مقالة منهجية

تحضير العينة لدراسات التمثيل الغذائي لقياس الطيف الكتلي أحادي الخلية: غسل الخلايا المركبة والتبريد والتجفيف والتخزين

DOI:

10.3791/68995

⸱

سبتمبر 16, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma, 2Department of Biochemistry and Physiology, University of Oklahoma Health Sciences Center

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يهدف هذا البروتوكول إلى الحفاظ على مستقلبات الخلايا لقياس الطيف الكتلي أحادي الخلية (SCMS) من خلال الجمع بين غسل محلول الملح المتطاير ، والتبريد السريع للنيتروجين السائل ، والتجفيف بالتجميد ، والتخزين -8 درجة مئوية. يوضح أن تبريد النيتروجين السائل ضروري للحفاظ على ملامح المستقلب ، بينما يجب تقليل التخزين البارد لفترات طويلة لمنع التغيرات الأيضية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبح قياس الطيف الكتلي أحادي الخلية (SCMS) أداة لا غنى عنها لدراسة التمثيل الغذائي الخلوي. نظرا للتقدم في تقنيات قياس الطيف الكتلي الحديثة (MS) والطلب في دراسات عدم تجانس الخلايا في العلوم البيولوجية الأساسية والأمراض البشرية ، تم تطوير وتطبيق مجموعة متنوعة من تقنيات SCMS المختلفة في البحوث المختبرية. نظرا لأن المستقلبات يمكن أن تعكس بدقة حالة الخلية ، فإن تحليل التمثيل الغذائي SCMS للخلايا الحية يعتبر أداة قوية لتوفير معلومات جزيئية حول الخلايا. ومع ذلك ، فإن التحدي الرئيسي في تحليل SCMS للخلايا الحية هو الحفاظ على ملامح المستقلب الداخلية أثناء تحضير العينة ونقلها وقياسها. تخضع المستقلبات الخلوية لدوران سريع وتكون حساسة للغاية للتغيرات البيئية ، مما يجعلها عرضة للتدهور أو التحول قبل التحليل. لمعالجة هذا القيد ، نقدم بروتوكولا قويا وقابلا للتكرار لتحضير الخلايا مصمما للحفاظ على سلامة المستقلب الخلوي ل SCMS. يدمج البروتوكول غسل الخلايا مع محلول فورمات الأمونيوم المتطاير (AF) ، والتبريد السريع بالنيتروجين السائل (LN2) ، والتجفيف بالتجميد بالفراغ ، والتخزين عند -80 درجة مئوية. يقلل هذا النهج من تلف غشاء الخلية مع وقف نشاط التمثيل الغذائي بشكل فعال. تشير النتائج إلى أن التبريد السريع للخلايا أمر حيوي. ومع ذلك ، فإن الحد من وقت التخزين عند -80 درجة مئوية ضروري للحفاظ على مستقلبات الخلية. يمكن استخدام البروتوكول المقترح لتقنيات SCMS الأخرى الحالية للتطبيقات الواسعة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ظهر عدم التجانس من خلية إلى خلية كمبدأ أساسي للأنظمة البيولوجية ، خاصة في سياقات تطور المرض ، ومقاومة الأدوية ، والتمايز الخلوي1،2. في الكائنات متعددة الخلايا ، حتى الخلايا المتطابقة وراثيا في نفس البيئة المكروية يمكن أن تظهر أنماطا ظاهرية مميزة ، تنشأ عن الاختلافات في مستويات النسخ3 ، والبروتينية4 ، والأهم من ذلك ، مستويات التمثيل الغذائي5. في حين أن علم الجينوم وعلم النسخ أحادي الخلية قد اكتسب زخما كبيرا في العقد الماضي ، إلا أن التمثيل الغذائي أحادي الخلية لا يزال متخلفا نسبيا بسبب التعقيد المتأصل والديناميكيات السريعة للمستقلبات6. المستقلبات حساسة للغاية للإشارات البيئية ، ولها هياكل كيميائية وأقطاب متنوعة7 ، وتوجد بتركيزات منخفضة في أحجام الخلايا الصغيرة8. هذه الخصائص تجعل قياسها الموثوق به من الخلايا الفردية تحديا تحليليا. نظرا لأن التمثيل الغذائي يوفر أقرب لقطة للحالة الوظيفية للخلية في الوقت الفعلي ، فإن تطوير طرق دراسة الأيض بقوة بدقة الخلية الواحدة أمر ضروري لفهم أعمق لفسيولوجيا الخلية وعلم الأمراض7.

تقنيات التمثيل الغذائي السائبة التقليدية متوسطة الإشارات عبر مجموعات كبيرة من الخلايا ، مما يخفي عدم التجانس الخلوي ويحتمل أن يحجب التوقيعات الأيضية النادرة ولكن المهمة. في المقابل ، تكشف عمليات التمثيل الغذائي أحادية الخلية عن ملامح كيميائية حيوية فريدة على مستوى الخلية الفردية ، مما يجعلها لا تقدر بثمن لدراسة عمليات مثل تمايز الخلايا الجذعية ، والاستجابات الدوائية ، وآليات المرض6،9،10،11،12،13. لقد طورت الطرق القائمة على قياس الطيف الكتلي (MS) ، مثل التصلب العصبي المتعدد للامتصاص والتأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI) وتصلب التصلب العصبي المتعدد الأيوني الثانوي (SI) ، في هذا المجال ولكنها تواجه تحديات مثل التحضير المعقد ، ومتطلبات الفراغ ، والتأين المدمر الذي يحد من تحليل الخلايا الحية9،14. على وجه الخصوص ، أدت التطورات الأخيرة في الأجهزة إلى تقنيات متطورة ، بما في ذلك وضع الإرسال MALDI إلى جانب التأين الناجم عن الليزر (t-MALDI-215) ومطياف الكتلة الأيونية الثانوية Orbitrap (OrbiSIMS) 16،17 ، مما مكن من التصوير الأيضي ثلاثي الأبعاد عالي الدقة والخالي من الملصقات على مستوى الخلية المفردة وتحت الخلية ، مما يوفر دقة كتلة استثنائية ودقة مكانية.

