مقالة منهجية

قياس شيخوخة الخلية الواحدة باستخدام مؤشر حيوي قائم على التصوير للكروماتين والشيخوخة فوق الجينية

DOI:

10.3791/69057

⸱

يناير 30, 2026

 ,  ,  , 
1Harry Perkins Institute of Medical Research, QEII Medical Centre and Centre for Medical Research, The University of Western Australia, 2Scintillon Institute

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم البروتوكول سير العمل التصويري والحسابي لاستخراج والتحقق من الكروماتين المعتمد على التصوير وعمر الجينات فوق الجيني (ImAge).

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتعزيز الرعاية الصحية الشخصية وتقييم استراتيجيات التجديد المحتملة، تعد العلامات الحيوية التي تعكس العمر البيولوجي أمرا بالغ الأهمية. لقد قدمنا الكروماتين المعتمد على التصوير وعمر فوق جيني (ImAge)، وهو مؤشر حيوي قائم على التصوير مشتق من التنظيم المكاني للكروماتين والعلامات فوق الجينية داخل نوى واحدة، يلتقط التغيرات الجوهرية المرتبطة بالعمر. يلتقط ImAge بشكل فعال ويحدد تأثيرات التدخلات التي تعدل العمر البيولوجي، ويظهر حساسية من خلال انخفاضات كبيرة بعد استراتيجيات التجديد (مثل تقييد السعرات الحرارية وإعادة البرمجة الجزئية عبر تعبير مؤقت مثل Oct4 وSox2 وKlf4 وMyc (OSKM) ويزيد بعد علاجات مثل العلاج الكيميائي. علاوة على ذلك، ارتبط انخفاض ImAge بنشاط حركي أعلى، مما يشير إلى أنه يلتقط تحسينات وظيفية إلى جانب عكس العمر البيولوجي، مما يوفر أداة واعدة لخلية واحدة لتقييم تدخلات طول العمر. نظرا لأن ImAge طريقة تكاملية تتطلب تصويرا عالي الجودة وتحليلا حسابيا دقيقا، نهدف إلى تقديم إرشادات شاملة لاستخراجها والتحقق منها. سيفصل هذا البروتوكول الشامل سير العمل لكل من إجراءات المختبر الرطب (تحضير العينات والتصوير) والاستخدام الصحيح لخط أنابيب الحوسبة المفتوح المصدر لدينا (إعداد البيئة ومعالجة بيانات التصوير) لاستخراج والتحقق من ImAge.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يؤكد متوسط العمر المتزايد وشيخوخة السكان حول العالم على الحاجة الملحة إلى مؤشرات حيوية فعالة للعمر الوظيفي أو البيولوجي 1,2,3. تعد هذه المؤشرات الحيوية ضرورية للتنبؤ بدقة بمخاطر المرض وعمرها، مما يمكن أن يعزز رعاية كبار السن بشكل كبير ويقلل التكاليف المرتبطة به. بينما حققت ساعات مثيلة الحمض النووي (DNAm) تقدما ملحوظا في قياس الشيخوخة البيولوجية 4,5,6، إلا أنها غالبا ما تعتمد على الانحدار الخطي وتتطلب مجموعات كبيرة، مما قد يتجاهل المكونات البيولوجية الدقيقة والمعتمدة على السياق الخاصة بالأفراد 7,8. علاوة على ذلك، تتطلب هذه التقنيات القائمة على التسلسل تحلل الخلية، وتحضير عينات معقدة، وكواشف باهظة الثمن لكل خلية، مما يجعلها أكثر تكلفة وتحديا للدراسات عالية الإنتاجية أو واسعة النطاق أو طولية حيث يكون تدمير العينة عيبا9.

لتجاوز هذه القيود، طورنا تقنية الكروماتين والعمر فوق الجيني المعتمد على التصوير (ImAge)، وهي تقنية جديدة تهدف إلى قياس التقدم في العمر والتجديد بدقة خلية واحدة. تم تطبيق هذه التقنية والتحقق منها في دم الفئران الطرفية وأعضاء صلبة مختلفة كما وصفها ألفاريز-كوجلين وآخرون. تصف هذه المنشورة البروتوكولات المحسنة بالتفصيل بحيث يمكن تكييفها وتبنيها من قبل باحثين آخرين لتطبيقات متنوعة.

يختلف هذا النهج بشكل جوهري عن ساعات DNA التقليدية من خلال التقاط مسارات جوهرية مرتبطة بالعمر بناء على التنظيم المكاني للكروماتين والعلامات اللاجينية داخل نوى واحدة1. تقدم الطرق القائمة على التصوير مزايا واضحة: فهي بطبيعتها غير مدمرة، مما يعني أن الخلايا لا تدمر أثناء المعالجة، على عكس الطرق القائمة على التسلسل. تسمح هذه الطبيعة غير المدمرة بشكل حاسم بالحفاظ على البنية المكانية للكروماتين والعلامات فوق الجينية على مستوى الخلية الواحدة، مع الحفاظ على السياق المكاني للخلايا داخل الأنسجة - وهو منظور غالبا ما يفقد في سير العمل التقليدي للتسلسل التسلسلي. علاوة على ذلك، فإن تقنيات التصوير عادة ما تكون أكثر فعالية من حيث التكلفة للدراسات واسعة النطاق أو الطولية، لأنها لا تتطلب كواشف باهظة الثمن أو تحضيرا مكتبيا معقدا لكل خلية، مما يجعلها مناسبة للملاحظات المتكررة على مدى الزمن10,11.

ميزة رئيسية ل ImAge هي قدرته على كشف المسارات المرتبطة بالعمر كميزات رئيسية جوهرية للبيانات نفسها، دون الحاجة إلى انحدار على العمر الزمني. أظهرت ImAge ارتباطا قويا بالعمر الزمني في خلايا دم الفأر الطرفية، والخلايا أحادية النواة، وأعضاء صلبة مختلفة1. والأهم من ذلك، أن ImAge يلتقط بشكل فعال الاضطرابات المتوقعة للعمر البيولوجي، حيث يظهر زيادة بعد العلاج الكيميائي وانخفاضا مع تقييد السعرات الحرارية وإعادة البرمجة الجزئية بسبب تعبير OSKM العابر في الكبد والعضلات الهيكلية. علاوة على ذلك، لوحظ أن قراءات ImAge ترتبط عكسيا بالنشاط الحركي في فئران متطابقة زمنيا، مما يشير إلى فائدتها في قياس جوانب العمر البيولوجي والوظيفي.

يتطلب تنفيذ منهجية ImAge خبرة في كل من إجراءات التجارب في المختبرات الرطبة12 والتحليلات الحاسوبية1 (الشكل 1)؛ لذلك، توفر هذه الورقة بروتوكولات شاملة خطوة بخطوة لكلا الجانبين. يهدف هذا البروتوكول المحسن إلى تسهيل التبني الواسع لتقنية ImAge، مما يمكن الباحثين من دراسة التغيرات المرتبطة بالعمر في الكروماتين والتنظيم فوق الجيني بدقة خلية واحدة عبر أنواع خلايا وأنسجة مختلفة. في هذا البروتوكول، تم اختيار H3K27ac و H3K27me3، وهما علامتان توفران تباين ودقة كافيين لتحديد ImAge، كعلامات تمثيلية. يمكن للباحثين تكرار هذا البروتوكول لقياس الشيخوخة البيولوجية، وتقييم تأثير تدخلات طول العمر، واستكشاف التغاير الكامن في عمليات الشيخوخة والتجديد على مستوى الكائن الفردي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تجرى جميع التجارب على وفقا للإرشادات والبروتوكولات المعتمدة من لجنة رعاية واستخدام المؤسسية (IACUC) التابعة لمعهد سكريبس للأبحاث (البروتوكول 09-0004-6). تم الحصول على البيانات المقدمة في هذا المخطوطة باستخدام فئران i4F ذكور، تتراوح أعمارهم بين 2 إلى 14 شهرا. تم جمع الأعضاء المهمة (الكبد والعضلة العظمية) من فئران ضابطة عمرها 13.8 شهرا من i4F وفئران من الأبناء الذين عولجوا لمدة أسبوع بجرعة منخفضة من دوكسيسيكلين (0.2 ملغ/مل)14. تم عزل النوى من عينات من صغار (3.2 أشهر)، وأعمارهم (13.8 شهرا)، وكبار السن الذين عولجوا بالدوكسيسيكلين لإفراز عوامل OSKM (OSKM العمر).

1. تصوير العينات

  1. تحضير العينة
    1. اجمع الأعضاء المهمة (الكبد والعضلات الهيكلية) من الفئران التي تم تشريحها حديثا (أو أنواع أخرى ذات اهتمام) وتجميد فوري بالنيتروجين السائل. احتفظ بالعينات عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
    2. انقل الأعضاء والأنسجة إلى هاون مبرد مسبقا وضعه فوق الثلج الجاف. صب النيتروجين السائل فوق الأنسجة المجمدة وطحن باستخدام مدقة مبردة مسبقا. سحق العينة باستخدام الهاون والمدقة المبردين مسبقا حتى يتم الحصول على مسحوق ناعم بشكل متجانس.
    3. يقوم بتقسيم الأنسجة المطحونة باستخدام ملعقة معدنية مبردة مسبقا إلى عدة أنابيب وتخزين عينات غير مستخدمة عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين عينات الأنسجة الأرضية في الأنابيب عند -80 درجة مئوية أو الاستمرار في عزل الأنوى.
    4. استخراج النوى من الأليكوات المجمدة باستخدام مجموعة مخزن تحلل النوى المتوفرة تجاريا حسب تعليمات الشركة المصنعة.
    5. عد النوى باستخدام تريبان بلو. اخلط النوى وتريبان بلو بنسبة متساوية في أنبوب منفصل. نقل 10 ميكرولتر من محلول نوى-تريبان بلو إلى جهاز قياس الدم أو عداد خلية آلي.
    6. تخفف عينات في PBS + 0.5٪ BSA بحيث يمكن طلاء 10,000 نواة في حجم يتراوح بين 20-30 ميكرولتر/بئر.
  2. تحضير الطلاء
    1. أدخل جميع البيانات الوصفية ذات الصلة لتحضير الطلاء والتحليل الحاسوبي في خريطة اللوحة (المرفقة في الملف التكميلي 1). سجل معرفات العينة (مثل الأرقام أو الحروف) في نفس التخطيط الذي تسجل فيه لوحة البئر الفعلية في تبويب sampleID. سجل الظروف التجريبية، بما في ذلك عمر العينة، بنفس ترتيب لوحة البئر الفعلية في تبويب الحالة.
      ملاحظة: سيتم استخدام المعلومات المقدمة في تبويب الحالة لتحديد الفئة العمرية لكل عينة (أي صغيرة أو كبيرة في السن). ستستخدم هذه الفئات العمرية المحددة لاحقا كمراجع لبناء نموذج التنبؤ بالشيخوخة (ImAge). لذلك، يجب أن يحتوي تبويب الحالة على بيانات يمكن ربطها بالعمر، إلى جانب ظروف تجريبية أخرى ذات صلة حسب الحاجة.
    2. سجل العلامات الحيوية المستهدفة (مثل H3K27me3) في نفس التخطيط الذي توجد فيه لوحة البئر الفعلية في تبويب القناة# (# يستبدل برقم). تحقق من أن جميع تركيبات البيانات الوصفية متطابقة ومعكوسة بشكل صحيح في صيغة جدول متتالية واحدة في تبويب خريطة اللوحة.
      ملاحظة: يجب أن يتوافق كل عمود في الجدول مع اسم تبويب معين (مثل "sampleID"). يتم توفير تبويب إضافي يسمى "البيانات الوصفية" لتوثيق أهداف المشروع وتلوين التفاصيل؛ لن تستخدم هذه المعلومات في تحليل البيانات. استخدم هذا التبويب حسب الحاجة.
    3. تصدير لوحة التبويب كصيغة ملف csv مع اسم المشروع القصير والوصفي (مثل project.csv).
      ملاحظة: يوفر تبويب البيانات الوصفية نموذجا لتلخيص أهداف المشروع ومعلومات التثبيت المناعي. استخدام تبويب البيانات الوصفية في قالب خريطة اللوحة اختياري لعملية الطلاء نفسها. ومع ذلك، هناك حاجة إلى تبويبات أخرى، بما في ذلك sampleID، channel# (حيث يستبدل # برقم)، للتحليل الحاسوبي.
  3. لوحة بحجم 10,000 نواة/بئر في حجم 20 - 30 ميكرولتر في صفيحة بئر (مثل ألواح 384 بئر). قم بتدوير اللوح عند 1000 × g (تسارع تسعة، تباطؤ 4) لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  4. ثبت بحجم بنسبة 1:1 من 8٪ بارافورمالديهايد (PFA) في PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    تحذير: نفذ خطوات PFA في غطاء بخاري والتخلص من النفايات وفقا لإجراءات السلامة المؤسسية.
  5. أزل المحلول. أضف 30 ميكرولتر من 0.1 مليون جليسين في PBS لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أزل المحلول. اغسله ب 100 ميكرولتر من PBS مرتين وأضف 30 ميكرولتر من PBS للتخزين.
    ملاحظة: يمكن تخزين الخلايا عند 4 درجات مئوية أو البدء فورا في وضع العلامات المناعية.
  6. تصنيف المناعة
    1. أزل PBS. أضف 30 ميكرولتر من محلول العزل (2٪ BSA و0.5٪ Triton X-100 في PBS) وحضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. أزل محلول الانسداد.
    2. أضف 25 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية: مضاد H3K27ac للفأر (1:250) ومضاد H3K27me3 من الأرنب (1:250) مخفف في محلول حاجز (0.4 - 2 ميكروغرام/مل). حضانه طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    3. إزالة محلول الأجسام المضادة الأولية. اغسله ب 100 ميكرولتر من PBS ثلاث مرات لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. أضف 25 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية: أليكسا 488 حمار مضاد للفأر (1:250) وأليكسا 555 حمار مضاد للأرنب (1:250) مخفف في مخزن حجب (1 - 10 ميكروغرام/مل). الحضانة لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية أو ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
    5. اغسله ب 100 ميكرولتر من PBS ثلاث مرات لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. صبغ ب DAPI/Hoechst بتركيز 30 ميكرولتر بتركيز 0.01 ملغ/مل. اغسل ب 100 ميكرولتر من PBS.
      ملاحظة: ضع الطبق عند 4 درجات مئوية في ورق الألمنيوم أو تابع فورا التصوير. DAPI/Hoechst مطلوبة لخطوة تقسيم الأنوى.
  7. التصوير
    1. خلايا الصور على مصور عالي المحتوى لتحقيق أقصى دقة (لهذه المجموعة تم استخدام 20x، لكن ينصح ب 63x).
      ملاحظة: على الرغم من إمكانية إجراء التصوير باستخدام أي مصور عالي المحتوى، إلا أن هذا البروتوكول يفترض بنية مجلدات مسطحة من الصور المكتسبة وتنسيق صورة عام (مثل .tiff) كمخرج الصورة المكتسبة (الشكل 2).
    2. اجمع عدة حقول في كل بئر وعدة مكدسات z، ويفضل أن تغطي من الأعلى إلى الأسفل لنوى الخلية. تغطي تغطية 10 ميكرومتر مع محور z (مثلا، 20 شريحة z عند خطوة z بحجم 0.5 ميكرومتر) معظم نوى خلايا الفأر. الحجم والتغطية المطلوبة تعتمد على النوع وأنواع الخلايا المعنية. يظهر التصوير التمثيلي في الشكل 3.
    3. نقل بيانات التصوير إلى الحاسوب حيث سيتم إجراء التحليل الحاسوبي، وفقا لهيكل المجلدات المعروض في الشكل 2.
    4. أضف البادئة المشروحة بالقوس المربع لاسم المشروع المعرف في الخطوة 1.2.2 أعلاه إلى مجلد بيانات الصورة (مثل [project]original_folder_name)

2. التحليل الحاسوبي لبيانات التصوير

  1. إعداد متطلبات برمجيات النظام (مطلوب فقط للإعداد الأولي)
    1. قم بتثبيت نظام ويندوز الفرعي للينكس (WSL) إذا كنت تعمل على جهاز ويندوز باتباع التعليمات في https://learn.microsoft.com/en-us/windows/wsl/install. قم بتثبيت أناكوندا أو مينيكوندا باتباع التعليمات في https://www.anaconda.com/docs/getting-started/anaconda/main
  2. إعداد بيئة حسابية (مطلوب فقط للإعداد الأولي)
    1. قم بتنزيل سكريبتات سير العمل من مستودع GitHub https://github.com/terskikh-lab/ImAge_workflow. قم بفك ضغط الملف المحمل.
      ملاحظة: قد يتم تعيين موقع تخزين البيانات بشكل تعسفي؛ ومع ذلك، ينصح باختيار مجلد مختلف عن موقع تخزين ملفات النظام (مثل قرص C على ويندوز).
    2. نظم مستودع ImAge المستنسخ ليطابق هيكل المجلدات المفترض لتنفيذ السكريبت بشكل صحيح (الشكل 2).
    3. افتح تطبيق الطرفية إذا كنت تعمل على لينكس أو ماك أو إس. افتح تطبيق WSL إذا كان يعمل على ويندوز.
    4. غير المجلد إلى ملف المستودع المستنسخ. ومن الآن فصاعدا، يشير مصطلح الأمر: إلى تعليمات لنسخ ولصق الكود التالي في التطبيق الطرفي، تليها الضغط على مفتاح الإنتر .
      الأمر: cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      ملاحظة: استبدل "/PATH_TO_CLONED_REPOSITORY" بإعداد المستخدم الخاص. على سبيل المثال، عندما يتم فك ضغط المستودع في مجلد "التحليل" في محرك D والوصول إليه من WSL، فسيكون هذا "/mnt/d/analysis".
    5. أنشئ بيئة حسابية جديدة باستخدام بايثون الإصدار 3.10 باستخدام conda (تطبيق سطر الأوامر مثبت مع Anaconda/miniconda).
      Command: conda create -n ImAge_workflow python=3.10
    6. فعل البيئة التي تم إنشاؤها حديثا.
      الأمر: كوندا تفعيل ImAge_workflow
    7. تثبيت potry (مدير حزم بايثون) باستخدام مثبت pip (مثبت حزم بايثون مثبت عند إنشاء بيئة ImAge_workflow).
      الأمر: pip install poetry
    8. قم بتثبيت حزم بايثون الأساسية باستخدام الشعر.
      الأمر: تثبيت الشعر
      تحذير: تأكد أن المجلد الحالي هو مجلد ImAge_workflow، ويمكن التحقق منه بتشغيل أمر: PWD.
    9. قم بتكوين CUDA داخل بيئة Conda لتمكين وظيفة وحدة معالجة الرسومات (GPU) في خطوة التقسيم لحسابات أسرع (وهي قابلة للتطبيق فقط على لينكس أو ويندوز مع بطاقة Nvidia).
      الأمر: mkdir -p $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d
      echo 'NVIDIA_PACKAGE_DIR=$(dirname $(python -c "استيراد nvidia; print(nvidia.__file__)"))' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      echo 'for dir in $NVIDIA_PACKAGE_DIR/*; do if [ -d "$dir/lib" ]; ثم تصدير LD_LIBRARY_PATH="$dir/lib:$LD_LIBRARY_PATH"; Fi done' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      ملاحظة: تكتشف السكربتات تلقائيا توفر بطاقة الرسوميات على الخادم. إذا لم تتوفر بطاقات الرسوميات، تشغيلها افتراضيا على المعالج.
  3. قم بإجراء العمليات الحسابية كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: يتكون التحليل الحاسوبي من أربع خطوات: تقسيم الأنوى، استخراج ميزات الصورة، بناء محور التقدم في العمر (ImAge)، والتنبؤ ب ImAge. يتم تنفيذ كل عملية باستخدام سكريبتات بايثون؛ o1_illumination_correction، o2_segmentation، o3_extract_features، o4_ImAge_validation. كل هذه الخطوات مشمولة في سكريبت بايثون واحد، main.py. يمكن تصور قراءات ImAge المستخرجة باستخدام مخطط صندوق وكمان كما هو موضح في الشكل 4. يمكن أيضا استخراج قراءة ImAge بصيغة جدول مباشرة (صيغة ملف .csv القياسية)، حيث يتم تمثيل العينات كصفوف ومقراءات مقابلة وبيانات وصفية كأعمدة. لدى المستخدمين المرونة لإجراء تحليلات رقمية إضافية على قراءات ImAge حسب الحاجة. يمكن الحصول على هذه المخططات وملف CSV باستخدام سكريبت بايثون واحد، visualization.py. تستخدم عملية التنبؤ ب ImAge إشارات تمهيدية تم الحصول عليها من خلايا فردية داخل نفس النسيج. هذه الإشارات القابلة للإقلاع هي إشارات متوسطة مشتقة من أخذ عينات عشوائية وتكرار متكرر. يهدف هذا النهج إلى ضمان أن التحليل يلتقط أكثر القراءات موثوقية وتمثيلا، مع تتناسب عدم اليقين في التحليل مع التغاير الفطري للنسيج.
    1. افتح تطبيق الطرفية إذا كنت تعمل على لينكس أو ماك أو إس. افتح تطبيق WSL إذا كان يعمل على ويندوز.
      الأمر: cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      تحذير: تأكد أن المجلد الحالي هو مجلد ImAge_workflow، ويمكن التحقق منه بتشغيل أمر: PWD.
    2. فعل البيئة.
      الأمر: كوندا تفعيل ImAge_workflow
    3. قم بتكوين معلمات التحليل على ملف سير العمل/main.py في محرر الكود أو النصوص (مثل تطبيق Notepad، Microsoft Visual Studio Code، إلخ).
      1. قم بتعيين اسم المشروع في المتغير p إلى معرف قصير وآمن لنظام الملفات يستخدم لتنظيم المخرجات (مثلا، p = brain_3ages_k27me3).
      2. قم بتعيين قائمة القنوات لاستخراج الميزات في chs. تضمين قناة التقسيم إذا كانت الميزات من تلك القناة مطلوبة للتحليل (chs = ['DAPI', 'H3K27me3', 'H3K27ac']).
      3. قم بتعيين معرفات قنوات الصور من أسماء الملفات إلى أعمدة خريطة اللوحات باستخدام imageIndex. تحديد تنسيق تسمية القناة المستخدم في نظام التصوير لجمع بيانات الصورة واستخدام تلك العلامة كمفتاح. قم بربط كل تسمية برأس العمود الدقيق الحساس للحروف في خريطة اللوحة المحفوظة في الخطوة 1.2.2 (مثلا، imageIndex = {'1': 'Channel1', '2': 'Channel2', '3': 'Channel3'}).
        تحذير: أسماء الأعمدة حساسة للحرف ويجب أن تتوافق مع ملف خريطة اللوحة الخاص بك.
      4. حدد مواقع البيانات: orgDataLoadPath إلى جذر مجموعة البيانات، orgDataSubFolder في المجلد الفرعي للصورة إذا لزم الأمر، وresultsSavePath إلى جذر الإخراج.
      5. أكد امتداد اسم الملف في imageFileFormat وقم بتحرير imageFileRegEx لاستخدام مجموعات التقاط مسماة بلغة بايثون لجميع الأجزاء المطلوبة: الصف، العمود، الحقل، zposition، والقناة. استخدم النحو التالي: (؟ P\d+)، حيث يتم استبدال GROUP بالصف، أو الكول، أو الحقل، أو zposition، أو القناة.
        ملاحظة: قم بتحديث السجل إذا اختلفت أسماء الملفات؛ يجب أن تحل جميع المجموعات المسماة بشكل صحيح. على سبيل المثال، يجب تحويل اسم الملف r01c11f01p01-ch1sk1fk1fl1.tiff إلى التالي: r(؟ P\d+)c(? P\d+)f(? P\d+)p(? P\d+)-ch(? P\d+)sk1fk1fl1\.tiff.
      6. اضبط قناة التقسيم في segmentation_ch إلى القناة النووية المستخدمة لاكتشاف الأجسام (مثلا، segmentation_ch = 'DAPI').
      7. قرر ما إذا كنت ستستخدم تصحيح الإضاءة عن طريق ضبط illumiCorrection. ضبطه على True لحساب وتطبيق نماذج BaSiC؛ ضبطه على False لمعالجة الصور الخام.
        ملاحظة: بالنسبة للألواح التي تحتوي على ≥ 25 بئرا، ينصح بتصحيح الإضاءة لتقليل التحيز المنهجي.
      8. اضبط حجم الفوكسل الفيزيائي بالميكرومتر في voxel_dim ك [z, y, x]. استخدم بيانات المجهر لتحديد التباعد (مثلا، voxel_dim = [1.0، 0.6، 0.6]). حفظ الملف وأغلق المحرر بعد التحقق من كل معلمة
    4. شغل السكربتات للحصول على قراءات ImAge وإجراء التحقق. أثناء تشغيل السكريبت، لا تغلق الطرفية أو تطبيق WSL.
      الأمر: تدفق عمل بايثون/main.py
      ملاحظة: السكربت (main.py) يشمل جميع الخطوات، بما في ذلك التقسيم، واستخراج الميزات، وبناء محور ImAge، والتنبؤ بشكل افتراضي. سيولد السكربت وقت إكمال تقديري لكل خطوة (مثل تقسيم النوى). كل عملية (مثل o1_illumination_correction) تولد ملفات مؤقتة بصيغة .pickle تحتوي على نتائج من كل عملية. ومع ذلك، فإن هذا الهدف هو فقط لنقل البيانات بين العمليات لضمان معالجة موحدة وليس مخصصا للتلاعب بالمستخدم في هذا المقال. ومع ذلك، إذا كان المستخدمون بحاجة إلى التلاعب أو تبني هذه الملفات، راجع الوثائق المضمنة في كل وظيفة بايثون لشكل البيانات وأنواع13.
    5. تصور النتائج وتصدير قراءات ImAge الخام لمزيد من التحليل على البرمجيات الخارجية. الأمر: سير عمل بايثون/visualization.py
      ملاحظة: تنتج هذه الخطوة أشكالا وجداول لقراءات ImAge، والملفات تقع في fig_o4_ImAge_validation_VIOLIN و export_o4_ImAge_validation على التوالي (الشكل 2).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجب أن تكون الصور الممثلة مأهولة بشكل جيد للحصول على خلايا مفردة، ولكن يجب ألا تلامس النوى الفردية بعضها البعض، لأن ذلك سيؤثر على جودة تقسيم نوى الخلايا. يوضح الشكل 3 التصوير التمثيلي للحصول على نتائج تحليلية حسابية قوية.

النتائج الموضحة في مخطوطة هذه الطريقة مقتبسة من مخطوطة ImAge بواسطة ألفاريز-كوغلين وآخرين. نجح ImAge في اكتشاف عكس الشيخوخة من خلال إعادة برمجة جزئية ناجمة عن OSKM في الجسم الحي (...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحضير العينة
لتحضير العينات، قم بجمع الأنسجة ذات الأهمية بسرعة وتجميدها فورا في النيتروجين السائل. عند طحن النسيج بالهاون والمدقة، يمكن استخدام غطاء سيليكون للهاون لمنع فقدان العينة. أضف المزيد من النيتروجين السائل إذا كان من الصعب سحق الأنسجة. بالنسبة للأنسجة الأكثر هشاشة، يمكن أيضا معالجة العينات طازجة (بدلا من مجمدها) لتقليل الاضطرابات الميكانيكية أو تلف الأنسجة. قد تحتاج بروتوكولات عزل النوى إلى تحسين حسب نوع الأنسجة؛ راجع إرشادات الشركة المصنعة. بعد عزل وعد النوى...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر جميع أعضاء مختبر تيرسكيخ الحاليين والسابقين على مساعدتهم في وضع البروتوكولات والإطار الحاسوبي. وقد تم دعم هذا العمل من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة R21 AG068913، R21 AG075483، R21 AG083782، وصندوق أبحاث وابتكار الصحة المستقبلية التابع لوزارة الصحة في غرب أستراليا، BU/PG: 01760/47004300 إلى A.V.T.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مصل البقر ألبومينسيغما-ألدريتش A9647
الأجسام المضادة الثانوية المضادة للفأر IgG (H+L) ذات امتصاص متقاطع عالي، أليكسا 488 إنفيتروجينA-21202
الأجسام المضادة الثانوية شديدة الامتصاص المتقاطع من نوع Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)، أليكسا 555إنفيتروجينA-31572
الجلايسينبيو-راد161-0718
الأجسام المضادة هيستون H3K27ac (mAb) النمط النشط39685
الأجسام المضادة هيستون H3K27me3 (pAb) النمط النشط39155
هوشت 33342إنفيتروجينH3570
طقم عزل الأنوى: Nuclei EZ Prepسيغما-ألدرتشNUC101
مصور أوبريت CLS عالي المحتوىالتجديدhttps://www.revvity.com/au-en/product/operetta-cls-system-hh16000020
بارافورمالديهايد 16٪ محلول مائي درجة كهرومغناطيسيةعلوم المجهر الإلكتروني15710-S
PBSثيرمو فيشرAM9624
الميكروصفيحة الدقيقة بئر 384 من نوع فينوبلايتالتجديد6057302
ترايتون-إكسسيغماT8787
محلول تريبان الأزرق، 0.4٪ Gibco 15250061 

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alvarez-Kuglen, M., et al. ImAge quantitates aging and rejuvenation. Nat Aging. 4, 1308-1327 (2024).
  2. Zampino, M., et al. Biomarkers of aging in real life: three questions on aging and the comprehensive geriatric assessment. GeroScience. 44 (6), 2611-2622 (2022).
  3. Moqri, M., et al. Biomarkers of aging for the identification and evaluation of longevity interventions. Cell. 186 (18), 3758-3775 (2023).
  4. Bell, C. G. DNA methylation aging clocks: challenges and recommendations. Genome Biol. 20 (1), 249(2019).
  5. Horvath, S., Raj, K. DNA methylation-based biomarkers and the epigenetic clock theory of ageing. Nat Rev Genet. 19 (6), 371-384 (2018).
  6. Field, A. E., et al. DNA methylation clocks in aging: Categories, causes, and consequences. Mol Cell. 71 (6), 882-895 (2018).
  7. Galow, A. M., Peleg, S. How to slow down the ticking clock: Age-associated epigenetic alterations and related interventions to extend life span. Cells. 11 (3), 468(2022).
  8. Westneat, D. F., Wright, J., Dingemanse, N. J. The biology hidden inside residual within-individual phenotypic variation. Biol Rev Camb Philos Soc. 90 (3), 729-743 (2015).
  9. Lähnemann, D., et al. Eleven grand challenges in single-cell data science. Genome Biol. 21 (1), 31(2020).
  10. Ninomiya, K. ImAge: quantifying epigenetic ageing with single-cell images. Nat Rev Cancer. 25, 755(2025).
  11. Stepanov, A. I. Genetically encoded epigenetic sensors for visualization of H3K9me3, H3K9ac and H3K4me1 histone modifications in living cells. Biochem Biophys Res Commun. 733, 150715(2024).
  12. Farhy, C., et al. Improving drug discovery using image-based multiparametric analysis of the epigenetic landscape. Elife. 8, e49683(2019).
  13. ImAge_workflow. , https://github.com/terskikh-lab/ImAge_workflow (2025).
  14. Chondronasiou, D., et al. Multi-omic rejuvenation of naturally aged tissues by a single cycle of transient reprogramming. Aging Cell. 21 (3), e13578(2022).
  15. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189 (5), 777-782 (2010).
  16. The Open Microscopy Environment. , bioformats. https://github.com/ome/bioformats (2025).
  17. González-Ramírez, M., et al. Differential contribution to gene expression prediction of histone modifications at enhancers or promoters. PLoS Comput Biol. 17 (9), e1009368(2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة