مقالة منهجية

تقييم استجابات الأوراق للمستقلبات الثانوية الميكروبية باستخدام تنسيق عالي الإنتاجية

DOI:

10.3791/69026

⸱

ديسمبر 5, 2025

 ,  ,  , 
1Ottawa Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada, 2The Boyce Thompson Institute for Plant Research, 3Department of Biology, University of Ottawa

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول نهجا عالي الإنتاجية لتقييم تسرب أيونات النبات، ونشاط البيروكسيداز، وإنتاج الكالوز في نفس العينة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفرز الميكروبات مستقلبات ثانوية متنوعة بنيويا أثناء الإصابة بالنباتات، يتم اكتشاف بعضها بواسطة خلايا النبات، مما يحفز استجابات الإجهاد. في هذه الطريقة، يتم قياس تحفيز تسرب الأيونات، ونشاط البيروكسيداز، وإنتاج الكالوز في نفس عينة قرص الورقة. أولا، أقراص الأرابيدوبسيس أو أوراق الشعير يتم تغلبها في الفراغ في صفيحة مكونة من 96 بئرا. بعد 4-6 ساعات، يتم قياس التوصيلية، تليها نشاط البيروكسيداز وترسيب الكالوز بعد 24 ساعة. ببتيد flg22 يحفز جميع الاستجابات الثلاث ويعد وسيلة تحكم إيجابية ميسورة التكلفة. تحفز الليبوببتيدات الحلقية السورباكتين والغراميلين نشاط بيروكسيداز وتسرب الأيونات على التوالي، بينما يقوم التريكوثيسين النباتي T-2 السام بقمع نشاط البيروكسيداز. بشكل عام، يتيح هذا النهج إجراء مقارنات متعددة بين الأنماط الجينية للنباتات أو علاجات المستقلبات. يمكن تطبيق هذا النهج على علم الوراثة الكيميائي أو الحماية الحيوية لتحديد المركبات المعدلة للإجهاد لمزيد من الدراسة. في علم الوراثة النباتية، يمكن استخدام هذا النهج لمقارنة الاستجابات عبر تجمعات النباتات لأغراض رسم الخرائط الجينية ولتحسين فهمنا لتفاعلات النبات مع الميكروبات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستجيب النباتات لجزيئات ميكروبية متنوعة لتنشيط استجابات الإجهاد الخلوي، والتي قد تؤدي إلى مقاومة للأمراض. يتم اكتشاف أنماط جزيئية مرتبطة بالميكروبات (MAMPs)، مثل ببتيد flg22 من سوط البكتيريا، بواسطة بروتينات مستقبلات النباتات لبدء عدد من الاستجابات الإشارة الخلوية. تشمل هذه الاستجابات المبكرة مثل شلالات الكيناز، إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، ارتفاع الكالسيوم، إزالة استقطاب الغشاء، والاستجابات المتأخرة مثل ترسيب الكالوز وتحفيز نشاط البيروكسيداز1. المستقلبات الثانوية الميكروبية (MSMs) صغيرة (50-1500 دالتون)، وهي جزيئات متنوعة هيكليا، وقابلة للاستبدال للنمو والتطور لكنها تعزز بقاء الميكروب. بعض MSM تحفز استجابات إجهاد خلوي في النباتات، رغم أن الآليات المشاركة في بدء هذه الاستجابات لا تزال غير محلولة 2,3. تشمل الآليات المقترحة للتعرف على النبات ل MSM الاستشعار الآلي، أو تعديلات البروتينات الناتجة عن الأكسدة والاختزال (Redox)، أو الإشارات القائمة على الدهون 4,5. في بعض الحالات، يحفز MSM استجابات إجهاد أو يسبب تلفا خلويا حسب التركيز. على سبيل المثال، سم T-2 يحفز إنتاج الكالوز وROS عند 1 ميكرومولار ويسبب موت الخلية عند 10 ميكرومول، وعادة ما يوصف بأنه سم نباتي4. تؤثر MSMs على المرض في بعض تفاعلات النبات والميكروبات ويمكن أن تحفز إما حساسية النبات أو مقاومته. على سبيل المثال، يحفز ليبوبتيد الغراميلين الحلقي إنتاج ROS، وتسرب الأيونات، وإنتاج الكالوز، بينما يعزز قابلية الشعير لفيوزاريوم غرامينيروم2. يحفز الليبوببتيدات الحلقية سيرينغومايسين وسيرينغوبتين إنتاج ROS النباتية ويعزز مقاومة المضيف ضد بكتيريا Pseudomonas fluorescens 3. أنواع أخرى من MSM، مثل السورفاكتين والإيتورين، تنتج بواسطة ميكروبات غير ممرضة وتعزز المقاومة ضد العدوى الممرضة اللاحقة من خلال تحفيز استجابات إجهاد النبات 6,7. تحفز هذه الإشارات الحامية الحيوية للعناصر المغناطيسية استجابات خلوية، بما في ذلك تدفقات الأيونات، وإنتاج ROS، والتغيرات النسخية، وإنتاج الكالوز8. فهم التفاعلات بين MSM والنباتات يمكن أن يساعد في تحديد دور MSM في مقاومة الأمراض وتحديد جينات المضيف التي يمكن الاستفادة منها لتحسين مقاومة المحاصيل.

الطرق الحالية لتقييم استجابات إجهاد النبات الناتجة عن MSM عادة ما تتضمن اختبار استجابة إجهاد واحدة تلو الأخرى8. نظرا لأن MSM الثانوي قد يكون صعبا في الاستخراج وقد تتوفر كمية محدودة من المستقلب، يمكن لاختبار وجود عدة استجابات داخل نفس العينة أن يوفر طمأنينة بأن MSM له تأثير على خلايا النبات. إحدى الطرق عالية الإنتاجية لتقييم انفجارات ROS الارتجاعية هي اكتشاف التوهج الناتج عن اللومينول المؤكسد في وجود بيروكسيداز الفجلالحار 9. للأسف، يتم تبريد التوهج القائم على اللومينول بواسطة الكاتيونات وبعض المذيبات، مما يحد من استخدام هذا الاختبار للمستخلصات التي تحتوي على الأملاح أو للجزيئات غير القطبية التي يجب إذابتها في DMSO، مما يتطلب طريقة تعمل مع هذه الملوثات9. لمعالجة هذه المشكلات، قمنا بتوسيع الطرق الحالية لتقييم ثلاث استجابات إجهاد (تسرب الأيونات، نشاط البيروكسيداز، والتصلب) من نفس عينة الورقة في اختبار عالي الإنتاجية (الشكل 1)10،11،12. نهجنا يتضمن معالجة أقراص الأوراق باستخدام MSMs باستخدام التسرب الفراغي في صفيحة تحتوي على 96 بئرا. بعد ذلك، تجرى قياسات التوصيلية بعد 4-6 ساعات من العلاج لتقييم تسرب الأيونات، تليها أنشطة بيروكسيداز وترسيب الكالوز عند 24 ساعة. تم تحسين نهجنا لتناسب الأرابيدوبسيس والشعير، لكنه يمكن توسيعه ليشمل أنواع نباتية أخرى مع التحقق التجريبي. على سبيل المثال، لا يمكن اكتشاف نشاط بيروكسيداز الشعير المستحث بهذه الطريقة، لكن يمكن اكتشاف كبت النشاط بواسطة المركبات السامة. لذا، تختلف خصائص الأوراق أو سعة الاستجابة المستحثة بين الأنواع، مما يحد من تطبيق هذا النهج على بعض أنواع النباتات.

يجب أن يأخذ تصميم التجارب باستخدام هذه الطريقة في الاعتبار الضوابط، والتكرار، وتركيز MSM المستخدم لضمان أفضل النتائج. السيطرة السلبية ضرورية لتحديد MSMs التي تحفز مستويات استجابة إجهاد مختلفة إحصائيا مقارنة بتأثيرات الجروح. من الناحية المثالية، يجب أن يحتوي التحكم السالب على نفس المذيب الذي يحتوي عليه MSM لكنه يفتقر إلى MSM. المذيبات النموذجية للموجات الكيميائية المقاومة للماء تشمل DMSO والميثانول، اللتين تحفزهما استجابات خلوية مثل إنتاج ROS بتركيزات عالية13,14. في هذا الاختبار، نلاحظ تأثيرا على نشاط البيروكسيداز، حيث يمنع 10٪ أو أكثر DMSO والميثانول نشاط بيروكسيداز الناجم عن flg22 (الشكل 2). في حالة المستخلصات المعقدة، قد يكون من الصعب تطوير تحكم سلبي يفتقر إلى MSM عندما تكون المستقلبات المعنية غير معروفة. بدلا من ذلك، فإن تقسيم المستخلصات بناء على الحجم أو القطبية أو الشحنة سيمكن من المقارنات النسبية بين الكسور لتحديد الجزء الأكثر إجهادا للتحليل الإضافي. بالإضافة إلى ذلك، يضمن تضمين ضابط إيجابي، مثل سم 1 ميكرومولار flg22 أو 10 ميكرومولار T-2 توكسين، أن يتمكن الباحث من تقييم أن الاختبار يعمل. نوصي بتضمين أربع نسخ تقنية لكل معالجة وتضمين ضوابط إيجابية وسالبية في كل لوحة عند قياس عدة ألواح داخل التجربة.

بشكل عام، يلتقط هذا النهج ثلاث استجابات لإجهاد النبات الناتج عن MSM، مما يوفر طريقة سهلة الوصول وفعالة من حيث التكلفة لمسح تفاعلات النبات مع MSM. يسمح التنسيق عالي الإنتاجية للباحثين بالتقاط الفروق الدقيقة بين الأنماط الجينية النباتية أو المستخلصات الميكروبية ضمن نفس الوحدة التجريبية. يتيح ذلك مناهج على مستوى النظام لفهم عائلات جينات النباتات أو مسح تجمعات النباتات لرسم الخرائط الجينية. على الجانب الميكروبي، يمكن استخدام هذا النهج لفحص المركبات الواقية الحيوية المحتملة أو في علم الجينوم الكيميائي لتحديد المركبات التي تعزز أو تقمع استجابات الإجهاد المحددة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير ومعالجة العينات

ملاحظة: يجب اتخاذ جميع احتياطات السلامة المناسبة وممارسات التخلص لتقليل المخاطر على المجرب والبيئة.

  1. زراعة النباتات
    1. ازرع نبات الأرابيدوبسيس حتى مرحلة 4-5 أسابيع في خليط تربة كورنيل (300 طحلب خث: 630 فيرميكوليت: 1 سماد بطيء الإطلاق: 4.2 جير) مع نبتتين في كل أصيص في 24 وعاء في كل صينية. قم بري النباتات حسب الحاجة من الأسفل بإضافة الماء إلى الصينية. اضبط ظروف غرفة النمو على 21 درجةمئوية بشكل مستمر مع 16 ساعة من الضوء و8 ساعات من الظلام، وحافظ على رطوبة تقارب 30-50٪. استخدم الأوراق الممتدة بالكامل من 5 إلى 9للتجربة والحصاد في الصباح.
    2. ازرع الشعير حتى تتوسع الأوراق الأولى والثانية بالكامل في 75 تربة زراعة: 24 تربة تربة سوداء واحدة: 1 خليط تربة جيرية. ازرع بذرة واحدة في كل وعاء في 24 قطعة لكل صينية، واسق حسب الحاجة. اضبط ظروف غرفة النمو على 21 درجةمئوية مع 16 ساعة من الضوء و8 ساعات من الظلام عند حوالي 30-50٪ رطوبة. تذوق الأوراق الأولى والثانية الممتدة بالكامل واحصد في الصباح.
  2. اجمع ثلاثة أقراص أوراق لكل نبتة باستخدام حفار الفلين بقطر 4 مم، مع تجنب الوريد الأوسط. تجنب نقع النسيج باستخدام ثقاب حاد بحركة التواء.
  3. ضع أقراص الأوراق فورا وبلطف في بئر واحد من صفيحة بسعة 96 بئر في 196 ميكرولتر من Milli-Q H2O. استمر في جمع الأقراص حتى يتم جمع العدد المطلوب من العينات.
  4. أضف المستقلبات الثانوية أو المعالجات بالمذيبات بالتركيز المطلوب إلى حجم نهائي يبلغ 200 ميكرولتر في الآبار الفردية.
  5. ضع لوحة 96 بئر مع إغلاق الغطاء في جرة جرس مع فوهة تفريغ.
  6. قم بتثبيت خرطوم التفريغ على فوهة جرس الجرة وشغل ضغط التفريغ حتى يصل الفراغ إلى 9.8 رطل/بوصة مربعة (عادة 10 ثوان). كرر هذه العملية مرة أخرى.
  7. ضع الغطاء على اللوحة وحضن على هزاز مداري (55 دورة في الدقيقة) تحت الضوء (13 واط، 50 ميكرومول∙م-2∙ثانية-1) موضوع على بعد 23 سم فوق الهزاز لمدة 4 ساعات.

2. قياسات تسرب الأيونات

  1. اغسل المجس بماء ميلي-كيو وامسح برفق على الكيموايپ ليجف. لاحظ قراءة موصلية الماء للرجوع إليها.
  2. بعد 4-6 ساعات من المعالجة، يتم أخذ عينات وتسجيل التوصيلية من الآبار الفردية عن طريق غمر المجس في السائل المحيط بقرص الورقة. أمسك اللوح بزاوية 45° لضمان أن المجس قد تم تثبيته بالكامل.
  3. شطف المجس بين العينات عن طريق غمر المجس في ماء Milli-Q ومسح المجس ليجفف على Kimwipe. أحيانا، اختبر توصيل الماء للتأكد من بقاء قراءات المجس مستقرة.
  4. ضع طبقة بلاستيكية ختم على اللوح وأعد إلى الهزاز الدائري للحضانة طوال الليل.

3. قياسات نشاط البيروكسيداز

  1. حضر ركيزة البيروكسيداز طازجة يوميا كمحلول 50 مل. سخن 40 مل من الماء المعقم المقطر إلى درجة حرارة 70 درجة مئويةفي كأس مع قضيب تحريك وذيب 50 ملغ من حمض 5-أمينوزاليسيليك (1 ملغ/مل) في الماء الساخن. أضف ماء حتى 50 مل واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6 باستخدام NaOH. المحلول حساس للضوء، لذا غطه بورق الألمنيوم أو استخدم أنبوبا كهرمانيا.
  2. في أنبوب مخروطي كهرماني بسعة 50 مل، اصنع محلول 1٪ H2O2 بإضافة 1.7 مل من 30٪ H2O 2 إلى 48.3 مل من Milli-Q H2O.
  3. قبل الاختبار مباشرة، أضف 10 ميكرولتر من محلول 1٪ H2O2 لكل ملليلتر من محلول 5-أمينوسيليك المطلوب لتوليد وسط الاختبار.
  4. لأخذ عينات من أقراص الأوراق المعالجة، خذ 50 ميكرولتر من كل بئر في النقطة الزمنية المطلوبة. انقله إلى صفيحة صافية ذات قاع مسطح بسعة 96 بئر وأضف 50 ميكرولتر من وسط الاختبار، مع الخلط بعمل الماصات 5x.
  5. حضن التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق وأوقف التفاعل بإضافة 20 ميكرولتر من 2 نيتروتن NaOH، ثم النقر برفق للخلط.
  6. قس امتصاص الآبار عند 595 نانومتر في قارئ لوحة.

4. تصوير الكالوز وتحليل الصور

  1. بعد أخذ عينات من الآبار لاختبار بيروكسيداز، أزل السائل المتبقي من الآبار وأضف 100 ميكرولتر من محلول حمض الخليك:الإيثانول (1:3) للتثبيت وإزالة الصبغ. ضع غطاء على اللوحة وحضن اللوحة على شاكر (60 دورة في الدقيقة) في غطاء بخار لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  2. استبدل محلول إزالة الصبغة بمحلول جديد وحضن لمدة 24 ساعة أخرى في درجة حرارة الغرفة.
  3. قم بإخراج محلول إزالة اللون وإضافة 100 ميكرولتر من 150 مللي موتر K2HPO4 لكل بئر. ضع الطبق على الهزاز واحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. أزل محلول الغسل K2HPO4 وأضف 100 ميكرولتر من 150 ملليمترK2HPO4 مع 0.1 ملغ/مل أنيلين بلو. غط صفيحة ال 96 بئرا بغطاء وورق ألمنيوم وحضن على هزاز لمدة لا تقل عن ساعتين (أرابيدوبسيس) أو طوال الليل (الشعير).
    ملاحظة: الأنيلين الأزرق حساس للضوء ويجب أن يكون جديدا مع كل نسخة تقنية.
  5. أزل محلول الأنيلين الأزرق واستبدل بمحلول جليسيرول بنسبة 50٪. غط ألواح ال 96 بئر بورق ألمنيوم وخزنها عند 4 درجات مئوية حتى تكون جاهزة للتصوير.
  6. ضع قطرة من محلول الجلسرول 50٪ على شريحة زجاجية نظيفة. التقط قرص ورقة بلطف مع ملقط وضعه على الجانب السفلي للأعلى على الشريحة. غط بطبقة غطاء 1.5 لتقليل فقاعات الهواء، وأضف 50٪ جلسيرول إضافي إذا لزم الأمر لملء تحت غطاء الغطاء.
  7. اجعل المادة الورقية في التركيز باستخدام الضوء الأبيض المنقول (المجال الساطع) تحت عدسة جاف بقيمة 20x.
  8. اختر طول موجة الإثارة إلى 370 نانومتر وطول موجة الانبعاث إلى 509 نانومتر للتصوير الأزرق الأنيليني وحدد وقت التعريض. تحسين وقت التعريض لتمكين إشارة كافية مع تجنب تشبع البكسلات الزائد. للمقارنة الكمية للصور، تأكد من أن شدة الليزر ووقت التعريض متسقان لجميع النسخ البيولوجية والمعالجات والتكرارات التقنية.
  9. لكل قرص ورقة، اختر ثلاثة مجالات رؤية مختلفة واحصل على صور لكل منها باستخدام المعلمات المحددة في الخطوة 4.8. التقاط جميع الصور التي تحتوي على مواد نباتية تملأ مجال الرؤية بالكامل بأقل مناطق خلفية (مواد غير نباتية). التقاط صور على مستوى z واحد على سطح الورقة.
    ملاحظة: وجود خلفية قد يكون أمرا لا مفر منه ويمكن تصحيحه في خطوات قياس الصور لاحقا. في هذا المثال، تلتقط الصور باستخدام مجهر تألق قائم مع مصباح زئبقي ومكعب مرشح DAPI (الإثارة 360/40 نانومتر، الانبعاث 460/50 نانومتر). في الحالات التي لا يتوفر فيها مصباح زئبق، يمكن استخدام مصدر ضوء LED متعدد الأطوال الموجية.
  10. لقياس النقاط الكالوزية من الصور، قم بتنزيل وتثبيت برنامج معالجة الصور المتاح مجانا في FIJI باستخدام التعليمات المتوفرة على الإنترنت في https://imagej.net/Fiji/Downloads. افتح FIJI واستورد صور الأنيلين الزرقاء للتحليل. لهذا التحليل، استخدم ملفات .tiff بدقة لا تقل عن 300 نقطة في البوصة الأولى. تصدير ملفات الصور بصيغة .tiff باستخدام برنامج المجهر قبل التحليل، أو دع FIJI تفتح المفاتيح.
    ملاحظة: يمكن لفيجي فتح معظم أنواع الملفات الخاصة (مثل . czi، .nd2، .lif، .vsi).
  11. اضبط المقياس على الصورة (انقر على التحليل | Set Scale)، باستخدام قيم المسافة من إعداد المجهر.
  12. حول الصورة إلى صورة رمادية بحجم 32-بت (انقر على الصورة | النوع | 32 بت).
  13. اضبط العتبة (انقر على الصورة | تعديل | العتبة) لتشمل فقط إشارة الفلورة التي تمثل التلوين الأزرق الأنيليني عن طريق النقر على تلقائي ثم تعديل القيم الدنيا والعظمى يدويا على منحنى العتبة. بمجرد الانتهاء من العتبة، اضغط على التقديم | تحول إلى قناع. باستخدام برنامج جداول البيانات، اكتب معلمات العتبة المحددة لكل صورة.
    ملاحظة: بسبب التوهج الذاتي الكامن لعينات النباتات وتنظيف نسيج النبات، قد يختلف العتبة بين العينات. لتكرار الصورة، من الضروري تسجيل عتبة كل صورة وأن تكون متسقا في تعديل قيم العتبة بين العينات.
  14. قم بقياس عدد وحجم النقاط الزرقاء الآنيلية باستخدام تحليل الجسيمات (انقر على تحليل | تحليل الجسيمات) باستخدام الإعدادات الافتراضية. للحصول على متوسط قيم جميع النقاط في الصورة، اختر تلخيص في المربع المنبثق، ثم اضغط على موافق.
  15. انسخ والصق هذه النتائج من صندوق الملخص في الجدول مع معايير العتبة لمزيد من التحليل. تشمل القيم المشمولة في هذا القياس العد (عدد النقاط الزرقاء الأنيلينية)، المساحة الكلية (المساحة الكلية بالوحدات2 من النقاط الزرقاء الأنيلينية)، متوسط الحجم (متوسط الحجم بالوحدات2 من النقطة الزرقاء الأنيلينية)، نسبة المساحة (نسبة التغطية المتوسطة بالوحدات2 من فلورية الأنيلين الزرقاء مقابل المساحة الكلية)، المحيط (متوسط محيط النقطة)، وIntDen (مؤشر شدة الفلورة في صبغة الأنيلين الأزرق).
  16. كرر الخطوات 4.11-4.15 لجميع الصور التي تم التقاطها أثناء التجربة. عند إغلاق صورة محددة من FIJI، اختر عدم الحفظ لتجنب تغيير صورة البيانات الخام لتحصل على قناع العتبة.
  17. إذا احتوت أي صور على مساحة ذات خلفية غير نباتية، قم بقياس مساحة نسيج النبات يدويا باستخدام أدوات اختيار المضلع أو الحر وقياس المساحة (انقر على التحليل | القياس). انسخ هذه القيمة إلى جدول البيانات لكل صورة.
  18. في جدول بيانات، قم بمتوسط القيم من الصور الثلاث في مجال الرؤية من نسخة بيولوجية واحدة. إذا كانت بعض الصور من التجربة تحتوي على مساحة غير نباتية (انظر الخطوة 4.17)، صحح جميع القيم بناء على مساحة نسيج النبات في كل صورة. على سبيل المثال، اقسم قيمة العد على مساحة نسيج النبات لكل صورة قبل الرسم البياني والمقارنات الإحصائية.

5. تحليل البيانات

  1. قيم جودة التجربة من خلال مقارنة الضوابط الإيجابية مع الضوابط السلبية داخل نفس اللوحة باستخدام اختبار t. إذا لم تحدث الضوابط الإيجابية تغييرات كبيرة في استجابات الإجهاد، يجب إعادة تقييم الظروف التجريبية مثل صحة النباتات، وتوقيت المعالجة، والضبط السلبي، وإمكانية تدهور الماكات.
  2. اختبار الأهمية
    1. إذا تم تقييم جميع النسخ التقنية لعلاج ما ضمن نفس اللوحة، قم بتحليل الفروقات بين العلاجات الفردية والتحكم السلبي باستخدام أساليب إحصائية قياسية مثل تحليل التحليل العميق أحادي الاتجاه مع اختبار توكي.
    2. إذا تم تقييم النسخ التقنية من المعالجة عبر عدة أطباق، قم بتطبيع كل عينة بالنسبة للتحكم السلبي لتقليل تأثير الخطأ من لوحة إلى أخرى. اقسم كل قيمة على متوسط عينات التحكم السلبية من داخل نفس اللوحة. إخضاع القيم الموحدة لطرق إحصائية قياسية.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام هذه الطريقة، يمكن تحديد ما إذا كان MSM ينشط مجموعة فرعية من استجابات الإجهاد الخلوي للنبات. توفر نتائج هذا الاختبار قياسا لنشاط البيروكسيداز، وتسرب الأيونات، وإنتاج الكالوز لتحديد ما إذا كان MSM يحفز استجابات تفاضلية مقارنة بجهاز التحكم السلبي. النتيجة الإيجابية لمركب ما تشير إلى فرق كبير عن الضابط السلبي، كما هو موضح في أيونوفور الجراميلين، الذي يحفز تسرب الأيونات وإنتاج الكالوز (الشكل 3)2. إدراج ضابط إيجابي، مثل 1 ميكرومولار فلوجي 22، الذي يحفز جميع الاستجابات الثلاث، يضمن أداء النبات سليما والظروف التجريبية (الشكل 3)11،15. يذوب الجراميلين وflg22 في الماء، بينما يتم إذابة السورفاكتين الكاره للماء وسم T-2 في DMSO. لتحضير الجزيئات الكارهة للماء، نقوم أولا بتحضير مخزون 10 مللي مولار في DMSO. يستخدم هذا المخزون لإنشاء تركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومولار في ماء ميلي-كيو لمعالجة الأوراق الذي يحتوي على 0.1٪ DMSO. يحفز السورباكتين (10 ميكرومول) نشاط البيروكسيداز والكالوز، بينما يقوم سم T-2 (10 ميكرومولار) بكبح نشاط البيروكسيداز ويحفز إنتاج الكالوز، ويرجح أنه بسبب موت الخلايا 2,6,16. استخدام الماء أو DMSO بنسبة 0.1٪ كضوابط سلبية مناسب للعلاجات المشار إليها، حيث ينتج كلا الضابطين نتائج متشابهة (الشكل 2).

في فحوصاتنا الأولية ل 100 من MSM المتاحة تجاريا، نرى تحريض الكالوز لمعظم المركبات التي قمنا بدراستها (>70٪) بينما يتم تحفيز تسرب الأيونات ونشاط البيروكسيداز بسبب عدد أقل من المركبات (30٪ و35٪). تنتج غالبية هذه المركبات بواسطة أنواع الفيوزاريوم ، بما في ذلك سبعة أنواع مختلفة من التريكوثيسينات مثل الديوكسينيفالينول (DON) وسم T-2. بينما تستمر عمليات التكرار لتأكيد هذه النتائج، فإنها تشير إلى اتجاهات مشابهة كما هو الحال مع الضوابط الإيجابية لدينا (الشكل 3) حيث تم تحفيز الكالوز بواسطة جميع العلاجات وتم تحفيز تسرب الأيونات أو البيروكسيداز بواسطة بعض العلاجات ولكن ليس كلها.

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة على إجراء تقييم الاستجابات الخلوية الناتجة عن MSM في الأوراق. توضع أقراص الأوراق في صفيحة مكونة من 96 بئر تحتوي على المعالجات المعنية، وتكون الأقراص متسللة بالتفريغ. تحتوي كل صفيحة على أربع نسخ من جهاز تحكم سلبي (ماء مع مذيب) وجهاز تحكم إيجابي (سم flg22 أو T-2). بعد 4-6 ساعات، تقاس موصلية السائل المحيط بقرص الورقة كقياس لتسرب الأيونات. بعد 24 ساعة، يتم قياس نشاط بيروكسيداز باستخدام اختبار لوني باستخدام السائل المحيط بقرص الورقة، ويتم إزالة صبغة قرص الورقة ومعالجته لقياس كمية الكالوز. الاختصار: MSM = المستقلب الثانوي الميكروبي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: تأثير المذيب على تسرب الأيونات الناتج عن flg22 أو نشاط البيروكسيداز. تمت معالجة أربع عينات مكررة من الأرابيدوبسيس ب 1 ميكرومولار flg22 مع DMSO أو الميثانول (0، 0.01، 0.1، 1، 10٪). تظهر الرسوم البيانية الشريطية متوسط توصيلية العينة بعد 4 ساعات أو نشاط البيروكسيداز (OD600) عند 24 ساعة بعد المعالجة من تجربة واحدة (n = 4، SD). تم تكرار التجربة مرتين بنتائج متشابهة. تم تحديد الفرق الكبير عن التحكم في المياه بواسطة اختبار t وتم الإشارة إليه بنجمة (p < 0.05). الاختصارات: DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد؛ MeOH = الميثانول. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: تحفيز تسرب الأيونات، نشاط البيروكسيداز، أو ترسيب الكالوز في أقراص أوراق الأرابيدوبسيس بواسطة جزيئات مشتقة من الميكروبات. شملت العلاجات الببتيدات المناعية غير السامة flg22 (1 ميكرومولار)، والليبوببتيدات الحلقية جراميلين وسورفاكتين (10 ميكرومولار)، وسم T-2 (10 ميكرومولار)2,6. تم تطبيع جميع البيانات إلى نسبة التحكم في DMSO + 0.1٪. تظهر مخططات الصندوق والشوارب توصيلية العينة بعد 4 ساعات، ونشاط البيروكسيداز (OD600) بعد 24 ساعة، أو عدد رواسب الكالوز بعد 24 ساعة من تجربة واحدة (n = 4-16 نبات). تشير مخططات الصناديق إلى 'x' لإظهار قيمة المتوسط، وتشير الصناديق إلى الربع الأول، والوسيط، والربع الثالث للمعالجة. أعلى وأدنى الملاحظات التي ليست استثناء تشير إليها الشوارب (>النطاق الربعي 1.5x، المشار إليه بدوائر). يشير الفرق الكبير عن التحكم في المياه بعلامة نجمية، وقد تم تحديده بواسطة تحليل النوفاين الأحادي الاتجاه مع اختبار توكي (p < 0.05). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفرز المجتمعات الميكروبية المستعمرة للنباتات متنوعا من MSMs لتسهيل تكوين الأغشية الحيوية، وقمع الميكروبات المتنافسة، والتأثير على مضيف النبات17. بينما لا تؤثر بعض النماذج التقنية المتوسطة على النبات، فإن البعض الآخر يسبب موت الخلايا السريع، أو يثبط وظيفة الخلية، أو يحفز مقاومة النبات17. بعض MSMs تؤثر على مقاومة النبات للميكروب المنتج للMSM، ويمكن اختيار الأنماط الجينية المقاومة بناء على عدم حساسية MSM 2,3,18. تحفز MSMs الأخرى مقاومة جهازية وتوفر الحماية ضد مسببات الأمراض الميكروبية، والتي استخدمت في الزراعة لتطوير منتجات واقية حيويا لقمع المرض8. لتطوير استراتيجيات فعالة ومستدامة لتحسين المحاصيل، من الضروري تحديد MSMs المفيدة والجينات النباتية التي تمكن الاستجابة المثلى ل MSM.

العثور على MSMs المفيدة يعقد بسبب أن هذه المركبات تنتج إنزيميا، حيث يتطلب المنتج النهائي عدة إنزيمات2. وهذا يجعل من الصعب تحديد أي جين يجب استهدافه لإلغاء إنتاج MSM للدراسات الجينية. التخليق الإنزيمي يؤدي إلى عدة اختلافات هيكلية لنفس النموذج الحيوي مع أنشطة حيوية محتملة مختلفة19. فصل وتنقية هذه الجزيئات النشطة الحيوية قد يستغرق وقتا طويلا أو مستحيلا. في بعض الحالات، يمكن تنقية تركيزات منخفضة فقط من الميكروبات السطحية الفردية، مما يتطلب عدة جولات من التنقية2. بمجرد الحصول على مركب أو مستخلص نشط بيولوجيا، يمكن استخدام عدة طرق لفهم كيف قد يؤثر الميكروب على النبات.

ركزت الجهود السابقة على مراقبة تأثير MSM على إعادة البرمجة النقدية أو الحماية الحيوية في النباتات النموذجية20. لتقييم استجابات MSM خارج محطات النماذج، فإن الاختبارات عالية الإنتاجية التي تلتقط استجابات لوسائل الإعلام المتوسطة المتنوعة وتتطلب الحد الأدنى من النماذج المتوسطة قد تكون مفيدة. تشير الدراسات الحديثة إلى أن انفجارات ROS هي استجابة مبكرة شائعة للمتلازمات المتوسطة الجنسية، بما في ذلك الجراميلين، السورفاكتين، السيرينغومايسين، وسيرينغوببتين2،3،7. يكتشف اختبار قائم على اللومينول انفجار ROS الأبوبلاستيك الناتج عن البيروكسيدازات وأوكسيدازات NADPH وقابل للاختبار عالي الإنتاجية21. للأسف، لا يمكن اكتشاف ROS داخل الخلايا الناتج عن MSMs، مثل السورفاكتين، باستخدام هذه الطريقة7. يوفر قياس نشاط البيروكسيداز بديلا أكثر حساسية من اختبار اللومينول للكشف عن التنشيط المؤقت لإنزيمات ROS المنتجة أثناء الإجهاد11. ملاحظتنا بأن السورفاكتين يحفز نشاط بيروكسيداز تتماشى مع أبحاث حديثة تظهر أن نشاط البيروكسيداز يتحفز بواسطة السورفاكتين والبوفيريسين في الأرابيدوبسيس (الشكل 3)2. بالإضافة إلى ذلك، أظهرنا أن flg22 وجراميلين الأيونوفور تسببان في تسرب الأيونات، وجميع المركبات المختبرة، بما في ذلك flg22، وسم T-2، والسورفاكتين، والغراميلين، تحفز الكالوز كما هو متوقع (الشكل 3)2،4،7.

من خلال تقييم عدة استجابات داخل نفس العينة، نقلل من التنوع التجريبي في تقييم كل من هذه الصفات بشكل منفصل ونتمكن من الارتباط بين السمات في الدراسات على مستوى النظام على استجابات إجهاد النبات. كما أن تقييم عدة علاجات أو أنماط جينية ضمن نفس الوحدة التجريبية يتيح التنمذج الظاهري على مستوى السكان لعلم الوراثة السكانية. على سبيل المثال، تم استخدام نهج مشابه لتحديد QTL الكامن الأساسي وراء إنتاج ROS الناتج عن flg22 في الشعير22. يمكن أيضا استخدام هذا الاختبار لفحوصات الوراثة الكيميائية للعثور على معدلات استجابة إجهاد النبات أو لتحديد الميكروبات المحتملة الواقية حيويا من المستخلصات الميكروبية.

لضمان أن الطريقة التجريبية تعمل ضمن النظام المعني، يجب على الباحثين مراعاة العوامل والقيود التالية:

جودة نسيج الورقة
تأكد من أن نسيج أوراق النبات لا يتعرض للإجهاد قبل الحصاد. تختلف علامات تعرض النباتات للإجهاد بين الأنواع لكنها تشمل عادة الذبول، الاصفرار، الاحمرار، البقع، التجعد الزائد للأوراق أو تدحرجها. أخذ عينات من نسيج الأوراق يسبب جروحا، لذا فإن تجنب النقع المفرط للنسيج يقلل من الأخطاء الخلفية الناتجة عن التعامل معه.

أنواع النباتات
تم تحسين هذا البروتوكول للاستخدام مع أوراق الشعير وأوراق الأرابيدوبسيس. تتطلب أوراق الشعير وقت صبغ أطول للكالوز مقارنة بالأرابيدوبسيس، ويرجح أن ذلك يعود إلى كثافة الشمع الجلدي في الأعشاب، مما يزيد من كره الماء ويحد من انتشار المعالجات داخل الورقة. قد يفسر هذا جزئيا أيضا نقص تحفيز نشاط البيروكسيداز باستخدام طريقتنا، رغم أننا تمكنا من رؤية كبت نشاط البيروكسيداز بواسطة مركبات سامة مشابهة لما قدمناه في الأرابيدوبسيس (الشكل 3). حاولنا زيادة عدد أقراص الأوراق لكل عينة إلى 5، مع تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 5 أو 6 أو 7، وزيادة عدد تسرب الفراغ إلى 10، وتعديل تركيز الركيزة أو تغيير الركيزة إلى غوياكول24. بينما لاحظنا زيادة في نشاط البيروكسيداز مع زيادة أقراص الأوراق وجولات التسرب، ظلت الفروق بين الضابط السلبي وflg22 صغيرة (زيادة بنسبة 10٪ مع flg22) أو غير ذات دلالة عبر التجارب. نعلم أن الشعير يستجيب ل flg22 من خلال تحفيز إنتاج ROS، وإنتاج الكالوز، وتعبير بيروكسيداز25,26. في جذور الذرة، أظهرت مستخلصات البروتين نشاطا ناتج عن البيروكسيداز الناتج عن MAMP، مما يشير إلى أن استخراج البروتين قد يكون مطلوبا لرؤية التحفيز، بدلا من اكتشاف نشاط البروتين المتسرب من أقراص الأوراق، كما هو الحال في اختبارنا24. في اختبارنا، يؤدي الجرح بوضوح إلى تحفيز نشاط بيروكسيداز في عينة التحكم السلبية، لأن هذا النشاط يختفي عندما تموت الخلايا بسبب التعرض للسموم. من الممكن أن يؤدي علاج flg22 إلى نفس البيروكسيدازات التي تسبب الجرح، بحيث يبدو أنه لم يحدث تحفيز. بدلا من ذلك، قد لا يكون اختبارنا حساسا بما يكفي لاكتشاف التغيرات الطفيفة، أو قد لا تنتشر البيروكسيدازات بشكل جيد في المحلول.

لتطبيق هذا البروتوكول على أنواع النباتات الأخرى، نقترح استخدام الطريقة كما هو موضح وإضافة الأرابيدوبسيس إلى جانب الأداة كوسيلة تحكم لضمان عمل البروتوكول. إذا بدا نشاط البيروكسيداز منخفضا، فإن زيادة عدد أقراص الأوراق لكل عينة، وزيادة عدد تسرب الفراغ إلى 5 أو 10، وتجربة علاجات مختلفة، بما في ذلك MAMPs أو الأيونوفورات الأخرى، أو سم T-2، قد يعطي نتيجة إيجابية.

العلاجات السلبية
تعتمد هذه الطريقة على تحكم سلبي فعال ومناسب للمقارنات. من الناحية المثالية، يجب أن يحتوي التحكم السلبي على نفس المذيب الخلفي المستخدم في معالجة MSM المعنية، ولكن بدون MSM. المذيب الخلفي سيكون ماء أو له نفس تأثير الماء على الإجهادات المقاسة. هذا نهج عملي في الحالات التي يكون فيها MSM منقايا بالفعل ويمكن إذابته في مذيب مختار. عند مقارنة المستخلصات الميكروبية، قد يكون التحكم السلبي ناتج ثانوي لتنقية جزئية ل MSM، يحتوي على نفس وسط الخلفية ولكن مع تركيز أقل من MSM بعد التجزئة. أو يمكن للجرب استخدام وسط الزراعة المستخدم لتوليد مستخلص يحتوي على MSM كأداة تحكم سلبية. في هذه العينات الأكثر تعقيدا، قد تحتوي العينات السلبية على أملاح تنفخ قياس التوصيلية، أو يمكن للمذيبات أن تثبط نشاط البيروكسيداز (الشكل 2). لتحديد ما إذا كانت الأملاح تؤثر على نتائج تسرب الأيونات، يمكن للجرب اختبار توصيلية جهاز التحكم السلبي وأخذ العينة في غياب قرص الورقة لتحديد ما إذا كانت العينة أو الورقة تولد تغييرات في التوصيلية. لتحديد ما إذا كانت المذيبات تؤثر على استجابات البيروكسيداز، يمكن للجرب إضافة flg22 إلى الضابط السلبي ومقارنة النتيجة مع flg22 المذاب في الماء لتحديد ما إذا كان هناك فرق. من الممكن أن المذيبات أو المركبات الملونة أو الأملاح الزائدة في حالة التحكم السلبي قد تخفي تأثيرات MSM على استجابات إجهاد النبات الموضحة، وبالتالي لن يكون هذا النهج مناسبا في جميع السيناريوهات.

وقت أخذ العينات
من المهم بدء العلاجات في الصباح، حيث تتبع استجابات الدفاع المحفزة دورة يومية وتكون أعلى سعةفي الصباح الباكر. من خلال تجربتنا، ينتج الأرابيدوبسيس تسرب الأيونات استجابة للغراميلين أسرع (4 ساعات) من الشعير والذرة (4-7 ساعات)، وبالتالي قد يكون هناك حاجة إلى مسار زمني لتحديد المعلمات التجريبية 2,28. تنخفض استجابة الخلايا مع مرور الوقت، ولا نوصي باختبار استجابات التوتر بعد 30+ ساعة من العلاج.

تركيز
يمكن أن يكون لتركيز MSM تأثير غير خطي على تحفيز استجابات إجهاد النبات، وهو ظاهرة تسمى هورميسيس20. اعتمادا على توفر وذوبان MSM، يفضل الباحثون اختبار استجابات إجهاد النبات عبر نطاق تركيزات MSM. تتراوح التركيزات النموذجية بين 100 نانوميل و1,000 ميكرومولار كنقطة بداية 2,11,20.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تقديم الدعم المالي ضمن الشراكة الزراعية الكندية المستدامة (#20230098)، وهي مبادرة اتحادية-إقليمية-إقليمية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حمض 5-أمينوساليسيليكميليبور سيغما  A79809
مضخة بارنارت الفراغيةمجموعة أرتيزان تكنولوجي400-3910
مسبار التوصيل الدقيق COND-905مختبرات لازار للأبحاث المحدودة.
ببتيد FLg22آنا سبيكAS-62633
إنفينيت 200PRO Fمجموعة تيكان المحدودة30190086
السورباكتينسيغما-ألدرتشS3523
سم T-2شركة كايمان للكيماويات20433

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annu Rev Phytopathol. 55 (1), 109-137 (2017).
  2. Brauer, E. K., et al. A cyclic lipopeptide from Fusarium graminearum targets plant membranes to promote virulence. Cell Rep. 43 (7), 114384(2024).
  3. Thoms, D., et al. Innate immunity can distinguish beneficial from pathogenic rhizosphere microbiota. bioRxiv. , (2023).
  4. Nishiuchi, T., et al. Fusarium phytotoxin trichothecenes have an elicitor-like activity in Arabidopsis thaliana, but the activity differed significantly among their molecular species. Mol Plant Microbe Interact. 19 (5), 512-520 (2006).
  5. Schellenberger, R., et al. Apoplastic invasion patterns triggering plant immunity: plasma membrane sensing at the frontline. Mol Plant Pathol. 20 (11), 1602-1616 (2019).
  6. Henry, G., Deleu, M., Jourdan, E., Thonart, P., Ongena, M. The bacterial lipopeptide surfactin targets the lipid fraction of the plant plasma membrane to trigger immune-related defence responses. Cell Microbiol. 13 (11), 1824-1837 (2011).
  7. Pršić, J., et al. Mechanosensing and sphingolipid-docking mediate lipopeptide-induced immunity in Arabidopsis. bioRxiv. , (2023).
  8. Crouzet, J., et al. Biosurfactants in plant protection against diseases: rhamnolipids and lipopeptides case study. Front Bioeng Biotechnol. 8, 1014(2020).
  9. Khan, P., et al. Luminol-based chemiluminescent signals: clinical and non-clinical application and future uses. Appl Biochem Biotechnol. 173, 333-355 (2014).
  10. Schenk, S. T., Schikora, A. Staining of callose depositions in root and leaf tissues. Bio-protoc. 5 (6), e1429(2015).
  11. Mott, G. A., Desveaux, D., Guttman, D. S. A high-sensitivity, microtiter-based plate assay for plant pattern-triggered immunity. Mol Plant Microbe Interact. 31 (5), 499-504 (2018).
  12. Hatsugai, N., Katagiri, F. Quantification of plant cell death by electrolyte leakage assay. Bio-protoc. 8 (5), e2758(2018).
  13. Zhang, X. H., Yu, X. Z., Yue, D. M. Phytotoxicity of dimethyl sulfoxide (DMSO) to rice seedlings. Int J Environ Sci Technol. 13, 607-614 (2016).
  14. Mannan, A., et al. DMSO triggers the generation of ROS leading to an increase in artemisinin and dihydroartemisinic acid in Artemisia annua shoot cultures. Plant Cell Rep. 29, 143-152 (2010).
  15. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. Plant J. 18 (3), 265-276 (1999).
  16. Jourdan, E., et al. Insights into the defense-related events occurring in plant cells following perception of surfactin-type lipopeptide from Bacillus subtilis. Mol Plant Microbe Interact. 22 (4), 456-468 (2009).
  17. Raaijmakers, J. M., De Bruijn, I., Nybroe, O., Ongena, M. Natural functions of lipopeptides from Bacillus and Pseudomonas: more than surfactants and antibiotics. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1037-1062 (2010).
  18. vábová, L., Lebeda, A. In vitro selection for improved plant resistance to toxin-producing pathogens. J Phytopathol. 153 (1), 52-64 (2005).
  19. Mousa, W. K., Raizada, M. N. The diversity of antimicrobial secondary metabolites produced by fungal endophytes: an interdisciplinary perspective. Front Microbiol. 4, 65(2013).
  20. Bektas, Y., Eulgem, T. Synthetic plant defense elicitors. Front Plant Sci. 5, 804(2015).
  21. Saeed, B., Trujillo, M. Analysis of immunity-related oxidative bursts by a luminol-based assay. Environ Responses Plants: Methods Protoc. , 339-346 (2022).
  22. Brauer, E. K., et al. Transcriptional and hormonal profiling of Fusarium graminearum-infected wheat reveals an association between auxin and susceptibility. Physiol Mol Plant Pathol. 107, 33-39 (2019).
  23. Taylor, P. The wetting of leaf surfaces. Curr Opin Colloid Interface Sci. 16 (4), 326-334 (2011).
  24. Mika, A., Boenisch, M. J., Hopff, D., Lüthje, S. Membrane-bound guaiacol peroxidases from maize (Zea mays L.) roots are regulated by methyl jasmonate, salicylic acid, and pathogen elicitors. J Exp Bot. 61 (3), 831-841 (2010).
  25. Brauer, E. K., et al. Transcriptional profiling and genetic mapping of barley responses to bacterial flagellin. Mol Plant Microbe Interact. 38 (2), 344-352 (2025).
  26. Takáč, T., et al. TALEN-based HvMPK3 knock-out attenuates proteome and root hair phenotypic responses to flg22 in barley. Front Plant Sci. 12, 666229(2021).
  27. Kim, M. G., Macoy, D. M., Lee, J. Y., Cha, J. Y., Kim, W. Y. Interactions between plant immunity, temperature, light, and circadian rhythm. J Plant Biochem Physiol. 9, 260(2021).
  28. Bahadoor, A., et al. Gramillin A and B: cyclic lipopeptides identified as the nonribosomal biosynthetic products of Fusarium graminearum. J Am Chem Soc. 140 (48), 16783-16791 (2018).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

96

مقالات ذات صلة