك تحديد مرض التصلب ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
يعلن جميع المؤلفين عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ES و MZ و P.P. هم أعضاء في مركز Toruń للتميز "نحو الطب الشخصي" الذي يعمل تحت مبادرة التميز - جامعة البحوث. تم دعم هذا البحث ماليا في إطار مشروع LIDER بعنوان "تطوير طريقة تحضيرية لعزل اللاكتوفيرين النشط بيولوجيا" ، DPWP / LIDER-XIII / 6/2023 ، بتمويل من المركز الوطني للبحث والتطوير (وارسو ، بولندا).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| حمض الفورميك 70٪ | تشيمبور | 115676307 | |
| الأسيتونيتريل | ميرك KGaA | 1.00014.1011 | |
| APT agar | ميرك KGaA | 1.10453.0500 | |
| معيار اختبار البكتيريا | بروكر دالتونيك GmbH | 8255343 | |
| CBL Agar (آجار اللاكتوز الأزرق الصيني) | ميرك KGaA | 1.02348.0500 | |
| كولومبيا بلود آغار | أكسويد | CM0331B | |
| M17 أجار | |||
| ميلك بليت كونت أغار (MPCA) | أكسويد | cm0681 | |
| السيدة آجار (دي مان، روجوسا وشارب آغار) | ميرك KGaA | 1.10660.0500 | |
| MSP 96 مستهدف من الفولاذ المصقول BC | بروكر دالتونيك GmbH | 8280800 | |
| ماء بيبتون | سيغما-ألدرتش | 70179 | |
| Scheadler agar | سيغما-ألدرتش | 91019 | |
| دم الخراف | بيوماكسيما | SL0160-100 | |
| حمض ثلاثي فلورو أسيتيك | سيغما-ألدرتش | T6508 | |
| أجار الصويا التريبتيك (TSA) | سيغما-ألدرتش | 22091 | |
| الماء | ميرك KGaA | 1.15333.2500 | |
| α-سيانو-4-حمض الهيدروكسي سيناميك | بروكر دالتونيك GmbH | 8201344 |
المراجع
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Savage, E., et al. Evaluation of three bacterial identification systems for species identification of bacteria isolated from bovine mastitis and bulk tank milk samples. Foodborne PathogDis. 14 (3), 177-187 (2017).
- Holt, J. G., et al. Bergey's manual of determinative bacteriology. , 9th ed, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (2000).
- Franco-Duarte, R., et al. Advances in chemical and biological methods to identify microorganisms-from past to present. Microorganisms. 7 (5), 130(2019).
- Czeszewska-Rosiak, G., et al. The usefulness of the MALDI-TOF MS technique in the determination of dairy samples' microbial composition: Comparison of the new EXS 2600 system with MALDI Biotyper platform. Arch. Microbiol. 206, 172(2024).
- Wilson, D. J., et al. Test agreement among biochemical methods, matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, and 16S rRNA sequencing for identification of microorganisms isolated from bovine milk. J Clin Microbiol. 57 (3), e01381-e01418 (2019).
- Barreiro, J. R., et al. Short communication: Identification of subclinical cow mastitis pathogens in milk by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. J Dairy Sci. 93 (12), 5661-5667 (2010).
- Vithanage, N. R., et al. Species-level discrimination of psychrotrophic pathogenic and spoilage gram-negative raw milk isolates using a combined MALDI-TOF MS proteomics-bioinformatics-based approach. J Proteome Res. 16 (6), 2188-2203 (2017).
- Ashfaq, M. Y., et al. Application of MALDI-TOF MS for identification of environmental bacteria: A review. J Environ Manage. 305, 114359(2022).
- Sugajski, M., et al. New sources of lactic acid bacteria with potential antibacterial properties. Arch Microbiol. 204 (349), 1-13 (2022).
- Lagier, J. C., et al. The rebirth of culture in microbiology through the example of culturomics to study human gut microbiota. Clin Microbiol Rev. 28 (1), 237-264 (2015).
- Złoch, M., et al. Culturomics approach to identify diabetic foot infection bacteria. Int J Mol Sci. 22 (17), 9574(2021).
- Bilen, M., et al. The contribution of culturomics to the repertoire of isolated human bacterial and archaeal species. Microbiome. 6 (94), 1-11 (2018).
- Bourassa, L., Butler-Wu, S. M. MALDI-TOF mass spectrometry for microorganism identification. Method Microbiol. 42, 37-85 (2015).
- Janiszewska, D., et al. Implications of sample preparation methods on the MALDI-TOF MS identification of spore-forming bacillus species from food samples: A closer look at Bacillus licheniformis, Peribacillus simplex, Lysinibacillus fusiformis, Bacillus flexus, and Bacillus marisflavi. ACS Omega. 8 (38), 34982-34994 (2023).
- Valentine, N., et al. Effect of culture conditions on microorganism identification by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. Appl Environ Microbiol. 71 (1), 58-64 (2005).
- Wragg, P., et al. Comparison of Biolog GEN III MicroStation semi-automated bacterial identification system with matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry and 16S ribosomal RNA gene sequencing for the identification of bacteria of veterinary interest. J Microbiol Methods. 105, 16-21 (2014).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن