إنشاء وتقييم نموذج الفئران الناجم عن مستخلص المبيضات البيضاء القابل للذوبان في الماء لالتهاب الشرايين التاجية المرتبط بمرض كاواساكي

مرض كاواساكي (KD) ، وهو شكل من أشكال متلازمة العقدة الليمفاوية المخاطية الجلدية ، هو مرض مناعي ذاتي يحدث عند الأطفال دون سن 5 سنوات ويرافقه التهاب الأوعية الدموية الحموي^1،2،3. تشير الدراسات إلى أن الدورات غير المعالجة أو العلاجية التي تتجاوز 10 أيام من مرض كاوايت كاناتي الشديد عرضة للتسبب في مضاعفات خطيرة للقلب والأوعية الدموية ، بما في ذلك بشكل رئيسي تمدد الأوعية الدموية التاجية وتضيق الشريان التاجي^4،5. قد يؤدي تمزق تمدد الأوعية الدموية التاجية إلى صدمة قلبية أو حتى موت مفاجئ ، وهو السبب الرئيسي لأمراض القلب المكتسبة عند الأطفال ^6,7. على الرغم من أن تطبيق الغلوبولين المناعي عن طريق الوريد قد حسن بشكل كبير من التشخيص ، إلا أن مسبباته ومسبباته لا تزال غير واضحة ، مما يحد من تطوير الاستراتيجيات العلاجية المستهدفة^8،9. لذلك ، أصبح إنشاء نماذج حيوانية يمكنها محاكاة خصائص الأمراض البشرية بدقة حاجة ملحة للبحث الحالي.

حاليا ، تتمثل إحدى العقبات الرئيسية في أبحاث مرض كاواساكي في عدم وجود نماذج حيوانية مميزة جيدا تلخص بشكل كامل أمراض المرض. من بين النماذج المختلفة التي تم تطويرها الآن ، يعد نموذج التهاب الأوعية الدموية الناجم عن مستخلص جدار الخلية الملبنة كاسي (LCWE) نظاما ناضجا نسبيا ، ويمكن أن يسبب هذا النموذج التهاب الشرايين التاجية. يستخدم على نطاق واسع لدراسة آلية خلل التنظيم المناعي والسيتوكينات المحددة في الأوعية الدموية الشبيهة بالدينار^10،11. كما اجتذب نموذج التهاب الأوعية الدموية الناجم عن مستخلص المبيضات البيضاء القابل للذوبان في الماء (CAWS) الكثير من الاهتمام نظرا لتشابهه الكبير مع السمات المرضية لمرض كاواساكي البشري^12،13. بعد التحسين والتحسين المنهجي من قبل فرق بحثية متعددة ، تطور النموذج الناجم عن CAWS ليصبح أداة مهمة لأبحاث مرض كاواساكي¹⁴. على الرغم من أن CAWS يمكن أن يحفز التهاب الشريان التاجي عن طريق الحقن داخل الصفاق ، إلا أن له قيودا من حيث أنه لا يمكنه إعادة إنتاج العملية المرضية الدقيقة لالتهاب الأوعية الدموية البشري KD بشكل كامل. على سبيل المثال ، لم يتم العثور على العدلات في علم الأمراض المتأخر للإنسان¹⁵ دينار كويتي ، ولكن تسلل العدلات لا يزال يحدث في هذا النموذج حتى 16 أسبوعا بعد حقن CAWS¹⁶. علاوة على ذلك ، لم يتم توضيح آلية التهاب الأوعية الدموية الناجم عن CAWS بشكل كامل في الوقت الحالي ، مما يحد من الفهم المتعمق والتطبيق للنموذج⁹. تهدف هذه الدراسة إلى إنشاء نموذج حيواني موحد ل KD من خلال تحسين بروتوكول الحث ل CAWS ، وتوضيح آلية المرض ، وتسهيل تطوير العلاجات المستهدفة.

استخدمت هذه الدراسة CAWS لإنشاء نموذج حيواني أكثر توحيدا لمرض كاواساكي. من خلال تجارب تحسين الجرعة المنهجية ، تقرر أن الحقن داخل الصفاق بمقدار 8 ملغ يوميا لمدة خمسة أيام متتالية هو نظام الإدارة الأمثل. يمكن لهذا النظام أن يحفز آفات الشريان التاجي بثبات مع الحفاظ على معدل بقاء مرتفع في. بالإضافة إلى ذلك ، استكشفنا كذلك دور الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا في تكوين التليف خلال المرحلة المزمنة من KD ، مع التركيز على الآلية المحتملة لقناة الأنيون المعتمدة على الجهد 1 (VDAC1) ، وهو بروتين رئيسي ينظم موت الخلايا المبرمج في الميتوكوندريا ، أثناء الانتقال من الالتهاب إلى التليف¹⁷. تجدر الإشارة إلى أنه من خلال تحليل التوطين المشترك للبلعمة الذاتية / الليزوزوم في هذه الدراسة ، لوحظت وظيفة الالتهام الذاتي غير الطبيعية في هذا النموذج. يوفر هذا النموذج المحسن أداة مهمة للدراسة المنهجية للتسبب في آفات الشريان التاجي في مرض كاواساكي وتقييم استراتيجيات العلاج الجديدة.

تمت الموافقة على جميع التجارب البحثية التي تتضمن بيانات حيوانية من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة لمستشفى Huai'an الشعبي رقم 1 التابع لجامعة نانجينغ الطبية (KY-2024-250-01). يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. تحضير CAWS

1. تلقيح المبيضات البيضاء في مرق سكر العنب سابورو وفقا للبروتوكول المعمول به من قبل دونغ وآخرون ¹⁸. ثم, زراعة المرق الملقح لاهوائي عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة في غرفة لاهوائية محكمة الغلق مع خليط الغاز.
   ملاحظة: لضمان عقم وسط الاستزراع ، يجب التحكم بشكل صارم في حالة الاستزراع اللاهوائي عند 37 درجة مئوية لمنع التلوث بالبكتيريا المتنوعة.
2. اشطفها بشكل متكرر باستخدام وسط محدد C واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة بسرعة دوران 4.5 × جم.
3. أضف حجما متساويا من الإيثانول اللامائي واتركه طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
4. قم بجهاز الطرد المركزي عند 4.5 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأضف حجما متساويا من الإيثانول اللامائي إلى الراسب ، واتركه طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
5. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية ، وأضف 50 مل من الأسيتون إلى الراسب ، وجهاز الطرد المركزي ، وجفف الراسب. قم بإذابة الراسب في محلول ملحي عادي معقم لاستخدامه لاحقا.

2. بناء نموذج فأر لمرض كاواساكي

1. اختر ثمانين فأرا من الذكور من فئة C57BL / 6 من فئة SPF تتراوح أعمارهم بين 4-6 أسابيع ، وقم بإيوائهم في ظروف خاضعة للرقابة مع إمكانية الوصول المجاني إلى الطعام والماء.
   ملاحظة: لتقليل التداخل المحتمل لتقلبات مستوى هرمون الاستروجين على الاستجابات المناعية والالتهابية ، تم استخدام ذكور الفئران فقط في دراسة إنشاء النموذج الأولي وتوصيف¹⁹.
2. قسم الفئران إلى 4 مجموعات بالتساوي بطريقة جدول الأرقام العشوائي ، بما في ذلك 3 مجموعات حقن CAWS بجرعات مختلفة (4 مجم ، 8 مجم ، 12 مجم) ومجموعة تحكم 1 من المحلول الملحي العادي ، مع 20 فأرا في كل مجموعة.
3. تحضير مسحوق CAWS في ثلاثة تركيزات 40 مجم / مل و 80 مجم / مل و 120 مجم / مل باستخدام محلول ملحي عادي معقم (0.9٪ كلوريد الصوديوم). حقن المجموعة التجريبية ب 0.1 مل من CAWS في الصباح من اليوم الأول إلى اليوم الخامس من التجربة ، وقم بإعطاء كمية متساوية من المحلول الملحي العادي للمجموعة الضابطة وفقا لنفس الجدول الزمني.
   ملاحظة: تم إجراء الحقن داخل الصفاق باستخدام حقنة أنسولين سعة 1 مل. عند التشغيل ، ضع الماوس مع انخفاض رأسه وذيله أعلى لمنع تلف الأعضاء مثل الأمعاء الغليظة والدقيقة عند إدخال المحقنة.
4. استخدم ميزانا إلكترونيا في الساعة 9 صباحا كل يوم لوزن العلف المتبقي في وحدة التغذية في نفس الوقت وحساب استهلاك الطعام لمدة 24 ساعة لكل قفص من الفئران.
5. في الأيام الثالثة والسابعة والرابعة عشرة والثامنة والثامنة والعشرين بعد الحقن الأخير ، اختر بشكل عشوائي وضحي ب 3 فئران من كل مجموعة في كل نقطة زمنية.
6. ضع الفئران في غرفة مغلقة مملوءة مسبقا بهواء الغرفة. أدخل ثاني أكسيد الكربون_{المضغوط 2} بمعدل تدفق 30٪ من حجم الغرفة في الدقيقة. بعد 5 دقائق ، تم إجراء خلع عنق الرحم لتأكيد الوفاة.
7. جمع ووزن عينات القلب. مراقبة الآفات الالتهابية في القلب والأوعية الدموية عن طريق تلطيخ HE.

