مقالة منهجية

مقايسة LIVE / DEAD محسنة إلى جانب قياس التدفق الخلوي لقياس البقاء على قيد الحياة بعد الإجهاد في خلايا الخميرة

DOI:

10.3791/69005

⸱

أغسطس 29, 2025

 ,  , 
1Department of Biology, University of Iowa, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا لتحديد البقاء على قيد الحياة بعد الإجهاد في عينات الخميرة. يستخدم الاختبار صبغتين فلوريتين ، SYTO 9 ويوديد البروبيديوم (PI) ، لتحديد سلامة غشاء البلازما. يستخدم قياس التدفق الخلوي لتوفير تقديرات كمية وقابلة للتكرار لكسور الخلايا الحية والميتة والتالفة لعينات ما بعد الإجهاد التأكسدي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد تحديد البقاء على قيد الحياة مهمة شائعة وحاسمة في أبحاث الخميرة. توفر البقع الحية / الميتة القائمة على سلامة غشاء البلازما اختبارا سريعا وعالي الإنتاجية لبقاء الخميرة عند اقترانها بقياس التدفق الخلوي. ومع ذلك ، يمكن أن تؤثر الاختلافات في المخزن المؤقت للتلطيخ وتركيز الصبغة ووقت الحضانة وإعدادات قياس التدفق الخلوي على جودة البيانات وقابليتها للتكرار. يقدم هذا البروتوكول مقايسة LIVE / DEAD موحدة لقياس البقاء على قيد الحياة بعد الإجهاد في الخميرة باستخدام قياس التدفق الخلوي. بعد علاج المبيضات glabrata ، وهو ممرض خميرة انتهازي ، بجرعات مختلفة من بيروكسيد الهيدروجين ، تم تلطيخ عينات ما بعد الإجهاد بصبغة LIVE / DEAD مكونة من عنصرين تتكون من SYTO 9 ويوديد البروبيديوم (PI). تم استخدام قياس التدفق الخلوي للتمييز بين مجموعات الخلايا الحية والتالفة والميتة وتحديد نسبها المئوية في كل عينة. تمت مقارنة تقديرات البقاء على قيد الحياة بناء على النسبة المئوية للإحصائيات الحية بنتيجة وحدة تشكيل المستعمرة (CFU) على نفس العينة. أسفرت الطريقتان عن نتائج متسقة للعينات المعالجة بالجرعة الوهمية والمميتة (1 M H2O2). عند الجرعة شبه المميتة البالغة 100 ملي مولار H2O2 ، قدر SYTO 9 / PI معدل بقاء أعلى من CFU ، مما يعكس اختلافا رئيسيا بين الاثنين ، حيث يقيم البروتوكول المقدم هنا بقاء الخلية مباشرة بعد الإجهاد ، بينما يحدد CFU النسبة المئوية للخلايا القادرة على التعافي والتكاثر. ومن ثم ، يقيس هذا البروتوكول الجدوى في مرحلة مبكرة من عملية موت الخلية. باختصار ، يوفر البروتوكول الموصوف هنا بديلا سريعا وقابلا للتطوير ل CFU لقياس كمية البقاء على قيد الحياة بعد الإجهاد في الخميرة. توفر نتائجها معلومات تكميلية ل CFU من خلال تقييم البقاء على قيد الحياة في مرحلة مبكرة والتمييز بين الخلايا الميتة والتالفة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحتوي شعبة الخميرة الناشئة على العديد من النماذج البيولوجية والتكنولوجيا الحيوية المهمة. تتمثل المهمة الشائعة والحاسمة في أبحاث الخميرة في تحديد تأثير الاضطرابات الجينية أو البيئية ، بما في ذلك الإجهاد أو العلاجات الدوائية. في التخمير الصناعي ، على سبيل المثال ، يجب على المنتجين مراقبة جدوى مزارع الخميرة لضمان كفاءة وجودة عملية التخمير1،2. عند دراسة أنواع الخميرة المسببة للأمراض ، يعد قياس بقائها على قيد الحياة بعد الإجهاد أو العلاج المضاد للفطريات أمرا بالغ الأهمية لفهم الأساس الجيني والميكانيكي للسمات المرتبطة بالعدوى مثل مقاومة مضادات الفطريات. يعد قياس البقاء على قيد الحياة على القسطرة والأسطح أيضا مهمة مهمة في الإعداداتالسريرية 3. تدعو جميع هذه السيناريوهات المتنوعة إلى مناهج كمية يمكنها قياس نتائج علاجات الأدوية والإجهاد بسرعة ودقة.

تنقسم الأساليب الحالية لتحقيق الهدف أعلاه إلى ثلاث فئات رئيسية بناء على ما تقيسه. تقيس الفئة الأولى الاستمغناء ، أو قدرة خلايا الخميرة الفردية على تكوين مستعمرة واحدة بعد الإجهاد. الطريقة التمثيلية في هذه الفئة هي مقايسة وحدة تشكيل المستعمرات (CFU). تقيس الفئة الثانية الحيوية ، والتي تعتمد على اكتشاف الأنشطة الأنزيمية في الخلايا الحية. تشمل الأمثلة المجسات الكيميائية مثل صبغة FUN-14. تقيس الفئة الثالثة من الطرق سلامة غشاء البلازما - يعتبر الفقدان الذي لا رجعة فيه لسلامة غشاء البلازما "نقطة اللاعودة" لموت الخلايا5. تشمل الأمثلة على هذه الفئة الأصباغ الفلورية مثل يوديد البروبيديوم (PI).

يقدم هذا العمل مقايسة LIVE / DEAD محسنة إلى جانب قياس التدفق الخلوي لتحقيق قياس كمي سريع وقابل للتطوير لبقاء الخميرة بعد العلاج بالإجهاد. هذا الاختبار القائم على نفاذية الغشاء أسرع من CFU ، حيث يستغرق 15-30 دقيقة من التلوين مقارنة ب 24-48 ساعة من الحضانة لتشكيل المستعمرات. أيضا ، يمكن فحص العينات الملطخة بصبغة LIVE / DEAD بسهولة باستخدام قياس التدفق الخلوي بالإضافة إلى الفحص المجهري ، الذي يقيس عشرات الآلاف من الخلايا في بضع ثوان ويمكنه بسهولة معالجة عينات 96 بئرا لمقايسات عالية الإنتاجية. نتيجة لذلك ، يكون هذا الاختبار سريعا وكميا وقابلا للتطوير. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام بقعة LIVE / DEAD المكونة من عنصرين تتكون من SYTO 9 و PI لتحقيق قوة حل محسنة. يقوم SYTO 9 بتسمية جميع الخلايا ، الحية أو الميتة ، بينما يدخل PI فقط الخلايا ذات أغشية البلازما المعرضةللخطر 6،7. لذلك ، تتراكم الخلايا الحية SYTO 9 فقط بينما تتراكم الخلايا الميتة كل من SYTO 9 و PI. نظرا لأن PI له تقارب أعلى من SYTO 9 للحمض النووي ، فإنه يستبعد هذا الأخير بشكل تنافسي في الخلية8. أيضا ، تشكل الصبغتان زوجا من نقل طاقة الرنين Förster (FRET) ، حيث يتم امتصاص انبعاث SYTO 9 بواسطة PI كإثارة له. نتيجة لذلك ، تظهر الخلايا الميتة تألق أخضر صامتا وأحمر قويا. في المقابل ، تعرض الخلايا الحية تألق أخضر ساطع8. يتيح هذا الاختلاف تمايزا أفضل بين الخلايا الحية والميتة في وجود اختلافات في شدة التألق داخل كل مجموعة.

منذ التقرير الأولي لتطبيقه في الخميرة في عام 2004 ، كان استخدام SYTO 9 / PI في دراسات الخميرة متقطعا واقتصر إلى حد كبير على التقييمات النوعية باستخدام الفحص المجهري7،9،10،11،12،13،14،15. أحد القيود الرئيسية على اعتماده كمقايسة كمية لبقاء الخميرة هو عدم وجود توصيف منهجي ومقارنة مع الأساليب المستخدمة على نطاق واسع مثل CFU. يصف هذا البروتوكول فحصا موحدا بما في ذلك المخزن المؤقت للتلوين ، وتركيز الصبغة ، ووقت التلوين ، وإعدادات قياس التدفق الخلوي ، والتي وجد أنها تقلل من القطع الأثرية وتولد نتائج قابلة للتكرار عند تطبيقها على C. glabrata ونوعين آخرين من الخميرة16. نظرا لأن تلطيخ SYTO 9 / PI يكشف عن مجموعة وسيطة "تالفة" من الخلايا التي تختلف عن كل من الخلايا الحية والميتة في نمط تلطيخها ، يمكن أن تكمل CFU من خلال الكشف عن معلومات أكثر دقة حول تأثيرات علاج الإجهاد على خلايا الخميرة ، مما قد يتيح تطبيقات جديدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تطبيق إجهاد بيروكسيد الهيدروجين

  1. قبل يوم واحد على الأقل من التجربة ، قم بتلقيح ثقافة ليلية من C. glabrata من مستعمرة واحدة على صفيحة مخططة حديثا إلى 3 مل من الوسائط الاصطناعية الكاملة (SC) (1.7 جم / لتر قاعدة نيتروجين الخميرة ، مزيج كامل من الأحماض الأمينية ، 2٪ وزن / حجم الجلوكوز ، الماء) ، وزرعها عن طريق وضع الأنبوب الزجاجي في أسطوانة أسطوانية وتنمو عند 30 درجة مئوية. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام شاكر مداري عن طريق وضع الأنبوب الزجاجي بزاوية مائلة وهز المزرعة عند 200 دورة في الدقيقة.
    1. قم بقياس الكثافة الضوئية (OD600) للثقافة الليلية في صباح اليوم التالي وتخفيفها بوسائط SC جديدة إلى OD600 ~ 0.2 بحجم إجمالي قدره 10 مل. دعها تنمو لمدة مضاعفين ، والتي تستغرق حوالي 4 ساعات ، للوصول إلى منتصف السجل (OD600 ~ 1) المرحلة.
      مثال: إذا كانت الثقافة الليلية تحتوي على OD600 = 10، فأضف 200 ميكرولتر من هذه المزرعة إلى وسائط SC سعة 9.8 مل.
  2. في غضون 30 دقيقة قبل معالجة الإجهاد ، قم بإعداد وسائط إجهاد بيروكسيد الهيدروجين. يخفف بيروكسيد الهيدروجين بشكل متسلسل من مخزون 30٪ (9.798 م) إلى وسائط كاملة اصطناعية (SC) إلى التركيز المطلوب. قم بتضمين علاج وهمي (SC بدون إضافة بيروكسيد الهيدروجين) وجرعة مميتة (1 M مناسب ل C. glabrata).
    مثال: لعمل وسائط إجهاد بيروكسيد الهيدروجين 100 ملي مولار، أضف 10.3 ميكرولتر من مخزون بيروكسيد الهيدروجين 9.798 M إلى 1 مل SC. لعمل وسائط إجهاد بيروكسيد الهيدروجين 10 ملي مولار ، قم بتخفيف 500 ميكرولتر من وسائط إجهاد بيروكسيد الهيدروجين 100 ملي مولار إلى 4.5 مل من SC.
  3. قم بقياس OD600 لثقافة منتصف السجل وتوحيدها ، على سبيل المثال ، OD600 = 1 ، بإضافة وسائط SC.
    مثال: ثقافة منتصف السجل عند OD600 = 1.2. أضف 0.2 مل من وسائط SC لكل 1 مل من المزرعة.
  4. انقل 600 ميكرولتر من ثقافة منتصف السجل لكل حالة اختبار إلى لوح بئر عميق 96. خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 3,000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق الشفط دون إزعاج حبيبات الخلية.
  5. أضف 600 ميكرولتر من وسائط الإجهاد الوهمية أو بيروكسيد الهيدروجين المحضرة في الخطوة 1.2 إلى كل بئر وقم بالماصة برفق لإعادة تعليق الخلايا.
  6. احتضان اللوحة لمدة 120 دقيقة عند 30 درجة مئوية مع الرج عند 300 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: يعتمد وقت الحضانة على المسألة البيولوجية ذات الأهمية.

2. تطبيق وصمة عار SYTO 9 / PI

  1. قبل التجربة ، قم بإعداد 10 مل على الأقل من محلول ملحي معقم بنسبة 0.85٪.
    ملاحظة: وجدنا 0.85٪ محلول ملحي لإنتاج الحد الأدنى من القطع الأثرية ، أي الخلايا غير الملوثة والشبيهة بالميتة في عينات معالجة وهمية ، مقارنة بالماء منزوع الأيونات أو وسائط النمو16.
  2. قم بإعداد محلول مخزون العمل من PI عند 0.2 ملي مولار باستخدام ماء معقم منزوع الأيونات.
    ملاحظة: يمكن تخزين مخزون العمل هذا من PI لمدة تصل إلى 6 أشهر عند 4 درجات مئوية.
  3. قبل التجربة مباشرة ، قم بإعداد محلول مخزون SYTO 9 العامل عند 33.4 ميكرومتر بماء معقم منزوع الأيونات.
    ملاحظة: قم بإعداد مخزون العمل SYTO 9 طازجا لكل تجربة. لا تخزن وتعيد استخدامها.
  4. ماصة برفق لخلط الخلايا في كل بئر من لوحة المعالجة. قم بقياس OD600 لكل حالة معالجة واحسب مقدار المخزن المؤقت اللازم لإعادة تعليق الخلايا إلى OD600 من 1.
    ملاحظة: يمكن استخدام الماصات متعددة القنوات للخلط الفعال والموحد. تجنب الإفراط في خلط العينات.
  5. اجمع خلايا الخميرة بعد العلاج الوهمي أو الإجهاد عن طريق الطرد المركزي عند 3,000 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية بعناية من خلال الشفط. قم بتعليق الخلايا في محلول ملحي معقم بنسبة 0.85٪ إلى OD600 = 1 (محسوبة في الخطوة 2.4).
    ملاحظة: استخدم ماصة متعددة القنوات لإعادة تعليق الخلايا. تعامل مع جميع ثقافات ما بعد العلاج بعناية وتجنب الإفراط في الخلط.
  6. احتفظ ب 50 ميكرولتر من كل عينة لتكون بمثابة أدوات التحكم في تلطيخ الصبغة غير الملوثة والمفردة.
    ملاحظة: تم العثور على الحد الأدنى من التألق الذاتي للنوع البري C. glabrata في كلتا القناتين ل SYTO 9 و PI. ومع ذلك ، تحقق دائما من العينات غير الملوثة بحثا عن التألق الذاتي وقم بإجراء طرح الخلفية المناسب أو استخدم وسائط نمو منخفضة التألق الذاتي.
  7. Aliquot 16 ميكرولتر من عينة ما بعد المعالجة معلقة في محلول ملحي 0.85٪ إلى أنبوب PCR سعة 50 ميكرولتر. أضف 2 ميكرولتر من مخزون العمل 0.2 ملي مولار من PI إلى تعليق الخلية. ثم أضف 2 ميكرولتر من مخزون العمل 33.4 ميكرومتر من SYTO 9 إلى نفس الأنبوب إلى الحجم النهائي البالغ 20 ميكرولتر.
    1. ستكون التركيزات النهائية ل PI و SYTO 9 20 ميكرومتر و 3.34 ميكرومتر على التوالي. قم بخلط الماصة برفق للخلط والتحضن لمدة 30 دقيقة في الظلام (يمكن استخدام الصندوق الأسود) في درجة حرارة الغرفة.

3. إعداد ومعايرة مقياس التدفق الخلوي

ملاحظة: يجب أن يتم ذلك على كل أداة جديدة وأيضا على التطبيقات الجديدة لتلوين SYTO 9 / PI ، بما في ذلك الأنواع / السلالات المختلفة ، أو الضغوطات الجديدة ، أو بروتوكول النمو ، إلخ. تم تطوير الإعدادات أدناه على مقياس التدفق الخلوي Attune NxT. راجع دليل المستخدم الخاص بالجهاز المستخدم للحصول على تعليمات محددة.

  1. اختر قنوات / مرشحات مضان مناسبة لمقياس التدفق الخلوي: تم استخدام مرشح ممر نطاق 530 نانومتر ± 30 نانومتر (BL1) ومرشح تمرير بطول 600 نانومتر (> 600 نانومتر ، BL3) لجمع الإشارات في القنوات الخضراء (SYTO 9) والحمراء (PI و SYTO 9). كلاهما كان متحمسا لليزر الأزرق 488 نانومتر.
  2. اضبط معدل التدفق على 200 ميكرولتر / دقيقة وتوقف عند جمع 30,000 حدث على الأقل.
    ملاحظة: يمكن تعديل عدد الأحداث لكل عينة بهدف تحقيق تقديرات قوية للنسب المئوية. يجب استبعاد العينات التي تحتوي على عدد قليل جدا من الأحداث (الخلايا). الخطوة التالية هي ضبط الفولتية على قنوات FSC و SSC أثناء الإعداد الأولي.
  3. قم بتخفيف عينة 16 ميكرولتر غير ملوثة ومعالجة وهمية إلى 200 ميكرولتر عازلة ملحية معقمة بنسبة 0.85٪. ماصة برفق لخلطها مباشرة قبل قياس التدفق الخلوي. قم بتشغيل هذا العينة وضبط الفولتية لقنوات FSC و SSC بحيث يكون السكان في مركز FSC vs. مؤامرة كثافة SSC.
    ملاحظة: تم استخدام جهد 345 مللي فولت و 399 مللي فولت ل FSC و SSC ، على التوالي. تتمثل الخطوات التالية في ضبط الفولتية على قنوات التجميع (BL1 و BL3) أثناء الإعداد الأولي.
  4. امزج 24 ميكرولتر من العينة المعالجة الوهمية مع 24 ميكرولتر من عينة معالجة ببيروكسيد الهيدروجين أو مقتولة حراريا 1000 ملي.
  5. قسم عينة الخلايا الحية والميتة المختلطة إلى ثلاثة أنابيب سعة كل منها 16 ميكرولتر. تلطخ الأنابيب الثلاثة ب (1) 2 ميكرولتر SYTO 9 و 2 ميكرولتر ماء لمدة 30 دقيقة ؛ (2) 2 ميكرولتر PI و 2 ميكرولتر ماء لمدة 30 دقيقة ؛ (3) 2 ميكرولتر SYTO 9 و 2 ميكرولتر PI لمدة 30 دقيقة. اتبع بروتوكول التلوين من القسم السابق.
    1. بعد الحضانة ، أضف 200 ميكرولتر من محلول ملحي معقم بنسبة 0.85٪ إلى كل أنبوب. هم الآن جاهزون لقياس التدفق الخلوي.
  6. قم بتشغيل الأنبوب (1) لضبط جهد قناة التألق الأخضر (BL1) ؛ ثم قم بتشغيل الأنبوب (2) لضبط جهد التألق الأحمر (BL3). الهدف هو أن يكون وضع توزيع شدة كل قناة ~ 104-10 5 للاستفادة من النطاق الديناميكي الكامل للأداة.
    ملاحظة: يرجى اتباع تعليمات مقياس التدفق الخلوي الخاص بك عند ضبط الفولتية. تحتوي بعض مقاييس التدفق الخلوي على جهد ثابت ، ويتم حذف هذه الخطوة.
  7. قم بتشغيل الأنبوب (3) للتحقق مما إذا كانت مجموعات الخلايا الحية والميتة منفصلة جيدا. اضبط جهد قناة BL1 أو BL3 إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: تم استخدام جهد 200 مللي فولت لكل من قنوات BL1 و BL3 على Attune NxT.
  8. قم بتشغيل العينة المعالجة الوهمية وغير الملوثة تحت إعدادات الجهد المحددة للتأكد من أن العينة تحتوي على الحد الأدنى من التألق الذاتي في القنوات ذات الأهمية (<102).

4. تشغيل العينات على مقياس التدفق الخلوي

  1. قم بتطبيق إعدادات مقياس التدفق الخلوي المحددة أعلاه وقم بتشغيل العينة غير الملوثة أولا للتأكد من أن إشارات التألق الذاتي أقل من 102 في كل من قنوات BL1 و BL3.
  2. أضف 200 ميكرولتر 0.85٪ محلول ملحي إلى كل عينة ملطخة وقم بتشغيلها على مقياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: إذا تم فحص عينات متعددة ، فقم بترتيب خطوة التلوين بحيث يتم تلطيخ كل عينة لمدة 30 دقيقة قبل تشغيلها على مقياس التدفق الخلوي.
  3. تصدير إخراج قياس التدفق الخلوي كملفات .fcs (FCS 3.0 أو 3.1 قياسي).

5. تحليل البيانات في R

ملاحظة: يتم توفير برنامج نصي لتحليل العينة كملف تكميلي 1. يتم توفير أمثلة على استراتيجيات البوابات في قسم النتائج التمثيلية.

  1. قم بتثبيت وتحميل الحزم المطلوبة: (1) flowCore (2) ggplot2 (3) ggcyto.
  2. استيراد ملفات .fcs إلى بيئة R الحالية.
  3. اضبط أسماء الملفات وحدد ظروف العلاج.
  4. قم بعمل مخطط كثافة ثنائي الأبعاد لجميع الأحداث على FSC. H مقابل SSC.H. استخدم بوابة مضلع لاستبعاد الأحداث غير الخلوية. قم بتسمية هذه البوابة "الخلايا".
    ملاحظة: في بعض مقاييس التدفق الخلوي ، يوصى باستخدام معلمة المنطقة على الارتفاع. تحقق من التوصيات الخاصة بالأداة.
  5. بالنسبة للسكان المسورين "الخلايا" ، قم بعمل مخطط كثافة ثنائي الأبعاد على FSC. H مقابل FSC.W. عادة ما تكون مجموعتان مرئيتين بنطاقات مماثلة من FSC. H ولكن FSC.W. المجموعة ذات متوسط FSC أقل. يحتوي مستوى W على الخلايا المفردة ("المنفردة"). ارسم بوابة مضلع لتحديدها وقم بتسمية البوابة "المفردة".
  6. بالنسبة للسكان المسورين "المفردين" ، قم بعمل مخطط كثافة ثنائي الأبعاد على BL1. H ضد BL3.H. ارسم بوابات مضلع للمجموعات الحية والتالفة والميتة بناء على عناصر التحكم في الخلايا الحية والميتة. ويرد مثال على ذلك في قسم النتائج التمثيلية.
  7. تحديد البقاء على قيد الحياة باستخدام النسب المئوية لكل مجموعة سكانية وتصدير الإحصائيات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تميز صبغة SYTO 9 / PI خلايا الخميرة الحية عن الخلايا الميتة بناء على إشارات التألق في القنوات الخضراء (500 نانومتر - 560 نانومتر) والحمراء (>600 نانومتر). تتألق الخلايا الحية ، التي تتراكم SYTO 9 فقط ، بقوة في القناة الخضراء ، مع الحد الأدنى من الإشارات الحمراء. تتراكم الخلايا الميتة كل من SYTO 9 و PI ومن المتوقع أن تتألق بقوة في القناة الحمراء ، مع إشارات مضان خضراء أقل مقارنة بالخلايا الحية بسبب الاستبعاد التنافسي ل SYTO 9 بواسطة PI و FRET.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول اختبار LIVE / DEAD باستخدام صبغتين فلوريتين ، SYTO 9 و PI ، واستخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد كمية البقاء على قيد الحياة بعد الإجهاد في الخميرة. في حين تم تطبيق هاتين البقعتين لتقييم البقاء على قيد الحياة في أنواع الخميرة المختلفة في الأدبيات وهما متاحان كمجموعة تجارية ، لا يقدم دليل الشركة المصنعة ولا الأدبيات تفاصيل كافية حول بروتوكول التلوين أو إعدادات قياس التدفقالخلوي 7. هنا ، نقدم بروتوكولا موحدا ناتجا عن التوصيف المنهجي للمقايسة ، بما في...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر الدكتور مايكل دايلي ومركز كارفر للتصوير على تدريبهم ودعمهم للفحص المجهري. نود أن نشكر الأعضاء السابقين والحاليين في مختبر تنظيم الجينات على التعليقات التي لا تقدر بثمن حول البروتوكول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
صفيحة بئر عميقة بعمق 96 بئرثيرمو فيشر278606NUNC 96
مقياس تدفق أتون NxT مع قارئ الألواحثيرمو فيشر A24858A24858السامبلر التلقائي (A42901)
Candida glabrataCG99، سلالة مختبرية مشتقة من العزل السريري (كورماك & فالكو، 1999)
مجموعة FungaLight Yeast LIVE/DEADثيرمو فيشر A24858L34952يحتوي على SYTO 9 (3.34 ملليمولار) ويوديد بروبيديوم (20 ملليموتر). يمكن أيضا شراء هذين المكونين بشكل منفصل من بائعين مختلفين.
بيروكسيد الهيدروجينسيغما ألدريتشH1009
مجهر لايكا كونفوكال SP8لايكاTCS SP8 X
كلوريد الصوديومسيغما ألدريتشS9888يستخدم لصنع محلول معقم بنسبة 0.85٪ NaCl
قاعدة النيتروجين الخميرية بدون أحماض أمينيةسيغما ألدريتشY0626يستخدم لصنع وسط Synthetic Complete بمزيج 2٪ من الجلوكوز والأحماض الأمينية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lourens-Hattingh, A., Viljoen, B. Growth and survival of a probiotic yeast in dairy products. Food Res Int. 34 (9), 791-796 (2001).
  2. Qiu, X., et al. Stress tolerance phenotype of industrial yeast: industrial cases, cellular changes, and improvement strategies. Appl Microbiol Biotechnol. 103 (16), 6449-6462 (2019).
  3. Welsh, R., et al. Survival, persistence, and isolation of the emerging multidrugresistant pathogenic yeast Candida auris on a plastic health care surface. J Clin Microbiol. 55 (10), 2996-3005 (2017).
  4. Millard, P. J., Roth, B. L., Thi, H. P., Yue, S. T., Haugland, R. P. Development of the FUN1 family of fluorescent probes for vacuole labeling and viability testing of yeasts. Appl Environ Microbiol. 63 (7), 2897-2905 (1997).
  5. WlochSalamon, D. M., Bem, A. E. Types of cell death and methods of their detection in yeast Saccharomyces cerevisiae. J Appl Microbiol. 114 (2), 287-298 (2013).
  6. Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD BacLight: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. J. Microbiol. Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
  7. Zhang, T., Fang, H. H. P. Quantification of Saccharomyces cerevisiae viability using BacLight. Biotechnol Lett. 26 (12), 989-992 (2004).
  8. Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry A. 61A (2), 189-195 (2004).
  9. Sun, S., Baryshnikova, A., Brandt, N., Gresham, D. Genetic interaction profiles of regulatory kinases differ between environmental conditions and cellular states. Mol Syst Biol. 16 (5), e9167(2020).
  10. Li, Z., et al. Allicin shows antifungal efficacy against Cryptococcus neoformans by blocking the fungal cell membrane. Front Microbiol. 13, 1012516(2022).
  11. Jin, Y., Zhang, T., Samaranayake, Y., Fang, H. H. P., Yip, H. K., Samaranayake, L. P. The use of new probes and stains for improved assessment of cell viability and extracellular polymeric substances in Candida albicans biofilms. Mycopathologia. 159 (3), 353-360 (2005).
  12. Bojsen, R., Regenberg, B., Folkesson, A. Saccharomyces cerevisiae biofilm tolerance towards systemic antifungals depends on growth phase. BMC Microbiol. 14, 305(2014).
  13. Ryan, L. K., et al. Activity of potent and selective host defense peptide mimetics in mouse models of oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (7), 3820-3827 (2014).
  14. Chudzik, B., Koselski, M., Czuryło, A., Trębacz, K., Gagoś, M. A new look at the antibiotic amphotericin B effect on Candida albicans plasma membrane permeability and cell viability functions. Eur. Biophys. J. (EBJ). 44 (1-2), 77-90 (2015).
  15. Roscetto, E., Contursi, P., Vollaro, A., Fusco, S., Notomista, E., Catania, M. R. Antifungal and antibiofilm activity of the first cryptic antimicrobial peptide from an archaeal protein against Candida spp. clinical isolates. Sci Rep. 8 (1), 17570(2018).
  16. Tang, H., Liang, J., He, B. Z. An optimized LIVE/DEAD assay using flow cytometry to quantify poststress and antifungaltreatment survival in diverse yeasts. BioRiv. , (2025).
  17. Stiefel, P., SchmidtEmrich, S., ManiuraWeber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiol. 15 (1), 36(2015).
  18. Rego, A., Ribeiro, A., CôrteReal, M., Chaves, S. Monitoring yeast regulated cell death: Trespassing the point of no return to loss of plasma membrane integrity. Apoptosis. 27 (9), 778-786 (2022).
  19. CarmonaGutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  20. Miller, J., et al. Using colony size to measure fitness in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 17 (10), e0271709(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Yeast SurvivalPlasma Membrane IntegrityCandida GlabrataHydrogen Peroxide StressSYTO 9 StainingPropidium IodideColony Forming Unit

مقالات ذات صلة