مقالة منهجية

طفرات العاثية الدقيقة مع أنظمة CRISPR-Cas بمساعدة NgTET

1.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69022

⸱

أكتوبر 14, 2025

 ,  , 
1Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, 2Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology, 3Department of Bionanoscience, Delft University of Technology, 4Philipps-Universität Marburg, Department of Chemistry, Center for Synthetic Microbiology (SYNMIKRO), 5Institute of Pharmaceutical Biology and Biotechnology, Department of Pharmacy, Marburg University

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا لتقليل تعديلات الحمض النووي في العاثيات باستخدام إنزيم NgTET ، مما يتيح طفرات CRISPR-Cas الفعالة والخالية من الندوب. تسهل هذه الطريقة الهندسة الوراثية للعاثيات للتطبيقات في التكنولوجيا الحيوية والعلاج بالعاثيات.

الملخص

البكتيريا ، الفيروسات التي تستهدف مضيفيها البكتيريا على وجه التحديد ، لديها إمكانات كبيرة للتكنولوجيا الحيوية والطب ، خاصة في مكافحة العدوى المقاومة للأدوية المتعددة. ومع ذلك ، لا تزال الآليات الجزيئية الكامنة وراء عدوى العاثيات غير مستكشفة إلى حد كبير. تعد الطفرات الدقيقة الخاصة بالموقع للعاثيات أداة قوية لتوضيح وظائف الجينات وتفاعلات العاثيات والمضيف.

ومع ذلك ، فإن التحدي الرئيسي في طفرات جينوم العاثيات هو وجود تعديلات الحمض النووي للعاثيات التي تتداخل مع أدوات تحرير الجينوم التقليدية مثل CRISPR-Cas.

بينما تم استخدام أنظمة CRISPR-Cas بنجاح للطفرات المستهدفة في الكائنات الحية المختلفة ، فإن فعاليتها في طفرات العاثيات غالبا ما تكون محدودة بسبب تعديلات الحمض النووي مثل الارتباط بالسيتوزين بالجليكوزيل. للتغلب على هذا الحاجز ، قمنا بتطوير طريقة فعالة تقلل مؤقتا من وفرة تعديلات الحمض النووي للعاثيات ، مما يتيح استهداف CRISPR-Cas الفعال وإدخال الطفرات الدقيقة في جينومات العاثيات. على وجه التحديد ، نستخدم ميثيل سيتوزين ثنائي أوكسيجيناز Ten Eleven Translocation (TET) من Naegleria gruberi (NgTET) ، والذي يعمل بشكل متكرر على تحلل السيتوزينات الميثيلة والهيدروكسي ميثيل في الحمض النووي. عن طريق أكسدة السيتوزينات الهيدروكسي ميثيل داخل الحمض النووي للعاثية ، يمنع NgTET التعديل اللاحق للسيتوزين مثل الارتباط بالجليكوزيل ويعزز بشكل كبير كفاءة انقسام الحمض النووي بوساطة Cas.

في الختام ، يتيح نهج تحرير الجينوم الدقيق والخالي من الندوب المقدم هنا الإدخال الفعال للطفرات النقطية مع الحفاظ على بنية الجينات الأصلية في جينومات العاثيات. من خلال الحفاظ على أطر النسخ والترجمة السليمة ، تقلل هذه الطريقة من الاضطرابات غير المقصودة للشبكات التنظيمية المعقدة. هذا مهم بشكل خاص للتحقيق في بروتينات العاثية الأساسية أو متعددة الوظائف. إن القدرة على توليد تعديلات جينية مستهدفة دون إدخال تسلسلات غريبة توسع بشكل كبير مجموعة الأدوات التجريبية لبيولوجيا العاثيات. لا تسهل هذه الإستراتيجية الدراسات الوظيفية التفصيلية فحسب ، بل تعزز أيضا إمكانية الهندسة العقلانية للعاثيات للتطبيقات العلاجية والتكنولوجيا الحيوية.

المقدمة

العاثيات هي فيروسات تستهدف البكتيريا على وجه التحديد. لقد اجتذبوا اهتماما بحثيا كبيرا نظرا لإمكاناتهم الهائلة في التكنولوجيا الحيوية والطب ، لا سيما في مكافحة البكتيريا المقاومة للأدويةالمتعددة 1،2،3. على الرغم من ذلك ، لا تزال بيولوجيا العاثيات غير مدروسة نسبيا. يعد الفهم الأعمق لآلياتهم الجزيئية لاختطاف مضيفيهم البكتيريين أمرا ضروريا لتسخير إمكاناتهم العلاجية والتكنولوجيا الحيوية بشكل كامل4. للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء عدوى العاثيات الفعالة وأيضا لهندسة العاثيات لتطبيقات محددة ، فإن القدرة على تعديل جينومات العاثيات وراثيا أمر ضروري. ومع ذلك ، فإنه لا يزال أحد أهم التحديات في مجال بيولوجيا العاثيات3،5،6.

غالبا ما يتم تعديل الحمض النووي للعاثية عن طريق تعديلات كيميائية محددة لقواعد البيورين والبيريميدين ، على سبيل المثال ، الارتباط بالجليكوزين السيتوزين والمثيلة. تحمي هذه التعديلات المادة الوراثية للعاثية من التعرف عليها وتدهورها بواسطة نوكليازات المضيف6. في حين أن هذه التعديلات ضرورية لياقة العاثيات ، إلا أنها تشكل عقبة كبيرة أمام مناهج هندسة جينوم العاثيات التي تعتمد على أنظمة استهداف الحمض النووي2،3،7.

تواجه استراتيجيات الطفرات الحالية ، بما في ذلك أنظمة تعديل التقييد والتقنيات القائمة على البروتين المتكرر القصير المتباعدة بانتظام (CRISPR) - CRISPR (Cas) ، تحديات كبيرة عند تعديل الحمض النووي للعاثية بسبب التعديلات اللاجينية الواقية مثل الارتباط بالجليكوزين8. يعتمد تحرير الجينوم بوساطة CRISPR-Cas ، وهو فعال للغاية في الخلايا البكتيرية وحقيقية النواة ، على خطوتين رئيسيتين: الانقسام الدقيق للحمض النووي في المواقع الجينومية المستهدفة بواسطة نوكلياز Cas ، متبوعا بإصلاح الحمض النووي من خلال إعادة التركيب المتماثل مع الحمض النووي للمتبرع الذي يحمل الطفرة المطلوبة1. ومع ذلك ، في العاثيات ، غالبا ما تمنع تعديلات الحمض النووي نوكليازات كاس من ربط الجينوم أو شقه بكفاءة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤدي الطبيعة السريعة والعابرة لتكرار العاثيات إلى الحد من كفاءة إعادة التركيب المتماثل. تجعل هذه الحواجز من الصعب بشكل خاص تطبيق تقنية CRISPR-Cas التي تستهدف الحمض النووي لطفرات العاثية. ثبت أن تعديلات الحمض النووي للعاثيات تضعف استهداف الحمض النووي للعاثيات باستخدام CRISPR-Cas في المختبر وفي الجسم الحي6،7.

لمواجهة التحديات التي تفرضها تعديلات الحمض النووي الوقائية في العاثيات ، نقدم استراتيجية طفرات الجينوم التي تسخر نشاط إزاحة الميثيل سيتوزين ثنائي الأكسجين (TET) ، وتحديدا NgTET. في حقيقيات النوى ، تحفز إنزيمات TET الأكسدة التدريجية للسيتوزين الميثيل من خلال العمليات التكرارية: يتم تحويل ميثيل سيتوزين (5mdC) أولا إلى هيدروكسي ميثيل سيتوزين (5hmdC) ، ثم إلى فورميلسيتوزين (5fdC) ، وأخيرا إلى كربوكسي سيتوزين (5cadC) (الشكل 1).

في نهج طفرات العاثيات لدينا ، يتم استخدام NgTET لتقليل وفرة تعديلات الحمض النووي الواقية مؤقتا ، وبالتالي تعزيز إمكانية وصول الحمض النووي للعاثيات إلى أدوات تحرير الجينوم مثل إنزيمات Cas9. تم اختيار NgTET لتعديل جينوم العاثية بسبب التقارير السابقة عن تعبيره الناجح في شكل نشط قابل للذوبان في مضيف بكتيري غير متجانس ، وخاصة الإشريكية القولونية. هذه الخاصية ضرورية ، حيث يجب أن يظل NgTET نشطا أثناء عدوى العاثية10.

figure-introduction-1
الشكل 1: الأكسدة التدريجية ل 5-ميثيل سيتوزين بواسطة TET Dioxygenase1. يحفز ثاني أوكسجيناز TET الأكسدة المتتالية ل 5-ميثيل -2'-ديوكسيسيتيدين (5mdC) إلى 5hmdC و 5-formyl-2'-deoxycytidine (5fdC) ، وفي النهاية إلى 5-carboxyl-2'-deoxycytidine (5cadC). المنتج النهائي ، 5cadC ، إما تلقائيا أو إنزيميا يعود إلى السيتوزين غير المعدل (dC) ، مما يساهم في التنظيم اللاجيني الديناميكي. هذه العملية متعددة الخطوات أساسية لمثيلة الحمض النووي النشطة في حقيقيات النوى. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

نظرا لأن ميثيل سيتوزين وهيدروكسي ميثيل سيتوزين من السلائف الشائعة لفرط تعديلات الحمض النووي للعاثية ، بما في ذلك الهياكل الواقية الضخمة مثل الارتباط بالجليكوزيلات ، يمكن استغلال النشاط التأكسدي لثنائي الأكسجين TET لمنع تكوين هذه التعديلات المفرطة للحمض النووي9. في نهج طفرات الجينوم القائم على TET ، نعبر بشكل غير متجانس عن NgTET مؤتلفا في بكتريا قولونية لأكسدة السيتوزينات الهيدروكسي ميثيلية في جينوم العاثية عند الإصابة ، وبالتالي منع تكوين الارتباط بالجليكوزيل الضخم. من خلال تقليل وفرة تعديلات الحمض النووي الضخمة هذه ، يمكن أن يزيد نهجنا من إمكانية وصول الحمض النووي للعاثيات إلى نوكليازات CRISPR-Cas. يسهل هذا الوصول المعزز التعرف الفعال على الهدف ، والانقسام الدقيق للحمض النووي ، وإدخال طفرات نقطية خالية من الندوب في جينوم العاثية ، مما يميزها عن طرق طفرات العاثية التقليدية التي تعتمد على حذف الجينات ، أو إدخال الجينات المراسلة ، أو تكامل الوصلات الاصطناعية لاختيار الطفرات القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل1،11. كانت هذه الاستراتيجيات التقليدية حتى الآن هي الأدوات الوحيدة المتاحة للطفرات المستهدفة في جينومات العاثيات ، وبالتالي تمثل أساسا مهما للطريقة المعروضة هنا. ومع ذلك ، يمكن أن تمتلك بروتينات العاثية المفردة وظائف متعددة. يؤدي حذف الجين بأكمله الذي يشفر بروتين محل اهتمام إلى تعطيل جميع الوظائف المرتبطة به. في المقابل ، يسمح الإدخال المستهدف للطفرات النقطية بالتعطيل الانتقائي لوظائف محددة ، مما يتيح تحليلا مفصلا لأدوارها حتى الآن ، لا تزال وظائف العديد من بروتينات العاثيات غير مميزة إلى حد كبير. وبالتالي ، قد نتغاضى عن الأنشطة الإضافية المرتبطة بجين معين. لذلك ، يفضل اتباع نهج بسيط يهدف إلى إزالة وظيفة واحدة فقط مع التسبب في تغييرات طفيفة في البروتين الكلي12،13. تتيح الطريقة الموضحة هنا إجراء تعديلات وراثية دقيقة دون تعطيل التنظيم الجيني أو الوظيفة الجينومية الشاملة. كان التحدي الرئيسي الآخر لطرق طفرات العاثية السابقة هو كفاءتها المنخفضة ، والتي أسفرت عادة عن معدلات طفرات تبلغ حوالي 0.1٪ 1،11. باستخدام هذه التقنية ، نقدم أول استراتيجية طفرات قادرة على إدخال تغييرات أحادية الكودون ، مما يحقق زيادة ملحوظة بمقدار سبعة أضعاف في كفاءة الاستهداف. من خلال دمجها مع طريقة فحص عالية الإنتاجية قائمة على ONT ، يتم تبسيط اكتشاف الطفرات النقطية ، مما يلغي الحاجة إلى فحص مجموعات العاثيات الكبيرة لعزل متحولة واحدة. تعالج استراتيجية الطفرات القائمة على TET الموضحة هنا قيودا طويلة الأمد في هذا المجال وتمكن من تحرير الجينوم بشكل أكثر موثوقية14.

بشكل عام ، لا يمكن تطبيق هذه الطريقة فقط لتعزيز فهمنا لآليات عدوى العاثيات ولكنها تحمل أيضا وعدا كبيرا للبيولوجيا التركيبية. من خلال تمكين هندسة جينوم العاثيات الدقيقة والفعالة ، فإنه يمهد الطريق لتخصيص العاثيات لتطبيقات محددة ، وبالتالي تعزيز إمكاناتها للتطبيقات الطبية والتكنولوجيا الحيوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يظهر الشكل 2 تخطيطيا يوضح توليد العاثية T4 المعالجة ب NgTET.

figure-protocol-1
الشكل 2: نظرة عامة تخطيطية على سير العمل المعمول به لطفرات العاثية T4 وفحص الطفرات. يتضمن سير العمل إنشاء العاثية T4 تحت التعديل باستخدام NgTET ، والتي يمكن التحقق من صحتها إما عن طريق تحليل LC-MS أو بدلا من ذلك عبر مقايسة انقسام CRISPR-Cas. بعد ذلك ، يتم إدخال طفرة الاهتمام في جينوم العاثية من خلال الطفرات الموجهة بالموقع بوساطة CRISPR-Cas وتحديدها عن طريق الانتقاء المضاد. يمكن بعد ذلك تأكيد وجود الطفرة المطلوبة باستخدام تسلسل Nanopore. بعد التحقق من الصحة ، يمكن نشر العاثية المتحولة لاستعادة التعديلات المفرطة للحمض النووي. يتيح ذلك استخدام العاثية المصممة هندسيا في التطبيقات النهائية ، بما في ذلك تحليل الأنماط الظاهرية للعدوى من خلال فحوصات التحلل وقياسات حجم الانفجار. يتم شرح كل خطوة في الشكل برقم البروتوكول المقابل بين قوسين لتسهيل ربط خطوات البروتوكول بالأجزاء المعنية من الشكل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. تقليل تعديلات الحمض النووي للعاثيات باستخدام المعالجة المسبقة ل NgTET (~ 2 يوم)

ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لتمكين الاستهداف الفعال لنوكلياز كاس أثناء الطفرات عن طريق تقليل وفرة تعديلات الحمض النووي للعاثيات.

  1. تلقيح سلالة الإشريكية القولونية BL21 (DE3) المحولة ب pET28a_NgTET عن طريق نقل المواد من مخزون الجلسرين إلى 10 مل من وسط LB المكمل ب 30 ميكروغرام / مل من الكاناميسين. احتضان طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 160 دورة في الدقيقة.
  2. في اليوم التالي ، استخدم المزرعة الليلية لتلقيح مزرعة رئيسية ب ODأولي 600 من 0.1 في 50 مل من وسط LB يحتوي على 30 ميكروغرام / مل كانامايسين. تحفيز المزرعة باستخدام 50 ميكرومتر IPTG عند الوصول إلى OD600 من 0.4.
  3. قم بزراعة المزرعة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 160 دورة في الدقيقة حتى تصل إلىOD 600 من 0.8.
  4. إصابة المزرعة بالعاثية ذات الأهمية عند تعدد العدوى (MOI) 0.1 واحتضان لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة مع الاهتزاز عند 120 دورة في الدقيقة.
  5. احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  6. مرر المادة الطافية من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر للحصول على العاثيات المعالجة ب NgTET مع الحمض النووي الناقص التعديل. قم بتخزين العاثيات المفلترة عند 4 درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل.
    ملاحظة: (نقطة التوقف المؤقت) العاثيات المفلترة مستقرة لعدة أشهر عند 4 درجات مئوية ، ويتم تخزينها في وسط رطل في زجاجة زجاجية.

2. التحقق من الصحة

ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو التحقق تجريبيا من الوفرة المنخفضة لتعديلات الحمض النووي للعاثيات.

  1. التحقق من صحة العلاج عبر LC-MS (~ 2 أيام)
    1. تنقية العاثيات عن طريق تدرج السكروز
      1. لإزالة الحمض النووي المتبقي من المحلل ، عالج 500 ميكرولتر من معلق العاثية (>10 10 PFU / مل) مع 20 وحدة من DNase I و 2 ميكرولتر من مزيج RNase A / T1 (4 ميكروغرام من RNase A ، 10 U من RNase T1).
      2. احتضن الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      3. قم بإعداد تدرج السكروز 0-45٪ في مخزن مؤقت TM (50 ملي Tris-HCl ، 10 ملي MgCl2 ، درجة الحموضة 7.5). تحضير التدرج باستخدام خلاط متدرج أو يدويا.
        ملاحظة: للتحضير اليدوي، ابدأ بسحب 5 مل من المخزن المؤقت TM في أنبوب متدرج. بعد ذلك ، باستخدام قنية حادة ، قم بسحب الماصة ببطء 5 مل من محلول السكروز 45٪ من أسفل الأنبوب ، مما يسمح لمحلول 0٪ بالارتفاع تدريجيا.
      4. قم بتحميل 500 ميكرولتر من محلول العاثية المعالج أعلى التدرج.
      5. جهاز طرد مركزي عند 70,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      6. أشعل أنبوب الطرد المركزي من الأسفل. سيسمح ذلك بتصور العاثية ، والتي تظهر كشريط عكر في التدرج. قم بإزالة الجزء المحتوي على العاثية بعناية باستخدام قنية حادة.
      7. انقل جزء العاثية المستخرج إلى أنبوب طرد مركزي جديد فائق.
      8. أضف 30 مل من المخزن المؤقت TM المثلج وجهاز الطرد المركزي عند 100,000 × جم لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.
      9. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت TM.
      10. قم بتخزين العاثيات المعلقة في قارورة زجاجية عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
    2. عزل الحمض النووي للعاثية
      1. أضف 1 ميكروغرام من البروتيناز K إلى العاثيات المعلقة.
      2. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
      3. أضف 1 حجم من خليط الفينول / الكلوروفورم / كحول الأيزوميل (P / C / I). امزج عن طريق الانعكاس. افصل المراحل عن طريق الطرد المركزي عند 15,000 × جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب تفاعل جديد. كرر الاستخراج ثلاث مرات.
        تحذير: كحول الفينول / الكلوروفورم / الأيزوميل (P / C / I) شديد السمية وتآكل ومتطاير. تعامل معه دائما داخل غطاء الدخان أثناء ارتداء معدات الحماية المناسبة ، بما في ذلك معطف المختبر ونظارات السلامة وقفازات النتريل المزدوجة. تجنب ملامسة الجلد والعين ، واحفظه في وعاء محكم الغلق في خزانة كيميائية مخصصة. التخلص من النفايات من خلال قنوات النفايات الخطرة المعتمدة. في حالة ملامسة ، اشطفها على الفور بالماء واطلب العناية الطبية.
      4. لإزالة الفينول المتبقي ، قم بإجراء ثلاث مرات من الاستخراج الخلفي للكلوروفورم مع حجم واحد من الكلوروفورم.
      5. قم بترسيب الحمض النووي بين عشية وضحاها بحجم 0.1 من 3 M NaOAc (الرقم الهيدروجيني 5.5) و 2.5 حجم من الإيثانول عند -20 درجة مئوية.
      6. في اليوم التالي, بيلت الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي في 15,000 × جم ل 1 ساعة عند 4 درجة مئوية.
      7. اغسل حبيبات الحمض النووي مرتين ب 200 ميكرولتر من 70٪ إيثانول ، ورجها برفق ، وقم بالطرد المركزي عند 15,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية بعناية.
      8. أعد تعليق الحمض النووي المنقى في ماء فائق النقاء.
      9. قم بتخزين الحمض النووي في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
        ملاحظة: (نقطة توقف) يمكن تخزين الحمض النووي المترسب عند -20 درجة مئوية لعدة أشهر.
    3. تحضير الحمض النووي للعاثيات لتحليل LC-MS
      1. هضم الحمض النووي المنقى إلى نيوكليوسيدات مفردة باستخدام مزيج هضم النوكليوزيد.
      2. تحليل تكوين الحمض النووي عبر LC-MS.
        ملاحظة: تسمح هذه الخطوة بالتحقق من فعالية علاج NgTET. يتم تكييف البروتوكول مع المعدات والعمود المحدد المتاح في المختبر ، ولكن يمكن تعديله بناء على الموارد والظروف المتاحة.
      3. استخدم الحمض النووي المهضوم المعزول من العاثية المنقاة (الخطوة 2.1.10).
      4. قم بتضمين المعايير التالية المتاحة تجاريا للقياسات: dA ، dT ، dG ، dC ، 5hmdC ، 5fdC ، 5cadC. إذا كان ذلك متاحا ، فقم بتضمين معيار فرط تعديل السيتوزين الموجود في الحمض النووي للعاثية.
      5. استخدم نظام HPLC مزودا بعمود C18 (150 × 2.1 مم ، 100 Å ، 3 ميكرومتر) وعمود حماية 20 × 2.1 مم.
      6. اضبط درجة حرارة العمود على 40 درجة مئوية ومعدل تدفق الشطف على 0.2 مل / دقيقة.
      7. تحضير المغترات على النحو التالي:
        الملوئ أ: 10 ملي أسيتات الأمونيوم في الماء (الرقم الهيدروجيني 4.5).
        Eluent B: 0.1٪ حمض الفورميك في الميثانول.
        تحذير: 0.1٪ حمض الفورميك في الميثانول قابل للاشتعال ويمكن أن يهيج الجلد والعينين والجهاز التنفسي. استخدميه دائما في منطقة جيدة التهوية أو غطاء الدخان. ارتد معدات الحماية المناسبة ، بما في ذلك معطف المختبر ونظارات السلامة وقفازات النتريل. الابتعاد عن الحرارة والشرر واللهب المكشوف. تخزينها في خزانة تخزين قابلة للاشتعال. تخلص من بروتوكولات النفايات الخطرة المعتمدة.
      8. تطبيق ملف تعريف الطور المتنقل التالي: 0-1 دقيقة: ثابت عند 5٪ B ؛ 1-5 دقائق: التدرج من 5٪ إلى 90٪ B ؛ 5-7 دقائق: ثابت عند 90٪ B ؛ 7-7.1 دقائق: التدرج من 90٪ إلى 5٪ B ؛ 7.1-12 دقيقة: ثابت عند 5٪ B.
      9. استخدم مطياف الكتلة في أوضاع التأين السالبة والإيجابية (الحقن المنفصلة) مع مصدر تأين الرش الكهربائي عالي الحرارة (H-ESI) في ظل الظروف التالية:
        جهد الرش H-ESI: 3400 فولت (+) ، 2400 فولت (-) ، غاز غمد: 35 وحدة تعسفية ، غاز إضافي: 7 وحدات تعسفية ، غاز الاجتياح: 0 وحدة تعسفية ، درجة حرارة أنبوب نقل الأيونات: 300 درجة مئوية ، درجة حرارة المرذاذ: 275 درجة مئوية ، وضع الكشف: مسح كامل باستخدام محلل كتلة Orbitrap ، دقة الكتلة: 120،000 ، نطاق الكتلة: 200-450 (م / z).
      10. استخراج الكروماتوغرامات الأيونية من أشكال [M-H]- (dA ، dT ، dC ، 5hmdC ، 5fdC ، 5cadC) و [M + H] + (5ghmdC) باستخدام برنامج Tracefinder.
      11. احسب الوفرة النسبية لكل تعديل عن طريق تطبيع منطقة الذروة لكل إشارة إلى منطقة ذروة dG داخل العينة ، باستخدام dG كمعيار داخلي خاص بالعينة.
  2. التحقق من الصحة باستخدام مقايسة انقسام CRISPR-Cas (~ 2.5 يوم)
    ملاحظة: تتيح هذه الخطوة التقييم الظاهري لنجاح علاج NgTET وتأثيره على انقسام كريسبر-كاس. إذا كان NgTET نشطا ، فلا ينبغي أن تتشكل لويحات من الحمض النووي للعاثية المعالجة ، أو يجب تقليل عيار العاثية ، لأن إزالة تعديلات الحمض النووي الواقية تجعل الجينوم عرضة لانقسام CRISPR-Cas12 أو 9. في المقابل ، إذا لم يتم علاج الحمض النووي للعاثية ، فإن عدد اللويحات المشكلة سيتوافق مع عيار العاثيات ، مما يشير إلى أن جينوم العاثية T4 شديد التعديل مقاوم للانقسام CRISPR-Cas12 أو 9.
    1. تلقيح بكتريا قولونية BL21 (DE3) من مزرعة ليلية ، تم تحويلها باستخدام كل من البلازميد pET28a_NgTET وبلازميد تعبير Cas12 أو Cas9 (على سبيل المثال ، DS-spCas أو pCpf1 بدون فاصل). يمكن العثور على جميع البلازميدات التي تحتوي على معلومات إضافية في الجدول 1.
      1. ينمو الخلايا في [ل] وسط يكمل مع المضادات حيوية مناسبة عند 3 [ك] مع يهتز, [سترتينغ فروم][أود] 600 من 0.1. بمجرد أن تصل المزرعة إلى OD600 من حوالي 0.4 ، قم بتحفيز تعبير NgTET عن طريق إضافة 0.05 ملي مولار IPTG واحتضان لمدة ساعتين إضافيتين عند 3 درجات مئوية.
      2. كعنصر تحكم ، قارن سلالات الإشريكية القولونية BL21 (DE3) مع وبدون الإفراط في التعبير عن NgTET. في حالة عدم وجود نشاط NgTET ، من المتوقع وجود عدد أكبر من وحدات تشكيل البلاك ، مما يشير إلى انخفاض كفاءة CRISPR-Cas بسبب وجود 5ghmdC الجليكوزيلات في الحمض النووي للعاثية.
    2. نقل 300 ميكرولتر من بكتريا قولونية المزارع إلى أنبوب معقم.
    3. إصابة المزرعة ب T4 WT أو العاثية المعالجة ب NgTET ب MOI 0.01. في هذه التجربة ، قم بتطبيق وزارة الداخلية منخفضة للتأكد من إصابة البكتيريا بعاثية واحدة فقط في كل مرة. يؤدي ذلك إلى زيادة كفاءة فحص الانقسام CRISPR-Cas إلى أقصى حد ويبسط تفسير النتائج. تخلط برفق لضمان توزيع متساو للعاثيات.
    4. احتضان معلق العاثية البكتيرية عند 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
    5. أضف خليط البكتيريا والعاثيات إلى 4 مل من LB Soft agar (0.75٪) مكمل بالمضادات الحيوية. تخلط جيدا ولكن برفق لتجنب إدخال الفقاعات.
    6. يسكب مزيج الأجار الناعم على طبق أجار LB مسخن مسبقا.
    7. اترك الألواح تصلب لفترة وجيزة في درجة حرارة الغرفة. احتضان الأطباق عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
    8. في اليوم التالي ، عد اللويحات الناتجة لتحديد وحدات تكوين البلاك (PFU).

3. طفرات كريسبر كاس (~ 1 أسبوع)

ملاحظة: يعتمد طفرات كريسبر-كاس على مبدأ أن موقعا معينا داخل جينوم العاثية يستهدف نوكلياز كاس أثناء عدوى العاثيات ، مما يؤدي إلى كسر مزدوج الخيط. يتم إصلاح هذا الكسر من خلال إعادة التركيب المتماثل باستخدام الحمض النووي للمتبرع ، والذي يتم توفيره على البلازميد الثاني الموجود في السلالة المضيفة المصابة أثناء الطفرات. يقوم البلازميد الذي يحتوي على الحمض النووي للمتبرع أيضا بتشفير NgTET ، وهو أمر ضروري للحفاظ على إمكانية الوصول إلى الحمض النووي للعاثيات ل Cas nuclease عن طريق تقليل وفرة السيتوزينات المعدلة ، كما هو موضح سابقا. في هذه الخطوة ، يتم إدخال الطفرات المستهدفة في جينوم العاثيات T4 المعالجة ب NgTET عند إصابة الإشريكية القولونية15. لضمان مستويات منخفضة باستمرار من تعديلات الحمض النووي في جينوم T4 ، يتم التعبير عن ثنائي الأكسجين NgTET عن طريق إضافة 50 ميكرومتر IPTG (على غرار الخطوة 1.2) طوال عملية الطفرات.

  1. توليد بلازميدات الحمض النووي pET28a_NgTET_donor عبر استنساخ البوابة الذهبية15
    1. لتوليد الحمض النووي للمتبرع ، اطلب التسلسل المطلوب كجين كامل أو تضخيم من الجينوم ، على سبيل المثال ، من جينوم العاثية ، وأدخل الطفرة المطلوبة.
      ملاحظة: بالنسبة لتصميم الحمض النووي للمتبرع ، قم بتضمين مناطق متجانسة تحيط بالموقع المستهدف (≈200 نقطة أساس على كل جانب للطفرات النقطية ؛ مناطق أطول للإدخالات الأكبر). يجب أن يحمل جزء المتبرع الخطي مواقع التعرف على BsaI التي تولد نتوءات متوافقة مع البلازميد عند الانقسام. في السيليكو الاستنساخ موصى به للتحقق من تصميم البناء. في النتائج التمثيلية ، يتم توضيح جميع المكونات الهامة للحمض النووي للمتبرع في مثال.
    2. أدخل جزء الحمض النووي للمتبرع في اتجاه مجرى تسلسل ترميز NgTET والفاصل في العمود الفقري pET28a_NgTET باستخدام مجموعة البوابة الذهبية.
      1. قم بإعداد تفاعلات التجميع عن طريق الجمع بين 70 fmol من البلازميد pET28a_NgTET ، و 140 fmol من إدخال الحمض النووي للمتبرع ، و 1 ميكرولتر من BsaI (20 وحدة / ميكرولتر) ، و 5 وحدات من T4 DNA ligase ، و 2 ميكرولتر من 10× ليغاز ، مع إضافة الماء الخالي من النوكلياز إلى الحجم النهائي البالغ 20 ميكرولتر.
      2. قم بتشغيل التفاعلات في 25 دورة في دورة PCR مع الإعدادات التالية: 1) التقييد ، 37 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة ، 2) الربط ، 16 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، 3) التقييد النهائي ، 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، و 4) التمسخ ، 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    3. أضف 6 ميكرولتر من خليط التفاعل (من الخطوة 3.1.2) إلى 100 ميكرولتر من بكتريا قولونية DH5α ، واحتضان على الجليد لمدة 10 دقائق ، وصدمة حرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية. ضع الخلايا على الفور على الثلج لمدة 1 دقيقة ، ثم أضف 750 ميكرولتر من وسط رطل. استرجع عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز (500 دورة في الدقيقة) لمدة 1 ساعة. صفيحة على أجار LB تحتوي على كاناميسين (30 ميكروغرام / مل) وتحتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
    4. اختر مستعمرة واحدة وتلقيح 20 مل من وسط LB مكمل بالكاناميسين (30 ميكروغرام / مل). احتضان طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 160 دورة في الدقيقة.
    5. من 5 مل من المزرعة الليلية ، قم بإزالة الخلايا وعزل الحمض النووي البلازميد باستخدام طريقة استخراج البلازميد القياسية. قم بإزالة البلازميد في 40 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز.
    6. تأكد من الاستنساخ الصحيح عن طريق تسلسل موقع إدخال البلازميد باستخدام تسلسل سانجر.
  2. بناء بلازميدات CRISPR-Cas المحتوية على فاصل (pCpf1-sp كنموذج)15
    ملاحظة: يتيح البلازميد الموصوف في هذا الفصل الخطوة الأولى من الطفرات من خلال إدخال كسر مزدوج الخيط الخاص بالموقع في جينوم العاثية. بينما يتم توضيح الإجراء هنا باستخدام نظام CRISPR-Cas12 (بلازميد pCpfl-sp) ، يمكن أيضا استخدام نوكليازات بديلة مثل CRISPR-Cas9 (بلازميد DS-spCas)15 .
    1. صمم فاصل 20 nt يستهدف موقع الطفرات (PAM: TTTV). تحديد وتصميم الفواصل الأولية المناسبة والفواصل المقابلة باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية.
    2. توليف اثنين من قليل النوكليوتيدات 5 ′ الفسفر. تأكد من أن كل منها يحمل 10 nt من تسلسل الفاصل المطلوب (يشكلان معا فاصل 20 nt الكامل) ومنطقة إضافية 10 nt مكملة لموقع الإدخال داخل البلازميد pCpf1-sp.
    3. أدخل فاصل CRISPR-Cas المصمم في بلازميد pCpf1-sp عن طريق تضخيم PCR باستخدام البادئات من الخطوة 2. قم بإعداد التفاعل على النحو التالي (الحجم النهائي 50 ميكرولتر): 5 ميكرولتر 10× مخزن مؤقت GC ، 1 ميكرولتر 10 ملي مولار dNTPs ، 1 ميكرولتر برايمر أمامي (10 ميكرومتر) ، 1 ميكرولتر برايمر عكسي (10 ميكرومتر) ، 2.5 ميكرولتر DMSO ، قالب بلازميد يتوافق مع 2 fmol ، 1 ميكرولتر Phusion DNA polymerase (2 U / μL) ، وماء خال من النوكلياز إلى 50 ميكرولتر.
    4. ضع أنابيب التفاعل في جهاز تدوير حراري وقم بتشغيل البرنامج التالي: التمسخ الأولي عند 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ 25 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، التلدين عند درجة الحرارة المناسبة (X °C) لمدة 30 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 6 دقائق ؛ متبوعا بتمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. احتفظ بالعينات عند 4 درجات مئوية حتى مزيد من المعالجة.
    5. امزج 5 ميكرولتر من تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل مع مخزن تحميل الحمض النووي (10×) وقم بتحميله على هلام الاغاروز 1٪. قم بتشغيل الجل بجهد 130 فولت لمدة 20 دقيقة وتصور نطاقات الحمض النووي باستخدام الإضاءة العابرة للأشعة فوق البنفسجية. إذا نجح التضخيم ، فقم بتنقية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعة تنظيف مناسبة وقم بإضفاء 20 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز.
    6. قم بتدوير البلازميد عن طريق الربط باستخدام 100 نانوغرام من المنتج المضخم الممزوج ب 1× T4 DNA ligase و 60 U T4 DNA ligase في حجم تفاعل إجمالي يبلغ 15 ميكرولتر. احتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. قم بتحويل 100 ميكرولتر من الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا باستخدام منتج الربط كما هو موضح في الخطوة 3.1.3. قم بتسخين الخلايا على أجار LB التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
    7. اختر مستعمرة واحدة من اللوحة وقم بتلقيحها في 20 مل من وسط LB مكمل ب 50 ميكروغرام / مل ستربتومايسين. احتضان طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 160 دورة في الدقيقة. من 5 مل من المزرعة الليلية ، احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي وعزل الحمض النووي البلازميد باستخدام طريقة استخراج البلازميد المفضلة. قم بإزالة البلازميد في 40 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز.
    8. تأكد من الاستنساخ الناجح عن طريق تسلسل البلازميد في موقع الإدخال باستخدام تسلسل سانجر.
  3. طفرات العاثية
    1. تحويل خلايا بكتريا قولونية BL21 (DE3) ببلازميدات: فاصل pET28a_NgTET_donor-DNA و pCpf1-sp (Cas12) / DS-SPcas (Cas9) (تم إنشاؤه في الخطوتين 3.1 و 3.2). امزج 1 ميكرولتر من كل بلازميد مع 100 ميكرولتر من بكتريا قولونية BL21 (DE3) المختصة كيميائيا. اتبع البروتوكول الموضح في الخطوة 3.1.3. قم بطلاء الخلايا المحولة على أجار تحتوي على 50 ميكروغرام / مل ستربتومايسين و 30 ميكروغرام / مل كانامايسين ، واحتضان طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
    2. تلقيح سلالة الإشريكية القولونية المحولة (بكتريا قولونية BL21 (DE3) pET28a_NgTET_donor-DNA و pCpf1-sp (Cas12) / DS-SPcas (Cas9) _spacer) إلى 10 مل من وسط LB مكمل ب 30 ميكروغرام / مل كانامايسين و 50 ميكروغرام / مل ستربتومايسين. احتضان طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 160 دورة في الدقيقة.
    3. في اليوم التالي ، قم بتخفيف المزرعة الليلية إلى ODأولي 600 من 0.1 في 50 مل من وسط LB يحتوي على 30 ميكروغرام / مل كانامايسين و 50 ميكروغرام / مل ستربتومايسين.
    4. قم بزراعة المزرعة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 160 دورة في الدقيقة حتى يتم الوصول إلى OD600 من 0.8. اخفض درجة الحرارة إلى درجة حرارة الغرفة (RT) وقلل سرعة التحريك إلى 130 دورة في الدقيقة.
      1. لتعزيز امتصاص العاثيات وحقن الحمض النووي ، أضف MgCl2 و CaCl2 إلى التركيزات النهائية البالغة 1 ملي مولار لكل منهما ، حيث تسهل هذه الكاتيونات ثنائية التكافؤ تفاعلات فعالة بين العاثيات والمضيف.
      2. إصابة المزرعة بعاثيات T4 المعالجة مسبقا ب NgTET ، وكعنصر تحكم سلبي ، بعاثيات T4 غير المعالجة ب NgTET بمعدل 0.1. استمر في الحضانة في RT لمدة 4 ساعات.
    5. بعد الحضانة ، انقل المزارع إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل وجهاز طرد مركزي عند 4000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة لتكوير الخلايا. قم بتصفية المواد الطافية من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر لإزالة أي خلايا بكتيرية متبقية. استخدم المواد الطافية المفلترة لفحوصات البلاك (الموضحة في الخطوة 2.2) لتحديد تركيز العاثية أو إجراء الاختيار المضاد.

4. تحديد المتحولة

ملاحظة: الغرض من الانتقاء المضاد هو تقليل نسبة العاثيات من النوع البري المتبقية في السكان بعد الطفرات. لهذا الغرض ، يتم استخدام العاثيات التي تم الحصول عليها من خطوة الطفرات (الخطوة 3.3) لإصابة الإشريكية القولونية التي تحمل نفس نظام CRISPR-Cas13 ، والذي يتم ترميزه بواسطة بلازميد آخر pBA560 (معلومات إضافية في الجدول 1) ونفس تسلسل الفاصل المطبق أثناء الطفرات. في هذا الإعداد ، تتعرف نوكليازات Cas بشكل انتقائي على الحمض النووي للعاثيات من النوع البري وتشقها ، بينما تظل العاثيات التي تحمل الطفرات المرغوبة غير متأثرة. هذا الضغط الانتقائي يمنع النسخ المتماثل من النوع البري ويثري سكان العاثيات الطافرة14.

  1. الاختيار المضاد باستخدام Cas13
    1. إصابة الإشريكية القولونية Cas13a_spacer (البلازميد pBA560) بالعاثيات للانتقاء المضاد. تسهل هذه الخطوة الاختيار المضاد عن طريق تحطيم الحمض النووي الريبي للعاثية الذي لم يخضع للطفرة المقصودة.
    2. قم بإجراء الاختيار المضاد في ظل نفس الظروف المستخدمة أثناء الطفرات (انظر الخطوات 3.3.1-3.3.5). استخدم الإشريكية القولونية التي تعبر عن فاصل Cas13a غير مستهدف كعنصر تحكم سلبي للتأكد من أن تقليل البلاك خاص بالفاصل.
    3. بعد الحضانة ، قم بتصفية المادة الطافية التي تحتوي على العاثيات المختارة من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر لإزالة الحطام البكتيري.
      ملاحظة: (نقطة التوقف المؤقت) العاثيات المفلترة مستقرة لعدة أشهر عند 4 درجات مئوية ، ويتم تخزينها في وسط رطل في زجاجة زجاجية.
    4. استخدم العاثيات المختارة والمفلترة لمقايسة البلاك على سلالة الإشريكية القولونية ب لعزل اللويحات الفردية للتحقق من صحة المصب.
  2. تسلسل الجيل التالي (~ 1 أسبوع)
    ملاحظة: تتضمن طريقة نهج التسلسل المتعدد للغاية عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل المكونة من خطوتين لتوليد حمض نووي أمبليكون متعدد الإرسال مناسب لتسلسل الجيل التالي طويل القراءة16.
    1. افصل العاثيات عن الطفرات عن طريق طلاءها كما هو موضح في الخطوة 2.2. قم بتضمين الضوابط المناسبة باستخدام العاثيات التي تم الحصول عليها من الطفرات التي يتم إجراؤها في كل من وجود وعدم وجود تعبير NgTET. كعنصر تحكم ، يجب ألا يؤدي استهداف CRISPR-Cas9 و Cas12 بدون NgTET إلى إدخال طفرات نقطية. في المقابل ، من المتوقع أن يتيح التعبير المشترك ل NgTET التحرير الناجح ، مما يؤدي إلى زيادة كفاءة الطفرات.
    2. لعزل العاثيات المفردة ، اختر لويحات فردية من اللوحة وانقلها إلى أنبوب يحتوي على 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت Pi-Mg (26 ملي مولار Na2PHO4 ، 68 ملي كلوريد الصوديوم ، 22 ملي مولار KH2PO4 ، 1 ملي مولار MgSO4 ، درجة الحموضة 7.5) و 1 ميكرولتر من CHCl3.
      تنبيه: الكلوروفورم سام ومتطاير ويشتبه في أنه مادة مسرطنة ، حتى في كميات صغيرة. تعامل فقط في غطاء الدخان وارتد معدات الحماية الكاملة ، بما في ذلك معطف المختبر ونظارات السلامة وقفازات النتريل. تجنب الاستنشاق وملامسة الجلد. تخزينها في وعاء محكم الغلق في خزانة كيميائية جيدة التهوية وقابلة للاشتعال. التخلص من نفايات الكلوروفورم عن طريق جمع النفايات الخطرة.
    3. استخدم 1 ميكرولتر من العاثية المعزولة T4 في المخزن المؤقت Pi-Mg كقالب للفحص.
    4. قم بإعداد مزيج التفاعل مع 0.125 ميكرومتر من كل برايمر (حول موضع الإدخال) ومزيج بوليميراز رئيسي عالي الدقة 1x ، مع ضبط الحجم الإجمالي لتفاعل التضخيم إلى 10 ميكرولتر. قم بتشغيل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل مع 30 دورة تضخيم.
    5. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني لإرفاق الرموز الشريطية. لذلك ، استخدم 1 ميكرولتر من تخفيف 1:10 للمنتج من أول تفاعل البوليميراز المتسلسل كقالب.
    6. قم بإعداد مزيج التفاعل باستخدام بادئات الترميز الشريطي 0.3 ميكرومتر ومزيج بوليميراز عالي الدقة بحجم إجمالي يبلغ 7 ميكرولتر. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل مع 20 دورة تضخيم.
      ملاحظة: (نقطة التوقف المؤقت) يمكن تخزين منتجات تفاعلات التفاعل التفاعلي المستمر في درجة حرارة -20 درجة مئوية لعدة أسابيع.
    7. قم بتجميع جميع منتجات تفاعل المتسلسل الشريطي وتنقيتها باستخدام التنظيف القائم على الخرزات المغناطيسية وفقا للبروتوكولات القياسية لإعداد مكتبة تسلسل الجيل التالي.
    8. التقط الحمض النووي باستخدام الخرز المغناطيسي ، واغسله مرتين بنسبة 80٪ من الإيثانول ، وقم بإلقاء 100 ميكرولتر من محلول الشطف (5 ملي مولار Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.5).
    9. قياس تركيز الحمض النووي باستخدام طرق القياس الطيفي والفلورومترية ، مع تطبيق مقايسة واسعة النطاق أو عالية الحساسية حسب الاقتضاء.
      ملاحظة: (نقطة الإيقاف المؤقت) يمكن تخزين الحمض النووي عند -20 درجة مئوية لعدة أسابيع.
    10. قم بإنشاء مكتبات تسلسل باستخدام بروتوكول قائم على الربط وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، بدءا من 1 ميكروغرام من الحمض النووي المدخل.

5. استعادة التكاثر المتحولة لتعديلات الحمض النووي وإثباتها

ملاحظة: بمجرد تحديد طفرة العاثية المطلوبة ، يتم نشرها في النوع البري بكتريا قولونية لاستعادة مستويات تعديل الحمض النووي المشابهة لتلك الموجودة في عاثية WT. هذا يضمن إمكانية استخدام العاثية المتحولة في التجارب البيولوجية اللاحقة دون أي تنازلات ، بصرف النظر عن الطفرة التي تم إدخالها.

  1. قم بإعداد مزرعة 10 مل من سلالة الإشريكية القولونية B في وسط LB واحتضنها طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع الرج عند 160 دورة في الدقيقة.
  2. في اليوم التالي ، قم بتلقيح وسط رطل طازج سعة 50 مل بالمزرعة الليلية لتحقيق OD600 أولي من 0.1.
  3. اترك المزرعة تنمو عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 160 دورة في الدقيقة حتى تصل إلىOD 600 من 0.8.
  4. أضف 50 ميكرولتر من مخزون العاثية المتحولة (4.2.2) إلى المزرعة. قم بإزالة المرحلة بعناية لتجنب نقل CHCl3.
  5. احتضن المزرعة المصابة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة مع رج لطيف عند 120 دورة في الدقيقة.
  6. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للثقافة عند 4000 × جم لإزالة الخلايا البكتيرية. قم بتصفية المادة الطافية من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر لتجميع العاثية.
  7. انقل العاثية المتحولة المفلترة إلى وعاء زجاجي واحفظها عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
    ملاحظة: (نقطة التوقف المؤقت) العاثيات المفلترة مستقرة لعدة أشهر عند 4 درجات مئوية ، ويتم تخزينها في وسط رطل في زجاجة زجاجية.
  8. كتحقق اختياري لتجديد تعديلات الحمض النووي ، وتحديدا السيتوزينات الغليكوزيلات ، قم بإجراء تحليل LC-MS كما هو موضح في الخطوة 2.1.
    1. لهذا الغرض ، قم بتنقية الحمض النووي للعاثية المستردة من ذرية العاثية كما هو موضح في الخطوة 2.1.1 ، وعزلها كما في الخطوة 2.1.2 ، ثم استعد لاحقا لتحليل LC-MS كما هو موضح في الخطوة 2.1.3.
    2. قم بتحليل الكروماتوجمات الأيونية وحساب الوفرة النسبية لكل تعديل عن طريق تطبيع منطقة الذروة لكل إشارة إلى منطقة ذروة dG داخل العينة ، باستخدام dG كمعيار داخلي خاص بالعينة كما هو موضح في الخطوات 2.1.3.
      ملاحظة: بما في ذلك العاثية من النوع البري T4 ، والعاثيات T4 المعالجة ب NgTET ، والعاثية T4 المعالجة بمتغير NgTET D234A غير النشط كعناصر تحكم ، من أجل التحقق مباشرة من وفرة 5ghmdC10 ومقارنتها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تحديد نطاق العاثية في التدرج.
تعتمد رؤية نطاق العاثية في التدرج على تركيز العاثية في العينة الأولية المحملة على التدرج. عندما تكون العاثية مركزة بشكل كاف (~>1 × 1011 PFU / مل) ، يمكن رؤية النطاق بوضوح عن طريق إضاءة التدرج من الأسفل بمصدر ضوء (انظر الشكل 3).

ومع ذلك ، عند تركيزات العاثية المنخفضة ، قد لا يكون الشريط مرئيا بسهولة. في هذه الحالة ، نوصي بتكرار محاولة التصور عن طريق إضاءة الأنبوب من الأسفل في الظلام ، مما يمكن أن يتيح ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تقدم هذه الدراسة استراتيجية قوية وقابلة للتكيف لإدخال طفرات نقطية دقيقة في جينومات العاثيات ، بما في ذلك تغيرات النوكليوتيدات المفردة. يتمثل أحد العناصر المركزية في سير العمل في دمج خطوات التحقق الصارمة في كل مرحلة ، وهو أمر ضروري لضمان دقة وكفاءة تحرير الجينوم. هذا أمر بالغ الأهمية بشكل خاص نظرا للطبيعة متعددة الخطوات لسير العمل والتفاعلات الديناميكية بين العاثيات ومضيفيها البكتيريين ، والتي تقدم العديد من المتغيرات التي يمكن أن تؤثر بشكل مباشر على نجاح طفرات العاثية. تشمل هذه العوامل ،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وقدمت KH و NP طلب براءة اختراع أوروبي ل "هندسة العاثيات" ، طلب براءة الاختراع الأوروبي رقم 23 175 257.7. يعلن المؤلفون الآخرون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

تلقى هذا المشروع تمويلا من مجلس البحوث الألماني (DFG; مشروع SPP 2330 رقم 464500427 ، مشروع RTG 2355 11 ، و RTG 2937 (مشروع رقم 505997786) من جمعية ماكس بلانك (تمويل قائد مجموعة أبحاث ماكس بلانك إلى KH).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.5 مل أنابيب رد فعلسارستيدت72.690.001
15 مل أنابيب كانوسيالسارستيدت62.554.502
15 مل أنابيب البولي بروبيلين ذات الجدران الرقيقة المفتوحةبيكمان كولتر علوم الحياة36170616 مم × 95 مم (للطرد المركزي الفائق)
50 مل أنابيب كنسيةسارستيدت62.547.254
5x مخزن مؤقت GCثيرمو فيشر العلمي إف 519 إل
6x TriTrack DNA تحميل صبغة   ؛ثيرمو فيشر العلمي R1161
الاغاروزميريديان بيوساينسبيو -41025الصف الجزيئي
جهاز طرد مركزي Avanti J-30Iبيكمان كولتر علوم الحياةلا يوجد كتالوج   رقمسيريان ن. JKY14M01 ، https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe
حمض البوريك   ؛ميرك10043-35-3
BsaI-HF الإصدار 2نيبR3733S
كلوريد الكالسيوم سداسي هيدراتأكروس أورجانيكس7774-34-797 ٪ نقية إضافية   ؛
مقياس كثافة الخليةهارفارد بيوكروم  80211630
ChemiDoc MP بيوراد12003154
كلوروفورمVWR650498
كوفيتسارستيدت67.742
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)   ؛سيجما ألدريتشطراز D4540
ثنائي الصوديوم فوسفات الهيدروجيننيو فروكس جي إم بي إتش7558-79-4درجة فارما
ماصات باستور زجاجية يمكن التخلص منهاVWR612-1702230 مم
DNase I روش471672800110 U/µ L
مزيج dNTP (10 ملي لكل dNTP)   ؛سيجما ألدريتش72004
DS_SPcas_ModAمنتج داخلي.https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_mapsبنية البلازميد التي تحتوي على CRISPR-Cas12 / ModA sgRNA
DS-spCas (نظام CRISPR-Cas9)Addgene 48645 (رقم ملحق addgene)البلازميد لبناء بلازميدات CRISPR-Cas المحتوية على فاصل (نظام CRISPR-Cas9) لطفرات العاثيات (الخطوة 3.2)
بكتريا قولونية تم استخدام سلالة باء للعدوى T4DSMZلا يوجد كتالوج   رقمالإشريكية القولونية (ميجولا 1895) كاستيلاني وشالمرز 1919 (DSM 613 ، ATCC 11303)
الإشريكية القولونية BL21 (DE3) سلالة التعبير ، خلية مختصةإنفيتروجينC600003سلالة التعبير ، الخلايا المختصة.
بكتريا قولونية DH5 &alpha ؛ سلالة الاستنساخ ، الخلايا المختصةإنفيتروجين18265017سلالة الاستنساخ ، الخلايا المختصة. 
إيدتاروث8043.2
الإيثانول (مطلق)  VWR200-578-6
خلية تدفق Flongleأكسفورد نانوبور تكنولوجيزلا يوجد كتالوج   رقمR10.4.1. الكيمياء ، https://nanoporetech.com/document/flongle
مجموعة Gene JET Plasmid Miniprep Kit   ؛ثيرمو فيشر العلمي 10242490
GeneRuler 1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم الحمض النوويثيرمو فيشر العلمي س1331
سلم الحمض النووي GeneRuler ULR   ؛ثيرمو فيشر العلمي سم 1213
متدرج ماستر 108بيوكومبلا يوجد كتالوج   رقمhttps://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming
جهاز طرد مركزي Heraeus Pico 17ثيرمو ساينتفيك75002410
Infors HT حاضنة Minitronإنفورس إيه جيلا يوجد كتالوج   رقمhttps://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs
الأيزوبروبيل - وبيتا ؛ -D-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيد (IPTG)سيجما ألدريتش367-93-1
كاناميسينكارل روثتي 832.1
إل بي أجاركارل روثعدد X969.1
LB-medium (Luria / Miller)  كارل روثالعدد X968.1
كلوريد المغنيسيوم سداسي الهيدرات   ؛سيجما ألدريتش7791-18-6
كبريتات المغنيسيوم   ؛سيجما ألدريتش7487-88-9
جهاز MinION تقنيات أوكسفرود النانولا يوجد كتالوج   رقمhttps://store.nanoporetech.com/eu/minion.html
وزارة الدفاع E165A_fwIDTGAATTAGTTTCAGATGA
ACAAGCGGTAATGATAC
CAGCT		التمهيدي الأمامي لإدخال طفرة نقطية ل ModA E165A ولإدخال نهايات لاصقة لاستنساخ البوابة الذهبية (الخطوة 3.1)
وزارة الدفاع E165A_revIDTCATATTACGATAACGA
TGACTATCCGGAAAC		التمهيدي العكسي لإدخال طفرة نقطية ل ModA E165A ولإدخال نهايات لاصقة لاستنساخ Golden Gate (الخطوة 3.1)
ModA_sgRNA_Cas12_fwIDTTCTTGTTCATCTACAAC
AGTAGAAATTAATTTAAA
GTTCTTAGACCCG		برايمر أمامي لتوليد فاصل لأنظمة CRISPR-Cas12 / CRISPR-Cas9 / CRISPR-Cas13 لطفرات العاثيات والاختيار المضاد (الخطوة 3.2 والخطوة 4.1)
ModA_sgRNA_Cas12_revIDTAGTAATGATAAAGAACT
TTAAATAATTTCTACTGT
TGTAGATGCTAC		برايمر عكسي لتوليد فاصل لأنظمة CRISPR-Cas12 / CRISPR-Cas9 / CRISPR-Cas13 لطفرات العاثية والاختيار المضاد (الخطوة 3.2 والخطوة 4.1)
مقياس الطيف الضوئي NanoDrop ND-1000 ثيرمو فيشر العلميAZY2019944
مجموعة NucleoMag   ؛ماشيري ناجلالرقم المرجع 744970.50
مزيج هضم النوكليوسيد نيو إنجلاند بيولابسطراز M0649S
pBA560 (نظام CRISPR-Cas13)أدجين186236 (رقم ملحق addgene)نظام تشفير البلازميد CRISPR-Cas13 للانتقاء المضاد (الخطوة 4.1)
بلازميد pCpfl-sp (نظام CRISPR-Cas12)أدجين122186
بلازميد pCpfl-sp (نظام CRISPR-Cas12)أدجين122186 (رقم ملحق addgene)بلازميد لبناء بلازميدات CRISPR-Cas المحتوية على فاصل (نظام CRISPR-Cas12) لطفرات العاثيات (الخطوة 3.2)
أوعية تفاعل تفاعل PCRسارستيدت72.991.002
بيكجرينVWR732-3196
pET28a_NgTET منتج داخلي.لا يوجد كتالوج   رقمالبلازميد متاح عند الطلب ، ويمكن العثور على خريطة البلازميد في https://zenodo.org/records/10615143  التالية ؛
pET28a_NgTET منتج داخلي.لا يوجد كتالوج   رقمالبلازميد لبناء pET28a_NgTET_donor الحمض النووي عبر استنساخ البوابة الذهبية (الخطوة 3.1) ، البلازميد   ؛ متاح عند الطلب ، يمكن العثور على خريطة البلازميد في https://zenodo.org/records/10615143  التالية ؛
لوحات بتريسارستيدت82.1473.00192 × 16 مم مع كاميرات
بوليميراز الحمض النووي Phusion   ؛ثيرمو فيشر العلمي إف -530 إكس إل2 U/µ L
فوسفات البوتاسيومسيجما ألدريتش7778-77-0أحادي القاعدة
مزود الطاقة العالمي PowerPacبيو راد1645070
البروتيناز K   ؛كارل روث   ؛7528.1100 مجم / مل
طقم تنقية QIAquick PCR   ؛كياجين28506
مقياس الفلور الكمي ، نظام QuantiFluor dsDNAبروميجاE2670
RNase A / T1  ثيرمو فيشر العلميطراز EN0551امزج 2 مجم / مل من RNase A 5000 وحدة / مل من RNase T1   ؛
روتي أكوا P / C / I لاستخراج الحمض النووي   ؛كارل روثعدد X985.1
أسيتات الصوديوم   ؛سيجما ألدريتش127-09-3
كلوريد الصوديوم سيجما ألدريتش7647-14-5
طقم تسلسل الربط SQK-LSK109أكسفورد نانوبور تكنولوجيزلا يوجد كتالوج   رقمhttps://nanoporetech.com/document/gDNA-q-sqk-lsk109
مرشحات Steritop ، 0.22 & م حجم المسامميليبورS2GPT05RE250 مل و 500 مل
ستربتومايسين 50 مجم / لتركارل روثإتش بي 66.1
السكروزنيوفروكس جي إم بي إتش57-50-1للبيولوجيا الجزيئية 
التأرجح دلو الألومنيوم الدوار  بيكمان كولتر علوم الحياةشبيبة[1]24.15
T4 DNA Ligase 5 U/µ Lثيرمو فيشر العلمي EL0011
T4 الحمض النووي ليغاز العازلةثيرمو فيشر العلمي ب69
أنابيب الاختبار ، الجدار الثقيل ، بدون إطاركارل هيشت GmbH42775054100 مم × 18 مم
دورة حرارية ، T100بيوراد1861096
الخلاط الحراري المريحة إيبندورف5382000015
قاعدة تريزماسيجما ألدريتش77-86-1
حمام واذر ، VWB2   ؛VWR462-0557حجم 12 لتر

المراجع

  1. Pozhydaieva, N., et al. Temporal epigenome modulation enables efficient bacteriophage engineering and functional analysis of phage DNA modifications. PLoS Genet. 20 (9), e1011384(2024).
  2. Schroven, K., Aertsen, A., Lavigne, R. Bacteriophages as drivers of bacterial virulence and their potential for biotechnological exploitation. FEMS Microbiol Rev. 45 (1), fuaa041(2021).
  3. Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. Bacteriophage applications for food production and processing. Viruses. 10 (4), 205(2018).
  4. Wolfram-Schauerte, M., Pozhydaieva, N., Viering, M., Glatter, T., Hofer, K. Integrated omics reveal time-resolved insights into T4 phage infection of E. coli on proteome and transcriptome levels. Viruses. 14 (11), 2502(2022).
  5. Usman, S. S., Uba, A. I., Christina, E. Bacteriophage genome engineering for phage therapy to combat bacterial antimicrobial resistance as an alternative to antibiotics. Mol Biol Rep. 50 (8), 7055-7067 (2023).
  6. Vlot, M., et al. Bacteriophage DNA glucosylation impairs target DNA binding by type I and II but not by type V CRISPR-Cas effector complexes. Nucleic Acids Res. 46 (2), 873-885 (2018).
  7. Tao, P., Wu, X., Tang, W. C., Zhu, J., Rao, V. Engineering of bacteriophage T4 genome using CRISPR-Cas9. ACS Synth Biol. 6 (10), 1952-1961 (2017).
  8. Mohanraju, P., et al. Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems. Science. 353 (6299), aad5147(2016).
  9. Zemach, A., McDaniel, I. E., Silva, P., Zilberman, D. Genome-wide evolutionary analysis of eukaryotic DNA methylation. Science. 328 (5980), 916-919 (2010).
  10. Hashimoto, H., et al. Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA. Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).
  11. Shitrit, D., et al. Genetic engineering of marine cyanophages reveals integration but not lysogeny in T7-like cyanophages. ISME J. 16 (2), 488-499 (2022).
  12. Dedrick, R. M., et al. Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus. Nat Med. 25 (5), 730-733 (2019).
  13. Marinelli, L. J., et al. BRED: a simple and powerful tool for constructing mutant and recombinant bacteriophage genomes. PLoS One. 3 (12), e3957(2008).
  14. Adler, B. A., et al. Broad-spectrum CRISPR-Cas13a enables efficient phage genome editing. Nat Microbiol. 7 (12), 1967-1979 (2022).
  15. Pozhydaieva, N., Höfer, K. Utilizing Golden Gate assembly to streamline CRISPR-Cas/NgTET-based phage mutagenesis. Methods Mol Biol. 2850, 329-343 (2025).
  16. Ramírez Rojas, A. A., et al. DuBA.Flow─a low-cost, long-read amplicon sequencing workflow for the validation of synthetic DNA constructs. ACS Synth Biol. 13 (2), 457-465 (2024).
  17. Lagerbäck, P., et al. Bacteriophage T4 endonuclease II, a promiscuous GIY-YIG nuclease, binds as a tetramer to two DNA substrates. Nucleic Acids Res. 37 (18), 6174-6183 (2009).
  18. Lagerbäck, P., Carlson, K. Amino acid residues in the GIY-YIG endonuclease II of phage T4 affecting sequence recognition and binding as well as catalysis. J Bacteriol. 190 (16), 5533-5544 (2008).
  19. Shembrey, C., et al. Principles of CRISPR-Cas13 mismatch intolerance enable selective silencing of point-mutated oncogenic RNA with single-base precision. Sci Adv. 10 (51), eadl0731(2024).
  20. Molina Vargas, A. M., et al. New design strategies for ultra-specific CRISPR-Cas13a-based RNA detection with single-nucleotide mismatch sensitivity. Nucleic Acids Res. 52 (2), 921-939 (2024).
  21. Shi, P., Wu, X. Programmable RNA targeting with CRISPR-Cas13. RNA Biol. 21 (1), 1-9 (2024).
  22. Levin, B. R., et al. The population and evolutionary dynamics of phage and bacteria with CRISPR-mediated immunity. PLoS Genet. 9 (3), e1003312(2013).
  23. Hershey, A. D., Chase, M. Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage. J Gen Physiol. 36, 39-56 (1952).
  24. Bair, C. L., Rifat, D., Black, L. W. Exclusion of glucosyl-hydroxymethylcytosine DNA containing bacteriophages is overcome by the injected protein inhibitor IPI. J Mol Biol. 366 (3), 779-789 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

NgTET DNA T4 Ecoli

مقالات ذات صلة