يعالج مرض التأين المحيط MS هذه المشكلات. تشمل تقنيات SCMS المحيطة التمثيلية قياس الطيف الكتلي للفيديو أحادي الخلية الحي (Video-MS) 18 و DESI19 و nano-DESI20. من بينها ، يعد SCMS أحادي المسبار أحد التقنيات التي تتميز بقدرتها على أخذ عينات من الخلايا الحية وتأينها مباشرة في الوقت الفعلي باستخدام نظام الشعيرات الدموية المزدوج21،22،23،24. تقلل هذه التقنية من اضطراب العينة مع تمكين التنميط الأيضي عالي الدقة في الموقع وقد تم تطبيقها بنجاح على دراسات امتصاص الدواء وتأثيره على التمثيل الغذائي للخلايا22،25،26،27،28،29،30 ، والاستجابات البيئية31،32 ، وعدم التجانس الأيضي33 ،34،35،36 بين الخلايا الفردية.

في حين أن العديد من طرق SCMS المحيطة تتيح تحليل الخلايا الحية ، إلا أنها تعاني عادة من انخفاض الإنتاجية بسبب المعالجة اليدوية المطلوبة لاختيار الخلية الفردية23،37،38. نظرا لأن التمثيل الغذائي للخلايا ديناميكي للغاية ، فإن تحضير العينة الممتد يمكن أن يغير ملامح المستقلبات. لمعالجة هذا ، يطبق الباحثون تقنيات التبريد مباشرة بعد عزل الخلايا39،40. يوقف التبريد نشاط التمثيل الغذائي إما عن طريق التبريد السريع41،42،43،44 أو تمسخ الإنزيم43،45،46،47 ، مما يحافظ على الحالة الكيميائية الحيوية للخلايا في لحظة محددة. هذه الخطوة حيوية لضمان بيانات التمثيل الغذائي الدقيقة وذات الصلة مؤقتا. يجب أن يوقف بروتوكول التبريد الفعال نشاط التمثيل الغذائي داخل الخلايا بسرعة ودقة. تم تقييم طرق مختلفة ، بما في ذلك المحلول الملحي متساوي التوترالبارد 48 ، والأسيتونيتريل المبرد46 ، والميثانول البارد44،47،48،49 ، والمحلول العازل للفوسفات المثلج (PBS) 43،50 ، و LN243،44،51 ، وحتى معالجات الهواء الساخن52. في حين أن العديد من هذه الأشياء تم تطويرها في الأصل لعمليات التمثيل الغذائي للخلايا السائبة ، فقد تم تكييف بعضها ، مثل الميثانول البارد والأسيتونيتريل ، لتقنيات الخلية المفردة مثل Pico-ESI-MS39 و MALDI-MS46. على الرغم من فعاليتها ، إلا أن كل طريقة لها عيوب: قد تتسبب المذيبات العضوية في تسرب المستقلب وتلف أغشية الخلايا48،53 ، ويمكن أن تتداخل محاليل الملح غير المتطايرة مع مرض التصلب العصبي المتعدد عن طريق التسبب في تثبيط الأيونات54 ، وتقليل الحساسية ، والمساس بدقة البيانات47،55.

يستخدم التجميد المفاجئ LN2 بشكل شائع في الأبحاث البيولوجية56 لأنه يوقف التمثيل الغذائي الخلوي بسرعة دون ترك الأملاح غير المتطايرة وراءه ، مما يجعله مناسبا تماما ل SCMS. ومع ذلك ، يمكن أن يتلف أغشية الخلايا ، وهو ما يمثل مشكلة بالنسبة ل SCMS57،58. لتقليل هذا الضرر ، استخدمت بعض الدراسات طريقة تتضمن الترشيح السريع ، وغسل كلوريد الصوديوم البارد ، وتجميد LN2 ، مما يساعد على الاحتفاظ بمستقلبات سريعة الدوران53،59. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة ليست مثالية ل SCMS بسبب الصعوبات في عزل الخلايا الفردية وتأثيرات المصفوفة المحتملة من بقايا الملح. يعد التخزين عند -80 درجة مئوية طريقة حفظ شائعة أخرى ، لكن آثارها على ملامح المستقلب أحادية الخلية لا تزال غير واضحة. لقد أبلغنا سابقا عن دراسات لمعالجة هذه القيود من خلال الجمع بين خطوات رئيسية متعددة: يتم غسل الخلايا أولا بمحلول AF متطاير متوافق مع مرض التصلب العصبي المتعدد ، ثم يتم إخمادها باستخدام LN2 ، وتجفيفها بالتجميد ، وتخزينها في درجة حرارة منخفضة (-80 درجة مئوية) 60. يقلل النهج الحالي من تلف الخلايا وتدهور الأيض ، مما يتيح قياسات SCMS أكثر دقة. يركز هذا العمل على التفاصيل التجريبية ، بهدف تعزيز اعتماد طريقة تحضير الخلايا هذه لتقنيات SCMS القوية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نفذ كل خطوة داخل مختبر معتمد للسلامة البيولوجية من الفئة الثانية وظروف معقمة. في هذه الدراسة ، تم استخدام خط خلية HCT-116 كنظام نموذجي ، وتم استزراع الخلايا في وسط ثقافة كامل. الحكام والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. ثقافة الخلية

  1. تحضير وسط كامل. مكمل وسط McCoy's 5A مع 10٪ مصل أبقار الجنين (FBS) و 1٪ بنسلين ستربتومايسين. قم بتسخينه إلى 37 درجة مئوية.
  2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. راقب التقاء يوميا والمرور عندما تصل الثقافات إلى ~ 80٪ من التقاء القار.
  3. مرور الخلايا (كل ~ 2 أيام).
    1. استنشق الوسط واشطفه مرة واحدة ب 5 مل من 1x PBS.
    2. أضف 2 مل من 0.25٪ من التربسين-EDTA إلى طبق الاستزراع واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق لتسهيل انفصال الخلايا.
    3. قم بتحييد التربسين عن طريق إضافة 8 مل من الوسط الكامل المسخن مسبقا والسحب برفق لتفريق الخلايا.
    4. انقل 1 مل من التعليق إلى 9 مل من الوسط الكامل الطازج.
    5. عد الخلايا.
      ملاحظة: تم حساب الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي TC20 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لم يتم استخدام Trypan Blue أو عوامل تلطيخ أخرى.
  4. خلايا البذور على الأغطية.
    1. تمييع الخلايا إلى تركيز نهائي ~ 1 × 106 خلايا / مل.
    2. ضع الأغطية الزجاجية الفردية مقاس 18 مم في آبار صفيحة مكونة من 12 بئرا.
      ملاحظة: يجب تعقيم الأغطية الزجاجية قبل استخدامها في زراعة الخلايا.
    3. أضف 2 مل من الوسط الكامل و 200 ميكرولتر من تعليق الخلية (~ 2 × 105 خلايا / بئر).
    4. احتضان الخلايا طوال الليل للسماح بربط الخلية.
      ملاحظة: للتأكد من أن الخلايا في حالة نمو طبيعية ، تحقق بشكل روتيني من مورفولوجيا الخلايا وحالة نموها (باستخدام المجهر) بالإضافة إلى فحص التلوث المحتمل بالميكوبلازما (باستخدام مجموعة أدوات الكشف عن الميكوبلازما).

2. غسل الخلايا بمحلول تنسيق الأمونيوم (AF)

ملاحظة: قم بإعداد محلول AF جديد في كل مرة.

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت لغسيل التركيز البؤري التلقائي. يزن 0.45 جم من فورمات الأمونيوم ويذوب في 50 مل من الماء بدرجة LC / MS. التركيز النهائي لفورمات الأمونيوم هو 0.14 M (0.9٪ وزن / وزن).
    ملاحظة: احتفظ بالمحلول باردا (0-4 درجة مئوية) حتى الاستخدام.
  2. أضف 2 مل من محلول التركيزات البؤرية التلقائية البارد إلى كل بئر من اللوحة المكونة من 12 بئرا.
  3. اشطف الأغطية. باستخدام زوج من الملقط المعقم لرفع كل غطاء يحتوي على خلايا ملتصقة برفق من بئره ثم ضعه لفترة وجيزة (لمدة 2-3 ثوان) ضعه في بئر منفصل مملوء مسبقا ب 2 مل من محلول فورمات الأمونيوم البارد 0.9٪ (AF). كرر عملية الشطف.
    ملاحظة: لتجنب إزعاج الخلايا أثناء خطوة الغسيل ، قم بشطف الخلايا برفق شديد.

3. تبريد الخلايا بالنيتروجين السائل (LN2)

  1. ضع كل غطاء مغسول بالتركيز البؤري التلقائي (الخلايا متجهة لأعلى) في طبق بتري داخل حاوية رقائق الألومنيوم.
    ملاحظة: ارتد قفازات مصنفة بالتبريد ونظارات واقية ومعطف مختبر. قم بإجراء جميع مناولات LN2 في منطقة جيدة التهوية. يمكن استخدام رقائق الألومنيوم لطي حاوية للتبريد LN2 .
  2. صب ببطء 10-20 مل من النيتروجين السائل على الأغطية ، مما يضمن تغطية كاملة.
  3. قم بإمالة طبق بتري على الفور بالملاقط لصب أي نيتروجين سائل متبقي.
    ملاحظة: أكمل هذا الإجراء في غضون ثوان قليلة لمنع تكون بلورات الثلج الكبيرة من رطوبة الغسيل المتبقية.

4. تجفيف الخلايا بالتجميد في الفراغ

  1. جففه بالتجميد مباشرة بعد تبريد LN2 لمنع الذوبان.
    ملاحظة: قم بإزالة دوار SpeedVac لإنشاء منصة مسطحة تستوعب طبق Petri مقاس 100 مم.
  2. باستخدام القفازات المبردة والملاقط المعزولة ، ضع طبق بتري الذي يحتوي على أغطية LN2 المبردة على غرفة مكثف الفراغ.
  3. قم بالمعالجة باستخدام إعدادات التفريغ القياسية واستمر لمدة 5-7 دقائق حتى يتبخر LN2 المرئي وتظهر الأغطية جافة. يجب ألا تحتوي الأغطية المجففة على أي بقايا من LN2 وبلورات ثلج.

5. تخزين الخلايا في فريزر -80 درجة مئوية

  1. لف الحاوية بمنشفة ورقية وانقلها إلى ثلاجة -80 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  2. بعد التخزين ، انقل الأغطية التي تحتوي على طبق بتري على الفور إلى مجفف بدرجة حرارة الغرفة لمدة ~ 10 دقائق. تأكد من اختفاء الصقيع المكثف أو الماء على الأغطية تماما قبل إخراجها من المجفف.
    ملاحظة: يؤدي نقل الأغطية بسرعة إلى المجفف إلى تقليل التكثيف ؛ حتى الترطيب السطحي البسيط يمكن أن يذيب المستقلبات المجففة.
  3. بعد غسل الرجفان الأذيني ، قسم العينات إلى مجموعتين (المجموعة 1 والمجموعة 2). قم بتطبيق بروتوكولات المعالجة التالية.
    المجموعة 1: تحليل → SCMS → إخماد LN2 (بدون تخزين).
    المجموعة 2: LN2 → التبريد والتجفيف بالتجميد → تخزين -80 درجة مئوية 48 ساعة → تحليل SCMS.
  4. تابع تحليل SCMS كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: يمكن تحضير المزيد من مجموعات الخلايا باستخدام ظروف مختلفة. تستخدم المجموعة 1 والمجموعة 2 لتوضيح البروتوكولات العامة.

6. تصنيع مسبار واحد وإعداد SCMS

ملاحظة: يتم تصنيع المسبار الفردي وفقا للإجراءات المعمول بها21،24،60،61 ، ويتم توفير بروتوكولات موجزة فقط هنا.

  1. اسحب إبرة الكوارتز مزدوجة التجويف باستخدام مجتذب ليزر وقم بإنشاء طرف ~ 10 ميكرومتر. قم بتجميع مسبار أحادي عن طريق إدخال الشعيرات الدموية للسيليكا المنصهرة وباعث النانو ESI في إبرة الكوارتز مزدوجة التجويف. قم بتثبيت جميع المكونات على شريحة زجاجية باستخدام إيبوكسي سريع التعبئة.
  2. قم بتركيب المسبار الفردي على مرحلة XYZ. قم بلصق المسبار الفردي على مناور XYZ بمحرك موجود تحت مجهر رقمي.
  3. قم بإقران الإعداد بمطياف الكتلة لتحليل SCMS.
  4. استخدم الأسيتونيتريل (≥99.9٪) الذي يحتوي على 0.1٪ حمض الفورميك كمذيب استخلاص بمعدل تدفق 150 نانولتر / دقيقة يتم توصيله بواسطة مضخة حقنة.
  5. قم بتعيين معلمات MS.
    وضع الأيون الموجب: m / z 200-1500 ، +2.9 كيلو فولت ، دقة الكتلة 120 كيلو (عند م / ز 200).
    وضع الأيونات السالبة: م / ز 70-900 ، -2.1 كيلو فولت ، دقة الكتلة 120 كيلو (عند م / ز 200).
    ملاحظة: نظرا لاكتشاف الأيونات السالبة بشكل عام في نطاق m / z أقل من نطاق الأيونات الموجبة ، يمكن استخدام نطاقات m / z مختلفة لهذين الوضعين الأيونيين. تتضمن إعدادات MS الإضافية وقت حقن أقصى يبلغ 100 مللي ثانية ، ومسح مجهري واحد ، والتحكم التلقائي القياسي في الكسب (AGC) ، ووضع المسح الكامل (لتحليل MS) ، والتفكك التصادمي عالي الطاقة (HCD) (لتحليل MS / MS) مع 10-35 طاقة تصادم طبيعية (NCE) ، و 320 درجة مئوية لدرجة حرارة أنبوب نقل الأيونات. تم إنشاء كروماتوگرام أيوني إجمالي (TIC) في كل نقطة مسح / وقت لمراقبة استقرار الإشارة واكتشاف الخلية الواحدة.

7. تجارب SCMS أحادية المسبار

  1. ضع قسائمي الغطاء (المجموعة 1 والمجموعة 2) معا على مرحلة XYZ الآلية لإعداد SCMS أحادي المسبار 21,24,61.
  2. لتقليل تأثيرات الدفعات ، حدد الخلايا بشكل عشوائي تحت المجهر.
  3. اكتساب أطياف كتلة الوضع الأيوني الموجب والسالب. قم بتحليل خلايا متعددة (على سبيل المثال ، ~ 30) لكل مجموعة بنفس المسبار الفردي ومعدل تدفق المذيبات وجهد التأين.
    ملاحظة: استخدم نفس المسبار الفردي ومعدل تدفق المذيبات وفولتية التأين لكل تجربة لضمان قابلية مقارنة البيانات. معايرة Orbitrap يوميا قبل الاستحواذ. يمكن إجراء كل من تحليلات التصلب العصبي المتعدد والتصلب العصبي المتعدد على مستوى الخلية الواحدة. جمع بيانات التصلب العصبي المتعدد للحصول على قيم دقيقة ل m / z لدراسات ملامح الأيض والتسميات المؤقتة في التحليل غير المستهدف. إجراء تحليل MS / MS للأيونات المختارة للتعرف الجزيئي في التحليل المستهدف. تم الحصول على البيانات باستخدام برنامج متوافق للحصول على البيانات وتفسيرها.

8. تحليل البيانات

  1. المعالجة المسبقة لبيانات SCMS الأولية باستخدام برنامج نصي R مخصص. تتضمن خطوات المعالجة المسبقة إزالة الخلفية والضوضاء وتطبيع شدة الأيونات إلى TIC11،12،23.
  2. قم بإزالة النظائر من بيانات SCMS باستخدام حزمة Python ms_deisotope.
  3. قم بإجراء محاذاة الذروة باستخدام برنامج نصي Python60 داخلي. استخدم عرض الحاوية 0.01 م / z للتجميع. استخدم تفاوت كتلة يبلغ 0.01 م / z أو 5 جزء في المليون لمحاذاة الذروة.
  4. قم بإجراء تحليل البيانات الإحصائية باستخدام MetaboAnalyst 6.062. قم بإجراء اختبار t وإنشاء خريطة حرارية (لمستويات المستقلب النسبية). حدد استخدام أفضل 100 في T-test / ANOVA لإنشاء أفضل 100 مستقلب ، مرتبة حسب قيم p من الأقل إلى الأعلى ، مع اختلاف كبير (ص < 0.05) من المقارنة. ارسم خريطة تمثيل لوني باستخدام أفضل 100 مستقلب.
  5. ابحث عن قيم دقيقة m / z وأطياف MS / MS مقابل قاعدة بيانات الأيض البشري (HMDB63). استخدم تفاوترا جماعيا يبلغ 10 صفحات في الدقيقة في البحث عن قاعدة بيانات MS.
    ملاحظة: يمكن استخدام قواعد بيانات أخرى ، مثل LipidMaps64 ، للبحث في قاعدة البيانات.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا التقرير منهجية تدمج غسل الخلايا ، والتبريد السريع للخلايا ، والتجفيف بالفراغ ، والتخزين عند -80 درجة مئوية (الشكل 1). على وجه التحديد ، تم تصميم هذا النهج للحفاظ على الحالة الأيضية للخلايا قبل تحليل SCMS. تم اختبار فعالية هذا البروتوكول من خلال تحضير الخلايا في ظل حالتين مختلفتين: الخلايا المروية والمجففة حديثا (المجموعة 1 ، بمثابة عنصر تحكم) ، والخلايا المخزنة المروية والمجففة و-80 درجة مئوية (المجموعة 2). تم تحليل كل مجموعة باستخدام طريقة SCMS أحادية المسبار في كل من وضعي الأيونات الموجبة والسالبة. تم استخدام تحليل المكونات الرئيسية (PCA) وتصور الخريطة الحرارية لتقييم الاختلافات في ملفات تعريف التمثيل الغذائي عبر المجموعات.

كشفت نتائج PCA في وضع الأيونات الإيجابية (الشكل 2 أ) أن المجموعتين 1 والمجموعة 2 لهما ملامح مستقلبات عامة متشابهة. توضح الملامح المتطابقة تقريبا للمجموعة 1 والمجموعة 2 أن التخزين -80 درجة مئوية لمدة 48 ساعة لا يغير الأيض بشكل كبير إذا تم إخماد الخلايا بشكل صحيح قبل التجفيف. في وضع الأيونات السالبة (الشكل 2 ب) ، لوحظ نمط مماثل ، على الرغم من أن المجموعة 2 تبدو أكثر وضوحا قليلا بسبب اختلافات التأين بين فئات مستقلبات محددة ، على سبيل المثال ، يتم اكتشاف الفوسفاتيديل كولين بشكل أفضل في الوضع الإيجابي ، بينما تتأين الأحماض الدهنية بشكل أكثر كفاءة في الوضع السلبي60. على الرغم من هذا الاختلاف ، فإن التجميع المتسق بين المجموعتين 1 و 2 عبر كلا الوضعين يدعم الاستنتاج القائل بأن بروتوكول التبريد والتجفيف والتخزين المتكامل يحافظ على سلامة التمثيل الغذائي.

أكد تحليل الخريطة الحرارية من صحة نتائج PCA من خلال تصوير الوفرة النسبية لأفضل 100 مستقلب عبر مجموعتين. كما هو موضح في الشكل 3 ، تعرض أفضل 100 مستقلب أنماط وفرة متسقة للغاية بين المجموعة 1 والمجموعة 2 في كلا الوضعين الأيونيين. لم يتم ملاحظة أي تحولات كبيرة أو تجميع خاص بالمجموعة ، على الرغم من أن الاختلافات الطفيفة في عدد قليل من مجموعات المستقلب قد تعكس اختلافات في كفاءة التأين أو استقرار المستقلبات. توضح هذه النتائج مجتمعة أن سير عمل التبريد والتجفيف والتخزين يحافظ على ملامح التمثيل الغذائي الخلوية بدقة عالية ، مما يجعله مناسبا تماما لتطبيقات SCMS المحيطة.

figure-results-1
الشكل 1: سير العمل العام لتحليل قياس الطيف الكتلي أحادي الخلية (SCMS) الذي يبحث في كيفية تأثير تبريد LN2 والتخزين لمدة 48 ساعة عند -80 درجة مئوية على ملامح المستقلب في الخلايا المفردة. (أ) تم زرع الخلايا واحتضانها وشطفها باستخدام محلول تنسيق الأمونيوم (AF). (ب) تم إعداد مجموعتين من الخلايا - المجموعة 1: تم غسل الخلايا وإخمادها وتجفيفها بالتجميد لإجراء تجارب SCMS الفورية دون تخزين. المجموعة 2: تم غسل الخلايا وإخمادها وتجفيفها بالتجميد وتخزينها عند -80 درجة مئوية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: تحليل المكون الرئيسي (PCA) لبيانات SCMS من خلايا HCT-116 في المجموعات التجريبية في (أ) وضع الأيونات الموجبة و (ب) وضع الأيونات السالبة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: خرائط حرارية توضح المستويات النسبية لأعلى 100 مستقلب تم اكتشافها في خلية HCT-116 مفردة محضرة في ظل ظروف مختلفة ، معروضة ل (أ) وضع الأيون الموجب و (ب) وضع الأيونات السالبة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتمثل الخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول في التبريد الفوري للخلايا الحية باستخدام LN2 بعد الغسيل باستخدام AF ، مما يقلل بشكل كبير من النشاط الأنزيمي ويوقف عمليات التمثيل الغذائي المستمرة. بالإضافة إلى ذلك ، أدى غسل الخلايا باستخدام AF قبل التبريد إلى تعزيز شدة الأيونات وتقليل تأثيرات المصفوفة ، مما يدعم إدراجها كخطوة تحضيرية لتحسين حساسية SCMS. في الدراسات الحالية ، تمت زراعة الخلايا في مجموعات مختلفة (أي المجموعة 1 والمجموعة 2) باستخدام نفس الدفعة الأولية لتقليل تباينها البيولوجي. تم اختيار وقت التخزين لمدة 48 ساعة لأن الخلايا ذات وقت النمو الإضافي (المجموعة 1) لا يزال بإمكانها الحفاظ على كثافة الخلايا المناسبة (على سبيل المثال ، لتجنب مجاميع الخلايا) لتحليل SCMS المقارن مع الخلايا المخزنة (المجموعة 2). ومع ذلك ، هناك ما يبرر توخي الحذر عند الاعتماد على التخزين البارد ، حتى لمدة 48 ساعة ، حيث لا تزال هناك تغيرات أيضية كبيرة لوحظت في المقارنات بين العينات المجففة حديثا والمخزنة (المجموعة 1 مقابل العينات المخزنة. المجموعة 2). على الرغم من أنه في الدراسات الفعلية ، يتم تخزين عينات الخلايا والأنسجة عادة لفترات أطول (على سبيل المثال ، لأسابيع وشهور) في مجمد -80 درجة مئوية ، يقترح تقصير وقت التخزين لتقليل التغيرات في المستقلبات.

لذلك يجب أن يركز استكشاف الأخطاء وإصلاحها على تقليل الوقت بين التجفيف وتحليل SCMS ، مما يضمن أن ظروف إزالة الجليد تتجنب التكثيف أو الجفاف الجزئي. يمكن أن يؤدي محتوى الماء المتبقي وتكثيف الماء أثناء انتقالات العينة إلى إعادة ترطيب الخلايا جزئيا وتمكين التفاعلات الأنزيمية والكيميائية مثل التحلل المائي والأكسدة وتحلل البروتين التي تؤدي إلى تحلل المستقلبات65 ، مما يؤدي إلى تغييرات اصطناعية في تكوين المستقلبات. العينات المجففة جيدا توقف هذه العمليات بشكل فعال وتحافظ على السلامة الجزيئية66. يعد ضمان بيئة جفاف خالية من الرطوبة والانتقال السريع إلى SCMS أمرا أساسيا لتجنب هذه المزالق.

على الرغم من نجاح هذه الطريقة في الحفاظ على ملامح المستقلب ، لا تزال هناك قيود. تتطلب الطريقة الوصول إلى نظام التجفيف بالتفريغ وفريزر -80 درجة مئوية ، وهي ليست فعالة تماما للتخزين طويل الأجل. علاوة على ذلك ، في حين أن التجفيف السريع في درجة حرارة الغرفة يحافظ على المستقلبات مؤقتا ، إلا أنه ليس بديلا عن التبريد LN2 . قد تستمر التعديلات المتعلقة بالتخزين بسبب إزالة المياه غير الكاملة وخطر الجفاف أثناء معالجة العينات. تسلط هذه القيود الضوء على الحاجة إلى تحسين الطريقة إذا كان التخزين الأطول أو الإنتاجية المرتفعة مطلوبة.

تقدم البروتوكولات المبلغ عنها في هذا العمل نهجا مبسطا وفعالا للحفاظ على الأيض أحادي الخلية ل SCMS المحيط. على عكس الطرق التي تتطلب واقيات مبرمجة بالتبريد أو تجميد في الموقع ، فإن سير العمل لدينا متوافق بسهولة مع تقنيات التأين المحيط الحالية ويسمح بأخذ عينات مرنة وجداول زمنية للتحليل. يوفر دمج غسل الخلايا والتبريد والتجفيف والتخزين قصير الأجل دون فقدان كبير لدقة التمثيل الغذائي حلا عمليا للمختبرات التي تفتقر إلى الوصول عند الطلب إلى مطياف الكتلة. يتمتع هذا النهج بإمكانيات قوية للنهوض بالبحث في بيولوجيا الأنظمة أحادية الخلية ، واستقلاب السرطان ، وعدم تجانس الاستجابة للأدوية ، والتنميط الظاهري الأيضي لمجموعات الخلايا النادرة. إن التطبيق الواسع لهذه البروتوكولات ، لا سيما بالنسبة لمنصات SCMS القائمة على التأين المحيط ، يجعلها مساهمة مهمة في مجال التقنيات التحليلية أحادية الخلية. في الدراسات المستقبلية ، يمكن تكييف هذه البروتوكولات وصقلها لاستيعاب مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. من خلال خطوات تحضير العينة الإضافية (على سبيل المثال ، تطبيق المصفوفة) ، يمكن تحليل الخلايا المعالجة بواسطة تقنيات SCMS الأخرى (على سبيل المثال ، MALDI و SIMS) ، مما يوفر دقة مكانية أعلى وإنتاجية لتحليل أعداد أكبر من الخلايا (على سبيل المثال ، الخلايا شديدة التقارئ). تشير النتائج أيضا إلى أنه يمكن استخدام بروتوكولات التبريد والتجفيف والتخزين هذه لإعداد الخلايا للشحن (على سبيل المثال ، في حاويات الثلج الجاف) ، مما يسمح بإجراء دراسات SCMS التعاونية في مواقع مختلفة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (2305182) ، والمعاهد الوطنية للصحة (1R01AI177469) ، ومبادرة تشان زوكربيرج. تم إنشاء الشكل 1 في BioRender (https://BioRender.com/yqn5isk).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
-80 درجة ؛ فريزر Cإيبندورف نيو برونزويكيو 700تحضير العينة
أسيتونتريلثيرموفيشر العلمية240744إعداد تجربة SCMS
فورمات الأمونيوم ثيرموفيشر العلمية401152500تحضير العينة
غطاء 18 ممزجاج غطاء صغير VMR48380046ثقافة الخلية
مجهر مجسم رقميشنتشن دي آند شركة F.سوبر آيز T004تحليل
أنابيب كوارتز مزدوجة التجويف ، 1.120 بوصة × 0.005 بوصة × 12 بوصةفريدريش & شركة ديموكMBT-005-020-2Qتصنيع مسبار واحد
راتنجات الايبوكسيديفكونالجزء رقم 20945تصنيع مسبار واحد
حمض الفورميكعلوم وارد 470301-120 500 ملإعداد تجربة SCMS
الشعيرات الدموية السيليكا المنصهرة ، ID: 40 µ ؛ م ، OD: 100 & mتقنيات بولي ميكروTSP040105تصنيع مسبار واحد
الشعيرات الدموية السيليكا المنصهرة ، ID: 50 & م ، OD: 150 & mتقنيات بولي ميكرو1068150015إعداد تجربة SCMS
أغطية زجاجية، 18 ممVWR 48380046ثقافة الخلية
مصل HyClone الاصطناعي (FBS)هيكلونSH3006603ثقافة الخلية
حاضنه هيراسيل (Heraeus)ثقافة الخلية
مجتذب الليزرشركة سوتر إنسترومنتنموذج P-2000تصنيع مسبار واحد
مصباح LED للأشعة فوق البنفسجيةفوشان ليانغ يا معدات طب الأسنانLY-C240تصنيع مسبار واحد
مكوي 5 أ جيبكو 2537128ثقافة الخلية
ميكرويونيونآيدكس للصحة و العلوم ذ م مإم -539إعداد تجربة SCMS
واجهة FAIMS pro المعدلة ثيرمو فيشر 98100-20046تحليل
مجموعة أدوات الكشف عن الميكوبلازما MycoAlert PLUSلونزاLT07-703ثقافة الخلية
لوحة بصرية شركة Thorlabs ، نيوتنتحليل
مياه من الدرجة Optima LC / MS (فيشر كيميكال ، الولايات المتحدة الأمريكية)ثيرموفيشر العلميةدبليو 6500تحضير العينة
مطياف الكتلة Orbitrap Exploris 240 ثيرموفيشر العلميةإعداد تجربة SCMS
البنسلين / الستربتومايسينجيبكو15140-122ثقافة الخلية
محلول ملحي مخزن من الفوسفات (PBS)VWR0780-50 لترثقافة الخلية
مكثف SpeedVac (Savant)ثيرموفيشر العلمية SPD111 فولتتحضير العينة
مضخة حقنة (SKE10)شركة Chemyx80561إعداد تجربة SCMS
حقنة ، 250 & Lهاملتون1725LTN250ULإعداد تجربة SCMS
TC20 عداد الخلايا الآليمختبرات بيو راد 1450102EDUعدد الخلايا
طبق زراعة الأنسجة ، 100 ممفيشر العلمي FB012924ثقافة الخلية
التربسين-EDTAثيرموفيشر العلمية25200-072ثقافة الخلية
مجهر رقمي USB ("Scorpio" 500 Zoom)Chinavasion ، الجملة المحدودةتحليل
راتنج علاج الأشعة فوق البنفسجيةبرايم لطب الأسنانرقم الصنف 006.030تصنيع مسبار واحد
برنامج Xcaliburثيرموفيشر العلمية
مرحلة XYZ (CONEX- MFACC)شركة نيوبورتتحليل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, S., Vu, H. M., Lee, J. H., Lim, H., Kim, M. S. Advances in mass spectrometry-based single cell analysis. Biology (Basel). 12 (3), 393(2023).
  2. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nat Methods. 8 (4 Suppl), S20-S29 (2011).
  3. Kanter, I., Kalisky, T. Single cell transcriptomics: Methods and applications. Front Oncol. 5, 53(2015).
  4. Newman, J. R., et al. Single-cell proteomic analysis of s. Cerevisiae reveals the architecture of biological noise. Nature. 441 (7095), 840-846 (2006).
  5. Rubakhin, S. S., Lanni, E. J., Sweedler, J. V. Progress toward single cell metabolomics. Curr Opin Biotechnol. 24 (1), 95-104 (2013).
  6. Yang, Y., et al. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 14-26 (2017).
  7. Johnson, C. H., Gonzalez, F. J. Challenges and opportunities of metabolomics. J Cell Physiol. 227 (8), 2975-2981 (2012).
