مقالة منهجية

نمذجة خلل التنسج وإصلاح السنخية الرئوية الوظيفية بعد الإصابة بالإنفلونزا

898 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69062

⸱

سبتمبر 19, 2025

 ,  ,  , 
1Cancer and Developmental Biology Laboratory, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

في هذه المقالة

ملخص

يوفر هذا البروتوكول تعليمات للإعطاء داخل الأنف ل IAV والتحليل النهائي لتلف رئة الفأر والتغيرات النسخية المرتبطة به لأنواع خلايا الرئة.

الملخص

تسبب العدوى الفيروسية أضرارا حادة وطويلة الأمد للحويصلات الهوائية الرئوية ، وهي بنية الأنسجة المتخصصة المسؤولة عن تبادل الغازات بين نظام القلب والأوعية الدموية والبيئة الخارجية. تمثل عدوى فيروس الأنفلونزا A (IAV) في الفئران نموذجا متعديا لاستجابة الرئة البشرية للعدوى الفيروسية وتحفز تغيرات عابرة ومستمرة في حالة الخلية في الحويصلات الهوائية. في بعض الحالات ، قد تؤدي حالات الخلايا الشاذة الناجمة عن الإصابة الفيروسية التي لا يتم حلها بمرور الوقت إلى إضعاف وظيفة تبادل الغازات الحرجة للرئة بشكل دائم. توضح هذه المقالة طرق العدوى داخل الأنف للفئران المصابة ب A / PR / 8/34 IAV وتوصيف التغيرات العابرة وطويلة الأمد في التركيب الخلوي وبنية الأنسجة للرئتين التالفة. يتيح هذا النموذج إجراء تحقيق مفصل في الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء إصلاح الرئة والخلل الوظيفي المزمن. يوفر هذا النهج أيضا منصة لتقييم التدخلات العلاجية التي تهدف إلى تعزيز التجديد الفعال للرئة واستعادة وظيفة الجهاز التنفسي بعد الإصابة الفيروسية.

المقدمة

تلعب الرئتان دورا مهما في تزويد الأنسجة المحلية بالأكسجين والمواد المغذية. تعتبر الخلايا البطانية (ECs) التي تملأ الأوعية الدموية الشعرية الصغيرة في الرئتين ضرورية للأداء السليم لأنسجة الرئة ، والحفاظ على سلامة الأوعية الدموية وتبادل الغازات الفعال1. تشكل ECs مكانة الأوعية الدموية وتتحدث بشكل متبادل مع الخلايا الأخرى مثل الخلايا الظهارية والخلايا المناعية والخلايا الوسيطة. هذا يساهم في تنظيم نمو الرئة وإصلاح الأنسجة استجابة للإصابة أو المرض2.

تعد عدوى فيروس الأنفلونزا H1N1 مشكلة عالمية3. غالبا ما يتم تشخيص المرضى المصابين بعدوى H1N1 بالتلف السنخي المنتشر النضحي (DAD)4. يمكن أن تؤدي العدوى بفيروس H1N1 إلى تلف خطير في الرئة وعواقب وخيمة، بما في ذلك الالتهاب الرئوي وإصابة الرئة الحادة الوخيمة ومتلازمة الضائقة التنفسية الحادة5. ينشأ الضرر بشكل أساسي من إصابة الفيروس بالخلايا الظهارية للرئة ، مما يؤدي إلى استجابة مناعية مفرطة تؤدي إلى التهاب وتلف الأنسجة وتراكم السوائل في الرئتين. وبالتالي ، فإن الخلايا الظهارية المبطنة للممرات الهوائية والحويصلات الهوائية ، المسؤولة عن تبادل الغازات ، تتضرر بشكل مباشر من فيروس H1N1 ، مما يؤدي إلى تعطيل البنية الطبيعية للرئة6،7. لقد أصبح من الواضح أن أنواع الخلايا الأخرى ، على الرغم من عدم إصابتها مباشرة ب IAV ، يمكن أن تتضرر استجابة للعدوى8،9. لذلك ، يؤثر تلف الأنسجة بعد الإصابة بالإنفلونزا على جميع المقصورات الخلوية في الرئة ، وقد ثبت مؤخرا أن عدوى IAV تسبب تغيرات عابرة ومستمرة في حالة الخلية في مقصورات خلوية متعددة9. يمكن أن تكون مرونة الخلية هذه استجابة للمرض مفيدة أو ضارة لإصلاح الأنسجة بنجاح وتستدعي مزيدا من الدراسة.

النموذج التجريبي الأكثر اعتمادا لدراسة الأنفلونزا والتسبب فيها هو العدوى داخل الأنف للفئران بفيروس الأنفلونزا A / PR / 8/3410. إنها تقنية مهمة تسمح بدراسة شدة المرض والوفيات والعدوى الفيروسية. تحاكي العدوى داخل الأنف للفئران طريق العدوى الطبيعي لدى البشر وتسمح بدراسة كل من الاستجابات المناعية التكيفية والفطرية ضد الفيروس. في عام 1934 ، تم عزل سلالة معينة من فيروس الأنفلونزا A "A / PR / 8/34" من مريض في بورتوريكو11. هذه السلالة من فيروس الأنفلونزا أصبحت الآن متكيفة مع الفئران ولم تعد تصيب البشر بشكل منتج. بسبب أوجه التشابه في جهاز المناعة بين الفئران والإنسان ، فإن الفئران هي النموذج الحيواني الأكثر شيوعا لأبحاث IAV12. في هذه الطريقة ، يتم إعطاء سلالة A / PR / 8/34 H1N1 مباشرة للفئران من خلال الخياشيم ، مما يحاكي عدوى طبيعية13. إنها طريقة سهلة وفعالة من حيث التكلفة ومريحة لدراسة آثار العدوى الفيروسية على أنسجة الرئة المضيفة في ظروف النوع البري (WT) وكذلك الضربة القاضية (KO). التقنيات البديلة لها مزايا وعيوب مقارنة بالنموذج داخل الأنف. يسمح التلقيح داخل القصبة الهوائية (IT) بإيصال الفيروس بدقة إلى الرئتين ، لكن هذه التقنية لا تحاكي تماما العدوى عن طريق الاستنشاق ولا توفر معلومات عن السمية في الجهاز التنفسي العلوي. يتطلب تلقيح تكنولوجيا المعلومات أيضا مهارة كبيرة لتقليل مخاطر إصابة القصبة الهوائية13،14. يحاكي تلقيح استنشاق الهباء الجوي (AR) الطريق الطبيعي للعدوى ويخلق أمراضا رئوية أكثر اتساقا مقارنة بالعدوى داخل الأنف ، ولكن قد يكون من الصعب الحفاظ على تركيز موحد للفيروس في الهباء الجوي وتحقيق توصيل دقيق للهباء الجوي الفيروسي. السلامة هي أيضا مصدر قلق مهم لطريقة التلقيح AR10. لذلك ، فإن تقنية التلقيح داخل الأنف لإعطاء IAV هي نهج حاسم للبحث الذي يركز على الرئة حول الآثار النهائية للعدوى الفيروسية في إصابة الأنسجة وإصلاحها. على عكس النماذج الكيميائية أو الميكانيكية ، فإنه يوفر طريقة أكثر واقعية وأقل توغلا لدراسة تلف الرئة الناجم عن الأنفلونزا والتفاعلات بين المضيف والممرض.

هنا ، نضع طريقة قابلة للتكرار للعدوى داخل الأنف للفئران بفيروس الأنفلونزا A (A / PR / 8/34) ولتوصيف كل من التغيرات الخلوية والهيكلية قصيرة وطويلة المدى في الحويصلات الهوائية الرئوية الناتجة عن الإصابة الفيروسية. يمكن أن تساعد الدراسات التي تستخدم هذه الطريقة في اكتشاف آليات تلف أنسجة الرئة وإصلاحها لتحديد الأهداف العلاجية الجديدة لأمراض الرئة.

البروتوكول

يعتبر العمل مع فيروس الأنفلونزا A في نموذج حيواني مستوى السلامة البيولوجية 2 (BSL2) ومستوى السلامة الحيوية للحيوان 2 (ABSL2). تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية المستخدمة لتوليد هذه البيانات من قبل لجنة رعاية واستخدامه التابعة لمركز أبحاث السرطان ، المعهد الوطني للسرطان ، المعاهد الوطنية للصحة (البروتوكول # 24-452). تمت الموافقة على هذا البروتوكول أيضا من قبل لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية التابعة لمركز أبحاث السرطان ، والمعهد الوطني للسرطان ، والمعاهد الوطنية للصحة. قبل البدء في هذا البروتوكول ، يوصى بأن يسعى المستخدمون للحصول على موافقة من لجنة رعاية واستخدامها المؤسسية ولجنة السلامة البيولوجية المؤسسية.

1. إعداد مخزون العمل

ملاحظة: يجب إجراء جميع الأعمال مع فيروس الأنفلونزا على الجليد في خزانة السلامة البيولوجية. أخرج الأطراف وأي شيء آخر يلامس الفيروس في وعاء يحتوي على مبيض بنسبة 10٪. يجب رش دلاء الثلج والماصات وصناديق الأطراف بمحلول مبيض بنسبة 10٪ بدلا من غمرها احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل. تخلص من النفايات الصلبة في حاوية نفايات بيولوجية وتخلص من النفايات السائلة في الحوض ، واشطفها بالماء.

  1. قم بإذابة المخزون المجمد (0.5 مل) من الفيروسات على الجليد في خزانة السلامة الحيوية.
  2. قم بإعداد حاوية نفايات تحتوي على 10٪ مبيض في ماء الصنبور. ضع صندوقي تجميد من البلاستيك أو الورق المقوى يمكنهما استيعاب ما يصل إلى 100 أنبوب عينة في فريزر -80 درجة مئوية للتبريد المسبق.
  3. قم بتسمية 160 أنبوبا سعة 1.5 مل مسبقا لحصص الفيروس. يفضل استخدام الأنابيب ذات الغطاء اللولبي على الأنابيب ذات الغطاء القابل للطي لتجنب تكوين الهباء الجوي عند فتح أنابيب المخزون الفيروسي للاستخدام. ضع الأنابيب على الجليد لتبريدها مسبقا قبل عمل حصص الفيروس.
  4. اصنع 3 ميكرولتر من الفيروس باستخدام ماصة وأطراف P20 معايرة، ووضع الفيروس فقط في أنابيب مبردة مسبقا واحتفظ بحصص الكمية على الجليد في جميع الأوقات.
  5. بعد عمل الحصص ، قم بتخزينها في صندوق تجميد مبرد مسبقا مكتوب عليه "A / PR / 8/34 Influenza Virus (IAV)" ، ورقم الكتالوج ، ورقم الدفعة ، وتاريخ انتهاء الصلاحية.
    ملاحظة: الكثير من الفيروسات لها عدوى مختلفة ولا ينبغي خلطها.
  6. ضع الصندوق في فريزر -80 درجة مئوية. تأكد من الحفاظ على كل شيء باردا قدر الإمكان ، حيث سينخفض العيار الفيروسي مع كل دورة تجميد / ذوبان.

2. تخفيف الكميات من الفيروس لاستخدامها في تجارب العدوى داخل الأنف

  1. قم بإذابة 3 ميكرولتر من المخزون الفيروسي على الجليد في خزانة السلامة الحيوية.
  2. قم بعمل تخفيف 1:100 (التخفيف A) عن طريق نقل 2 ميكرولتر من 3 ميكرولتر إلى أنبوب مبرد مسبقا 1.5 مل يحتوي على 198 ميكرولتر من D-PBS البارد.
  3. استمر في تخفيف المخزون الفيروسي حتى يصل إلى التركيز المناسب ل 0.5-1 LD50 في خلفية سلالة الفئران المستخدمة. احتفظ بكل شيء على الجليد واستخدم أنابيب مبردة مسبقا لتجنب ارتفاع درجة حرارة الفيروس.
    ملاحظة: على سبيل المثال ، بالنسبة ل VR-95PQ ، 70063082 الدفعة ، يصيب الفئران بفيروس 12,600 إلى 31,500 CEID50 / ميكرولتر (يتم قياسه حسب وزن الجسم) بتخفيف 1: 500,000.
  4. من التخفيف A (1: 100) ، قم بعمل تخفيف 1: 50،000 (التخفيف B) عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من التخفيف A إلى 4990 ميكرولتر من D-PBS البارد في أنبوب مبرد مسبقا سعة 15 مل. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل.
  5. من التخفيف B ، قم بعمل تخفيف 1: 500،000 (التخفيف C) عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من التخفيف B إلى 1.8 مل من D-PBS في أنبوب مبرد مسبقا سعة 5 مل. تخلط جيدا عن طريق سحب العاصة لأعلى ولأسفل.
    ملاحظة: لتحديد التخفيف المثالي للفيروس لاستخدامه في إصابة عند شراء قطعة جديدة ، من الممكن تقدير استخدام عيار الفيروس المشار إليه في ورقة المنتج وضبط التخفيف بناء على عيار الدفعة السابقة. أفضل طريقة لتحديد التخفيف المثالي هي القياس التجريبي للمجموعة الجديدة من الفيروسات باستخدام فئران C57BL / 6 من النوع البري. خطط لمجموعة من التخفيفات التي تمتد من 1: 50،000 إلى 1: 500،000 واطلب 1-2 أقفاص من C57BL / 6 من إناث الفئران لكل تخفيف للاختبار. يصيب الفئران بتركيزات مختلفة ويراقب فقدان وزنها. لاختبار العيار الفيروسي ، تقترح الدراسة استخدام إناث الفئران فقط لتقليل التباين الذي قد يكون ناتجا عن الاختلافات بين الجنس أو الوزن بين الفئران. غالبا ما تصبح إناث الفئران أكثر مرضا من ذكور الفئران ، ربما بسبب صغر حجمها ، أو بسبب الاختلافات الخاصة بالجنس في الاستجابة لعدوى الأنفلونزا ، كما يحدث في أشكال أخرى من إصابة رئة الفأر15. على الرغم من أن هذا لم تتم دراسته بالتفصيل ، فقد تم استخدام إناث الفئران في تجارب العيار لأنه إذا تم تحديد العيار باستخدام ذكور الفئران ، فقد تموت إناث الفئران بالجرعة المحددة. ومع ذلك ، فقد وجد أن ذكور الفئران تمرض بشكل ملحوظ ولديها إصابات ملحوظة في الرئة عند إصابتها بعيار فيروسي ، والذي تم تحديده باستخدام إناث الفئران فقط. سيكون التخفيف المثالي إذا كنت تستخدم الفئران ذات الخلفية المختلطة أو الفرشة هو "1 LD50" ، وهو التخفيف الذي يموت عنده 50٪ من الفئران البرية C57BL / 6. الفئران الخارجية أكثر مقاومة للعدوى16 وستصاب وتتعافى جيدا عند هذا التخفيف. إذا كانت الفئران للتجربة ستكون على خلفية فطرية C57BL / 6 ، فستكون الجرعة المثالية نصف هذا "0.5 LD50". نظرا لأن الهدف من هذه التجارب هو دراسة الإصابة والإصلاح ، فمن المثالي تحديد الجرعة التي تمرض فيها الفئران وتفقد 20-25٪ من وزن جسمها ، لكن معظم الفئران تتعافى في النهاية (الشكل 1). إذا كانت جميع الفئران في الدراسة بنفس الوزن تقريبا (~ 25 جم) ، فمن الممكن إعطاء فيروس الأنفلونزا عند 50 ميكرولتر من التخفيف المناسب لكل فأر. ومع ذلك ، يتراوح وزن الفئران من 15-35 جم. لذلك ، قم بإدارة 2 ميكرولتر من التخفيف الفيروسي لكل جرام من وزن الجسم (على سبيل المثال ، يتلقى الفأر الذي يبلغ وزنه 15 جراما 30 ميكرولتر من الإنفلونزا ، بينما يتلقى الفأر الذي يبلغ وزنه 35 جراما 70 ميكرولتر). ينتج عن هذا مستوى أكثر اتساقا من العدوى وتلف الأنسجة عبر ذات الأحجام المختلفة. هذه المعلومات مطلوبة للتخطيط لحجم التخفيف C.

3. نقل الكميات الفيروسية إلى المرافق الحيوانية

  1. ضع أنبوب 5 مل مع التخفيف الفيروسي النهائي في الثلج وقم بتسمية الحاوية بملصق بيولوجي. قم بتبطين صندوق حامل عينة بلاستيكي بمناشف ورقية لامتصاص الانسكابات المحتملة.
  2. ضع المواد اللازمة للعدوى داخل الأنف داخل الصندوق المسمى بالمخاطر البيولوجية: ماصة P200 ، وصندوق غير مفتوح من أطراف ماصة P200 المفلترة ، وقلم ، وأنبوب مخروطي سعة 50 مل مملوء بمواد التبييض الطازجة بنسبة 10٪ للنفايات الفيروسية. كوسيلة للتحكم في العدوى ، املأ أنبوبا بحجم 1.5 مل بنفس D-PBS البارد المستخدم لتخفيف IAV.

4. إعطاء IAV للفئران

ملاحظة: يتطلب العمل مع فيروس الأنفلونزا في منشأة مرفق مستوى أمان ABSL2. تشمل معدات الوقاية الشخصية القياسية مقشرات ، ومعطف مختبر يمكن التخلص منه ، وقلنسوتين للشعر ، وقفازات مزدوجة من النتريل ، وأغطية أحذية مزدوجة ، ونظارات واقية (نظارات أمان) ، وقناع. يجب إبقاء فيروس الأنفلونزا المخفف على الجليد طوال بروتوكول الإدارة لتجنب فقدان العدوى.

  1. يجب أن تتم جميع الأعمال مع الفيروسات داخل خزانة السلامة البيولوجية. على الرغم من أن فيروس الأنفلونزا A / PR / 8/34 هو سلالة تتكيف مع الفأر ، إلا أن فيروسات الأنفلونزا عرضة للطفرات ، وبالتالي ، تعالج الفيروس كما لو كان من المحتمل أن يكون معديا للإنسان.
  2. قم بإدارة التخدير الأيزوفلوران للحيوانات واحدة تلو الأخرى بمعدل تدفق 2.5-3٪ على آلة المرذاذ. انقل من صندوق التخدير إلى مخروط الأنف قبل إعطاء الأنفلونزا.
  3. عندما يكون الفأر تحت التخدير ، تحقق من تنفسه وقم بقرصة إصبع القدم لمعرفة ما إذا كان يتفاعل. تكون الفئران جاهزة للإصابة بعدوى IAV عندما تتفاعل مع قرصة إصبع القدم مع تشنج صغير أو "قفز" - ولكن ليس إذا كانت مستيقظة بما يكفي لتحريك رؤوسها.
  4. باستخدام ماصة P200 مضبوطة على 50 ميكرولتر (أو 2 ميكرولتر/جم من وزن الجسم؛ انظر الملاحظة أدناه الخطوة 2.5)، استنشق IAV المخفف (أو التحكم في PBS) من القارورة على الثلج وضع الماصة على صندوق الطرف أو المنشفة الورقية حيث لن يلامس الطرف القفازات أو سطح خزانة السلامة البيولوجية.
  5. التقط الماوس المخدر عن طريق التقشير وأمسك الماوس في وضع مستقيم بزاوية 45 درجة. قم بإمساك الفأر بإحكام بما يكفي بحيث تكون القصبة الهوائية ممدودة لاستنشاق أفضل ، ولكن ليس بإحكام بحيث يتم إعاقة التنفس. تأكد من أن أنفاس الماوس ضحلة ولكنها متسقة ، دون أن تلهث.
  6. قم بسحب التخفيف IAV ببطء في فتحتي أنف الفأر. ويمكن القيام بذلك بنجاح باستخدام أي من الطريقتين كما هو موضح في الخطوتين 1.6.4 و2.6.4.
    1. قم بإسقاط التخفيف الفيروسي في فتحتي الأنف باتجاه التنقيط ، بالتناوب بين فتحتي الأنف بحيث يدخل الفيروس جانبي الأنف.
    2. قم بإنشاء "فقاعة" من الفيروس تمتد على كلا فتحتي الأنف ، ويتم الحفاظ عليها عن طريق سحب العينة باستمرار وببطء أثناء استنشاق الفأر للسائل.
      ملاحظة: استخدمت هذه الدراسة باستمرار طريقة تقطير الفقاعات ، والتي كانت أكثر تحكما وقابلية للتكرار. تسمح هذه الطريقة بتوصيل تعليق الفيروس بسهولة إلى فتحتي الأنف تحت التخدير وتسهل التنفس الطبيعي. الطريقة الإسقاطية صالحة بنفس القدر ، ولكن أيا كانت الطريقة المستخدمة ، يجب تطبيق الاتساق في الطريقة عبر التجارب لضمان تباين أقل في النتائج.
  7. أمسك طرف الماصة بالقرب من الأنف ، لكن لا تلمس الأنف. إذا كان الفأر يستيقظ ، فقم بإعطاء نصف الجرعة وأعد الفأر إلى مخروط أنف الأيزوفلوران قبل إعطاء النصف الثاني من الجرعة.
  8. إذا كان الفأر مستيقظا بما يكفي لهز رأسه أو السعال أو بصق الفيروس ، فمن الضروري إجراء المزيد من التخدير لتجنب التسبب في فيروس الهباء الجوي ولضمان إصابة جيدة. إذا لم يكن الماوس مستيقظا ، فقم بإدارة الجرعة بأكملها. إذا تم وضع الماوس مرة أخرى على مخروط الأنف ، فكرر الخطوة 4.6 لإدارة IAV المتبقي.
  9. أخرج الطرف في وعاء نفايات يحتوي على مبيض طازج بنسبة 10٪. استخدم طرفا جديدا لكل قفص من الفئران.
  10. بعد كل إعطاء IAV ، أمسك الفأر في وضع مستقيم لمدة 1-2 دقيقة لإبقاء مجرى الهواء مفتوحا والتأكد من توصيل الأنفلونزا بشكل كاف إلى الرئتين. إذا تم نقل فيروس الإنفلونزا بنجاح إلى رئتي الفأر ، فيمكن الشعور بالفرقعة عن طريق وضع إصبع واحد على كل جانب من صدر الفأر.
  11. بعد أن يبدأ الماوس في التعافي ، ضع الماوس مرة أخرى في القفص للتعافي تماما. سوف تتعافى الفئران بسرعة من الأيزوفلوران ولكن تحتاج إلى المراقبة حتى تصبح متنقلة.
  12. سجل الأحداث مثل طقطقة في الصدر والتنفس العميق التي تشير إلى أن IAV قد تم استنشاقه جيدا ، أو الفقاعات ورذاذ الأنف الذي يشير إلى طرد بعضها من أنف الفأر. تتبع هذه المعلومات في جدول بيانات سجل الإصابة (الملف التكميلي 1) ودفتر ملاحظات المختبر.
  13. كرر الخطوات 4.2-4.12 لكل ماوس يصاب بالعدوى.

5. النقل إلى المختبر

  1. ضع 50 مل مخروطي يحتوي على مبيض وأطراف مرة أخرى في صندوق حامل العينة البلاستيكية ، جنبا إلى جنب مع بقايا تخفيف IAV (إن وجد) وعناصر المختبر المستخدمة في عدوى الإنفلونزا.
  2. بمجرد العودة إلى المختبر ، احتضن أي شيء ملامس للفيروس بنسبة 10٪ مبيض. رش دلاء الثلج والماصات وصناديق الأطراف بمحلول مبيض بنسبة 10٪ بدلا من الغمر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل. تخلص من النفايات الصلبة في حاوية النفايات الحيوية وتخلص من النفايات السائلة في الحوض ، مع شطفها بالماء.

6. مراقبة الفئران والإجراءات التجريبية الإضافية

  1. مراقبة درجة حالة الجسم (BCS) 17 ووزن الجسم لجميع الفئران المصابة ب IAV (PBS) والفئران المصابة ب IAV يوميا بعد الإصابة بالإنفلونزا ، بدءا من اليوم التالي للإصابة (اليوم 1) أو 3 أيام بعد الإصابة (اليوم 4). من غير المرجح أن تفقد الفئران المصابة ب IAV وزنا كبيرا حتى اليوم 4 بعد الإصابة (الشكل 1).
    ملاحظة: يجب القتل الرحيم للفئران التي تفقد أكثر من 30٪ من وزن جسمها أو تصل إلى درجة حالة الجسم 1.
  2. إذا رغبت في ذلك، يتم تطبيق EdU للفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP) أو في مياه الشرب لمراقبة تكاثر الخلايا بعد عدوى الأنفلونزا.
    ملاحظة: تتكاثر العديد من أنواع الخلايا في رئة الفأر بعد التلف الناجم عن IAV9. من الممكن إعطاء أدوية أخرى أو طعام خاص أو ماء خاص حسب الرغبة لأغراض تجريبية محددة. ضع في اعتبارك أن الفئران لا تأكل أو تشرب كالمعتاد أثناء تعافيها من الأنفلونزا ، لذلك قد تكون طريقة الإدارة القائمة على الحقن مرغوبة أكثر ؛ من ناحية أخرى ، قد يكون من الصعب حقن الفئران ب BCS من 2-2.5.

7. حصاد أنسجة الرئة لنهج المصب

  1. حصاد أنسجة الرئة للتطبيقات النهائية ، بما في ذلك تحليل التألق المناعي ، أو قياس التدفق الخلوي ، أو تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية في منشأة الفأر أو في المختبر في خزانة السلامة البيولوجية.
  2. القتل الرحيم للفئران واحدة تلو الأخرى باستخدام ثاني أكسيد الكربون2. لا تخلع عنق الرحم لتجنب خلع القصبة الهوائية. عادة ما يكون استئصال الصدر الثنائي طريقة ثانوية معتمدة للقتل الرحيم.
    ملاحظة: تتبع هذه الدراسة إرشادات رعاية المعتمدة من قبل المؤسسة وبروتوكول القتل الرحيم CO2 وقد استخدمت هذه الطريقة باستمرار في دراسات الأنفلونزا السابقة دون إدخال تباين كبير في إصابة الرئة أو النتائج التشريحية المرضية. يمكن أيضا استخدام الكيتامين / الزيلازين للقتل الرحيم للفئران لتجنب الضرر الناجم عن استنشاق ثاني أكسيد الكربون2 . ومع ذلك ، يعد استنشاق ثاني أكسيد الكربون2 طريقة مقبولة إذا كان الحصول على الكيتامين / الزيلازين مكلفا للغاية أو إذا كان الحصول على ترخيص إدارة مكافحة المخدرات أمرا صعبا للغاية.
  3. تشريح فتح تجويف الصدر وفضح القفص الصدري والقصبة الهوائية.
  4. افتح الحجاب الحاجز وقم بتشريحه بعيدا عن القفص الصدري بعناية حتى لا تثقب الرئتين. قطع على طول جوانب القفص الصدري وإزالة القفص الصدري من الأعلى. قطع الترقوة وتشريح العظام والأنسجة الرخوة بعيدا عن مقدمة القصبة الهوائية.
  5. قم بتشريح العضلات والأنسجة المحيطة بالقصبة الهوائية حتى تظهر حلقات الغضروف ، لكن لا تثقب القصبة الهوائية. باستخدام ملقط منحني ، ادفع المريء للخارج من خلف القصبة الهوائية وقم بتشريحه بعيدا عن القصبة الهوائية.
  6. قم بربط قطعة من الخيط خلف القصبة الهوائية واربط عقدة خياطة فضفاضة (قم بربط أحد طرفي الطرف حول ملقط مع آخر ، وامسك بالطرف الفضفاض للخياطة ، واسحب الطرف السائب من خلال الحلقات).
  7. قم بتغذية الدورة الدموية باستخدام D-PBS. قم بقص وعاء كبير (تحت الطرف الأمامي أو في الجزء السفلي من الحجاب الحاجز) وقم بتشغيل D-PBS من خلال البطين الأيمن (أسفل القلب ، متجها لأعلى) عن طريق الضغط ببطء على نهاية المحقنة. إذا كانت الإبرة غير مرئية من خلال جدار القلب ، فمن المحتمل أن تكون في البطين الأيسر. هذا يزيل الدم من الرئتين.
    ملاحظة: لا تدفع الفقاعات. إذا كان هناك أي فقاعات في الخط ، فقم بطردها قبل دفع D-PBS بالمحقنة. إذا كان موت الخلايا البطانية مصدر قلق ، فمن اللطيف استخدام التروية بالجاذبية بدلا من دفع PBS يدويا.
  8. في حالة جمع الأنسجة لعلم الأنسجة أو التألق المناعي فقط ، انتقل إلى الخطوة 7.9 ؛ في حالة التجمع لتعليق الخلية الواحدة فقط ، اقطع جميع فصوص الرئة وضعها في PBS على الجليد ، ثم انتقل إلى الخطوة 7.11.
  9. تضخم الرئة للتألق المناعي أو الأنسجة في اتجاه مجرى النهر:
    1. نفخ الرئتين في 2٪ بارافورمالديهايد (PFA) وتجفيف من خلال الإيثانول لتضمين البارافين أو تضخيم 2٪ PFA وتجفيف من خلال السكروز للتشريح بالتبريد.
    2. بالنسبة لتقنيات الكشف عن الحمض النووي الريبي مثل منظار الحمض النووي الريبي أو تفاعل التهجين المتسلسل (HCR) ، قم بتثبيت الرئتين في 4٪ PFA. للحصول على أفضل تثبيت ، قم بتضخيم الرئتين في 2٪ من الأغروز ذوبان منخفض للغاية وقم على الفور بتقسيم ميكروتوم اهتزازي إلى 2٪ أو 4٪ PFA في صفيحة زراعة الأنسجة من أجل التألق المناعي في اتجاه مجرى النهر.
  10. تضخم الرئة باليد:
    1. قم بنفخ الرئتين يدويا بحقنة وإبرة 21-23 جرام مع أو بدون أنبوب أو باستخدام الجاذبية عن طريق لصق أنبوب من PFA على حامل حلقي على ارتفاع 30 سم فوق سطح المقعد.
    2. بعد عزل القصبة الهوائية ، أدخل الإبرة في الجزء العلوي من القصبة الهوائية ، وشطبة لأعلى ، دون ثقب الجزء السفلي من القصبة الهوائية ، وشد الخيط حول القصبة الهوائية والإبرة قبل إدخال السائل.
      ملاحظة: ينطوي استخدام إبرة حادة على خطر طفيف من ثقب القصبة الهوائية مقارنة بالإبرة ذات الطرف الحاد ، ويجب على الباحثين توخي الحذر الشديد أثناء العملية لتجنب أي ضرر. إذا كانت إبرة حادة تثقب القصبة الهوائية ، فيجب استخدام إبرة ذات طرف حاد.
  11. لإنشاء تعليق أحادي الخلية لقياس التدفق الخلوي في اتجاه مجرى النهر أو تحليل تسلسل الخلية المفردة ، قم بإزالة أنسجة الرئة من D-PBS وفرم أنسجة الرئة بالمقص ، ثم قم بتقطيعه بشفرة حلاقة لمدة 2-3 دقائق للحصول على قطع أنسجة أدق.
  12. ينفصل في مخزن مؤقت للهضم يحتوي على 480 وحدة / مل من الكولاجيناز الأول ، و 100 ميكرولتر / مل ، و 2 ميكرولتر / مل DNase في D-PBS ، عند 37 درجة مئوية لمدة 30-35 دقيقة. قم بالتصفية من خلال مرشحات 100 ميكرومتر و 40 ميكرومتر ، وتحلل أي خلايا دم حمراء متبقية باستخدام مخزن تحلل كلوريد الأمونيوم والبوتاسيوم (ACK) ، وأعد تعليقها في 1٪ BSA في PBS للمعالجة والتحليل النهائي.
    ملاحظة: للكشف عن العدوى الفيروسية وإزالتها بعد العدوى في الرئتين ، من الممكن تقييم العبء الفيروسي باستخدام مقايسة qRT-PCR أو TCID50 في متجانسات الرئة لقياس تكاثر الفيروس. يمكن أيضا استخدام تلطيخ Neuraminidase و capsid للكشف عن العدوى الفيروسية. يجب أن يحدث التخلص الفيروسي بحلول الأيام 8-9 بعد الإصابة18،19 ، بينما يستمر إصلاح وتجديد أنسجة الرئة لعدة أسابيع9.

النتائج

بالمقارنة مع الفئران غير المصابة والمعالجة ب PBS ، ستظهر الفئران المصابة ب IAV تلفا غير متجانس في الأنسجة (الشكل 1 أ). يمكن تحديد تلف الأنسجة باستخدام خوارزمية تجميع k-means في MATLAB20 (الشكل 1 ب). ستبدأ الفئران المصابة ب IAV في إنقاص الوزن بين 3-4 أيام بعد الإصابة. عند العيار المثالي ، ستفقد الفئران ما بين 20-30٪ من وزن جسمها الأولي ، مع حدوث الحد الأقصى لفقدان الوزن في 8-10 أيام بعد الإصابة (نقطة في البوصة) (الشكل 1 ج). بحلول 11-12 نقطة في البوصة ، يجب أن تكون الفئران قد بدأت في زيادة الوزن ويجب أن تعود إلى حدود 10-15٪ من وزن الجسم الأولي بمقدار 14 نقطة في البوصة. بالنسبة لدراسات التجديد ، من المفيد أن تفقد معظم الفئران في التجربة الوزن وتتعرض لتلف الأنسجة ولكنها لا تموت. ومع ذلك ، نظرا لعدم التجانس في تلف الأنسجة (الشكل 1 أ ، ب) والتباين المحتمل في الإعطاء داخل الأنف ، فمن الطبيعي أن لا تفقد العديد من الفئران في التجربة الوزن أو تتعرض لتلف الأنسجة وأن تفقد العديد من الفئران >30٪ من وزن الجسم ، مما يؤدي إلى القتل الرحيم (الشكل 1 د). قد تحتاج التجارب التي تسعى إلى تحديد الفرق في البقاء على قيد الحياة وفقدان الوزن بين ، على سبيل المثال ، الفئران المصابة ب KO لجين معين وعناصر التحكم في WT الخاصة بها إلى ضبط عيار وجرعة IAV وستحتاج إلى إجراء حساب للطاقة لتحديد حجم العينة المطلوب للكشف عن مثل هذا الاختلاف في هاتين المعلمتين.

بالإضافة إلى التغييرات في بنية الأنسجة العامة وصحة الفأر ، تحدث تغييرات النسخ في جميع المقصورات الخلوية الرئوية على مدار استجابة الأنسجة للتلف. يتضمن ذلك كلا من حالات الخلايا العابرة التي يتم حلها في النهاية مع إصلاح الأنسجة ، بما في ذلك حالات الخلايا الظهارية الانتقالية أو الوسيطة وحالات الخلايا المناعية النخاعية ، وحالات الخلايا المستمرة التي لا تساهم في الإصلاح الوظيفي ، بما في ذلك Krt5 + الخلايا الظهارية والخلايا البطانية TrkB +9. على سبيل المثال ، في البطانة الشعرية لرئة الفأر ، تنشأ حالة خلية بطانية عابرة محفزة بالإنترفيرون عند 6 نقطة في البوصة ، وتتميز بتعبير عال عن الجينات المحفزة للإنترفيرون (الشكل 2 أ). يتم حل هذه الحالة بمقدار 11-19 نقطة في البوصة (الشكل 2 أ). تنشأ حالة البطانة الشعرية الناجمة عن الإصابة (iCAP) عند 11 نقطة في البوصة ، وتتميز بتعبير عال عن Ntrk2 (TRKB) و Sparcl1 و Bnip3 (الشكل 2 ب). على عكس حالة الخلية البطانية المحفزة بالإنترفيرون ، تستمر حالة الخلية البطانية iCAP في مناطق الأنسجة المتضررة بشدة ولا تزال موجودة بعد عام من الإصابة (الشكل 2 ج). تنشأ أيضا حالات الخلايا الظهارية السنخية العابرة ، بما في ذلك الخلايا الانتقالية السنخية وحالات الخلايا الظهارية السنخية غير الناضجة من النوع الأول (AT1) ، بعد الإصابة (الشكل 2 د). أخيرا ، تؤدي العدوى إلى فقدان العديد من البلاعم السنخية الداخلية (aMAC_a) وإعادة تكوينها من كل من الخلايا الوحيدة الالتهابية (iMON) و aMACs الداخلية. البلاعم السنخية بعد عام واحد من الإصابة لها حالات نسخ مختلفة (aMAC_a و aMAC_b) اعتمادا على أصلها (الشكل 2E) 9. تستدعي حالات الخلايا العابرة والمستمرة التي تنشأ بعد إصابة الرئة الحادة مزيدا من الدراسة ، حيث أن سلوكها غير الطبيعي داخل المكانة قد يساهم إما بشكل منتج أو سلبي في إصلاح الأنسجة الناجح ووظيفة الأنسجة اللاحقة. تم نشر بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية سابقا9 وتم إيداعها في Gene Expression Omnibus باسم GEO: GSE262927.

figure-results-1
الشكل 1: مراقبة إصابة الرئة وصحة. (أ) تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين (HE) لأقسام أنسجة الرئة من رئة مصابة بمرض وهمية (معالجة ب PBS) على اليسار ورئة مصابة ب IAV على اليمين. بالمقارنة مع الرئة غير المصابة ، تظهر الرئة المصابة ب IAV تلفا غير متجانس في الأنسجة. قضبان المقياس ، 1 مم. (ب) باستخدام خوارزمية التجميع k-means في MATLAB20 ، يمكن وصف تلف الأنسجة بأنه شديد (أحمر) أو تالف (أخضر) أو طبيعي (أزرق). من المهم ملاحظة أنه في فص الرئة المعالج ب PBS على اليسار ، تصنف هياكل مجرى الهواء على أنها "شديدة" بسبب كثافة وشدة تلطيخ الخلايا الظهارية في مجرى الهواء. ومع ذلك ، لا يزال من الممكن تمييز الفرق بسهولة بين الرئتين المعالجتين ب PBS والرئتين المصابتين بالإنفلونزا بالنظر إلى خط الأساس هذا. قضبان الميزان ، 1 مم. (ج) مثال على منحنى فقدان الوزن من تجربة عدوى IAV تمثيلية حيث تم جمع رئتي الفأر بعد 13 يوما من الإصابة (نقطة في البوصة). يحتوي المنحنى على بيانات من ستة فئران من النوع البري ، وتمثل النقاط المتوسط ، بينما تمثل أشرطة الخطأ الخطأ القياسي للمتوسط. (د) مثال على منحنى البقاء على قيد الحياة من تجربة عدوى IAV تمثيلية حيث تم جمع رئتي الفأر بعد 14 يوما من الإصابة (dpi). يحتوي المنحنى على بيانات من سبعة فئران من النوع البري. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: مراقبة تغيرات حالة الخلايا البطانية الشعرية بعد عدوى IAV. (أ) تنشأ حالة EC المحفزة بالإنترفيرون عند 6 نقطة في البوصة يتم حلها بين 11-19 نقطة في البوصة. تظهر إعادة تحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلية المنشورة من رئتي الفئران في عدة نقاط زمنية مختلفة بعد الإصابة بالإنفلونزا أن درجة وحدة الإنترفيرون في جميع أنواع الخلايا البطانية الشعرية هي الأعلى عند 6 نقطة في البوصة. تمت إعادة تحليل البيانات باستخدام R ، وتستند درجة وحدة الإنترفيرون إلى التعبير عن 87 جينا محفزا بالإنترفيرون داخل كل نوع من أنواع الخلايا. CAP1, نوع الشعيرات الدموية 1 الخلية البطانية; iCAP ، الخلية البطانية الناجمة عن الإصابة. CAP2, نوع الشعيرات الدموية 2 الخلية البطانية; EC ، الخلية البطانية. (ب) في المقابل ، تنشأ حالة EC الناجمة عن الإصابة والتي تتميز بالتعبير عن Ntrk2 (TRKB) عند 11 نقطة في البوصة وتستمر لمدة تصل إلى عام بعد الإصابة. شريط المقياس ، 500 ميكرومتر. (ج) توضح بيانات النسخ من تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية للخلايا البطانية الشعرية للرئة بعد الإصابة بالإنفلونزا الطبيعة الديناميكية لحالة الخلايا البطانية الشعرية أثناء إصلاح الأنسجة. (د) تعاني الخلايا الظهارية السنخية أيضا من مرونة الخلايا بعد الإصابة بالإنفلونزا. ينشأ نوع الخلية الانتقالية السنخية بين 6-11 نقطة في البوصة ويتم حلها بمقدار 19 نقطة في البوصة. تنشأ حالة خلية AT1 غير الناضجة (AT1_c) عند 11 نقطة في البوصة وتستمر حتى 90 نقطة في البوصة. (ه) بعد الإصابة ، تفقد العديد من البلاعم السنخية الموجودة (aMAC_a) ، ويظهر تدفق الخلايا الوحيدة الالتهابية (iMON) عند 6 نقطة في البوصة. يتم إعادة تكوين مجموعة البلاعم السنخية بواسطة aMACs الموجودة لتجديد aMAC_a السكان ، والخلايا الوحيدة الالتهابية ، مما يولد aMAC_b من السكان. على الرغم من أن كلاهما يمثل حالة البلاعم السنخية ، إلا أنه يمكن تمييز aMACs الناتجة عن طريق النسخ. تشير الرسوم البيانية في (CE) إلى النسبة المئوية للخلايا في كل مجموعة سكانية في كل نقطة زمنية في مجموعة بيانات عدوى الأنفلونزا الطولية وتم إنشاؤها باستخدام R. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملف التكميلي 1: سجل الإصابات وسجل الوزن وسجل حالة الجسم (BCS) لمراقبة بعد الإصابة بالإنفلونزا. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

هنا ، أبلغنا عن طريقة ملائمة لنقل فيروس الأنفلونزا إلى الفئران لبدء إلحاق ضرر سريع وفعال برئتي الفئران ودراسة آليات كل من التجديد الناجح وإصلاح خلل التنسج. نوضح أن التلقيح داخل الأنف ل A / PR / 8/34 IAV يمكن أن يكون تقنية خالية من الإجهاد. يستغرق الأمر أقل من دقيقتين لكل فأر لإكمال التلقيح بعد التخدير الأيزوفلوراني. إنها تقنية بسيطة وغير جراحية للتلقيح الفيروسي تتبع المسار الطبيعي للعدوى وتسمح بدراسة استجابة كل من الأنسجة والجهاز المناعي بطريقة أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية. يمكن للفيروس الذي يتم تلقيحه من خلال فتحتي أنف الفأر أن يحفز مناعة الغشاء المخاطي والجهازية21. والأهم من ذلك ، أن الضرر الناجم عن العدوى الفيروسية مرئي بوضوح في شرائح أنسجة الرئة الملطخة بالهيماتوكسيلين واليوزين (HE) تلطيخ22 (الشكل 1). تم نشر جدول زمني كامل للتغيرات النسخية المتوقعة في أنواع خلايا الرئة في كل جزء من الرئةسابقا 9. هنا ، قمنا بإعادة تحليل مجموعة فرعية من هذه البيانات لإثبات أنه في المقصورات المناعية البطانية الشعرية ، والظهارية السنخية ، والنخاعية في رئتي الفأر ، تحدث تغيرات نسخية عابرة ومستمرة على مدار الاستجابة لعدوى الأنفلونزا من الفئران غير المصابة حتى عام بعد الإصابة (الشكل 2).

هناك العديد من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول ، وسيؤدي استكشاف الأخطاء وإصلاحها المناسبة لهذه الخطوات إلى تجربة ناجحة. فيروس الأنفلونزا A / PR / 8/34 هو سلالة من الإنفلونزا تتكيف مع الفأر ولا تصيب البشربشكل منتج 23 ، ولكن من المهم دائما اتباع جميع إجراءات السلامة المشار إليها أثناء التجربة لتجنب أي احتمال لإصابة موظفي المختبر. يعد إعطاء التخدير الأيزوفلوران خطوة حاسمة لضمان التسليم الناجح للفيروس ، حيث لن تستنشق الفئران الفيروس جيدا عندما تكون مستيقظة. افحص التنفس وراقب حركة رأس الفأر أثناء العملية لضمان تلقيح الفيروس في كلتا فتحتي الأنف. إذا لم يتم تخدير الفئران بالكامل ، فيمكن توليد فقاعات ، مما يحد من استنشاق الفيروس ويولد الهباء الجوي. يجب تجنب كلتا النتيجتين ، ويجب إعادة وضع الفئران مرة أخرى على مخروط أنف الأيزوفلوران إذا لوحظ أي عطس أو فقاعات في فتحتي الأنف. تعد مراقبة ما بعد العدوى ، مثل قياس فقدان الوزن ودرجة حالة الجسم والحالة الصحية ، بالإضافة إلى توفير مكمل غذائي للتعافي ، مكونا مهما في هذه التجربة. إذا لوحظ أن الفئران لا تفقد وزنا كافيا أو ليس لديها الكمية المتوقعة من تلف الأنسجة (الشكل 1) ، فمن الممكن أن تكون الجرعة منخفضة جدا. من ناحية أخرى ، إذا وصلت العديد من الفئران إلى نقطة نهاية فقدان وزن الجسم بنسبة 30٪ ، فمن الممكن أن تكون الجرعة عالية جدا. في كلتا الحالتين ، من الأفضل تحديد الجرعة المناسبة من خلال عيار تجريبي لمجموعة من الفيروس باستخدام مجموعة من الفئران C57BL / 6 كما وصفنا هنا.

نظرا لأن عدوى الأنفلونزا لا تزال منتشرة في جميع أنحاء العالم ، وتسبب أمراضا تنفسية وخيمة ، ويمكن أن تكون قاتلة ، فإن فهم عملية العدوى الفيروسية والاستجابة الخلوية للعدوى وإصابة الأنسجة في الرئة أمر بالغ الأهمية. وبالتالي ، قد تساعد طريقة العدوى داخل الأنف الموصوفة في هذه الدراسة في تحديد الآليات التنظيمية المهمة وتطوير مناهج علاجية جديدة لأمراض الرئة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تستخدم التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية سلالة مختلفة من فيروس الأنفلونزا المتكيف مع الفأر ، مثل X31 ، لتحديد التأثيرات على بنية أنسجة الرئة ووظيفتها في حالة التهابات الجهاز التنفسي المتكررة. نظرا لأن العديد من الأشخاص يتعرضون لالتهابات تنفسية متعددة في حياتهم ، فإن مثل هذا الامتداد لهذا النموذج يمكن أن يكون له آثار مهمة على دراسة تجديد أنسجة الرئة ، وبالتالي على الصحة العامة.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحوث الداخلية للمعاهد الوطنية الأمريكية للصحة (NIH) ، والمعهد الوطني للسرطان ، ومركز أبحاث السرطان.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب 1.5 مل & nbsp;فيشر ساينتيفك02-682-557
100 وميكرو؛ مصفاة خلية Mفالكون352360
أنبوب مخروطي بحجم 15 ملفالكون352196
1x PBSGibc010010-023
40 وميكرو؛ مصفاة خلية Mفالكون352340
أنبوب 5 ملالكرة الأرضية6101C
أنبوب مخروطي بحجم 50 ملفالكون352098
مخزون فيروس الإنفلونزا A/PR/8/34ATCC VR-95PQالقطع المختلفة لها مؤشرات فيروسات مختلفة
مخزن تحليل ACKجودة بيولوجية118-156-101
الأجسام المضادة المضادة لTRKBR& دي سيستمزAF1494
المبيضكلوروكس10٪ مبيض
مصل البقر ألبومينسيغما ألدريتشA8022
غرفة تحفيز التخدير بثاني أكسيد الكربونأيلا يوجد
كولاجناز النوع الأولجيبكو17100017
DAPIميليبور سيغما28718-90-3
DispaseكورنينغCB-40235
أدوات التشريح: مقص، ملقط منحني، ملقط مستقيمأيلا يوجد
دنيسسيغما ألدريتش4716728001
D-PBSكورنينغ21-031-CM
الإيثانولفارمكو111000200
القوارير الزجاجيةعلوم الحياة DWK986562
دلو الثلجأيلا يوجد
إيزوفلورانكوفيتروس29404
نيدلز، 21&200; 23 جأيلا يوجد
P20/P200 pipette بيبيتمانF144056M/F144058M،
أطراف الماصة P20/P200توماس ساينتفيك1159M43/1159M40
بارافورمالديهايد (PFA) ثيرمو ساينتفيكJ19943-k22٪ PFA
بيبيتمانأيلا يوجد
صناديق الفريزر البلاستيكية أو الكرتونيةأيلا يوجد
شفرة الحلاقةأيلا يوجد
منصة الحلبةأيلا يوجد
بيبتس مصلية، 5 ملفالكون357543
غرفة إيزوفلوران الفأر ذات العلوية المنزلقةسومني ساينتيفك
الخياطةفيشر ساينتيفكNC9422522
أنابيب الحقنة وأقفال اللويرأيلا يوجد
حقنة، 10 ملأيلا يوجد
آلة تخدير الطاولة الإيزوفلورانأوهميداأوهميدا إيزوتيك- 4معدل التدفق يجب أن يكون 2.5– 3%
أجاروز ذوبان منخفض جداسيغما ألدريتشA5030-1G
ميزان الوزنأوهاوسCS200

المراجع

  1. Mammoto, A., Mammoto, T. Vascular niche in lung alveolar development, homeostasis, and regeneration. Front Bioeng Biotechnol. 7, 318(2019).
  2. Tsikis, S. T., Hirsch, T. I., Fligor, S. C., Quigley, M., Puder, M. Targeting the lung endothelial niche to promote angiogenesis and regeneration: a review of applications. Front Mol Biosci. 9, 1093369(2022).
  3. Torrego, A., Pajares, V., Mola, A., Lerma, E., Franquet, T. Influenza A (H1N1) organising pneumonia: figure 1. BMJ Case Rep. 2010, bcr1220092531(2010).
  4. Murota, M., et al. Influenza H1N1 virus-associated pneumonia often resembles rapidly progressive interstitial lung disease seen in collagen vascular diseases and COVID-19 pneumonia; CT-pathologic correlation in 24 patients. Eur J Radiol Open. 7, 100297(2020).
  5. Niethamer, T. K., et al. Defining the role of pulmonary endothelial cell heterogeneity in the response to acute lung injury. eLife. 9, e53072(2020).
  6. Klomp, M., Ghosh, S., Mohammed, S., Khan, M. N. From virus to inflammation, how influenza promotes lung damage. J Leukoc Biol. 110 (1), 115-122 (2021).
  7. Newton, A. H., Cardani, A., Braciale, T. J. The host immune response in respiratory virus infection: balancing virus clearance and immunopathology. Semin Immunopathol. 38 (4), 471-482 (2016).
  8. Jones, D. L., et al. An injury-induced mesenchymal-epithelial cell niche coordinates regenerative responses in the lung. Science. 386 (6727), eado5561(2024).
  9. Niethamer, T. K., et al. Longitudinal single-cell profiles of lung regeneration after viral infection reveal persistent injury-associated cell states. Cell Stem Cell. 32 (2), 302-321.e6 (2025).
  10. Belser, J. A., Gustin, K. M., Katz, J. M., Maines, T. R., Tumpey, T. M. Comparison of traditional intranasal and aerosol inhalation inoculation of mice with influenza A viruses. Virology. 481, 107-112 (2015).
  11. Oltean, T., Maelfait, J., Saelens, X., Vandenabeele, P. Need for standardization of influenza A virus-induced cell death in vivo to improve consistency of inter-laboratory research findings. Cell Death Discov. 10 (1), 247(2024).
  12. Nguyen, T. -Q., Rollon, R., Choi, Y. -K. Animal models for influenza research: strengths and weaknesses. Viruses. 13 (6), 1011(2021).
  13. Jin, X. -Y., et al. Comparative pathogenicity of influenza virus-induced pneumonia mouse model following intranasal and aerosolized intratracheal inoculation. Virol J. 21 (1), 240(2024).
  14. Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 164(2012).
  15. Cantu, A., Gutierrez, M. C., Dong, X., Leek, C., Anguera, M., Lingappan, K. Modulation of recovery from neonatal hyperoxic lung injury by sex as a biological variable. Redox Biol. 68, 102933(2023).
  16. Sunagar, R., Kumar, S., Namjoshi, P., Rosa, S. J., Hazlett, K. R. O., Gosselin, E. J. Evaluation of an outbred mouse model for Francisella tularensis vaccine development and testing. PLoS One. 13 (12), e0207587(2018).
  17. Cowley, P. M., Roberts, C. R., Baker, A. J. Monitoring the health status of mice with bleomycin-induced lung injury by using body condition scoring. Comp Med. 69 (2), 95-102 (2019).
  18. Gonzalez, A. J., Ijezie, E. C., Balemba, O. B., Miura, T. A. Attenuation of influenza A virus disease severity by viral coinfection in a mouse model. J Virol. 92 (23), e00881-e00918 (2018).
  19. Lv, J., et al. Kinetics of pulmonary immune cells, antibody responses and their correlations with the viral clearance of influenza A fatal infection in mice. Virol J. 11, 57(2014).
  20. Liberti, D. C., et al. Alveolar epithelial cell fate is maintained in a spatially restricted manner to promote lung regeneration after acute injury. Cell Rep. 35 (6), 109092(2021).
  21. Cipolla, D., et al. Inhalable and nasal biologics: analytical, formulation, development, and regulatory considerations. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 2024, (2025).
  22. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (6), (2014).
  23. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal models for influenza virus pathogenesis and transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نمذجة خلل التنسج وإصلاح السنخية الرئوية الوظيفية بعد الإصابة بالإنفلونزا
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.