يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) المُحسَّن القائم على الفينول الساخن من البكتيريا الميتاكوندريا: نهج قوي لتحليل موثوق للتعبير الجيني

745 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69006

⸱

سبتمبر 11, 2026

 ,  ,  , 
1Amity Institute of Molecular Medicine and Stem Cell Research, Amity University Uttar Pradesh, 2Amity Institute of Genome Engineering, Amity University Uttar Pradesh

في هذه المقالة

ملخص

تعمل هذه الدراسة على تحسين طريقة لاستخلاص الـ RNA تعتمد على الفينول الساخن لبكتيريا Mycobacterium، مما ينتج RNA عالي الجودة مناسب للتحليلات الترانسكريبتومية. وعند مقارنتها بطريقتي TRIzol و RNeasy تحت ظروف متطابقة، وفرت هذه الطريقة إنتاجية أعلى، وسلامة مماثلة، وكفاءة أفضل من حيث التكلفة، مما يجعلها بديلًا عمليًا لدراسات التعبير الجيني واسعة النطاق.

الملخص

تظل Mycobacterium tuberculosis (Mtb) تهديداً صحياً عالمياً رئيسياً، مما يؤكد الحاجة إلى دراسات ترانسكريبتومية موثوقة لفهم بيولوجيتها وآليات مقاومتها للأدوية. وتعتمد هذه التحليلات على الحصول على RNA عالي الجودة وبإنتاجية عالية. ورغم توفر عدة طرق لاستخلاص RNA، فإن العديد منها يتطلب كواشف باهظة الثمن، أو أحجام زراعة كبيرة، أو معدات متخصصة، مما يحد من ملاءمتها للدراسات واسعة النطاق، لا سيما في البيئات محدودة الموارد. وفيما يلي، يتم عرض طريقة محسنة لاستخلاص RNA تعتمد على الفينول الساخن مصممة خصيصاً للمتفطرات. تستخدم هذه الطريقة الحد الأدنى من حجم المزرعة وكواشف متاحة بشكل شائع لإنتاج RNA عالي الجودة باستمرار، وهو مناسب لتطبيقات الترانسكريبتوميك عالية الإنتاجية. وقد تم تقييم كمية وسلامة RNA عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام وتحليل سلامة RNA (RIN)، وتم تأكيد ملاءمته للتطبيقات اللاحقة بواسطة qPCR و Qubit 4. ولمعايرة أداء الطريقة المحسنة، تم إجراء استخلاص متوازٍ لـ RNA باستخدام TRIzol و RNeasy تحت ظروف تجريبية متطابقة، بما في ذلك نفس أنواع Mycobacterium، وحجم المزرعة، ومرحلة النمو (اللوغاريتمية والثابتة)، وظروف التحلل. وقد أتاح ذلك مقارنة مباشرة من حيث الإنتاجية والجودة والجدوى والتكلفة. وأظهرت طريقة الفينول الساخن المحسنة إنتاجية وجودة RNA مماثلة أو محسنة مع تقليل تكلفة الكواشف والاعتماد على المعدات المتخصصة بشكل كبير. ونظراً لكفاءتها وقابلية تكرارها وتكلفتها الميسورة، يوفر هذا البروتوكول بديلاً عملياً لدراسات التعبير الجيني والترانسكريبتوميك واسعة النطاق في Mtb وأنواع المتفطرات الأخرى.

المقدمة

M. tuberculosis (Mtb)، وهو العامل المسبب لمرض السل (TB)، لا يزال السبب الرئيسي للوفاة الناجمة عن مسبب مرض معدٍ واحد، متجاوزاً بذلك فيروس نقص المناعة البشرية/الإيدز (HIV/AIDS). في عام 2024، تسبب السل في وفاة ما يقرب من 1.3 مليون شخص في جميع أنحاء العالم1. ويزداد هذا العبء تفاقماً بسبب ارتفاع انتشار السلالات المقاومة للأدوية المتعددة (MDR) والسلالات شديدة المقاومة للأدوية (XDR). وبناءً على ذلك، هناك حاجة ملحة لفهم الأساس الجزيئي لإمراضية السل وتحديد أهداف علاجية جديدة2.

أصبح التوصيف النسخي لبكتيريا Mtb أداة مهمة لتوضيح العناصر الوظيفية المشاركة في التفاعلات بين المضيف والممرض3، والتكيف مع الإجهاد البيئي4، والآليات الكامنة وراء مقاومة الأدوية5. وقد أدت المنهجيات المتقدمة مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR)، والمصفوفات الدقيقة (microarrays)، وتسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) إلى تعزيز القدرة على تحليل ترانسكريبتوم المتفطرات بشكل كبير6. ومع ذلك، يعتمد نجاح هذه الطرق بشكل كبير على توفر حمض RNA عالي الجودة، والذي يعتمد بدوره على التحلل الخلوي الفعال أثناء عملية الاستخلاص. ويجعل جدار الخلية المعقد المكون من الميكوليل-أرابينوجالاكتان-ببتيدوجليكان في بكتيريا Mtb استخلاص RNA صعباً بشكل خاص7. وغالباً ما تتطلب تقنيات التحلل الموجودة، بما في ذلك التحلل المائي الإنزيمي8، والسونيكيشن (sonication)9، والضرب بالخرز (bead-beating)10، معدات مكلفة وأحجام مستنبتات كبيرة، مما يحد من عمليتها في العديد من مختبرات المستوى الثالث من السلامة البيولوجية (BSL-3). بالإضافة إلى ذلك، يتطلب معدل النمو البطيء لبكتيريا Mtb فترات استنبات طويلة للحصول على كتلة حيوية كافية11.

وللتغلب على هذه القيود، تم تطوير طريقة محسنة لاستخلاص RNA تعتمد على الفينول الساخن (Hot Phenol)، وتتميز بأنها سريعة واقتصادية. وباستخدام 3 mL فقط من المزرعة في مرحلة النمو اللوغاريتمي المتوسط، تعطي هذه الطريقة من 45–60 µg من RNA عالي الجودة والمناسب للتحليلات النسخية اللاحقة. ويتم تحقيق تحلل الخلايا باستخدام مطحنة أنسجة يدوية مدمجة وكواشف متاحة بسهولة، مما يلغي الحاجة إلى أجهزة باهظة الثمن. ورغم أنه تم الإبلاغ عن طريقة الفينول الساخن سابقاً11,12، إلا أن طريقة الفينول الساخن المحسنة تعزز من سهولة الاستخدام والجدوى الاقتصادية وإنتاجية RNA. وقد أُجري التحسين باستخدام M. smegmatis mc2155 (Msmeg) وتم التحقق من نجاحها باستخدام Mtb H37Rv.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. استزراع Mycobacterium

  1. يتم تلقيح 1mL من المخزون الجليسيرولي لبكتيريا Msmeg أو Mtb في 10 mL من وسط Middlebrook 7H9 المكمل بـ 0.2% جليسيرول، و0.05% Tween 80، و10% ADC عند درجة حرارة 37 °C مع الرج بسرعة 150 rpm حتى تصل الكثافة الضوئية (OD) إلى 1–1.5.
  2. تُنمى المزرعة الثانوية بإضافة 1% من المزرعة الأولية إلى 10 mL من وسط 7H9 حتى الوصول إلى منتصف مرحلة النمو اللوغاريتمي، حيث تكون الكثافة الضوئية OD600nm = 0.6–0.7.
  3. تُقسم المزرعة إلى حصص حجم كل منها 3 mL، ثم تُفصل المزارع بالطرد المركزي عند 2000 x g لمدة 5 min في درجة حرارة الغرفة (23–25 °C).
  4. تُحفظ الرواسب عند درجة حرارة -80 °C حتى يتم استخلاص الـ RNA.
    تنبيه: بالنسبة لمزارع Mtb، يجب اتباع إرشادات مستوى السلامة البيولوجية الثالث (BSL3) وإتمام التعطيل الحراري للراسب عند 95 ˚C لمدة 20–25 min.
    ملاحظة: يوضح الشكل 1 المخطط الانسيابي للخطوات الأساسية المتبعة أثناء استخلاص الـ RNA باستخدام طريقة الفينول الساخن.

مخطط لاستخلاص الـ RNA بطريقة الفينول الساخن مع الخطوات؛ مقايسة النسخ؛ سلامة الـ RNA بواسطة Qubit؛ التحليل.
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لطريقة الفينول الساخن والتحليل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. استخلاص الـ RNA

  1. طريقة الفينول الساخن (طريقة HP)
    1. أضف 200 µL من محلول TES المنظم (100 mM Tris-HCl، pH 8.0؛ 5 mM EDTA، pH 8.0؛ 0.1 M NaCl؛ % SDS؛ 1% β-mercaptoethanol) إلى كتلة الخلايا وأعد تعليق الكتلة باستخدام جهاز الرج vortexing.
    2. أضف ما يقرب من 0.1 g من حبيبات السيليكا بحجم 0.1 mm إلى العينة. استخدم مطحنة أنسجة يدوية لمدة 10–15 ثانية حتى تذوب الكتلة تمامًا على الثلج. كرر هذه الخطوة لدورتين إضافيتين، يليهما تجميد سريع في النيتروجين السائل بعد كل تكرار.
    3. أو استخدم جهاز تفتيت حبيبات مكتبي عالي السرعة لمدة دقيقة واحدة عند ضبط السرعة على 5 (5.0 m/s) في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوة لـ 3 دورات واحفظ العينة على الثلج لمنع ارتفاع درجة الحرارة بعد كل دورة.
      ملاحظة: كرر عملية تحلل خلايا Mtb لـ 6–8 دورات (دقيقة واحدة لكل دورة) إما باستخدام مطحنة أنسجة يدوية أو جهاز تفتيت الحبيبات، مع التبريد المتقطع على الثلج بعد كل دورة. استخدم مياهًا معالجة بـ DEPC (Diethylpyrocarbonate) لتحضير جميع المحاليل المنظمة والكواشف اللازمة لاستخلاص RNA.
    4. أضف 200 µL إضافية من محلول TES المنظم (يتم تسخينه مسبقًا إلى 65 °C) إلى كل عينة ليصل الحجم الإجمالي إلى 400 µL. أضف إلى كل عينة 200 µL من الفينول الحمضي (فينول متوازن مع محلول سترات منظم بتركيز 100 mM، pH 4.5) و 200 µL من الكلوروفورم (اخلط الفينول الحمضي والكلوروفورم بنسبة متساوية قبل إضافتهما إلى العينة).
    5. احضن العينة عند 65 °C على وحدة تسخين (heat block) مع الرج بسرعة 900 rpm لمدة 30 دقيقة، ثم قم بالطرد المركزي عند 12000 x g لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تأكد من حدوث فصل مناسب للأطوار بعد الطرد المركزي (سيلاحظ وجود طور مائي علوي رائق يحتوي على RNA، وطور بيني متميز يحتوي على DNA، وطور عضوي سفلي يحتوي على البروتينات والدهون).
    6. أزل الطبقة العلوية من الطور المائي وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 mL. أضف حجمًا مساويًا من خليط الفينول الحمضي والكلوروفورم مرة أخرى. قم بالطرد المركزي عند 12,000 x g لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تأكد من حدوث فصل مناسب للأطوار.
    7. انقل الطبقة المائية العلوية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 mL، ثم أضف 30 µL من محلول أسيتات الصوديوم المنظم بتركيز 3 M، pH 5.3، و 240 µL من الإيزوبروبانول المبرد. احضن العينة عند −80 °C لمدة تتراوح من 30 دقيقة إلى ساعة واحدة.
      ملاحظة: يمكن تخزين أنبوب الطرد المركزي الدقيق طوال الليل عند -80 °C في هذه الخطوة. أغلق أنبوب الطرد المركزي الدقيق بعدة طبقات من البارافيلم لمنعه من الانفتاح عند 65 °C أثناء الحضن.
      تحذير: يعد الفينول والكلوروفورم مواد كيميائية خطرة؛ لذا يجب اتباع إجراءات الوقاية الشخصية المناسبة (PPE)، وضوابط الهندسة مثل خزانات استخلاص الغازات (fume hoods)، وإجراءات التخلص من النفايات المحددة.
    8. قم بالطرد المركزي عند 12,000 x g لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تأكد من تكوين الكتلة وأزل السائل الطافي بعناية دون تحريك الكتلة.
    9. أعد تعليق الكتلة في 1 mL من الإيثانول بتركيز 75% وقم بالطرد المركزي عند 12,000 x g لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. نفذ هذه الخطوة مرتين وجفف الكتلة في الهواء.
    10. أعد تعليق الكتلة في 50 µL من مياه خالية من النيوكلييز.
      ملاحظة: لإذابة RNA، احضنه في مياه خالية من RNase لمدة 10–30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  2. طريقة TRIzol
    1. أضف 200 µL من كاشف TRIzol إلى كتلة الخلايا.
      تحذير: يعد TRIzol مادة كيميائية خطرة؛ لذا يجب اتباع إجراءات الوقاية الشخصية المناسبة (PPE)، وضوابط الهندسة مثل خزانات استخلاص الغازات (fume hoods)، وإجراءات التخلص من النفايات المحددة.
    2. اتبع طريقة تحلل الخلايا كما في الخطوات 2.1.2 - 2.1.3.
    3. أضف 200 µL إضافية من كاشف TRIzol، يليه 200 µL من الكلوروفورم، ثم استخدم جهاز الرج vortex لمدة دقيقة واحدة. قم بالطرد المركزي عند 13,400 x g لمدة 15 دقيقة عند 4 °C. تأكد من حدوث فصل مناسب للأطوار بعد الطرد المركزي.
    4. انقل الطور المائي بعناية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 mL.
    5. قم بترسيب RNA بإضافة 500 µL من الإيزوبروبانول إلى الطور المائي والحضن عند −80 °C لمدة تتراوح من 30 دقيقة إلى ساعة واحدة.
    6. قم بترسيب RNA عن طريق الطرد المركزي عند 15,000 x g لمدة 20 دقيقة عند 4 °C. راقب الكتلة بعناية وأزل السائل الطافي دون تحريك الكتلة.
    7. أعد تعليق الكتلة بـ 1 mL من الإيثانول بتركيز 75% وقم بالطرد المركزي عند 13,400 x g لمدة دقيقة واحدة عند 4 °C. كرر هذه الخطوة مرتين، وجفف الكتلة في الهواء لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم أعد تعليقها في 50 µL من مياه خالية من النيوكلييز.
  3. طريقة طقم استخلاص RNA المتوفر تجاريًا
    1. أعد تعليق كتلة الخلايا في 200 µL من محلول إعادة التعليق المنظم (المتوفر في الطقم).
    2. اتبع طريقة تحلل الخلايا كما في الخطوات 2.1.2 - 2.1.3.
    3. أجرِ التجربة اللاحقة وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.

3. المعالجة بإنزيم DNase، والتقدير الكمي، والتصوير المرئي

  1. لإزالة التلوث بالحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (genomic DNA)، أضف 1 µL من DNase I (10units) و5 µL من RDD buffer (1x) إلى كل عينة RNA واحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  2. قم بقياس كمية عينة RNA طيفياً باستخدام Nanodrop وقياس سلامة RNA باستخدام Qubit4. القيمة المقبولة لـ RIN تتراوح بين 7.5 -10، بينما القيم المقبولة لـ A260/A280 وA260/A230 تقع في النطاق 1.8–2.0 و2.0–2.2 على التوالي.
  3. قم بتصوير RNA على هلام أغاروز بتركيز 1% باستخدام 1X RNA loading dye.

4. تخليق الـ cDNA وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (quantitative real-time PCR)

  1. قم بتجهيز تفاعل بحجم 20 µL لتحضير الـ cDNA باستخدام طقم cDNA Reverse Transcription و 1 µg من الـ RNA، باتباع تعليمات الشركة المصنعة في جهاز الدورات الحرارية (thermal cycler).
  2. قم بتجهيز تفاعل PCR في الوقت الحقيقي (real-time PCR) بحجم 10 µL باستخدام 50 ng من الـ cDNA، و 0.4 µM من كل بادئ (primer)، و SYBR وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتشغيل العينة في جهاز Real-Time PCR Thermal cycler.
    ملاحظة: استُخدمت البادئات التالية لتحليل qPCR:
    Mtb sigA Fw 5' cctcaaacagatcggcaagg 3', Mtb sigA Rv 5' cagatccacatcatgtcgcg 3'
    Mtb hsp70 Fw 5’ gctggtggacaagttcaagg 3', Mtb hsp70 Rv 5' ggtcagctgctcgtctaaga 3'
    Mtb16srRNA Fw 5' gcgatacgggcagactagag 3', Mtb16srRNA Rv 5' aaggaaggaaacccacacct 3'
    Ms. sigA Fw 5' gaagacaccgacctggaact 3', Ms.sigA ms Rv. 5' gactcttcctcgtcccacac 3'
    Ms. sigH Fw 5' gaagggttcccgtacaagg 3', Ms sigH Rv. 5' tcatgacgtcacctcctcg 3'
    Ms. sigE Fw 5' caccaccaaccttttcctcg 3', Ms. sigE Rv. 5' accctcgatgtcacacagg 3'

5. التحليل الإحصائي

  1. أجرِ اختبار t-test للطلاب لجميع المكررات البيولوجية باستخدام برنامج Graph Pad Prism، واعتُبرت القيمة P ≤ 0.05 ذات دلالة إحصائية. تمثل أشرطة الخطأ الخطأ المعياري من ثلاث مكررات بيولوجية على الأقل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

جودة وحصيلة الـ RNA

تم تقييم جودة وكمية الـ RNA عن طريق الفصل الكهربائي بهلام الأجاروز (الشكل 2). لوحظت حزم حادة ومتميزة تقابل 23S و 16S rRNA في جميع طرق الاستخلاص، مما يؤكد نجاح عزل الـ RNA الكلي. وأظهرت طريقتا الفينول الساخن (Hot Phenol) وTRIzol ثلاث حزم واضحة تمثل 23S (~2900 bp) و 16S (~1500 bp) و 5S rRNA (~120 bp)، مما يشير إلى أن الـ RNA سليم وعالي الجودة. وفي المقابل، أظهرت طريقة الطقم القائمة على العمود حزمتي 23S و 16S فقط،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بهدف تطوير طريقة بسيطة وقوية لاستخلاص الـ RNA من بكتيريا Mycobacterium، تم تحسين طريقة الفينول الساخن (Hot Phenol). لاحقاً، تمت مقارنة الـ RNA المستخلص باستخدام هذه الطريقة مع نهجين شائعين الاستخدام: TRIzol وطريقة مجموعة الاستخلاص القائمة على الأعمدة12,13. وقد تمت مقارنة هذه التقنيات بناءً على إنتاجية الـ RNA ونقاوته وسلامته والتكلفة ووقت المعالجة لتقييم مدى ملاءمتها للتطبيقات الجزيئية اللاحقة. أنتجت كل من طريقتا الفينول الساخن وTRIzol RNA سليماً وعالي ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لم يكن هناك أي تضارب في المصالح بين المؤلفين. وقد وافق جميع المؤلفين على تقديم البحث.

شكر وتقدير

أود أن أعرب عن تقديري للدعم المقدم من وزارة التكنولوجيا الحيوية (DBT)، والمجلس الهندي للأبحاث الطبية (ICMR)، ومجلس أبحاث العلوم والهندسة (SERB).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حبيبات سيليكا بحجم 0.1 ملمMP BiomedicalsMP116911050
2-بروبانولسيجما (Sigma)278475
Bead Ruptor 4 revvity
كلوروفورمسيجما288306
جهاز طرد مركزي مبردThermoScientific42541217
دي إن إيز 1 (DNase I) qiagen79254
إيديتات (EDTA)سيجماE02SS
HClمختبر الأبحاث والخدمات (SRL)62889
كتلة تسخينMIULABMU-E02-1049
طقم النسخ العكسي للحمض النووي الريبوزي المتمم (cDNA) عالي السعة Thermo Fischer Scientific4368814
مطحنة أنسجة تعمل بمحرك G10إكليلG22616008
NaClسيجماS5886
جهاز قياس الطيف الضوئي النانوي (Nanophotometer N50) تنفيذT51601
فينول متوازن مع محلول سترات منظم بتركيز 0.1 مولار، وبأس هيدروجيني (pH) 4.5سيجماP4682
PowerUP SYBRApplied BiosystemsA25742
مقياس الفلورية Qubit 4 Invitrogen2.32262E+12
جهاز الدورات الحرارية لتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (Real-Time PCR)Analytik Jena AG844-00503-2
طقم استخلاص الحمض النووي الريبوزي السهل RNA easy KitQiagen74104
سلفات دوديسيل الصوديوم (SDS)سيجماS9888
خلات الصوديومسيجماS2889
جهاز الدورات الحرارية Biorad621BR29739
كاشف TRIسيجماT9424
قاعدة تريس (Tris base)HimediaMB029
β-ميركابتويثانولسيجما516732

المراجع

  1. Global tuberculosis report, 2024. , Available from: https://www.who.int/publications/b/74877 (2024).
  2. Lange, C., et al. Drug-resistant tuberculosis: An update on disease burden, diagnosis and treatment. Respirology. 23 (7), 656-673 (2018).
  3. Tailleux, L., et al. Probing host-pathogen cross-talk by transcriptional profiling of both Mycobacterium tuberculosis and infected human dendritic cells and macrophages. PLoS One. 3 (1), e1403(2008).
  4. Voskuil, M. I., et al. Inhibition of respiration by nitric oxide induces a Mycobacterium tuberculosis dormancy program. J Exp Med. 198 (5), 705-713 (2003).
  5. Zhang, Y., Yew, W. W. Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis. 13 (11), 1320-1330 (2009).
  6. Arnvig, K. B., Young, D. B. Identification of small RNAs in Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 73 (3), 397-408 (2009).
  7. Brennan, P. J., Nikaido, H. The envelope of mycobacteria. Annu Rev Biochem. 64, 29-63 (1995).
  8. Belisle, J. T., Sonnenberg, M. G. Isolation of genomic DNA from mycobacteria. Methods Mol Biol. 101, 31-44 (1998).
  9. Manganelli, R., et al. Role of the extracytoplasmic-function sigma factor σH in Mycobacterium tuberculosis global gene expression. Mol Microbiol. 45 (2), 365-374 (2002).
  10. Rustad, T. R., et al. Global analysis of mRNA stability in Mycobacterium tuberculosis. Nucleic Acids Res. 41 (1), 509-517 (2013).
  11. Mangan, J. A., Sole, K. M., Mitchson, D. A., Butcher, P. D. An effective method of RNA extraction from bacteria refractory to disruption, including mycobacteria. Nucleic Acids Res. 25 (3), 675-676 (1997).
  12. Venkataraman, B., Gupta, N., Gupta, A. A robust and efficient method for the isolation of DNA-free, pure and intact RNA from Mycobacterium tuberculosis. J Microbiol Meth. 93 (3), 198-202 (2013).
  13. Hiebert, R. M., et al. RNA extraction and RNA-sequencing method for transcriptomic analysis of Mycobacterium tuberculosis. Biotechniques. 77 (1), 23-34 (2025).
  14. Kumar, K., Tharad, M., Ganapathy, S., et al. Phenylalanine-rich peptides potently bind ESAT6, a virulence determinant of Mycobacterium tuberculosis, and concurrently affect the pathogen's growth. PLoS One. 4, e7615(2009).
  15. Alli, A. O., et al. Optimization of RNA extraction in Mycobacterium tuberculosis for studying intracellular gene expression. Afr J Clin Exp Microbiol. 10 (2), 64-79 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

استخلاص الفينول الساخنالمتفطرة السليةالدراسات الترانسكريبتوميةسلامة الحمض النووي الريبيالرحلان الكهربائي للهلامتحليل qPCRمقارنة بـ TRIzolمقارنة بـ RNeasy
استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) المُحسَّن القائم على الفينول الساخن من البكتيريا الميتاكوندريا: نهج قوي لتحليل موثوق للتعبير الجيني
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.