  8. By B Alberts, D. B., Lewis, J., Raft, M., Roberts, K., Watson, J. D. Molecular biology of cell. 1361, Garland Publishing. (1994).
  9. Zhang, L., Vertes, A. Single-cell mass spectrometry approaches to explore cellular heterogeneity. Angew Chem Int Ed Engl. 57 (17), 4466-4477 (2018).
  10. Duncan, K. D., Fyrestam, J., Lanekoff, I. Advances in mass spectrometry-based single-cell metabolomics. Analyst. 144 (3), 782-793 (2019).
  11. Lan, Y., Zou, Z., Yang, Z. Single cell mass spectrometry: Towards quantification of small molecules in individual cells. TrAC Trends Anal Chem. 174, 117657(2024).
  12. Renmeng Liu, Z. Y. Single cell metabolomics using mass spectrometry- techniques and data analysis. Analytica Chimica Acta. 1143, 11(2021).
  13. Chen, Z. Y., et al. Metabolomics studies of cell-cell interactions using single-cell mass spectrometry combined with fluorescence microscopy. Chem Sci. 13, 6687-6695 (2022).
  14. Ibanez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  15. Niehaus, M., Soltwisch, J., Belov, M. E., Dreisewerd, K. Transmission-mode MALDI-2 mass spectrometry imaging of cells and tissues at subcellular resolution. Nat Methods. 16 (9), 925-931 (2019).
  16. Passarelli, M. K., et al. The 3D orbisims-label-free metabolic imaging with subcellular lateral resolution and high mass-resolving power. Nat Methods. 14 (12), 1175-1183 (2017).
  17. Suvannapruk, W., et al. Single-cell metabolic profiling of macrophages using 3D orbisims: Correlations with phenotype. Anal Chem. 94 (26), 9389-9398 (2022).
  18. Tsuyama, N., Mizuno, H., Tokunaga, E., Masujima, T. Live single-cell molecular analysis by video-mass spectrometry. Anal Sci. 24 (5), 559-561 (2008).
  19. Zhang, H., Shi, X., Lu, H., Li, L. Delineation of subcellular molecular heterogeneity in single cells via ultralow-flow-rate desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging. Anal Chem. 97 (18), 9985-9991 (2025).
  20. Bergman, H. -M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-desi ms. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  21. Pan, N., et al. The single-probe: A miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).
  22. Liu, R., Zhang, G., Yang, Z. Towards rapid prediction of drug-resistant cancer cell phenotypes: Single cell mass spectrometry combined with machine learning. Chem Commun (Camb). 55 (5), 616-619 (2019).
  23. Bhusal, D., Wije Munige, S., Peng, Z., Yang, Z. Exploring single-probe single-cell mass spectrometry: Current trends and future directions. Anal Chem. 97 (9), 4750-4762 (2025).
  24. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. Applications of the single-probe: Mass spectrometry imaging and single cell analysis under ambient conditions. J Vis Exp. (112), e53911(2016).
  25. Pan, N., et al. Quantification of drug molecules in live single cells using the single-probe mass spectrometry technique. Anal Chem. 91 (14), 9018-9024 (2019).
  26. Sun, M., Yang, Z. Metabolomic studies of live single cancer stem cells using mass spectrometry. Anal Chem. 91 (3), 2384-2391 (2019).
  27. Lan, Y., Chen, X., Yang, Z. Quantification of nitric oxide in single cells using the single-probe mass spectrometry technique. Anal Chem. 95 (51), 18871-18879 (2023).
  28. Chen, X., Sun, M., Yang, Z. Single cell mass spectrometry analysis of drug-resistant cancer cells: Metabolomics studies of synergetic effect of combinational treatment. Anal Chim Acta. 1201, 339621(2022).
  29. Sun, M., Chen, X., Yang, Z. Single cell mass spectrometry studies reveal metabolomic features and potential mechanisms of drug-resistant cancer cell lines. Anal Chim Acta. 1206, 339761(2022).
  30. Bensen, R. C., et al. Single-cell mass spectrometry quantification of anticancer drugs: Proof of concept in cancer patients. ACS Pharmacol Transl Sci. 4 (1), 96-100 (2021).
  31. Liu, R., Zhang, G., Sun, M., Pan, X., Yang, Z. Integrating a generalized data analysis workflow with the single-probe mass spectrometry experiment for single cell metabolomics. Anal Chim Acta. 1064, 71-79 (2019).
  32. Nguyen, T. D., et al. Single-cell mass spectrometry enables insight into heterogeneity in infectious disease. Anal Chem. 94 (30), 10567-10572 (2022).
  33. Liu, R., et al. Quantifying cell heterogeneity and subpopulations using single cell metabolomics. Anal Chem. 95 (18), 7127-7133 (2023).
  34. Pan, N., Rao, W., Standke, S. J., Yang, Z. Using dicationic ion-pairing compounds to enhance the single cell mass spectrometry analysis using the single-probe: A microscale sampling and ionization device. Anal Chem. 88 (13), 6812-6819 (2016).
  35. Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Mass spectrometry measurement of single suspended cells using a combined cell manipulation system and a single-probe device. Anal Chem. 91 (3), 1738-1742 (2019).
  36. Chen, X., Peng, Z., Yang, Z. Metabolomics studies of cell-cell interactions using single cell mass spectrometry combined with fluorescence microscopy. Chem Sci. 13 (22), 6687-6695 (2022).
