Research Article

الكشف السريع عن المكورات العنقودية الذهبية والمكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الفلوري متعدد الإرسال في الوقت الحقيقي

DOI:

10.3791/69004

⸱

September 19th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, Guangdong Cardiovascular Institute, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University, 2Department of Laboratory, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم هذا البروتوكول تفاعل البوليميراز المتسلسل متعدد الإرسال في الوقت الفعلي مع بادئات / مجسات تستهدف جينات nuc و MRSA mecA الخاصة ب SA. إنه يتيح الكشف النوعي السريع (<1 ساعة) للأحماض النووية SA / MRSA في عينات البلغم البشري ، والتغلب على قيود الطرق القائمة على الثقافة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المكورات العنقودية الذهبية (S.aureus) هي مسببات الأمراض البشرية الشائعة إيجابية الجرام التي تسبب العدوى المكتسبة من المجتمع والمستشفيات ، مع مظاهر سريرية متنوعة تتراوح من الآفات السطحية الموضعية والتسمم الغذائي إلى الالتهابات الجهازية القاتلة. أدى اكتشاف المضادات الحيوية إلى خفض معدل الوفيات بشكل كبير ، لكن مشكلة مقاومة الأدوية أصبحت بارزة بشكل متزايد منذ ذلك الحين. منذ التعرف الأول على MRSA في عام 1960 ، برزت هذه السلالة كتهديد عالمي للصحة العامة. MRSA هو أحد مسببات الأمراض الرئيسية للالتهابات المستشفية ، وهو قادر على التسبب في أمراض خطيرة مختلفة مثل التهاب الشغاف والتهاب العظم والنقي المزمن والالتهاب الرئوي والتهاب المفاصل القيحي وتجرثم الدم. لذلك ، فإن الكشف السريع والدقيق عن المكورات العنقودية الذهبية ومقاومته للأدوية أمر بالغ الأهمية لتوجيه العلاج السريري.

طرق الكشف الروتينية الحالية عن S.aureus و MRSA لها قيود كبيرة. يمكن أن توفر طريقة الاستزراع البكتيري التقليدية ، التي تعمل بمثابة "المعيار الذهبي" لعقود من الزمن ، تحديد الأنواع النهائية ونتائج حساسية الأدوية ، لكن العملية تستغرق وقتا طويلا ، وتستغرق من 48 إلى 72 ساعة. علاوة على ذلك ، فإن هذه الطريقة عرضة للتلوث وتعتمد على مرافق المختبرات المتخصصة والفنيين المهرة. يحقق الاختبار المصلي تشخيصا غير جراحي عن طريق الكشف عن الأجسام المضادة للعنقودية العنقودية العنقودية في مصل المريض ، لكنه لا يمكنه التمييز بين الالتهابات النشطة والالتهابات السابقة ، ولا يمكنه تحديد السلالات المقاومة للأدوية (مثل MRSA).

تركز هذه الدراسة على تطوير طريقة جديدة للكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل الفلوري في الوقت الفعلي للتغلب على القيود المذكورة أعلاه. تصمم هذه الطريقة بادئات محددة ومجسات فلورسنت TaqMan تستهدف الجين النووي الخاص بالأنواع من S.aureus وجين mecA الذي يتوسط مقاومة الميثيسيلين ، مما يتيح التضخيم والكشف المتزامن عن S.aureus و MRSA في نظام تفاعل واحد. تقلل هذه التقنية بشكل كبير من وقت الاكتشاف ، مما يوفر حلا سريعا ودقيقا وفعالا من حيث التكلفة للكشف عن S.aureus و MRSA. يحسن هذا النهج المبتكر بشكل كبير من كفاءة التشخيص السريري ويسهل التنفيذ المبكر للعلاج بالمضادات الحيوية الموجه ، مما يقدم مساهمات مهمة في السيطرة على الالتهابات البكتيرية المقاومة للأدوية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المكورات العنقودية الذهبية هو أحد مسببات الأمراض الشرطية إيجابية الجرام على نطاق واسع والتي تستعمر الغشاء المخاطي للأنف للأفراد الأصحاء1،2. عندما تتعرض مناعة المضيف للخطر ، يمكن أن تسبب التهابات جلدية موضعية أو غزو الأنسجة العميقة أو أمراض جهازية (مثل الالتهاب الرئوي والتهاب الشغاف والتهاب العظم والنقي وتجرثم الدم)3. تم تطبيق الميثيسيلين ، وهو بنسلين شبه اصطناعي ، سريريا لعدوى المكورات العنقودية الذهبية في عام 1959 ، وبعد ذلك بعامين ، ظهر MRSA في المملكة المتحدة ، وانتشر بسرعة إلى الدول الأوروبية بما في ذلك الدنمارك وفرنسا وسويسرا4. لا تؤدي مقاومة MRSA للمضادات الحيوية β-لاكتام إلى تعقيد الإدارة السريرية فحسب ، بل تزيد أيضا من مخاطر العدوى بشكل كبير5. أدت عوامل متعددة - بما في ذلك الاستعمار / الانتشار الذي لا يمكن السيطرة عليه ، وتكاليف الوقاية المرتفعة ، والإفراط في استخدام المضادات الحيوية - إلى زيادة معدلات الإصابة ب MRSA6. ونظرا لانتقال العدوى السريع وآليات المقاومة المعقدة، ترتبط العدوى بالمكورات المقاومة الذهبية الذهبية المقاومة للميثيثي بمعدلات وفيات مرتفعة، حيث أبلغ عن ما يقرب من 000 150 حالة ووفيات > 7 حالة وفاة سنويا في بلدان الاتحاد الأوروبي7. وفقا لبيانات مراقبة CHINET ، ظلت معدلات الإصابة ب MRSA في الصين أعلى من 30٪ على مدى السنوات الخمس الماضية8. يؤدي ارتفاع خطر الإصابة بالعدوى المتنقلة في المستشفيات إلى زيادة حدة أعباء الصحة العامة وإجهاد أنظمة الرعاية الصحية9،10. لذلك ، فإن تطوير تقنيات الكشف السريع الفعالة والدقيقة عن MRSA أمر ملح سريريا لتحقيق التشخيص المبكر والعلاج الشخصي وتقليل الوفيات ومقاطعة سلاسل انتقال العدوى.

تمتد تقنيات الكشف الحالية ل S.aureus و MRSA إلى مجالات متعددة بما في ذلك الكشف عن النمط الظاهري ، والكشف الجيني ، والكشف عن النسخ ، والكشف عن البروتينات ، وتقنية قياس الطيف الكتلي ، والتحليلات القائمة على المعلوماتية الحيوية11.

يوصى بطرق الكشف عن النمط الظاهري ، مثل طريقة انتشار القرص (طريقة KB) وطريقة التركيز المثبط الأدنى (طريقة MIC) ، على أنها "معايير ذهبية" من قبل معهد المعايير السريرية والمختبرية (CLSI) واللجنة الأوروبية لاختبار الحساسية لمضادات الميكروبات (EUCAST). تتمتع هذه الطرق بمزايا عدم الحاجة إلى أدوات متخصصة ، حيث تستخدم على نطاق واسع لمراقبة طيف المقاومة والتحقيق الوبائي. ومع ذلك ، فإن عيوبها واضحة أيضا: فترات الاستزراع الطويلة (أكثر من 24 ساعة) ، ونتائج طريقة KB لبعض المضادات الحيوية الجديدة تتطلب التحقق من الصحة بواسطة قيم MIC ، مع نتائج سلالات نقطة التوقف كونها عرضة للعوامل البشرية12،13.

من بين طرق الكشف على المستوى الجيني ، يتميز تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي بخصائص الحساسية العالية والخصوصية القوية ، مما يتيح الحكم الأولي على المقاومة وتقصير وقت التجربة ، بتكلفة منخفضة وكفاءة عالية. لكن حدودها تكمن في القدرة على اكتشاف جينات المقاومة المعروفة فقط والاعتماد على الأدوات المتخصصة14. آلية المقاومة الميكروبية معقدة للغاية ، مما يجعل من الضروري تطوير طرق تقنية يمكن أن تغطي الأنماط الظاهرية المقاومة غير المعروفة وتمكن من التعرف السريع. تحدد تقنية GoPhAST-R الناشئة (AST المدمجة بين النمط الجيني والنمط الظاهري من خلال اكتشاف الحمض النووي الريبي) الأنماط الظاهرية للمقاومة من خلال اكتشاف مستويات تعبير mRNA ، مما يتيح الكشف المتزامن عن الجينات المختلفة المرتبطة بالمقاومة عبر مسببات الأمراض المتعددة ، وتقصير وقت الاستجابة التجريبية ، وتحقيق دقة 94-99٪ عند دمجها مع التعلم الآلي15.

من بين طرق الكشف على مستوى البروتين ، تعتمد طريقة تراص اللاتكس PBP2a على الارتباط الخاص بالمستضد والأجسام المضادة ، مع عملية بسيطة ونتائج سريعة ، ولها خصوصية وحساسية عالية ل MRSA. ومع ذلك ، لا يمكنه التفريق بين الأنواع المختلفة من المكورات العنقودية ، كما أن حساسية الكشف عن المجموعات التجارية لديها بعض الانخفاض ، مما يتطلب إعادة الاختبار بعد الحث باستخدام الأوكساسيلين8.

تحقق طرق الكشف المستندة إلى التصلب العصبي المتعدد MALDI-TOF ، مثل طريقة DOT-MGA (DNA Oligonucleotide Tag-Microarray Detection of Genomic Amplification) ، الأداء التحليلي الأمثل في 6-8 ساعات من الحضانة ، بمعدل كشف يصل إلى 96.4٪ ، وكل من الحساسية والنوعية 100٪. لكن التكلفة مرتفعة ، والمواضع المحدودة على اللوحة المستهدفة تجعل من الصعب اكتشاف مئات العينات في وقت واحد16,17.

من بين تقنيات تحليل المعلوماتية الحيوية جنبا إلى جنب مع بيانات omics للتنبؤ بالمقاومة ، تبرز تقنية تسلسل الجينوم الكامل بدقتها العالية وقدراتها الشاملة في تحليل المعلومات. إلى جانب قواعد بيانات تحليل جينات المقاومة مثل Resfinder ، يمكنه تحليل ما إذا كانت السلالات تحمل جينات مقاومة معينة ، والتنبؤ بإمكانات المقاومة ، واكتشاف تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) والطفرات الجينية المرتبطة بالمقاومة ، مع دعم تخزين وإعادة تحليل بيانات الجينوم الكامل18. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة تشغيلا من قبل متخصصين لديهم خلفيات في المعلوماتية الحيوية ، ونادرا ما تستخدم في الاختبارات اليومية ، وتستخدم بشكل شائع للتحليل الوبائي أو المراقبة الجزيئية لمسببات الأمراض19.

المنهجيات المذكورة أعلاه إما عالية التكلفة أو تستغرق وقتا طويلا أو لا تزال في مرحلة البحث والتطوير. سريريا ، هناك حاجة ملحة لحل يوازن بين "الفورية" و "الدقة" - تعمل تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الفلوري متعددة الإرسال الجديدة على ملء هذه الفجوة عن طريق تضخيم جينات nuc / mecA في وقت واحد في أنبوب واحد ، وضغط دورة الكشف إلى ساعة واحدة. إنه يسد بدقة فجوة النافذة الزمنية في عملية "الفحص في حالات الطوارئ - كتابة المقاومة" التقليدية ، مما يوفر أداة تشخيص جزيئية أكثر كفاءة من حيث الوقت للوقاية من عدوى المستشفيات ومكافحتها. يستخدم اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل المحدد هذا بشكل أساسي للكشف عن عينات الجهاز التنفسي ، مع عينات البلغم كمثال نموذجي. يظهر حساسية 500 نسخة / مل وخصوصية عالية ، بينما لا تتأثر بالعوامل المضادة للبكتيريا. نظرا لخصائص الأداء المواتية هذه ، فإن اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل هذا يحمل قيمة تطبيقية كبيرة لتشخيص التهابات الجهاز التنفسي ومراقبة التهابات المستشفيات التي تسببها MRSA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى الشعب بمقاطعة قوانغدونغ (رقم الأخلاقيات: KY2025-510-01). يمكن العثور على معلومات مفصلة حول المواد المستخدمة في هذا البحث (الكواشف والمواد الكيميائية والمعدات والبرامج) في جدول المواد.

1. بروتوكول جمع العينات وحفظها

  1. معايير الشمول: باستثناء مواد مراقبة الجودة ، يتم تحديد جميع العينات التي تم جمعها كعينات إيجابية باستخدام الطريقة القياسية الذهبية (الفحص القائم على الثقافة).
  2. جمع البلغم البشري
    1. اجمع 1-3 مل من البلغم السعال العميق من الجهاز التنفسي السفلي للأشخاص باستخدام أنابيب أخذ عينات معقمة. ختم الأنابيب على الفور ونقلها للتحليل. قم بمعالجة العينات على الفور للاختبار.
  3. تخزين العينات:
    1. تحليل العينات التي تم جمعها عبر الطريقة المذكورة أعلاه على الفور. يسمح بالتخزين قصير الأجل في ظل الشروط التالية:
      2-8 درجة مئوية: ≤7 أيام
      -20 درجة مئوية ± 5 درجات مئوية: ≤6 أشهر
      -70 درجة مئوية ± 5 درجات مئوية: ≤24 شهرا
      ملاحظة: في هذه الدراسة ، لم تعالج عينات البلغم بمواد حافظة (مثل مرق BHI + الجلسرين ، إلخ). بعد جمعها ، تم تخزينها في ظل الظروف الموضحة أعلاه ، وتم تجنب التجميد والذوبان المتكرر بشكل صارم. تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. الحد الأقصى المسموح به لدورات التجميد والذوبان: ≤3.

2. استخراج الحمض النووي

ملاحظة: أكمل جميع الإجراءات داخل خزانة السلامة الحيوية لتجنب التلوث.

  1. للمعالجة المسبقة لعينة البلغم ، اخلطي العينة مع محلول هيدروكسيد الصوديوم بنسبة 1: 4 (عينة البلغم: محلول هيدروكسيد الصوديوم 4٪) لتسييل عينات البلغم اللزجة والقضاء على الشوائب المتداخلة ، ثم دوامة تماما (30 ثانية) واحتضان في درجة حرارة الغرفة (22-25 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة لتحقيق التسييل.
  2. تحضير كواشف استخراج الحمض النووي
    1. أخرج الطبق المعبأ مسبقا المكون من 96 بئرا من المجموعة. حرك اللوحة ذات 96 بئرا برفق لتركيز الكواشف والخرز المغناطيسي في الجزء السفلي من اللوحة المكونة من 96 بئرا.
    2. قم بتمزيق فيلم ختم رقائق الألومنيوم بعناية ، وتجنب اهتزاز لوحة 96 بئرا لمنع تناثر السائل.
    3. في حلول العمود 1 والعمود 7 من لوحة 96 بئر: أولا ، أضف 20 ميكرولتر من البروتيناز K ، ثم أضف عينة 200-300 ميكرولتر ليتم استخراجها.
  3. استخراج الحمض النووي الآلي (الطريقة القائمة على الخرزة المغناطيسية)
    1. ضع لوحة 96 بئرا معبأة مسبقا مع عينات مضافة في الفتحة المقابلة لأداة استخراج الحمض النووي الآلية.
    2. اتبع عملية استخراج الحمض النووي كما هو موضح أدناه.
      1. باستخدام عصا المغناطيس في غرفة المختبر ، انقل الخرزات المغناطيسية الممتصة بالحمض النووي إلى فتحات كاشف مختلفة.
      2. استخدم مجموعة التقليب لخلط السائل بسرعة وبشكل متكرر ، بحيث يمتزج السائل والخرز المغناطيسي بالتساوي.
      3. عندما تتحد الخرزات السائلة والمغناطيسية بشكل متناغم ، تتقدم آلة استخراج الحمض النووي الآلي خلال المراحل المتتالية من تحلل الخلية ، وامتصاص الحمض النووي (70 درجة مئوية ، 15 دقيقة ، 3 مرات من الامتزاز المغناطيسي) ، والغسيل (3 مرات ، امزج لمدة دقيقتين في كل مرة ، ثم قم بإجراء الامتزاز المغناطيسي مرتين (15 ثانية لكل منهما) ، والشطف (مرتين ، امزج لمدة 5 دقائق في كل مرة ، 3 مرات من الامتزاز المغناطيسي) ، في النهاية ، يحصل على حمض نووي عالي النقاء.
      4. التحقق من صحة تركيز الحمض النووي ونقاوته باستخدام مقياس الطيف الضوئي. كان حجم عينة الحمض النووي 50 ميكرولتر ، مع تركيز يتراوح من 50 إلى 100 نانوغرام / ميكرولتر ، ونسبة A260 / A280 هي 1.8 ± 0.2.
    3. بعد انتهاء البرنامج ، امتص محلول الشطف الذي يحتوي على الحمض النووي مباشرة من العمود 6 والعمود 12 للاختبار اللاحق. إذا لزم الأمر ، قم بتخزين عينات الحمض النووي المستخرجة المتبقية عند -20 درجة مئوية للحفظ على المدى الطويل والاستخدام المستقبلي.

3. qPCR الكشف عن الأحماض النووية العنقودية الذهبية والأحماض النووية MRSA

  1. تحضير كواشف التضخيم
    1. أخرج محلول تفاعل تضخيم الحمض النووي ومحلول تفاعل nuc / mecA من المجموعة (بادئات / مسبار خاص بالجين النووي ل S. aureus ، و mecA ل MRSA). بعد الذوبان عند 22-25 درجة مئوية ، تتأرجح تماما واخلطها بالتساوي ، ثم قم بإجراء الطرد المركزي الفوري (~ 6000 جم ، 15 ثانية ، 22-25 درجة مئوية).
    2. وفقا لعدد العينات المراد اختبارها ، N ، قم بإعداد الكواشف بناء على الكمية الإجمالية ل N + 2 (N هو عدد العينات ، و 2 هي ضوابط الجودة السلبية والإيجابية). الخطوات المحددة هي كما يلي:
      1. قم بإعداد مزيج نظام التفاعل (محلول تفاعل تضخيم الحمض النووي 16 ميكرولتر (Buffer ، dNTPs ، بوليميراز الحمض النووي ، إنزيم UDG) + محلول تفاعل nuc / mecA 4 ميكرولتر (بادئات ومجسات لجينات الكشف المستهدف nuc و mecA والمرجع الداخلي GAPDH).
      2. أضفه إلى أنبوب طرد مركزي بحجم مناسب ، وتتأرجح بالكامل واخلطه بالتساوي ، وقم بإجراء الطرد المركزي الفوري (~ 6000 جم ، 15 ثانية ، 22 درجة مئوية -25 درجة مئوية). ثم قم بتوزيع 20 ميكرولتر لكل أنبوب في أنابيب تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
  2. أضف عينات الحمض النووي ومراقبة الجودة:
    1. في أنابيب تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل المعدة أعلاه (20 ميكرولتر) ، على التوالي ، أضف 5 ميكرولتر من الحمض النووي من العينات المختبرة ، والتحكم الإيجابي ، والتحكم السلبي ، مما يحقق حجما نهائيا قدره 25 ميكرولتر لكل أنبوب.
    2. قم بتغطية الأنابيب بإحكام وقم بإجراء الطرد المركزي الفوري (~ 6000 × جم ، 15 ثانية ، 22-25 درجة مئوية) ثم ضع الأنابيب في أداة PCR.
  3. تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR):
    1. اضبط برنامج ركوب الدراجات على النحو التالي: ما قبل التمسخ: 97 درجة مئوية ، 90 ثانية ، دورة واحدة ؛ الخطوتان التاليتان ل 42 دورة: تمسخ 97 درجة مئوية لمدة 2 ثانية و 55 درجة مئوية للتلدين لمدة 15 ثانية.
    2. اضبط معلمات الكشف عن إشارة التألق على النحو التالي: استخدم وضع العلامات الفلورية FAM لجينات nuc ؛ وضع العلامات الفلورية VIC لجينات mecA ؛ ووضع العلامات الفلورية CY5 لجين GAPDH كعنصر تحكم داخلي للمجموعة. اجمع البيانات عند درجة حرارة 55 درجة مئوية. عند الانتهاء من التفاعل ، تأكد من حفظ البيانات للتحليل المستقبلي.
    3. تحليل البيانات باستخدام برنامج qPCR الخاص (SLAN 96P):
      1. معلومات العينة: في مخطط تخطيط لوحة البئر للبرنامج ، قم بتسمية أنواع العينات (على سبيل المثال ، التحكم الإيجابي ، والتحكم السلبي ، والعينة غير المعروفة ، والجين المرجعي الداخلي ، وما إلى ذلك) المقابلة لمواضع تحميل العينة.
      2. وضع أنابيب التفاعل: افتح غطاء وحدة تسخين الأداة ، ضع لوحة / أنابيب PCR محكمة الغلق بثبات بالداخل ، وتأكد من أنها تتناسب بشكل وثيق مع وحدة التسخين ، وأغلق غطاء الوحدة بإحكام (لتجنب تفاوت درجة الحرارة)
      3. بدء التفاعل: بعد التأكد من صحة إعدادات البرنامج في البرنامج ، انقر فوق بدء التشغيل وسجل معرف التجربة للرجوع إليه في المستقبل.
      4. إيقاف التشغيل وإزالة الأنابيب: بعد انتهاء تشغيل البرنامج ، انتظر حتى تنخفض درجة حرارة وحدة التسخين إلى أقل من 50 درجة مئوية ، ثم افتح الغطاء لإزالة لوحة / أنابيب PCR ، والتعامل مع العينات بشكل صحيح.
  4. تحليل البيانات
    1. قبل تحليل البيانات ، تأكد من ثلاث نتائج مرئية: 1) تظهر منحنيات التضخيم لجميع العينات (بما في ذلك التحكم الداخلي) شكل S نموذجي ، مع عدم وجود منحنيات صعودية مسطحة أو متأخرة بشكل غير طبيعي ؛ 2) يعبر خط عتبة التألق المرحلة الأسية للمنحنيات ، وتكون قيم Ct للتحكم الداخلي (على سبيل المثال ، GAPDH) ضمن 38 دورة ≤ (معامل التباين < 5٪) ؛ 3) يتم تضمين الضوابط السلبية / الإيجابية طوال التجربة بأكملها لمراقبة احتمالية التلوث.
      1. إذا كانت التجربة خارجة عن السيطرة، فأعد فحص الدفعة بأكملها. إذا أظهرت عينة تضخيما غير طبيعي (مثل منحنى S غير نمطي أو قيمة Ct ضمن النطاق الحرج) ، فأعد التحقق من تلك العينة المحددة.
    2. قم باستدعاء البيانات التجريبية في البرنامج ، وقم بتعيين العتبة وخط الأساس ، واحسب قيم Ct تلقائيا أو يدويا ، حيث تقوم الأداة تلقائيا بتحديد عتبة خط الأساس. اضبط قيمة التحديد الإيجابي النهائي على Ct ≤ 36 ؛ يتطلب النطاق المرجعي للجين المرجعي الداخلي Ct ≤ 38. تأكد من أن منحنيات التضخيم الخاصة بها تظهر ملامح مميزة على شكل حرف S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكشف عن المكورات العنقودية الذهبية والميدادوسوفوزي العنقودية العنقودية الذهبية باستخدام qPCR
استنادا إلى الجين النووي الخاص بالأنواع من S. aureus وجين مقاومة الأدوية mecA ل MRSA ، قمنا بتصميم بادئات ومجسات مصنفة بفلوروفورات مميزة للكشف عن qPCR. جميع نتائج مراقبة الجودة خلال تجارب qPCR تقع باستمرار ضمن العتبات الموصى بها ، مما يؤكد موثوقية نتائج الكشف (الشكل 1).

في هذه الدراسة ، قمنا بالتحقق م...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد الكشف الدقيق والمبكر عن مقاومة الميثيسيلين أمرا بالغ الأهمية لتشخيص العدوى التي تسببها المكورات العنقودية الذهبية. يمكن أن يقلل التحديد المبكر للمسرحية العنقودية الذهبية و MRSA من إساءة استخدام المضادات الحيوية واسعة الطيف ويقلل من الضغط الانتقائي الذي يؤدي إلى ظهور وانتشار المقاومة البكتيرية.

تتطلب طرق الكشف عن النمط الظاهري التقليدية ، مثل انتشار قرص سيفوكسيتين ، فترة زراعة تتراوح بين 18 و 24 ساعة وتظهر معدلات سلبية كاذبة عالية للسلالات...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح متضاربة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذه الدراسة من قبل مؤسسة قوانغدونغ للأبحاث الطبية (A2025034). تم دعم هذا العمل من قبل Shanghai BioGerm Medical Technology Co.، Ltd. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
مستخرج الحمض النووي الآليدانسمارت 32لاستخراج الحمض النووي
BSC-1500IIA2-Xبيوبيس20143222263 SEDAخزانة السلامة الحيوية
جهاز الطرد المركزي الإلكترونيويلتيكجهاز طرد مركزي للسائل المتبقي من جدار الأنبوب
مجموعة الكشف عن جينات مقاومة الأدوية المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلينبوجيZC-HX-38-2الكشف عن جينات مقاومة المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين
طقم استخراج الحمض النوويبوجيتيكيو-BG-001-96Bاستخراج الحمض النووي
نظام تحليل PCR الطبي الأوتوماتيكي بالكامل SLANهونغشيتحليل البيانات
SLAN-96S آلة PCR في الوقت الحقيقيهونغشيشبكة محلية - 96Sتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري
Thermo Scientific NanoDropثيرمو ساينتفيكنانو دروب واحدالتحليل الكمي للحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتينات
مجمدات درجة حرارة منخفضة للغاية (DW-YL450)ميلينج20172220091 SEDA-20 &درجة ؛ C لتخزين الكواشف
دوامة -5كيلين بيللخلط الكاشف

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gherardi, G. Staphylococcus aureus infection: pathogenesis and antimicrobial resistance. Int J Mol Sci. 24 (9), Int J Mol Sci(2023).
  2. Linz, M. S., Mattappallil, A., Finkel, D., Parker, D. Clinical impact of Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections. Antibiotics. 12 (3), 557(2023).
  3. Gao, Y., Chen, Y., Cao, Y., Mo, A., Peng, Q. Potentials of nanotechnology in treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Eur J Med Chem. 213, 113056(2021).
  4. Barber, M. Methicillin-resistant staphylococci. J Clin Pathol. 14 (4), 385-393 (1961).
  5. Arêde, P., Milheiriço, C., de Lencastre, H., Oliveira, D. C. The anti-repressor MecR2 promotes the proteolysis of the mecA repressor and enables optimal expression of β-lactam resistance in MRSA. PLoS Pathog. 8 (7), e1002816(2012).
  6. Ayliffe, G. A. The progressive intercontinental spread of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clin Infect Dis. 24 (Suppl 1), S74-S79 (1997).
  7. Borg, M. A., Camilleri, L. What is driving the epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in Europe. Microb Drug Resist. 27 (7), 889-984 (2021).
  8. Wang, B., et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in China: a multicentre longitudinal study and whole-genome sequencing. Emerg Microbes Infect. 11 (1), 532-542 (2022).
  9. Wang, X., et al. Phylogenetic analysis and virulence characteristics of methicillin-resistant Staphylococcus aureus ST45 in China: a hyper-virulent clone associated with bloodstream infections. mSystems. 8 (2), e0002923(2023).
  10. Tong, S. Y., et al. Genome sequencing defines phylogeny and spread of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a high transmission setting. Genome Res. 25 (1), 111-118 (2015).
  11. Sanchini, A. Recent developments in phenotypic and molecular diagnostic methods for antimicrobial resistance detection in Staphylococcus aureus: a narrative review. Diagnostics. 12 (1), 208(2022).
  12. Humphries, R. M., et al. The continued value of disk diffusion for assessing antimicrobial susceptibility in clinical laboratories: report from the Clinical and Laboratory Standards Institute Methods Development and Standardization Working Group. J Clin Microbiol. 56 (8), e00437-e00518 (2018).
  13. Schön, T., et al. Multicentre testing of the EUCAST broth microdilution reference method for MIC determination on Mycobacterium tuberculosis. Clin Microbiol Infect. 27 (2), 288.e1-288.e1 (2021).
  14. Pancholi, P., et al. Multicenter evaluation of the Accelerate PhenoTest BC kit for rapid identification and phenotypic antimicrobial susceptibility testing using morphokinetic cellular analysis. J Clin Microbiol. 56 (4), e01329-e01417 (2018).
  15. Martinsen, M. A., Jaramillo Cartagena, A., Bhattacharyya, R. P. Core antibiotic-induced transcriptional signatures reflect susceptibility to all members of an antibiotic class. Antimicrob Agents Chemother. 65 (6), e02296-e02320 (2021).
  16. Josten, M., et al. Identification of agr-positive methicillin-resistant Staphylococcus aureus harbouring the class A mec complex by MALDI-TOF mass spectrometry. Int J Med Microbiol. 304 (8), 1018-1023 (2014).
  17. Nix, I. D., et al. Detection of methicillin resistance in Staphylococcus aureus from agar cultures and directly from positive blood cultures using MALDI-TOF mass spectrometry-based direct-on-target microdroplet growth assay. Front Microbiol. 11, 232(2020).
  18. Bortolaia, V., et al. ResFinder 4.0 for predictions of phenotypes from genotypes. J Antimicrob Chemother. 75 (12), 3491-3500 (2020).
  19. Cunningham, S. A., Jeraldo, P. R., Schuetz, A. N., Heitman, A. A., Patel, R. Staphylococcus aureus whole genome sequence-based susceptibility and resistance prediction using a clinically amenable workflow. Diagn Microbiol Infect Dis. 97 (3), 115060(2020).
  20. Skov, R., et al. Phenotypic detection of methicillin resistance in Staphylococcus aureus by disk diffusion testing and Etest on Mueller-Hinton agar. J Clin Microbiol. 44 (12), 4395-4399 (2006).
  21. Bhowmik, D., Das, B. J., Pandey, P., Chetri, S., Chanda, D. D., Bhattacharjee, A. An array of multiplex PCR assays for detection of staphylococcal chromosomal cassette mec (SCCmec) types among staphylococcal isolates. J Microbiol Methods. 166, 105733(2019).
  22. Pereira, E. M., et al. Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus haemolyticus: methicillin-resistant isolates are detected directly in blood cultures by multiplex PCR. Microbiol Res. 165 (3), 243-249 (2010).
  23. Vandenbussche, F., Vandemeulebroucke, E., De Clercq, K. Simultaneous detection of bluetongue virus RNA, internal control GAPDH mRNA, and external control synthetic RNA by multiplex real-time PCR. Methods Mol Biol. 630, 97-108 (2010).
  24. Cui, C., Ba, X., Holmes, M. A. Prevalence and characterization of mecC MRSA in bovine bulk tank milk in Great Britain, 2017–18. JAC Antimicrob Resist. 3 (1), dlaa125(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Staphylococcus AureusMethicillin Resistant StaphylococcusMRSA DetectionMultiplex Real Time PCRFluorescent PCRBacterial Drug ResistanceRapid Pathogen DetectionmecA Genenuc GeneNosocomial Infections

Related Articles