3. معايير التلوين والدرجات HE

1. تم عزل القلب وقوس الأبهر (حوالي 3 مم × 3 مم) بسرعة. قم بإجراء متوسط بضع القص وفقا للطريقة الموصوفة²⁰. افصل القلب بسرعة عن قوس الأبهر (حوالي 3 مم × 3 مم). تم تثبيت الأنسجة التي تم جمعها في الفورمالين المحايد بنسبة 10٪ لمدة 24 ساعة.
2. بعد التثبيت ، قم بتجفيف الأنسجة من خلال سلسلة إيثانول متدرجة (70٪ إيثانول لمدة ساعة واحدة ، 80٪ إيثانول لمدة ساعة واحدة ، 95٪ إيثانول لمدة ساعة واحدة ، و 100٪ إيثانول لمدة ساعة واحدة) ، واضح في الزيلين ، وتضمينه في البارافين. أخيرا ، قسم الكتل إلى شرائح متواصلة بحجم 5 ميكرومتر.
3. لتلوين H & E ، قم بتلطيخ الأقسام بالهيماتوكسيلين لمدة 5 دقائق ، واشطفها بالماء الجاري لمدة 10 دقائق ، ثم قم بالبقع المضادة بالإيوزين لمدة دقيقتين ، ثم تابع الجفاف والتركيب²¹.
   ملاحظة: وفقا لدرجة إصابة الأوعية الدموية الحميمة ، يتم تصنيفها إلى ثلاث درجات: تتميز الدرجة الأولى بشكل أساسي بتورم البطانة وتراكم العدلات. يتجلى الصف الثاني في تنكس العضلات الملساء ، وتسلل الخلايا الالتهابية ، وتلف العضيات. تظهر الدرجة الثالثة مع آفات شديدة مثل نخر البطانة وتساقط ، وترسب الفيبرين.

4. تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان

1. بعد التثبيت ، قم بتجفيف عينات الأنسجة من خلال سلسلة إيثانول متدرجة ، واضحة في الزيلين ، وتضمينها في البارافين.
2. بعد إزالة الشمع ، قم بترطيب الأقسام من خلال سلسلة إيثانول متدرجة إلى الماء المقطر استعدادا للتلطيخ.
3. قم بتلطيخ النوى بالهيماتوكسيلين الحديدي من Weigert لمدة 5 دقائق ، ثم اشطفها جيدا تحت الماء الجاري ، ثم صبغ السيتوبلازم بحمض Lichun Red Fuchsin لمدة 5 دقائق.
4. تفريق مع 1٪ حمض الفوسفوموليبيك لمدة 1 دقيقة ، ثم تلطيخ ألياف الكولاجين مباشرة باللون الأزرق الأنيلين لمدة 3 دقائق. اشطفيه بسرعة باستخدام 1٪ حمض الخليك الجليدي.
   ملاحظة: تحكم بشكل صارم في توقيت خطوة التمايز لضمان خصوصية التلوين.
5. بعد الجفاف بالإيثانول والزيلين ، ويصبح شفافا ، أغلق الفيلم المحايد.
6. اشطف الأجزاء الملطخة تحت الماء الجاري لإزالة الصبغة الزائدة.
7. قم بتجفيف الأقسام من خلال سلسلة إيثانول متدرجة ، واضحة في الزيلين ، وقم بتثبيتها بصمغ محايد.
8. راقب الأقسام تحت المجهر الضوئي بتكبير ثابت. يجب أن تظهر ألياف الكولاجين باللون الأزرق ، وألياف العضلات والسيتوبلازم الأحمر ، والنوى زرقاء عميقة.

5. تلطيخ التألق المناعي

1. إصلاح أقسام الخلايا أو الأنسجة ، وحظرها بنسبة 5٪ BSA لمدة ساعة واحدة لتقليل الارتباط غير المحدد.
2. استخدم مصلا طبيعيا من نفس أصل النوع مثل الجسم المضاد الثانوي ، وقم بتخفيفه باستخدام PBS بنسبة 1:10 ، ثم قم بإسقاطه على العينة. أغلقه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد الختم ، اشطفيه برفق مرتين باستخدام PBS.
3. احتضان الأقسام بالجسم المضاد الأساسي طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد الغسيل باستخدام PBS ، أضف الجسم المضاد الثانوي الفلوري واحتضان في الظلام لمدة 1 ساعة.
4. تلطيخ اللب باستخدام DAPI ، والختم بعامل تركيب مضاد للتبريد ، والمراقبة تحت الفحص المجهري متحد البؤر.

6. الكيمياء المناعية

1. بعد إزالة الشمع وترطيب أقسام البارافين ، قم بإجراء إصلاح المستضد ومنع البيروكسيديز الذاتي.
2. حضانة الأجسام المضادة وتطوير اللون: أولا ، قم بحظر المصل الطبيعي ، ثم احتضان الجسم المضاد الأساسي والجسم المضاد الثانوي المسمى HRP بالتسلسل ، وأخيرا ، تطوير لون DAB. التحكم في درجة التفاعل تحت المجهر.
3. أعد تلطيخ نوى الخلية بالهيماتوكسيلين. بعد الجفاف والشفافية ، أغلق الألواح وراقب الإشارة الموجبة الصفراء البنية تحت المجهر.
   ملاحظة: تحتاج التجربة إلى إعداد عناصر التحكم والتحكم الصارم في شروط الاستعادة وتطوير اللون.

7. الكشف عن التحلل التلقائي

1. الاستزراع المشترك RAW264.7 البلاعم مع جراثيم المبيضات البيضاء بنسبة مناسبة (10: 1) ، واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 4 ساعات ، 8 ساعات ، 12 ساعة ، 16 ساعة ، 20 ساعة ، 24 ساعة ، 28 ساعة ، 32 ساعة ، 36 ساعة ، 40 ساعة ، 44 ساعة ، و 48 ساعة لإنشاء نموذج البلعمة.
2. اغسل ثلاث مرات باستخدام PBS المبرد مسبقا لإزالة الجراثيم غير البلعمة.
3. أولا ، قم بحظر العينات بنسبة 5٪ BSA لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، احتضن على التوالي بالجسم المضاد الأساسي ضد LC3 (تخفيف 1: 200) في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، متبوعا بالجسم المضاد الثانوي المسمى Alexa Fluor 488 في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
4. أضف مسبار الليزوزوم الأحمر Lyso-Tracker Red مباشرة إلى الخلايا لتصور توطين الليزوزومات. أخيرا ، قم بتلطيخ النوى باستخدام DAPI (1 ميكروغرام / مل) لمدة 5 دقائق.
   ملاحظة: يجب إجراء عملية العملية بأكملها في الظلام لضمان التحكم بدقة في وقت الحضانة وتركيز الجسم المضاد.

في البداية ، قمنا بتقييم التغيرات المرضية في عضلة القلب بشكل منهجي الناجمة عن جرعات مختلفة من CAWS في الفئران. لم تلاحظ أي وفيات في المجموعة الضابطة من برنامج التقويم التلفزيوني ، ومجموعة CAWS 4 مجم ، ومجموعة CAWS 8 مجم (ن = 20 في كل مجموعة). في المقابل ، كانت الاستجابة الالتهابية في مجموعة 4 مجم خفيفة ولم تفي بمتطلبات النمذجة. كان معدل الوفيات أعلى في مجموعة 12 مجم CAWS (9/20 ، 45٪) ، وحدثت الوفيات من اليوم الثالث إلى اليوم العاشر بعد الحقن. تشير هذه النتائج إلى أن جرعة 12 مجم يمكن أن تسبب ضررا التهابيا موضعيا مفرطا وسمية جهازية. لذلك ، تم استبعاد هذه الجرعة من الدراسات اللاحقة. تم اختيار جرعة 8 مجم في النهاية كنظام الجرعات الأمثل لأنها يمكن أن تسبب بشكل فعال التهاب الشرايين التاجية بشكل كبير مع الحفاظ على معدل بقاء مقبول والحد الأدنى من ردود الفعل السلبية المحلية. (الشكل 1 أ). في النهاية ، تقرر أن الحقن داخل الصفاق بمقدار 8 مجم CAWS هو جرعة النمذجة المثلى. أظهرت نتائج تلطيخ HE للمجموعة التجريبية عملية ديناميكية نموذجية للالتهاب والتليف. في اليوم الثالث ، حدث تسلل التهابي بؤري ، يتكون بشكل أساسي من العدلات والخلايا الوحيدة حول الأوعية الدموية. بحلول اليوم السابع ، توسع النطاق الالتهابي إلى الخلال عضلة القلب ، مصحوبا بتورم كبير في خلايا عضلة القلب ووذمة خلالية. في اليوم الرابع عشر ، وصل الالتهاب إلى ذروته ، وحدث اضطراب ترتيب ألياف عضلة القلب والنخر البؤري. في اليوم الثامن والعشرين ، على الرغم من تخفيف الالتهاب ، فقد تشكل التليف المبكر (الشكل 1 ب والشكل 2 أ). في المقابل ، ظل هيكل عضلة القلب طبيعيا في جميع النقاط الزمنية في المجموعة الضابطة. تم تأكيد جميع النتائج من خلال تقييم مزدوج التعمية ، والذي تحقق من أن جرعة 8 مجم من CAWS يمكن أن تحفز بثبات نموذج إصابة عضلة القلب بما يتفق مع خصائص مرض كاواساكي.

بعد ذلك ، تم استخدام طريقة تلطيخ ماسون ثلاثية الألوان للتحقيق فيما إذا كان التهاب الأوعية الدموية الشبيه بمرض كاواساكي الناجم عن CAWS سيؤدي إلى تليف مستمر يحيط بالشرايين التاجية (CA). أظهرت النتائج التجريبية أنه في مجموعة حقن CAWS للفئران ، تم اكتشاف رواسب ألياف الكولاجين الواضحة حول جدران الشرايين التاجية الملتهبة والشريان الأورطي ، وتزامنت هذه المناطق الليفية بشكل كبير مع مواقع توزيع تسلل الخلايا الالتهابية. في المقابل ، أظهرت الفئران في مجموعة التحكم في برنامج تلفزيون البرامج التلفزيونية تلطيخا ضعيفا للكولاجين فقط ، والذي كان محصورا ضمن النطاق الهيكلي الطبيعي لجدار الأوعية الدموية (الشكل 2 أ). أظهر التحليل الكمي أن ترسب ألياف الكولاجين بشكل كبير حدث في 14 يوما ، وكانت درجة التليف مختلفة إحصائيا عن درجة المجموعة الضابطة (الشكل 2 ج).

بالنظر إلى أن التغيير المرضي المركزي في مرض كاواساكي هو الاستجابة المناعية الالتهابية لجدار الأوعية الدموية ، والتي تنطوي على العمل المنسق لخلايا مناعية متعددة22،23 ، فقد استكشفنا بعد ذلك التغيرات المميزة للبيئة المكروية المناعية في نموذج CAWS من خلال تلطيخ التألق المناعي (IF). في اليوم الرابع عشر بعد حقن CAWS ، تم إجراء تلطيخ IF لعلامات الخلايا المناعية على أنسجة القلب للفئران المحقونة ب CAWS. أظهرت النتائج التجريبية أنه في اليوم الرابع عشر من النمذجة للفئران في مجموعة علاج CAWS ، زاد تسلل الخلايا التائية CD3 + ، والخلايا التائية السامة للخلايا CD8 + ، والبلاعم من نوع CD86 + M1 ، والضامة F4 / 80 + ، والخلايا القاتلة الطبيعية NK1.1 + في الشرايين التاجية وأنسجة عضلة القلب بشكل ملحوظ مقارنة بمجموعة التحكم في PBS (الشكل 2 ب، د). من خلال التحليل المنهجي لتغيرات التعبير لهذه العلامات المناعية ، لم يتحقق فقط من أن نموذج CAWS يمكن أن يحاكي بدقة الخصائص المناعية لمرض كاواساكي البشري ، ولكن الأهم من ذلك ، أنه كشف عن الآلية المحتملة لمجموعات فرعية مختلفة من الخلايا المناعية في حدوث المرض وتطوره ، مما يوفر أساسا نظريا للتطوير اللاحق لاستراتيجيات التدخل المناعي المستهدفة.

أثبتت الأبحاث أن الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا هو آلية رئيسية كامنة وراء تليف عضلة القلب24،25،26. من المسلم به أنه في ظل الإجهاد الالتهابي ، يمكن لقناة الأنيون المعتمدة على الجهد 1 (VDAC1) ، وهي بروتين حاسم لمراقبة جودة الميتوكوندريا ، أن تؤدي إلى فتح غير طبيعي للمسام الانتقالية لنفاذية الميتوكوندريا (mPTP) عندما يتم تنظيم تعبيرها. وهذا بدوره يحفز موت الخلايا المبرمج وينشط الخلايا الليفية17،27. لاستكشاف هذه الآلية ، قمنا بتقييم تعبير VDAC1 في المرحلة المزمنة باستخدام الكيمياء المناعية. كشفت النتائج التي توصلنا إليها أنه بالمقارنة مع مجموعة التحكم في PBS ، فإن تعبير بروتين VDAC1 في أنسجة عضلة القلب للفئران في المجموعة المعالجة ب CAWS كان مرتفعا بشكل ملحوظ بعد 28 يوما من النمذجة (الشكل 3). تم تحديد الإشارات الإيجابية في الغالب في المناطق الليفية وحول الأوعية الدموية ، مما يشير إلى أن الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا بوساطة VDAC1 قد يساهم في تليف عضلة القلب في نموذج مرض كاواساكي. توفر هذه البيانات أدلة تجريبية فيما يتعلق بالآليات الجزيئية لإصابة عضلة القلب التي يسببها CAWS.

وجدت الدراسات السابقة أن الخلل الوظيفي للميتوكوندريا بوساطة VDAC1 متورط في عملية تليف عضلة القلب لمرض كاواساكي ، ولكن لم يتم توضيح آليته المحددة بعد. بالنظر إلى أن الحفاظ على توازن الميتوكوندريا يعتمد على الوظيفة الطبيعية لنظام التهام الذاتي والليزوزومي. نتوقع أن VDAC1 قد يؤدي إلى تفاقم التليف من خلال التأثير على تكوين أو وظيفة البلعمة الذاتية ، مما يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للميتوكوندريا. للتحقق من هذه الفرضية ، أنشأنا أولا نموذج عدوى بوغ المبيضات البيضاء في البلاعم (RAW264.7) (الشكل 4) واكتشفنا التغيرات الديناميكية للتدفق الذاتي والنشاط الليزوزومي في النموذج. تظهر النتائج التجريبية أن تكوين الجسيمات الحالة للالتهام الذاتي يزداد في المرحلة المبكرة (في غضون 2-3 ساعات بعد إصابة الخلية) ، بينما يتم حظر التدفق الذاتي في المرحلة اللاحقة (3-4 ساعات بعد إصابة الخلية). يمكن تقييم تغيير تدفق الالتهام الذاتي عن طريق تغيير تلطيخ الدمج بعد التوطين المشترك للبلعمة الذاتية والليزوزوم. تؤكد هذه النتيجة أن الخلل الوظيفي في البلعمة الذاتية يمكن أن يؤدي بالفعل إلى ضعف الخلوية.

الشكل 1: التحليل النسيجي المرضي للقلب والشرايين التاجية. (أ) منحنيات البقاء على قيد الحياة للفئران المحقونة ب PBS أو جرعات مختلفة من CAWS (4 مجم و 8 مجم و 12 مجم ؛ ن = 20 لكل مجموعة). (ب) تم تقديم نتائج تلطيخ HE للقلب في مجموعة علاج CAWS (8 مجم) في نقاط زمنية مختلفة (3 د ، 7 د ، 14 د ، 28 د). قضبان المقياس: 1500 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: تحليل تليف الكولاجين وتسلل الخلايا المناعية. (أ) نتائج تلطيخ ماسون لمجموعة CAWS 8 مجم والمجموعة الضابطة. تقدم ألياف الكولاجين لونا أزرق مميزا ، وألياف العضلات والسيتوبلازم حمراء ، ونواة الخلية زرقاء داكنة. تشير الأسهم إلى الجراثيم الفطرية. قضبان المقياس: 1500 ميكرومتر. (ب) نتائج تلطيخ التألق المناعي لمجموعة CAWS 8 مجم والمجموعة الضابطة (CD3 المسمى CD3 + الخلايا التائية ، CD8 المسمى CD8 + الخلايا التائية السامة للخلايا ، CD86 المسمى CD86 + M1 الضامة ، F4 / 80 المسمى F4 / 80 + الضامة ، و NK1.1 المسمى NK1.1 + الخلايا القاتلة الطبيعية). قضبان المقياس: 200 ميكرومتر. (ج) تقييم درجة التليف القلبي. تم تقييم درجة التليف القلبي بناء على النسبة المئوية لمنطقة التلوين ثلاثية الألوان في أنسجة القلب في المجال البصري عند تكبير 800x. الطريقة المحددة هي كما يلي: نظرا لأن ألياف الكولاجين مصبوغة باللون الأخضر الفاتح بأصباغ أنيونية جزيئية كبيرة ، فقد لوحظ 100 مجال بصري عند تكبير 800 مرة (جميع الشرائح بسمك 5 ميكرومتر) ، وتم تحديد درجة التليف القلبي من خلال النسبة المئوية للمساحة الخضراء في المساحة الإجمالية. كلما زادت النسبة المئوية ، زادت حدة التليف. (د) تم تحليل النسبة المئوية للخلايا المناعية إحصائيا وفقا لنتائج تلطيخ التألق المناعي ، *** ص < 0.001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: التحليل الكيميائي المناعي لتعبير VDAC1 في مجموعة PBS ومجموعة CAWS في اليوم 28. (أ) التحليل الكيميائي المناعي لتعبير VDAC1. شريط المقياس: 800 ميكرومتر. الجسيمات السوداء البنية هي نتائج إيجابية. (ب) التحليل الإحصائي للنسبة المئوية للخلايا الإيجابية كيميائيا المناعية VDAC1 ، ص < 0.001. (ج) التحليل الإحصائي للدرجة H للكيمياء المناعية VDAC1. تم اشتقاق البيانات من تكرارات بيولوجية متعددة (ن = 20 فأرا لكل مجموعة) ، وتم التعبير عن النتائج كمتوسط ± الانحراف المعياري وتحليلها إحصائيا (*** ص < 0.001). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: الكشف عن التحلل الذاتي بعد بلعمة المبيضات البيضاء بواسطة خلايا الفأر RAW264.7. (أ) تشير الأسهم إلى الجراثيم الفطرية. قضبان المقياس: 25 ميكرومتر. يمكن تقييم تغيير تدفق الالتهام الذاتي عن طريق تغيير تلطيخ الدمج بعد التوطين المشترك للبلعمة الذاتية والليزوزوم. (ب) يحدد تحليل الدورة الزمنية لمعدل تكوين التحلل الذاتي المعلمات ذات الصلة. تم التعبير عن النتائج كمتوسط ± الانحراف المعياري وتم تحليلها إحصائيا (***p < 0.001). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.