  37. Bergman, H. M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-desi ms. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  38. Portero, E. P., Nemes, P. Dual cationic-anionic profiling of metabolites in a single identified cell in a live Xenopus laevis embryo by microprobe CE-ESI-MS. Analyst. 144 (3), 892-900 (2019).
  39. Zhang, X. C., et al. Combination of droplet extraction and pico-ESI-MS allows the identification of metabolites from single cancer cells. Anal Chem. 90 (16), 9897-9903 (2018).
  40. Guo, S., Zhang, C., Le, A. The limitless applications of single-cell metabolomics. Curr Opin Biotechnol. 71, 115-122 (2021).
  41. Buziol, S., et al. New bioreactor-coupled rapid stopped-flow sampling technique for measurements of metabolite dynamics on a subsecond time scale. Biotechnol Bioeng. 80 (6), 632-636 (2002).
  42. Sake, C. L., Newman, D. M., Boyle, N. R. Evaluation of quenching methods for metabolite recovery in photoautotrophic Synechococcus sp. Pcc 7002. Biotechnol Prog. 36 (5), e3015(2020).
  43. Wang, T. X. Y. G., Zhuang, Y., Wang, G. A systematic evaluation of quenching and extraction procedures for quantitative metabolome profiling of HeLa carcinoma cell under 2D and 3D cell culture conditions. Biotechnol J. 18 (5), e2200444(2023).
  44. Hernandez Bort, J. A., et al. Reduced quenching and extraction time for mammalian cells using filtration and syringe extraction. J Biotechnol. 182 - 183 (100), 97-103 (2014).
  45. House, R. R. J., et al. A diverse proteome is present and enzymatically active in metabolite extracts. Nat Commun. 15 (1), 5796(2024).
  46. Amantonico, A., Urban, P. L., Fagerer, S. R., Balabin, R. M., Zenobi, R. Single-cell MALDI-MS as an analytical tool for studying intrapopulation metabolic heterogeneity of unicellular organisms. Anal. Chem. 82, 6(2010).
  47. Sellick, C. A., et al. Effective quenching processes for physiologically valid metabolite profiling of suspension cultured mammalian cells. Anal Chem. 81 (1), 174-183 (2008).
  48. Dietmair, S., Timmins, N. E., Gray, P. P., Nielsen, L. K., Kromer, J. O. Towards quantitative metabolomics of mammalian cells: Development of a metabolite extraction protocol. Anal Biochem. 404 (2), 155-164 (2010).
  49. Faijes, M., Mars, A. E., Smid, E. J. Comparison of quenching and extraction methodologies for metabolome analysis of Lactobacillus plantarum. Microb Cell Fact. 6, 27(2007).
  50. Pabst, M. G. J., et al. Nucleotide and nucleotide sugar analysis by liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry on surface-conditioned porous graphitic carbon. Anal. Chem. 82 (23), 6(2010).
  51. Lorenz, M. A., Burant, C. F., Kennedy, R. T. Reducing time and increasing sensitivity in sample preparation for adherent mammalian cell metabolomics. Anal Chem. 83 (9), 3406-3414 (2011).
  52. Wahrheit, J., Heinzle, E. Quenching methods for the analysis of intracellular metabolites. Methods Mol Biol. 1104, 211-221 (2014).
  53. Volmer, M., Gettmann, J., Scholz, S., Buntemeyer, H., Noll, T. A method for metabolomic sampling of suspended animal cells using fast filtration. BMC Proc. 5 (Suppl 8), P93(2011).
  54. Richard King, R. B., Fernandez-Metzler, C., Cynthia Miller-Stein, A. T. O. Mechanistic investigation of ionization suppression in electrospray ionization. J Am Soc Mass Spectrom. 11, 8(2000).
  55. Dunn, W. B. Current trends and future requirements for the mass spectrometric investigation of microbial, mammalian and plant metabolomes. Phys Biol. 5 (1), 011001(2008).
  56. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: Quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), 53(2017).
  57. Krismer, J., et al. Screening of Chlamydomonas reinhardtii populations with single-cell resolution by using a high-throughput microscale sample preparation for matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. Appl Environ Microbiol. 81 (16), 5546-5551 (2015).
  58. Ye, D., et al. Improved sample preparation for untargeted metabolomics profiling of Escherichia coli. Microbiol Spectr. 9 (2), e0062521(2021).
  59. Volmer, M., et al. Fast filtration for metabolome sampling of suspended animal cells. Biotechnol Lett. 33 (3), 495-502 (2011).
  60. Wije Munige, S., Bhusal, D., Peng, Z., Chen, D., Yang, Z. Developing a cell quenching method to facilitate single cell mass spectrometry metabolomics studies. JACS Au. 5 (5), 2379-2387 (2025).
  61. Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells. J Vis Exp. (148), e59875(2019).
  62. Pang, Z., et al. Metaboanalyst 6.0: Towards a unified platform for metabolomics data processing, analysis and interpretation. Nucleic Acids Res. 52 (W1), W398-W406 (2024).
  63. Wishart, D. S., et al. Hmdb 5.0: The human metabolome database for 2022. Nucleic Acids Research. 50 (D1), D622-D631 (2022).
  64. Conroy, M. J., et al. Lipid maps: Update to databases and tools for the lipidomics community. Nucleic Acids Res. 52 (D1), D1677-D1682 (2024).
  65. Pinu, F., Villas-Boas, S. Extracellular microbial metabolomics: The state of the art. Metabolites. 7 (3), 43(2017).
  66. Rockinger, U., Funk, M., Winter, G. Current approaches of preservation of cells during (freeze-) drying. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (8), 2873-2893 (2021).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة