مقالة منهجية

إعداد وتقييم نموذج قصور المبيض المبكر للفئران

1.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69000

⸱

سبتمبر 19, 2025

 , 
1The First Hospital of Anhui University of Science and Technology'

في هذه المقالة

ملخص

يحدد هذا البروتوكول طريقة لبناء نموذج فأر قصور المبيض المبكر عن طريق حقن سيكلوفوسفاميد. يكرر النموذج بشكل فعال وسهل وقابل للتكيف التقدم المرضي لقصور المبيض البشري المبكر ، مما يدل على موثوقية عالية وفعالية من حيث التكلفة.

الملخص

قصور المبيض المبكر (POI) هو حالة حرجة تؤدي إلى العقم عند النساء ، مما يستلزم نماذج حيوانية موثوقة للبحث الميكانيكي والعلاجي. هنا ، نقدم بروتوكولا موحدا لإنشاء وتقييم نموذج فأر POI الناجم عن السيكلوفوسفاميد (CTX). تم اختيار إناث الفئران البالغة من العمر ستة إلى ثمانية أسابيع مع دورات شبق منتظمة وإخضاعها لحقن CTX داخل الصفاق: جرعة أولية قدرها 100 مجم / كغ في اليوم الأول ، تليها جرعات يومية قدرها 20 مجم / كجم لمدة 14 يوما لاحقة. تمت مراقبة التغيرات الديناميكية في دورات الشبق عن طريق علم الخلايا المسحة المهبلية مع تلطيخ رايت. تم قياس مستويات المصل من الاستراديول (E2) والهرمون المنبه للجريب (FSH) والهرمون المضاد للمولر (AMH) باستخدام ELISA لتقييم تغيرات الغدد الصماء. تم تقييم علم الأنسجة في المبيض من خلال تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (H & E) للأقسام المضمنة بالبارافين لتحديد رتق الجريبات ، بينما تم إجراء التحليل الكيميائي المناعي للكاسباز المشقوق -3 للكشف عن موت الخلايا المبرمج للخلايا الحبيبية. أظهرت النتائج تعطيل دورة الشبق ، وانخفاض كبير في مستويات E2 و AMH ، وارتفاع تركيزات FSH ، وزيادة رتق الجريبات ، وتعزيز موت الخلايا المبرمج للخلايا الحبيبية في الفئران المعالجة ب CTX ، مما يؤكد نمذجة POI الناجحة. يمكن لطريقة بناء النموذج هذه أن تحاكي بشكل كبير آلية تلف المبيض الناجم عن العلاج الكيميائي ، وتقدم سمات مرضية نموذجية مثل استنفاد احتياطي البصيلات واضطرابات الهرمونات الجنسية. يوفر منصة تجريبية موثوقة للكشف عن آلية السمية الإنجابية للعلاج الكيميائي ، وفحص الأدوية التي تحمي المبيض ، وتحسين استراتيجيات الحفاظ على الخصوبة. علاوة على ذلك ، فإن هذا النموذج سهل التشغيل نسبيا ومنخفض التكلفة وله دورة إنتاج قصيرة ، مما يجعل من السهل تنفيذه وتعميمه. تتوافق المنهجية مع متطلبات JoVE للعروض التجريبية القابلة للتصور خطوة بخطوة.

المقدمة

قصور المبيض المبكر (POI) ، وهو الشكل الأكثر انتشارا لاضطراب الشيخوخة الإنجابية للإناث ، لا يضر بصحة المرضى الجسدية والعقلية بشدة من خلال أعراض نقص هرمون الاستروجين وضعف الإنجاب فحسب ، بل يزيد أيضا من مخاطر الإصابة بالأمراض المصاحبة ، بما في ذلك الكسور واضطرابات المناعة الذاتية وأمراض القلب والأوعية الدموية وداء السكري وما إلى ذلك.1. وبالتالي ، أصبح تطوير استراتيجيات علاجية فعالة وآمنة أولوية ملحة للغاية في الطب الحديث. نظرا للتوافر المحدود للعينات السريرية ، والمسببات متعددة العوامل ، والمخاطر الأخلاقية العالية المرتبطة بأبحاث POI ، أصبح إنشاء نماذج حيوانية موثوقة تسمح بالتحقيق الميكانيكي المنهجي والتحقق من صحة السلامة أمرا لا غنى عنه.

حاليا ، يتم استخدام نماذج تلف المبيض الناجم عن العلاج الكيميائي على نطاق واسع لدراسات POI. تم تحديد سيكلوفوسفاميد (CTX) ، وهو عامل مؤلكل له خصائص مثبطة للمناعة ، على أنه مركب قوي سام للغدد التناسلية. تتضمن آليتها تلف تشابك الحمض النووي لقمع التكاثر الخلوي2 ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج للخلايا الاحتياطية للمبيض3،4. تلخص النماذج المستندة إلى CTX بشكل فعال السمات المميزة السريرية ل POI ، بما في ذلك استنفاد البصيلات البدائية ، ونقص هرمون الاستروجين في الدم ، وارتفاع مستويات الهرمون المنبه للجريب (FSH). يوفر حقن CTX داخل الصفاق في الفئران مزايا مميزة: التوافر البيولوجي العالي من خلال الامتصاص البريتوني السريع ، وقابلية التشغيل الموحدة مع الحد الأدنى من التباين التقني ، والفعالية من حيث التكلفة للدراسات واسعة النطاق. والجدير بالذكر أن بنية المبيض للفئران تشبه إلى حد كبير بنية البشر ، مما يسهل الملاحظة الديناميكية لنضوب البصيلات والتغيرات الهرمونية. علاوة على ذلك ، فإن الفئران منخفضة التكلفة ولديها معدل تكاثر سريع ، وتفي بمتطلبات دراسات العينات واسعة النطاق.

على الرغم من هذه المزايا ، أدى عدم التجانس في أنظمة جرعات CTX (على سبيل المثال ، الحقن أحادي البلعة مقابل الحقن المجزأة) ونوافذ الإدارة الزمنية إلى نتائج نمذجة غير متسقة عبر الدراسات. لمعالجة هذه الفجوة ، نقدم بروتوكولا منهجيا لتحسين جرعة CTX وتكرار الإدارة لتحريض POI في الفئران. تهدف هذه الدراسة إلى إنشاء نموذج قابل للتكرار من خلال التقييم الكمي لنضوب احتياطي المبيض ، وعدم التنظيم الهرموني ، والارتباطات النسيجية المرضية ، وبالتالي توفير منصة قوية للاستكشاف الميكانيكي والفحص العلاجي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت مراجعة هذا البروتوكول والموافقة عليه من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة لشركة Anhui Shendong Biotechnology Development Co.، Ltd. (رقم الأخلاقيات: SDLL202502281). تلتزم هذه الدراسة بإرشادات المعاهد الوطنية للصحة بشأن رعاية واستخدام القوارض المختبرية في جميع إجراءات التجارب على. كانت أنثى الفئران C57BL / 6 المستخدمة في هذه التجربة تبلغ من العمر 6-8 أسابيع وتم الحفاظ عليها في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF). كسلالة فطرية وسلالة فرعية من سلالة C57 ، تتميز فئران C57BL / 6 بمعطفها الأسود. قبل التجربة ، تأقلمت الفئران لمدة أسبوع واحد في مختبر في ظل ظروف درجة حرارة ورطوبة خاضعة للرقابة ، مع دورة ضوئية / داكنة مدتها 12 ساعة لتقليد إيقاعات الساعة البيولوجية الطبيعية. طوال فترة التأقلم ، تم تزويد الفئران بحرية الوصول إلى الغذاء والماء.

1. تحضير

ملاحظة: حدد 24 أنثى فأر من فئة C57BL / 6 بعامل حماية من الشمس تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع مع دورات شبق طبيعية. اجمع سائل الغسيل المهبلي من الفئران في الساعة 9:00 صباحا لمدة 10 أيام متتالية لتحضير مسحات الخلايا المهبلية المقشرة. راقب دورات الشبق واختر الفئران التي لديها دورة واحدة مستمرة وكاملة على الأقل.

  1. اسمح للفئران بالتأقلم مع البيئة لمدة أسبوع واحد قبل التجارب. ضع علامة على الفئران باستخدام ثقب الأذن بعد فترة التكيف. سجل قياسات وزن الجسم مباشرة بعد وضع العلامات.
  2. أمسك الفئران بإحكام حتى يحدث التبول الطبيعي الناجم عن الإجهاد. شل الحركة عن طريق الضغط على جلد الرقبة الظهرية بين الإبهام والسبابة في اليد اليسرى. ضع رأس الماوس لأسفل لكشف منطقة البطن بالكامل.
  3. قم بتحميل طرف ماصة معقمة على ماصة دقيقة. استنشاق 10 ميكرولتر من محلول ملحي فسيولوجي معقم. قم بإجراء ثلاث دورات تدفق متتالية عبر القناة المهبلية. احتفظ بسائل الغسيل داخل طرف الماصة.
  4. قم بتوزيع سائل الغسيل بالتساوي عبر شريحة المجهر الزجاجي. تنزلق بالهواء تماما في درجة حرارة الغرفة. إصلاح الخلايا عن طريق غمرها في 95٪ إيثانول لحفظها. قم بتسمية الشرائح بشكل شامل مع المعلمات التجريبية ، والحفاظ على التخزين المحمي في صناديق الشرائح المقاومة للضوء عند 4 درجات مئوية عند عدم المعالجة.
  5. بروتوكول تلطيخ رايت
    1. اغمر الشرائح في 95٪ إيثانول (لمدة 3-10 دقائق). اشطفها جيدا تحت تيار الماء المقطر.
    2. نقل الشرائح من خلال حمام الإيثانول بنسبة 95٪ (مدة 1 دقيقة).
    3. اكشط الفيلم المؤكسد من سطح محلول الهيماتوكسيلين باستخدام ورق ترشيح نظيف. اغمر الشرائح في الهيماتوكسيلين المصفى (لمدة 5 دقائق).
    4. اشطف الشرائح بالماء المقطر. اغمس لفترة وجيزة (<1 ثانية) في محلول حمض الهيدروكلوريك 1٪. يكتمل بشطف الماء المقطر الممتد.
    5. تحضير بقع مختلطة باستخدام محاليل Orange G و EA50. وصمة عار الشرائح في الخليط (لمدة 3 دقائق).
    6. مرر الشرائح عبر ثلاثة حمامات إيثانول متتالية بنسبة 95٪ (فترات 5 ثوان).
    7. عالج بالزيلين على مرحلتين (2 دقيقة لكل منهما).
      ملاحظة: قم بالتشغيل داخل غطاء الدخان لتجنب استنشاق بخار الزيلين. أغلق الحاويات مباشرة بعد الاستخدام.
    8. الحفاظ على العينات بشكل دائم باستخدام وسيط تركيب الراتنج المحايد
  6. عند قراءة الشريحة تحت المجهر ، حدد الخلايا ذات السيتوبلازم الوردي الباهت والنوى الأرجوانية الداكنة كخلايا ظهارية نواة ، وخلايا وردية شاحبة غير متقشرة غير متقشرة كخلايا ظهارية متقرنة ، وخلايا زرقاء مستديرة صغيرة كخلايا دم بيضاء.
    ملاحظة: حدد مرحلة دورة الشبق بناء على الخصائص الخلوية التالية: (1) مرحلة الشبق: الخلايا الظهارية ذات النواة السائدة. تظهر كخلايا فردية وأوراق مجمعة. وجود الكريات البيض المتناثرة (<5٪ مجال الرؤية); (2) مرحلة الشبق: خلايا ظهارية متقرنة وفيرة الخصائص: مورفولوجيا كبيرة مسطحة مع حدود غير منتظمة. قريب من غياب الكريات البيض والخلايا المنواة (<2٪ مجتمعة); (3) مرحلة Metestrus: تقليل عدد الخلايا الكيراتينية. تسلل الكريات البيض الناشئ. عودة ظهور الخلايا الظهارية نواة (20٪-40٪ تكوين); (4) مرحلة Diestrus: الكريات البيض السائدة والخلايا المنواة (>80٪). الغياب الافتراضي للخلايا الكيراتينية (<1٪)5. الرجوع إلى الأطلس الخلوي القياسي في الشكل 1 للتحقق من النمط.
  7. تنظيم البيانات وتحليلها، واختيار 24 فأرا بدورات شبق طبيعية.

2. تحضير حقن سيكلوفوسفاميد

ملاحظة: سيكلوفوسفاميد غير مستقر للضوء ويجب التعامل معه في الظلام طوال العملية. السيكلوفوسفاميد سام ، لذلك يجب ارتداء الملابس الواقية وقفازات النتريل ذات الطبقة المزدوجة والأقنعة أثناء العملية.

  1. أضف 200 مجم من مسحوق سيكلوفوسفاميد المعقم من الدرجة الصيدلانية إلى 10 مل من المحلول الملحي المعقم. تخلط جيدا للحصول على محلول سيكلوفوسفاميد 20 مجم / مل. احتفظ بجزء واحد للاستخدام الفوري. تحضير تركيزات إضافية مع الباقي.
  2. انقل 200 ميكرولتر من مخزون 20 مجم / مل إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل ملفوف بورق الألمنيوم. أضف 800 ميكرولتر من المحلول الملحي المعقم للوصول إلى الحجم الإجمالي 1 مل. خلط دوامة لمدة 30 ثانية للحصول على محلول 4 مجم / مل. قم بإعداد 14 حصة متطابقة (1 مل لكل منها). قم بتخزين جميع الحصص في درجة حرارة -20 درجة مئوية في رف عمودي.

3. حقن محلول السيكلوفوسفاميد

ملاحظة: قم بتقسيم 24 فأرا عشوائيا إلى ثلاث مجموعات باستخدام نظام محوسب: (1) فارغ: لا يوجد علاج (ن = 8) ؛ (2) NS: ضوابط مالحية (ن = 8)؛ (3) POI: مجموعة سيكلوفوسفاميد (ن = 8). حقن الفئران كل صباح الساعة 9:00. بالنسبة لمجموعة POI ، يتم حقن 100 مجم / كغ من محلول سيكلوفوسفاميد داخل الصفاق في اليوم الأول ، ثم حقن 20 مجم / كغ من محلول سيكلوفوسفاميد بشكل مستمر لمدة 14 يوما القادمة. حقن حجم متساو من المحلول الملحي الطبيعي داخل الصفاق في مجموعة NS ، واترك مجموعة BALNK دون علاج. قم بوزن جميع الفئران قبل كل حقنة ، كل يوم ، واجمع الخلايا المهبلية المقشرة لتلطيخها بعد الحقن.

  1. ضع كرة قطنية مبللة بالأيزوفلوران مع ملقط في وعاء قابل للغلق. ضع الماوس داخل الحاوية لمدة 10 ثوان من التخدير.
    ملاحظة: الأيزوفلوران هو مخدر متطاير له سمية وتهيج معينة. يجب إجراء العمليات في بيئة جيدة التهوية وفقا للبروتوكولات المعتمدة مؤسسيا.
  2. احسب حجم الحقن: وزن الجسم (جم) × 5 = ميكرولتر. تطهير الربع السفلي الأيمن بمسحة إيثانول 75٪. أدخل إبرة 26 جيجا بزاوية 30-45 درجة (اتجاه شطبة لأعلى). تقدم 5 مم عبر جدار البطن حتى الإحساس "الفرقعة". تقديم المحلول بمعدل 50 ميكرولتر / ثانية.
  3. ضع السوائل المتبقية والمعدات الملوثة في حاويات نفايات مقاومة للضوء تحمل علامة "نفايات حساسة للضوء". تخلص من كرات القطن المنقوعة بالأيزوفلوران في حاويات محكمة الغلق مخصصة ملصقة بملصقات واضحة للنفايات الخطرة.
  4. قم بإذابة 4 مجم / مل من الاقتباس المجمد في حمام مائي 37 درجة مئوية (3 دقائق). إعادة حساب الجرعة اليومية: وزن الجسم (جم) × 5 = ميكرولتر. تحقق من وضوح المحلول قبل تحميل المحقنة.

4. جمع المصل

ملاحظة: بعد 15 يوما من حقن محلول سيكلوفوسفاميد ، اجمع الدم من قمة قلب جميع الفئران. جهاز طرد مركزي للحصول على المصل. يجب أخذ عينات من الفئران في المجموعة الضابطة ومجموعة NS خلال مرحلة الديستروس. خضعت فئران مجموعة POI لأخذ عينات متطابقة مع الوقت مقترنة بفئران المجموعة الضابطة / NS ، والتي تم تأكيد أنها في حالة ديستروس.

  1. تخدير الفأر
    1. ضع الماوس في حجرة شفافة محكمة الإغلاق تحتوي على كرة قطنية مشبعة بالأيزوفلوران.
    2. راقب سلوك الماوس. يشير فقدان منعكس التقويم (الفشل في تصحيح الموقف الذاتي عند قلب الرأس برفق) إلى تحريض التخدير المناسب. تتطلب هذه العملية عادة 2-3 دقائق.
    3. قم بإزالة الماوس من الحاوية. ثبت رأسه بيدك اليسرى ، واضغط برفق على الجفن العلوي بإصبعك السبابة. أمسك قطعة قطن معقمة في يدك اليمنى ، واغمسها في مرهم العين الإريثروميسين لتجميع كمية قطرها 1-2 مم.
      1. ضعي المرهم بالتساوي على سطح مقلة العين والجفن الداخلي. أغلق الجفن ، ثم دلكي برفق بأطراف إصبعك لمدة 10 ثوان لتوزيع المرهم بشكل موحد. امسح المرهم الزائد حول العين باستخدام قطعة قطن جافة.
  2. ضع الماوس في وضع ضعيف على لوح رغوي. تقليم شعر الصدر باستخدام مقص جراحي. تطهير مناطق الصدر والبطن بنسبة 75٪ إيثانول.
    1. شق الجلد والأنسجة تحت الجلد على طول خط الوسط. قطع العضلات الوربية طوليا على طول الجانب الأيسر من القص. كشف القلب.
  3. أدخل حقنة (مع توجيه شطبة الإبرة لأعلى) في قمة القلب بزاوية حوالي 30 درجة. تقدم الإبرة ببطء وبلطف شفط. حقن الدم الذي تم الحصول عليه في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل.
  4. ضع الدم الذي تم الحصول عليه في جهاز طرد مركزي. اضبط جهاز الطرد المركزي على 850 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. استخدم ماصة لإخراج مصل الطبقة العليا ووضعه في أنبوب طرد مركزي سعة 0.5 مل. قم بتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

5. الكشف عن هرمون الاستروجين في الدم و FSH و AMH

  1. ضع المصل المجمد في ثلاجة 4 درجات مئوية طوال الليل لإذابته ببطء.
  2. أخرج مجموعة ELISA من الثلاجة قبل 30 دقيقة للسماح للكواشف الموجودة فيها بالعودة إلى درجة حرارة الغرفة.
  3. وفقا لتعليمات المجموعة ، قم بإجراء تخفيفات تسلسلية للمعيار باستخدام المخفف القياسي. بشكل عام ، قم بتعيين تدرجات تركيز متعددة ، مثل 0 ، 10 ، 20 ، 40 ، 80 ، 160 بيكوغرام / مل ، إلخ.
  4. أضف المعيار المخفف وعينات المصل المراد اختبارها إلى الآبار المقابلة للوحة ELISA ، 100 ميكرولتر لكل بئر. في الوقت نفسه ، قم بإعداد آبار تحكم فارغة وأضف 100 ميكرولتر من مخفف العينة.
  5. ضع لوحة ELISA في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة للسماح للمستضد والجسم المضاد بالارتباط الكامل.
  6. بعد انتهاء الحضانة ، استنشق السائل بعناية في الآبار. اغسل لوحة ELISA بمحلول الغسيل 3-5 مرات. بعد كل غسلة ، جفف لوح ELISA برفق لإزالة محلول الغسيل المتبقي.
  7. أضف محلول عمل الأجسام المضادة المسمى بالإنزيم ، 100 ميكرولتر لكل بئر. استمر في الحضانة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  8. كرر خطوات الغسيل المذكورة أعلاه ، واغسلها 3-5 مرات ، واتركها حتى تجف بالصياغة.
  9. أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة إلى كل بئر. تخلط برفق عن طريق الرج. احتضن في الظلام عند 37 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة حتى يتطور اللون الأزرق الصافي.
  10. أضف 100 ميكرولتر من محلول الإنهاء إلى كل بئر لإيقاف التفاعل. لاحظ تغير اللون من الأزرق إلى الأصفر.
  11. استخدم قارئ صفيحة دقيقة لقراءة قيم الامتصاص (قيم A) لكل بئر بطول موجي 450 نانومتر وتسجيل البيانات.
  12. خذ تركيز المعيار على أنه الحصر وقيمة الامتصاص المقابلة كإحداثي لرسم منحنى قياسي. بشكل عام ، استخدم تركيبات متعددة الحدود للتأكد من أن معامل الارتباط r² للمنحنى القياسي أكبر من 0.99.
    1. وفقا للمنحنى القياسي ، استبدل قيمة الامتصاص لعينة المصل المراد اختبارها في معادلة المنحنى القياسية لحساب تركيز الهرمون في العينة.

6. جمع أنسجة المبيض

  1. قم بالقتل الرحيم للفأر الذي لا يزال مخدرا عن طريق خلع عنق الرحم (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا) ، ثم استخدم المقص الجراحي لفتح بطن الفأر.
  2. يقع المبيضان أسفل الكلى وملفوفة في وسادات دهنية بيضاء. ارفعي الضمادات الدهنية برفق باستخدام الملقط لكشف المبايض وقناتي فالوب. استخدم المقص لفصل المبايض عن الأنسجة الضامة المحيطة.
  3. ضع أنسجة المبيض التي تمت إزالتها في 4٪ بارافورمالديهايد للتثبيت لمدة 24 ساعة.

7. تحضير أقسام البارافين

  1. الجفاف: أخرج المبيضين ومررهما عبر محاليل الإيثانول بتركيزات مختلفة (75٪ ، 85٪ ، 95٪ ، 100٪) بالتسلسل ، مع استمرار كل خطوة لمدة ساعة واحدة.
  2. علاج الشفافية: أولا ، عالج المبايض في خليط من الزيلين والإيثانول لمدة 15 دقيقة. ثم اغمرهم في الزيلين الأول والزيلين الثاني لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
  3. تشريب الشمع: اغمر المبايض في خليط من الزيلين والبارافين. ثم انقلها إلى Paraffin I و Paraffin II و Paraffin III لمدة 0.5 ساعة لكل منهما.
  4. التضمين: ضع المبايض المشبعة بالشمع في قالب تضمين. اضبط اتجاه الأنسجة (بحيث يكون السطح المقطوع متجها لأسفل). صب البارافين المذاب في القالب واتركه يبرد ويتصلب.
  5. التقسيم: قطع كتلة البارافين إلى أقسام بسمك 5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم. قم بإجراء التقسيم التسلسلي وانقل الشريط برفق باستخدام فرشاة ، مع التأكد من أنه يشكل شريطا موحدا وشفافا يكون مسطحا دون تشويه عند تعويمه على حمام مائي

8. تلطيخ H & E

  1. إزالة الشمع: اغمر الأقسام المدمجة بالبارافين في الزيلين الأول لمدة 10 دقائق. ثم انقل الأقسام إلى الزيلين II وانقعها لمدة 10 دقائق أخرى.
  2. الإماهة: قم بتمرير الأقسام عبر سلسلة من محاليل الإيثانول بتركيزات مختلفة بالتسلسل: 100٪ إيثانول ، 95٪ إيثانول ، 85٪ إيثانول ، 75٪ إيثانول ، مع وقت غمر 5 دقائق لكل منها. أخيرا ، اشطف الأقسام بالماء المقطر لمدة 1 دقيقة.
  3. تلطيخ الهيماتوكسيلين: اغمر الأقسام في محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين لمدة 5 دقائق. اشطف الأقسام تحت الماء الجاري لمدة 30 ثانية.
  4. التمايز: اغمر الأقسام في محلول حمض الهيدروكلوريك والإيثانول بنسبة 1٪ لمدة 1-3 ثوان. اشطف الأقسام تحت الماء الجاري لمدة 1-2 دقيقة.
  5. تلطيخ السيتوبلازم: انغمس في محلول eosin Y (1 دقيقة). امسح البقع الزائدة بورق الترشيح.
  6. الجفاف: مرر الأقسام عبر سلسلة من محاليل الإيثانول: 85٪ إيثانول ، 95٪ إيثانول ، 100٪ إيثانول (مرتين) ، مع وقت غمر 5 ثوان لكل منها.
  7. المقاصة: اغمر الأقسام في الزيلين الأول لمدة 5 دقائق. ثم انقل الأقسام إلى الزيلين II وانقعها لمدة 5 دقائق أخرى.
  8. التركيب: قم بإسقاط الراتينج المحايد على القسم الملطخ. ضع غطاء بعناية فوق القسم.
  9. عد البصيلات: راقب الأقسام الملطخة تحت المجهر. عد وسجل عدد البصيلات في مراحل النمو المختلفة.

9. الكيمياء المناعية ل Caspase-3 في أنسجة المبيض

  1. استرجاع المستضد: ضع الأقسام منزوعة الشمع والترطيب في مخزن سترات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 6.0). سخني الأقسام في فرن الميكروويف على طاقة عالية لمدة 5 دقائق. ثم أخرجهم واتركهم يبرد.
    1. كرر عملية التسخين مرتين أخريين ، ليصبح المجموع 3 دورات تسخين. بعد التبريد الطبيعي ، اغسل الأقسام باستخدام PBS 3 مرات ، في كل مرة لمدة 5 دقائق.
  2. التخلص من البيروكسيديز الداخلي: أضف 3٪ H₂O₂ قطرة على الأقسام. احتضن الأقسام في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 10 دقائق. اغسل الأقسام باستخدام PBS 3 مرات ، في كل مرة لمدة 3 دقائق.
  3. حجب المصل وحضانة الأجسام المضادة: أضف الأرنب المضاد الأساسي المضاد للكاسباز -3 على الأقسام. احتضن الأقسام في صندوق مبلل عند 4 درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، اترك الأقسام تعود إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. اغسل الأقسام باستخدام PBS 3 مرات ، في كل مرة لمدة 5 دقائق.
  4. تطوير اللون ، ومواجهة التلوين ، والتركيب: استخدم DAB لتطوير الألوان ، والتي تستغرق عادة حوالي 1-5 دقائق. قم بتلطيخ الأقسام بالهيماتوكسيلين لمدة 2 دقيقة. بعد التلطيخ ، اغسل الأقسام لمدة 5 دقائق.
    1. ثم ضع الأقسام في ماء الأمونيا لمدة 1 دقيقة لتحويلها إلى اللون الأزرق. أخيرا ، قم بإجراء الجفاف من خلال تدرج الإيثانول ، ومسح الأقسام ، وتركيبها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم توضيح عملية إنشاء نموذج ماوس POI في الشكل 2. تم تسجيل وزن الجسم ودورة الشبق للفئران بدءا من اليوم الأول لحقن المخدرات. بعد 15 يوما من حقن CTX ، كان متوسط معدل انخفاض وزن الجسم للفئران في مجموعة POI (3.717٪ ± 1.463٪) أعلى بكثير من ذلك في مجموعة BLANK (0.2526٪ ± 0.1469٪) ومجموعة NS (0.4305٪ ± 0.2494٪) (ص < 0.0001). لم يكن هناك فرق يعتد به إحصائيا في وزن الجسم بين مجموعة NS ومجموعة BLANK (ص > 0.05). (الشكل 3 أ).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يؤثر قصور المبيض المبكر بشكل خطير على الصحة البدنية للمرأة ونوعية حياتها ، ويزداد انتشاره عالميا عاما بعد عام. ومع ذلك ، في الوقت الحالي ، لا يزال هناك نقص في طرق العلاج الآمنة والفعالة ل POI. يعد إنشاء نموذج حيواني موثوق به وقابل للتكرار أمرا بالغ الأهمية لدفع البحوث حول POI. سريريا ، تتنوع أسباب POI ، وأدوية العلاج الكيميائي هي عوامل مسببة للأمراض مهمةومعروفة 8. كدواء للعلاج الكيميائي عامل مؤللة ، يسبب CTX بشكل أساسي سمية المبيض من خلال الإجهاد التأكسدي وموت الخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

يقر المؤلفون بامتنان بالدعم المالي الذي تلقاه من مؤسسة وو جيبينغ الطبية من خلال برنامج التمويل الخاص للبحوث السريرية (المنحة رقم 320.6750.17067). كما أننا نقر بامتنان بمنصة البحث والدعم الفني الذي قدمته شركة Anhui Shendong Biotechnology Development Co.، Ltd.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4٪ بارافورمالديهايدسانغون الهندسة الحيوية المحدودةA500684-0500
75٪ كحولشاندونغ Dexinkang التكنولوجيا الطبية المحدودة200603
الإيثانول اللامائيمصنع الكاشف الكيميائي Bengbu
أنابيب الطرد المركزيبيوشاربBS-15-M
طاولة باردةكوانلين الطبيةQL-LT20230003
كرات القطنشاندونغ بريليانس المحدودة20241008
أغطيةجيانغسو شيتاي المعدات التجريبية المحدودة80312-3412
سيكلوفوسفاميدباكستر أونكولوجي GmbH3K645A
مجففهوبى شياوغان هايكو للتكنولوجيا الطبية المحدودةKH-TS
آلة الصباغةهوبى شياوغان هايكو للتكنولوجيا الطبية المحدودةKH-S101 
محلول تلطيخ EA50هوبى تايكانغ المعدات الطبية المحدودةJ7EC20
كماشة علامة الأذنشنتشن رويوود علوم الحياة والتكنولوجياج22002-10
تقسيم فعال للبارافينTongxiang Hualing الشمع الصناعة المحدودة20241018
فرن تجفيف كهربائي (فرن)شنغهاي Yuejin المعدات الطبية المحدودةHCZF-11
حاضنة مياه ثرموستاتية ساخنة كهربائياشنغهاي Yuejin المعدات الطبية المحدودةإتش إس دبليو -600
آلة التضمينPrisstar Changzhou الأجهزة الطبية المحدودةPMB-A
وصمة عار إيوسينسيويل للتكنولوجيا الحيوية المحدودةجي 1005-2
محلول تمايز الهيماتوكسيلينسيويل للتكنولوجيا الحيوية المحدودةجي 1039-500 مل
محلول تلطيخ الهيماتوكسيلينسيويل للتكنولوجيا الحيوية المحدودةجي 1005-1
إيزوفلورانشاندونغ آنتي تربية التكنولوجيا المحدودة2024101501
مجهرآنهوي جياشانغ التكنولوجيا الحيوية المحدودةSQS-12P
طقم ELISA للفأر المضاد لهرمون مولر (AMH)Hengyuan التكنولوجيا الحيويةHB1334-مو
مجموعة المقايسة المناعية المرتبطة بالإنزيم استراديول الفأر (E2)Hengyuan التكنولوجيا الحيويةHB975-مو
طقم ELISA للهرمون المنبه لجريب الفأر (FSH)Hengyuan التكنولوجيا الحيويةHB967-مو
اللثة المحايدةنانتشانغ يولو المعدات التجريبية المحدودة240504
جهاز تبييض الأنسجة المرضيةPrisstar Changzhou الأجهزة الطبية المحدودةPHY-III
مخزن مؤقت PBSبيوشاربBL302A
نصائح الماصةبيوشاربBS-10-T
الماصاتدالونج المعدات الطبية المحدودةYE213AT0257922
مجفف الأنسجة السريعهوبى شياوغان هايكو للتكنولوجيا الطبية المحدودةKH-TS
القطاعهغديياردة -315
الشرائحجيانغسو شيتاي المعدات التجريبية المحدودة80312-3161
آلة تشويههوبى تايكانغ المعدات الطبية المحدودة131001305
حقن كلوريد الصوديومووهان بينهو شوانغي الصيدلانية المحدودةهاتف: 240525K04
حقنةجيانغسو تشيو الأجهزة الطبية المحدودة
تهتز القطاعةشنغهاي Zhixin أداة المحدودةZQP-86
الزيلينتيانجين Kaitong الكاشف الكيميائي المحدودة20240102

المراجع

  1. Federici, S., et al. Primary ovarian insufficiency: update on clinical and genetic findings. Front Endocrinol. 15, 1464803(2024).
  2. Soleimani, R., Heytens, E., Darzynkiewicz, Z., Oktay, K. Mechanisms of chemotherapy-induced human ovarian aging: Double-strand DNA breaks and microvascular compromise. Aging (Albany NY). 3 (8), 782-793 (2011).
  3. Bellusci, G., et al. Kinase-independent inhibition of cyclophosphamide-induced pathways protects the ovarian reserve and prolongs fertility. Cell Death Dis. 10 (10), 726(2019).
  4. Yuksel, A., et al. The magnitude of gonadotoxicity of chemotherapy drugs on ovarian follicles and granulosa cells varies depending upon the category of the drugs and the type of granulosa cells. Hum Reprod. 30 (12), 2926-2935 (2015).
  5. Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertil Re Pract. 6, 5(2020).
  6. Wang, Z., Wang, Y., Yang, T., Li, J., Yang, X. Study of the reparative effects of menstrual-derived stem cells on premature ovarian failure in mice. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 11(2017).
  7. Shen, J., et al. Transplantation of the LRP1(high) subpopulation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells improves ovarian function in mice with premature ovarian failure and aged mice. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 64(2024).
  8. Letourneau, J. M., et al. Acute ovarian failure underestimates age-specific reproductive impairment for young women undergoing chemotherapy for cancer. Cancer. 118 (7), 1933-1939 (2012).
  9. Nynca, A., et al. Tamoxifen decreases ovarian toxicity without compromising cancer treatment in a rat model of mammary cancer. BMC Genomics. 24 (1), 325(2023).
  10. Feng, Y., et al. Protective effect of Luffa cylindrica fermentation liquid on cyclophosphamide-induced premature ovarian failure in female mice by attenuating oxidative stress, inflammation and apoptosis. J Ovarian Res. 17 (1), 24(2024).
  11. Huang, Y., et al. Bushen Huoxue recipe ameliorates ovarian function via promoting BMSCs proliferation and homing to ovaries in POI mice. Phytomedicine. 129, 155630(2024).
  12. Ai, G., et al. Adipose-derived stem cells promote the repair of chemotherapy-induced premature ovarian failure by inhibiting granulosa cells apoptosis and senescence. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 75(2023).
  13. Anderson, R. A., et al. Anti-Müllerian hormone as a marker of ovarian reserve and premature ovarian insufficiency in children and women with cancer: A systematic review. Hum Reprod Update. 28 (3), 417-434 (2022).
  14. Jiao, X., et al. Ovarian reserve markers in premature ovarian insufficiency: within different clinical stages and different etiologies. Front Endocrinol. 12, 601752(2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة