Method Article

تحليل النوع الفرعي للخلية لبروتيزوم الغشاء العصبي في الخلايا العصبية الحسية الجسدية

DOI:

10.3791/69061

⸱

October 10th, 2025

 ,  , 
1Department of Molecular Pharmacology and Neuroscience, Loyola University Chicago Stritch School of Medicine, 2Center for Translational Research and Education

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تحديد بروتيزوم الغشاء العصبي (NMP) مؤخرا في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الحسية الجسدية كمنظم رئيسي لإدراك اللمس والألم والحكة. تقدم هذه المقالة سير عمل قويا لتحليل تعبير ووظيفة NMP الخاصة بنوع الخلية باستخدام فرز الخلايا ، وتوصيف النسخ ، وتحليلات الفلورسنت المناعي القائمة على الثقافة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتمد إشارات الخلايا العصبية الحسية على البروتيزومات الوظيفية ، ويؤثر توطينها تحت الخلوي على الوظيفة. تم التعرف مؤخرا على مركب بروتيسوم متخصص ، وهو بروتيازوم الغشاء العصبي (NMP) ، في مجموعة سكانية فرعية من الخلايا العصبية الحسية الجسدية المحيطية. يتم تحديد موقع NMP حصريا في غشاء البلازما في سوما والمحاور القريبة والبعيدة. كشف تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) أنه في ظل الظروف العادية ، يتم التعبير عن NMP في الغالب في الخلايا العصبية MrgprA3 + و Cysltr2 + ، والتي تتوسط الإحساس الميكانيكي والحكة والألم. أدى تثبيط NMP الحاد والانتقائي في جلد مخلب الفئران إلى تقليل الحساسية الميكانيكية والألم دون التأثير على الإحساس الحراري. والجدير بالذكر أنه على عكس تثبيط البروتيازوم العالمي ، فإن تثبيط NMP الانتقائي لا يسبب اعتللا عصبيا. تشير الدراسات المختبرية إلى أن NMP يسهل الاتصال من الخلايا العصبية إلى الخلايا العصبية ، ربما من خلال إطلاق ببتيدات الإشارات ، وهو ضروري للاستجابات العصبية الطبيعية للتحفيز. تحدد هذه النتائج NMP كمنظم رئيسي للحديث المتبادل للخلايا العصبية الحسية المطلوبة للمس الطبيعي والألم والإحساس بالحكة. وبالتالي ، يمثل NMP هدفا محتملا لإدارة الألم. تقدم هذه المقالة طرقا لعزل كل من مجموعات الخلايا العصبية التي تعبر عن NMP وغير المعبرة عن NMP باستخدام تغذية الأجسام المضادة وفرز الخلايا المنشطة بالتألن (FACS). هذه المجموعات مناسبة لتنميط التعبير الخاص بنوع الخلية عبر scRNA-seq أو التحليلات القائمة على الثقافة لديناميكيات تعبير NMP. توفر هذه الطرق معا سير عمل قويا للتحقيق في ديناميكيات تعبير NMP ومساهمتها في حالات المرض المرتبطة بالألم.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وظيفة البروتيازوم ضرورية للتطور الأمثل وصيانة الجهاز العصبي المحيطي (PNS) 1،2،3،4،5،6. تظهر الدراسات التي تستخدم مثبطات البروتيازوم في المختبر وفي الجسم الحي أن نشاط البروتيازوم أمر بالغ الأهمية للنمو العصبي ، والتسنين النخاعي ، والاستثارة ، ووظيفة الخلايا الدبقية7،8،9،10. علاوة على ذلك ، يؤدي العلاج الكيميائي القائم على مثبطات البروتيازوم إلى اعتلالات عصبية مؤلمة في 30-60٪ من المرضى ، وغالبا ما تتميز بألم مزمن وإحساس متغير في الأطراف8،9،11،12،13. ومن المثير للاهتمام ، أن إعطاء جرعة منخفضة من هذه المثبطات نفسها يقلل من الحساسية للمنبهات المؤلمة ، مما يشير إلى دور معقد للبروتيازوم في المعالجة الحسية6،14،15. ومع ذلك ، على الرغم من هذه الدراسات المكثفة ، ظلت الوظيفة المحددة للبروتيزومات في الجهاز العصبي المحيطي غير مفهومة جيدا.

البروتيازوم هي آلية تحلل البروتين الأساسية في جميع مجالات الحياة وهي ضرورية للحفاظ على توازن البروتين16. يتكون البروتيازوم الأساسي 20S من أربع حلقات سباعية من وحدات فرعية α و β و β و α ويتوسط تحلل البروتين المستقل عن اليوبيكويتين17،18. يشكل الارتباط بالجسيمات التنظيمية البروتيازوم المغطى ب 26S و 30S ، والذي يتوسط تحلل البروتين المعتمدعلى اليوبيكويتين 4،17. في الخلايا العصبية ، تم تحديد البروتيازوم في جميع المقصورات الخلوية ، ومن المعروف أن توطينها تحت الخلوي يؤثر على الوظيفة19. ومع ذلك ، فإن العديد من مثبطات البروتيازوم شائعة الاستخدام تفتقر إلى الخصوصية لاستهداف مجموعات البروتيازوم الموضعية بشكل انتقائي.

في الواقع ، باستخدام مثبطات البروتيازوم غير المنفذة للغشاء ووضع العلامات على الأجسام المضادة في الخلايا غير المنفذة ، تم العثور على مركب بروتيازوم خاص بالخلايا العصبية لتوطين غشاء البلازما في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الحسيةالجسدية 20. نتج عن تحليل scRNA-seq للخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية الأولية (DRG) ، المفصولة إلى مجموعات NMP + و NMP عبر تغذية الأجسام المضادة ضد وحدة فرعية من البروتيازوم وفرز FACS ، 20 مجموعة خلوية متميزة نسخيا20. كشف مزيد من التحليل أن خلايا NMP + تجمعت في 3 فقط من 20 مجموعة. باستخدام مجموعات علامات الجينات لأنواع فرعية عصبية محددة ، تم تحديد 13 نوعا فرعيا مختلفا من الخلايا العصبية الحسيةالجسدية 20. تتجمع غالبية الخلايا العصبية NMP + مع الخلايا العصبية الحسية MrgprA3 + و Cysltr2 + 20. تم تجميع الحد الأدنى من خلايا NMP + في مجموعة ثالثة ، حيث لم يتم تحديد مجموعات جينات محددة ، وبالتالي تركت هذه المجموعةدون تعيين 20. الخلايا العصبية MrgprA3 + و Cysltr2 + هي مستقبلات الألم من النوع C ، حساسة للحرارة والمحفزات الميكانيكية والحكة ، المقابلة للأنواع الفرعية العصبية CGRP-θ و SST ، على التوالي21،22. من بين 20 مجموعة خلوية تم تحديدها ، عبرت 7 مجموعات NMP عن علامات جينية متوافقة مع الخلايا غير العصبية ، بما في ذلك خلايا شوان ، والخلايا الدبقية الساتلية ، والخلايا المناعية ، كما تركت20 غير مخصصة. كانت مجموعات الخلايا هذه متوقعة ، حيث لا يمكن فصل الخلايا غير العصبية عن الخلايا العصبية أثناء زراعة الخلايا العصبية DRG20.

التحقيق في وظيفتها ، أدى تثبيط NMP في المختبر إلى تغيير استثارة الخلايا العصبية إلى KCl والهيستامين وتحفيز αβ-methyleneadenosine 5'-triphosphate20. في الجسم الحي ، قلل تثبيط NMP من الحساسية للمنبهات الميكانيكية والألم دون أي تأثيرات على الإحساس الحراري20. تكشف هذه النتائج أن NMP هو منظم رئيسي للإحساس الميكانيكي والألم والحكة ، وهدف علاجي محتمل لإدارة الألم20. ومع ذلك ، فإن الآليات المحددة التي تربط نشاط NMP بتطور الألم عبر سياقات المرض المختلفة لا تزال غير مفهومة جيدا. لذلك ، هناك ما يبرر إجراء مزيد من التحقيق في ديناميكيات تعبير NMP ووظيفته في الحالات المرتبطة بالألم والاعتلال العصبي.

هنا ، تصف هذه المقالة سير عمل قوي (الشكل 1) لتحديد وعزل مجموعات الخلايا العصبية NMP + DRG. يتيح هذا النهج التحقيق الخاص بنوع الخلية لديناميكيات تعبير NMP باستخدام فرز FACS ، وتسلسل scRNA، والتلوين المناعي. تتيح هذه الأساليب تحليلا عالي الدقة لتعبير NMP بطريقة خاصة بنوع الخلية ، والتي يمكن استخدامها للتحقيق في دور NMP في الحالات الطبيعية والمختلفة المرتبطة بالألم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الطرق الموصوفة باستخدام التجارب من قبل لجنة رعاية واستخدامها المؤسسية (IACUC) التابعة لكلية الطب بجامعة لويولا في شيكاغو.

1. تحضير محاليل الهضم ووسائط DRG ووسائط FACS

  1. قم بإعداد محلول ملحي كامل (CSS) يحتوي على 137 ملي كلوريد الصوديوم ، و 5.3 ملي كلوريد الصوديوم ، و 1 ملي مولار MgCl2 · 6H2O ، و 25 ملي مولار سوربيتول ، و 10 ملي مولار HEPES ، و 3 ملي مولار CaCl2 · 2H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم وتعقيم المرشح.
  2. قم بإعداد محلول عمل مزيج إنزيم تفكك الأنسجة (الترش المعتدل) عن طريق الجمع بين 190 ميكرولتر من المخزون (5 مجم / مل في H2O) ، و 84 ميكرولتر من 50 ملي EDTA ، و 6.5 مل من CSS. تحضير طازجة وتعقيم بالفلتر قبل الاستخدام.
  3. قم بإعداد مزيج إنزيم تفكك الأنسجة (الترشيح المنخفض) - محلول غراء يحتوي على 190 ميكرولتر من محلول مخزون مزيج الإنزيم ، و 150 ميكرولتر من غراء ، و 84 ميكرولتر من 50 ملي مولار EDTA ، و 6.5 مل من CSS. تحضير طازجة وتعقيم بالفلتر قبل الاستخدام.
  4. قم بإعداد محلول BSA/TI/DMEM عن طريق الجمع بين 7.5 مجم من مثبطات التربسين و7.5 مجم من BSA في 5 مل من وسط DMEM/F12. تحضير طازجة وتصفية التعقيم.
  5. قم بإعداد وسائط الخلايا العصبية DRG عن طريق الجمع بين 10٪ مصل أبقار الجنين (FBS) ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، و 1٪ جلوتامين ، و 2٪ 50x B27 مكمل في 430 مل من DMEM / F12.
  6. قم بإعداد المخزن المؤقت FACS عن طريق الجمع بين 1٪ FBS و 1x PBS و 25 ملي مولار HEPES و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين في الماء المعقيم. تحضير طازجة وتصفية التعقيم.
  7. قبل أربع وعشرين ساعة من بدء البروتوكول ، قم بتغطية أنبوبين من البوليسترين المستدير القاع سعة 5 مل عن طريق ملئهما بمخزن مؤقت FACS ووضعهما عند 4 درجات مئوية.

2. تحضير تعليق الخلايا العصبية DRG أحادي الخلية

  1. احصد جميع DRGs من 4-6 فئران P20-P23 باتباع الطرق الموصوفة سابقا20،23.
  2. انقل DRGs إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وأضف 7 مل من محلول عمل مزيج إنزيم تفكك الأنسجة (التشويش المعتدل). احتضان بتحريك لطيف (عن طريق الدوران) عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  3. قم بتدوير العقد على حرارة 120 × جم لمدة دقيقتين. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات وأعد تعليق العقد في 7 مل من مزيج إنزيم تفكك الأنسجة (التثبيث المنخفض) - محلول عمل غراء احتضان بتحريك لطيف (عن طريق الدوران) عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. تدور لأسفل عند 120 × جم لمدة 2 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق العقد في 500 ميكرولتر من محلول BSA / TI / DMEM.
  5. قم بتشويه العقد 12-16x باستخدام ماصة باستور زجاجية مصقولة بالنار سعة 1 مل.
  6. قم بتصفية الحطام الخلوي عن طريق تمرير الخلايا عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر. اغسل المصفاة ب 1 مل من محلول BSA / TI / DMEM لضمان جمع جميع الخلايا العصبية DRG. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
  7. تدور على حرارة 120 × جم لمدة دقيقتين. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات برفق في 1 مل من وسائط DRG.
    ملاحظة: هذا هو تعليق الخلايا العصبية DRG أحادي الخلية.

3. تغذية الأجسام المضادة لتسمية الخلايا العصبية الإيجابية NMP

  1. قسم تعليق الخلايا العصبية DRG إلى أنبوبين سعة 1.5 مل ، يحتوي كل منهما على 500 ميكرولتر ، وقم بتسمية الأنبوبين: "أساسي" و "غير أساسي".
  2. أضف 20 ميكرولتر من الجسم المضاد للماعز المضاد للبروتيزوم 20S الوحدة الفرعية ألفا 2 (PSMA2) إلى الأنبوب المسمى "الأساسي" (تخفيف 1:25).
    1. اختياري: لاختبار سلامة الغشاء وخصوصية الجسم المضاد PSMA2 ، قم بتضمين عينة إضافية من DRGs الأولية المحتضنة بسلسلة ثقيلة مضادة للخيوط العصبية للدجاج (NF-H) (1: 1،000) متبوعة بمضاد للدجاج (على سبيل المثال ، 488 مترافق) ثانوي (1: 250) (الخطوة 3.10).
      ملاحظة: يجب ألا يؤدي التحكم في وضع العلامات المضادة ل NF-H إلى عدم وضع العلامات الخلوية إذا كان الغشاء العصبي سليما.
  3. احتضان الخلايا تحت تحريض لطيف لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. مرشح دافئ ومعقم 1x PBS أثناء حضانة الأجسام المضادة الأولية.
  5. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 200 × جم لمدة دقيقتين وقم بإزالة 90٪ من المادة الطافية (تخلص منها).
  6. أعد تعليق الخلايا العصبية في 500 ميكرولتر من 1x PBS الدافئ. احتضان الأنابيب بتحريك لطيف لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  7. كرر الخطوات من 3.5 إلى 3.6 ليصبح المجموع ثلاث عمليات غسل.
  8. أثناء تقدم خطوات الغسيل ، قم بإعداد الأجسام المضادة الثانوية عن طريق تخفيف 4 ميكرولتر من IgG المضاد للماعز (فلوروفور 555 نانومتر) في 1,000 ميكرولتر من وسائط DRG الدافئة (تخفيف 1: 250).
  9. بعد الغسيل الثالث ، أعد تعليق كل من الأنابيب "الأولية" و "غير الأولية" في 500 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد الثانوي.
    ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا ، قم بحماية الأنابيب من الضوء عن طريق لفها بورق الألمنيوم.
  10. احتضان الأنابيب بتحريك لطيف لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  11. اغسل الخلايا بتكرار الخطوات 3.5-3.6 ليصبح المجموع ثلاث غسلات.
  12. بعد الغسيل الثالث ، أعد تعليق الخلايا العصبية في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. انقل الخلايا المعلقة لفصل أنابيب البوليسترين المستديرة ذات القاع بسعة 5 مل وضعها على الثلج في دلو ثلج بغطاء للحماية من الضوء.
  13. ضع الأنابيب ذات القاع المستدير المعالجة مسبقا التي تحتوي على مخزن مؤقت FACS من اليوم السابق في دلو الثلج مع الأنابيب التي تحتوي على الخلايا وانتقل إلى خطوة فرز FACS.

4. فصل الخلايا العصبية إيجابية NMP (NMP +) والخلايا العصبية السلبية NMP (NMP-) عبر فرز FACS

  1. مباشرة بعد تغذية الأجسام المضادة ووضع العلامات على الخلايا العصبية DRG ، خذ الخلايا والأنابيب المطلية إلى فارز FACS.
  2. أضف 7-أمينواكتينومايسين D (7-AAD) (1: 1,000) إلى كل من الأنابيب "الأساسية" و "غير الأولية". احتضان لمدة 10-30 دقيقة على الثلج.
    ملاحظة: يستخدم 7-AAD لاستبعاد الخلايا الميتة من عملية الفرز.
  3. قم بإزالة المخزن المؤقت FACS من الأنابيب التي تم تغطيتها طوال الليل واستبدلها ب 1 مل من مخزن FACS الجديد. تعمل هذه الأنابيب كأنابيب تجميع للخلايا العصبية التي تم فرزها.
  4. استخدم الأنبوب المسمى "لا أساسي" لتعيين المعلمات والبوابات للخلايا العصبية غير المسماة.
  5. قم بتطبيق بوابات التشتت الأمامي (FSC) لعزل الخلايا المتوافقة مع حجم الخلايا العصبية الحسية. تتراوح أقطار الخلايا العصبية الحسية من 10 إلى 50 ميكرومتر.
  6. قم بتطبيق بوابة التشتت الجانبي (SSC) لاستبعاد الخلايا الميتة والحطام (تشتت الجانب السفلي) ولعزل الأحداث المتوافقة مع حبيبات الخلايا العصبية DRG (تشتت جانبي أكبر).
  7. قم بتحميل الأنبوب "الأساسي" وقم بتعيين معلمات البوابات كما هو محدد مع عينة "لا أولية" للكشف عن مجموعات الخلايا العصبية غير المسماة (NMP-) و 555 إيجابية (NMP +).
  8. باستخدام فوهة 100 ميكرومتر وضغط فرز من 15-20 رطل لكل بوصة مربعة ، قم بفرز الخلايا العصبية إلى 555+ و 555-.
  9. انتقل إلى التحليل النهائي للخلايا العصبية التي تم فرزها.

5. تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية للخلايا العصبية NMP + و NMP

  1. انقل الخلايا المصنفة إلى أنابيب سعة 1.5 مل وضعها على الثلج. انقل الخلايا إلى نواة تسلسل أحادية الخلية.
  2. قم بإجراء تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية على الخلايا العصبية المصنفة NMP + و NMP على عمق 30,000 إلى 100,000 قراءة لكل خلية.
  3. قم بتحليل بيانات scRNA-seq باستخدام العديد من البرامج المتاحة مجانا لإنشاء مجموعات الخلايا وفقا لملفات تعريف التعبير الجيني المحددة. لمزيد من التفاصيل حول خطوات التحليل والبرامج المستخدمة سابقا ، راجع Villalón Landeros et al.20.
  4. قم ببناء قائمة بعلامات الجينات المحددة لتحديد مجموعات الخلايا العصبية الفردية باستخدام قواعد البيانات المتاحة مثل https://painseq.shinyapps.io/harmonized_painseq_v2/ أو https://kleintools.hms.harvard.edu/tools/springViewer_1_6_dev.html?datasets/Sharma2019/all
  5. استخدم قائمة علامات الجينات المحددة لتحديد مجموعات الخلايا الناتجة.
    ملاحظة: تم إجراء تحليل تسلسل scRNA-seq الذي تم إجراؤه سابقا من قبل شركة استشارية مستقلة (www.cmcherryconsulting.com).

6. الثقافات الأولية للخلايا العصبية المخصبة NMP + و NMP

  1. في اليوم السابق للتجربة ، ضع أغطية مستديرة مقاس 12 مم في صفيحة زراعة 24 بئرا (غطاء / بئر) واغسلها بنسبة 70٪ إيثانول لمدة 15 دقيقة. ثم اشطفها بالماء المعقم 3x وجففها في الهواء في غطاء معقم لزراعة الأنسجة.
  2. بمجرد أن تجف الأغطية ، قم بتغطيتها ب 0.1 مجم / مل من بولي إل ليسين هيدروبروميد (PLL) وضعها عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  3. في يوم التجربة ، قم بإزالة PLL ، وشطف الأغطية بالماء المعقم 3x ، واتركها تجف في غطاء زراعة الأنسجة.
    ملاحظة: يمكن حفظ PLL وإعادة استخدامه.
  4. قم بتخفيف 10 ميكرولتر من 1 مجم / مل لامينين في 125 ميكرولتر من وسائط DRG وبقعة 20-30 ميكرولتر في وسط كل غطاء.
  5. قم بتغطية الأغطية باللامينين لمدة 40 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
  6. انقل الخلايا المصنفة بنظام FACS إلى أنبوب سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق لجمع الخلايا. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا العصبية في 50 ميكرولتر من وسائط DRG الدافئة.
  7. استنشق اللامينين من الغطاء واترك الغطاء حتى يجف.
  8. بذرة 15-20 ميكرولتر من الخلايا العصبية المعلقة على كل غطاء زلاة. انقل اللوحة بعناية مع الأغطية المصنفة إلى حاضنة زراعة الأنسجة واحتضنها لمدة 30 دقيقة على الأقل (لا تزيد عن 1 ساعة) للسماح للخلايا بالالتصاق.
  9. انقل اللوحة مرة أخرى إلى غطاء زراعة الأنسجة وأضف 1 مل من وسائط DRG الدافئة المعقمة إلى كل بئر تحتوي على خلايا على الأغطية.
    ملاحظة: اخفض طرف الماصة إلى الزاوية السفلية من البئر ووزعها ببطء لتجنب لمس الغطاء وتعطيل الخلايا. يمكن أن تؤدي إضافة الوسائط بسرعة كبيرة إلى حدوث اضطراب وإزاحة الخلايا.
  10. حافظ على الثقافات عند 37 درجة مئوية مع رطوبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2/95٪ مع تغيير الوسائط بنسبة 75٪ كل 2-3 أيام.

7. تحليل تعبير NMP الخاص بنوع الخلية

  1. قم بإعداد صفيحة ثقافة مقاس 140 مم أو صينية تلطيخ مضان مناعي عن طريق تبطينها بقطعة كبيرة من البارافيلم.
  2. باستخدام ملقط معقم 5/45 ، انقل الأغطية من طبق زراعة الأنسجة إلى البارافيلم الموجود على صينية التلوين ، مما يضمن أن الجانب الذي يحتوي على الخلايا العصبية DRG متجها لأعلى.
  3. أضف 100 ميكرولتر من وسائط DRG إلى كل غطاء على البارافيلم لمنع الخلايا من الجفاف.
    ملاحظة: أضف السوائل عن طريق سحب العينة ببطء فوق حافة الغطاء.
  4. قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي للماعز المضاد ل PSMA2 في وسائط DRG الدافئة عند تخفيف 1:20.
  5. باستخدام شفاط مزود بطرف P10 غير مفلتر ، قم بإزالة الوسائط من الغطاء ببطء عن طريق الشفط من الحافة. أضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة للماعز المضاد ل PSMA2 إلى الأغطية واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة.
  6. استنشق بعناية محلول الأجسام المضادة الأساسي من الأغطية. أضف 100 ميكرولتر من PBS (في درجة حرارة الغرفة) واحتضنه لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة لغسلها.
  7. استنشق PBS من الغطاء وكرر إضافة PBS وشفطه لما مجموعه ثلاث غسلات.
  8. قم بإعداد الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماعز (على سبيل المثال ، 555 مقترنة) في وسائط DRG الدافئة عند تخفيف 1: 250.
  9. بعد الغسيل الثالث ، أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف إلى الغطاء واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة.
    ملاحظة: من هذه الخطوة إلى الأمام ، قم بحماية الخلايا من الضوء.
  10. استنشق محلول الجسم المضاد الثانوي من الغطاء واغسل 3 مرات كما هو موضح في الخطوات 7.6-7.7.
  11. قم بإزالة آخر غسول PBS وقم بتثبيت الخلايا بإضافة 100 ميكرولتر من محلول التثبيت الذي يحتوي على 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) ، 4٪ سكروز في 1x PBS. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  12. شفط المثبت وغسل 3x عن طريق تكرار الخطوات 7.6-7.7.
  13. قم باختراق الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من المنظفات غير الأيونية بنسبة 0.1٪ (على سبيل المثال ، Triton X-100) في 1x PBS واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  14. استنشاق محلول نفاذية وغسل 3x عن طريق تكرار الخطوات 7.6-7.7.
  15. أضف 100 ميكرولتر من محلول الانسداد الذي يتكون من 5٪ FBS و 5٪ مصل الحمير في 1x PBS واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة.
  16. قم بإعداد مزيج الأجسام المضادة الأولية الخاصة بنوع الخلايا العصبية DRG وفقا للتخفيفات التالية في محلول الحظر: الببتيد المرتبط بالجين المضاد للكالسيتونين (CGRP) (1: 500) ؛ إيزوليكتين B4 ، اقتران البيوتين (IB4) (1:50) ؛ دجاج مضاد NF-H (1: 1000).
    ملاحظة: لا تتداخل هذه الأجسام المضادة مع بعضها البعض ويمكن إضافتها معا في نفس المحلول.
  17. قم بإزالة محلول الانسداد وأضف مزيج الأجسام المضادة الأساسي إلى الغطاء. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.
  18. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة واغسله 3 مرات بتكرار الخطوات 7.6-7.7.
  19. قم بإعداد محلول مزيج الأجسام المضادة الثانوي عن طريق تخفيف الستربتافيدين (على سبيل المثال ، 647 مترافقا) ، والحمار المضاد للأرانب (على سبيل المثال ، 488 مترافقا) ، والحمار المضاد للدجاج (على سبيل المثال ، 405 مترافقا) إلى 1: 500 لكل منهما.
  20. قم بإزالة آخر غسول PBS وأضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية إلى الأغطية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.
  21. اغسل 3 مرات بتكرار الخطوات 7.6-7.7.
  22. اختياري: تحضير صبغة نووية عند 1-10 ميكروغرام / مل. أضف 100 ميكرولتر من محلول البقع النووي ، واحتضنه لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة ، واغسله 2x بالماء منزوع الأيونات (diH2O) عن طريق تكرار الخطوات 7.6-7.7.
  23. اسحب آخر غسيل من الغطاء وباستخدام ملقط رفيع ، ارفع الغطاء من البارافيلم. امسح السوائل الزائدة عن طريق لمس حافة الغطاء برفق إلى منديل خال من النسالة.
  24. ضع قطرة 7 ميكرولتر من وسط التثبيت على شريحة مجهر. ضع الغطاء برفق فوق قطرة الوسط المتصاعدة ، مع التأكد من أن الخلايا متجهة لأسفل وتلامس الوسط.
  25. ضع شرائح المجهر مع الأغطية في درج أو صندوق مظلم وجاف لمدة ساعة واحدة على الأقل حتى تجف وتغلق حافة الغطاء. انتهي من إغلاق حافة الأغطية باستخدام طلاء أظافر سريع الجفاف وانتظر 10-15 دقيقة قبل التصوير.
  26. صور الشرائح باستخدام مجهر متحد البؤر الفلوري أو القرص الدوار المجهز بمرشحات الضوء المناسبة لتصور التألق الأزرق والأخضر والأحمر والأحمر البعيد.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتمد القدرة على التمييز بين NMP والبروتيزومات داخل الخلايا على مناهج وضع العلامات غير المنفذة للغشاء. تسمح تغذية الأجسام المضادة باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالوحدة الفرعية للبروتيازوم على الخلايا العصبية الحية لتسمية البروتيازوم التي لا يمكن الوصول إليها إلا من خارج الخلية. نظرا لحجمها ومحبة للماء ، فإن الأجسام المضادة غير قادرة على عبور أغشية الخلايا السليمة24. تحافظ الخلايا العصبية الحية على سلامة الغشاء ، مما يمنع الأجسام المضادة من دخول الخلية. باستخدام ه...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتيزومات ضرورية في جميع الخلايا ويمكن العثور عليها في جميع المقصورات في جميع أنحاء الخلية19. أدى الاكتشاف الأخير لمركب البروتيازوم المتخصص ، NMP ، في الخلايا العصبية للجهاز العصبيالمركزي 25،26،27و20 المحيطي إلى تغيير فهمنا الحالي لوظيفة البروتيازوم. أظهر العمل السابق أن NMP يعمل كبروتيسوم إشارة يتوسط الحديث المتبادل بين الخلايا العصبية الحسية ل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم E.V.L من قبل صناديق بدء التشغيل من كلية الطب بجامعة لويولا شيكاغو ستريتش. نود أن نشكر روبرت لاد على نصائحه ومساعدته في FACS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
محلول عازل HEPES سعة 1 متر، درجة حموضة 7.3الجودة البيولوجية118-089-721مخزن مؤقت FACS
10x PBSثيرمو فيشر العلمي70011-044مخزن مؤقت FACS
محلول مخزون بارافورمالديهايد 16٪ (PFA) ؛ درجة EMEMS15710حل مثبت
1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)فيشر العلمية10-010-023يغسل FACS
أنبوب بوليسترين دائري القاع سعة 5 ملفيشر العلمية14-959-6أنابيب FACS
7-أمينواكتينومايسين د (7-AAD)إنفيتروجينأ 1310تسميات الخلايا الميتة
ملحق B27ثيرمو فيشر العلمي17504044وسط الثقافة
ألبومين مصل الأبقارميليبورسيجماA9647 ؛ سجل المستخلصات الكيميائية: 9048-46-8BSA / TI / DMEM
ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم (CaCl ؟-2H؟ O)ميليبورسيجماطراز C7902محلول ملحي كامل
سلسلة ثقيلة مضادة للخيوط العصبية للدجاج (NF-H)ميليبورسيجماأب 5539جسم
DMEM / F12 1: 1ثيرمو فيشر العلمي11320033وسط الثقافة BSA / TI / DMEM
حمار مضاد للماعز IgG (H + L) Alexa Fluor Plus 555ثيرمو فيشر العلميأ 32816جسم
حمار مضاد للأرانب IgG (H + L) Alexa Fluor Plus 488ثيرمو فيشر العلميأ 32790جسم
DyLight 405 حمار مضاد للدجاججاكسون إيمونوبيرسيرش703-475-155جسم
إيدتاميليبورسيجما[إ5134] ؛ سجل المستخلصات الكيميائية: 6381-92-6حلول عمل Liberase TM / Liberase TL-papain
مصل الأبقار الجنينية (FBS)ميليبورسيجماأ 9647وسط الثقافة / محلول المخزن المؤقت / حظر FACS
ماصة باستور زجاجية ، 9 بوصةفيشر العلمية1367820 دالمعايرة بالتحليل الحجمي
الماعز المضادة ل PSMA2صنع في المنزلNAجسم
مسحوق HEPESميليبورسيجماإتش4034محلول ملحي كامل
هوشستثيرمو فيشر العلميهاتف H21492وصمة عار نووية
مصل الحصانثيرمو فيشر العلمي26050070حل الحظر
IB4 ، البيوتين المقترنميليبورسيجماL2140جسم
لامينينسيجما ألدريتشL2020-1MGطبق ثقافة
ل-الجلوتامينثيرمو فيشر العلمي25030081وسط الثقافة
انخفاض التبشير الليبراز (TL)ميليبورسيجما54010200001حل مخزون Liberase TL
Liberase trituration معتدل (TM)ميليبورسيجما5401119001حل الأسهم Liberase TM
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم (MgCl؟ -6H؟ O)ميليبورسيجمام 2393محلول ملحي كامل
وسائط التركيبساوثرن بيوتك0100-01فلوروماونت-جي
غراءورثينجتونالقط #: 9001-73-4حل عمل Liberase TL-papain
البنسلين / الستربتومايسينميليبورسيجما15140122وسط الاستزراع / FACS المخزن المؤقت
هيدروبروميد بولي إل يسينميليبورسيجماص 4707طبق ثقافة
كلوريد البوتاسيوم (KCl)ميليبورسيجماص 5405محلول ملحي كامل
أرنب مضاد ل CGRPImmunostar24112جسم
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)ميليبورسيجماS9888; سجل المستخلصات الكيميائية: 7647-14-5محلول ملحي كامل
السوربيتولميليبورسيجما56755-ممحلول ملحي كامل
ستريبتافيدين أليكسا فلور 647 مترافقثيرمو فيشر العلميطراز S21374جسم
سكروزسيجما ألدريتشS0389-500Gحل مثبت
مثبطات التربسينميليبورسيجماT9253 ؛ سجل المستخلصات الكيميائية: 9035-91-8BSA / TI / DMEM

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cartelli, D., Cavaletti, G., Lauria, G., Meregalli, C. Ubiquitin proteasome system and microtubules are master regulators of central and peripheral nervous system axon degeneration. Cells. 11 (8), 1358(2022).
  2. Fortun, J., et al. Impaired proteasome activity and accumulation of ubiquitinated substrates in a hereditary neuropathy model. J Neurochem. 92 (6), 1531-1541 (2005).
  3. Thibaudeau, T. A., Smith, D. M. A practical review of proteasome pharmacology. Pharmacol Rev. 71 (2), 170-197 (2019).
  4. Türker, F., Cook, E. K., Margolis, S. S. The proteasome and its role in the nervous system. Cell Chem Biol. 28 (7), 903-917 (2021).
  5. VerPlank, J. J. S., Lokireddy, S., Feltri, M. L., Goldberg, A. L., Wrabetz, L. Impairment of protein degradation and proteasome function in hereditary neuropathies. Glia. 66 (2), 379-395 (2018).
  6. Moss, A., et al. A role of the ubiquitin-proteasome system in neuropathic pain. J Neurosci. 22 (4), 1363-1372 (2002).
  7. Meregalli, C., et al. Bortezomib-induced painful neuropathy in rats: a behavioral, neurophysiological and pathological study. Eur J Pain. 14 (4), 343-350 (2010).
  8. Meregalli, C. An overview of bortezomib-induced neurotoxicity. Toxics. 3 (3), 294-303 (2015).
  9. Velasco, R., Alberti, P., Bruna, J., Psimaras, D., Argyriou, A. A. Bortezomib and other proteosome inhibitors-induced peripheral neurotoxicity: from pathogenesis to treatment. J Peripher Nerv Syst. 24 (Suppl 2), S52-S62 (2019).
  10. Cavaletti, G., et al. Bortezomib-induced peripheral neurotoxicity: a neurophysiological and pathological study in the rat. Exp Neurol. 204 (1), 317-325 (2007).
  11. Cata, J. P., et al. Quantitative sensory findings in patients with bortezomib-induced pain. J Pain. 8 (4), 296-306 (2007).
  12. Meng, L., et al. Peripheral neuropathy during concomitant administration of proteasome inhibitors and factor Xa inhibitors: identifying the likelihood of drug-drug interactions. Front Pharmacol. 13, 757415(2022).
  13. Mina, S. A., et al. Post-marketing analysis of peripheral neuropathy burden with new-generation proteasome inhibitors using the FDA adverse event reporting system. Turk J Hematol. 38 (3), 218-221 (2021).
  14. Holzer, A. -K., Suciu, I., Karreman, C., Goj, T., Leist, M. Specific attenuation of purinergic signaling during bortezomib-induced peripheral neuropathy in vitro. Int J Mol Sci. 23 (7), 3734(2022).
  15. Meng, L., et al. a potent and selective proteasome inhibitor, exhibits in vivo antiinflammatory activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (18), 10403-10408 (1999).
  16. Maupin-Furlow, J. Proteasomes and protein conjugation across domains of life. Nat Rev Microbiol. 10 (2), 73-82 (2012).
  17. Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu Rev Biochem. 65 (1), 801-847 (1996).
  18. Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 Å resolution. Nature. 386 (6624), 463-471 (1997).
  19. Pines, J., Lindon, C. Proteolysis: anytime, any place, anywhere. Nat Cell Biol. 7 (8), 731-735 (2005).
  20. Landeros, E. V., et al. The nociceptive activity of peripheral sensory neurons is modulated by the neuronal membrane proteasome. Cell Rep. 43 (4), 114058(2024).
  21. Qi, L., et al. A mouse DRG genetic toolkit reveals morphological and physiological diversity of somatosensory neuron subtypes. Cell. 187 (6), 1508-1526.e16 (2024).
  22. Sharif, B., Ase, A. R., Ribeiro-da-Silva, A., Séguéla, P. Differential coding of itch and pain by a subpopulation of primary afferent neurons. Neuron. 106 (6), 940-951.e4 (2020).
  23. Krueger, E. R., Church, T. R., Brennan, A., Türker, F., Landeros, E. V. Protocol to study neuronal membrane proteasome function in mouse peripheral sensory neurons. STAR Protoc. 6 (1), 103552(2025).
  24. Chiu, M. L., Goulet, D. R., Teplyakov, A., Gilliland, G. L. Antibody structure and function: the basis for engineering therapeutics. Antibodies. 8 (4), 55(2019).
  25. Ramachandran, K. V., et al. Activity-dependent degradation of the nascentome by the neuronal membrane proteasome. Mol Cell. 71 (1), 169-177.e6 (2018).
  26. He, H. -Y., et al. Neuronal membrane proteasomes regulate neuronal circuit activity in vivo and are required for learning-induced behavioral plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (3), e2216537120(2023).
  27. Paradise, V., et al. ApoE isoforms differentially regulate neuronal membrane proteasomes to shift the threshold for pathological aggregation of endogenous tau. bioRxiv. , (2022).
  28. Banker, G., Goslin, K. Culturing nerve cells. , 2nd edn, MIT Press. (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Neuronal Membrane ProteasomeSomatosensory NeuronsSensory Neuron SignalingDorsal Root GangliaAntibody FeedingFlow CytometryCell Type SpecificitySingle Cell RNA SequencingProteasome InhibitionPain Sensation

Related Articles