يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل فصل ظهارة عدسة عين الفأر وكتلة الخلايا الليفية ، متبوعا بعزل الحمض النووي الريبي وتحليل qPCR. تسمح هذه الطريقة بفصل مقصورات خلايا العدسة لتحليل أكثر تفصيلا للنسخ والعمليات البيولوجية في الخلايا الظهارية مقابل خلايا الألياف المتمايزة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل الحمض النووي الريبي من ظهارة عدسة العين للماوس والكتل السائبة لخلايا الألياف
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
العدسة عبارة عن نسيج متخصص وشفاف في الغرفة الأمامية للعين يتكون من نوعين رئيسيين من الخلايا ، الخلايا الظهارية والخلايا الليفية. تغطي طبقة أحادية من الخلايا الظهارية للعدسة نصف الكرة الأمامي للعدسة ، بينما تتكون معظم العدسة من كتلة من خلايا ألياف العدسة. يحيط الغشاء القاعدي الكولاجيني ، المعروف باسم الكبسولة ، بالأنسجة بأكملها ويغلفها. تلتصق الخلايا الظهارية للعدسة بقوة بكبسولة العدسة ويمكن فصلها بسهولة عن كتلة الألياف السائبة عن طريق تقشير الكبسولة بعيدا عن الأنسجة. كانت الصعوبات في الحصول على تركيز كاف من الحمض النووي الريبي من العدد المنخفض من الخلايا الظهارية في الطبقة الأحادية للعدسة قد أعاقت سابقا دراسة الخلايا الظهارية مقابل نسخ الخلايا الليفية. يقدم هذا البروتوكول طريقة لفصل وعزل مقصورات الخلايا الظهارية والألياف وخطوات تركيز الحمض النووي الريبي بشكل نظيف للسماح بإجراء تجارب نسخية لاحقة على عينات الخلايا الظهارية من زوج واحد من عدسات الفأر. تساعد القدرة على التحقيق في أنواع الخلايا الرئيسية للعدسة بشكل فردي في التحقيق في الآليات البيولوجية لصيانة العدسة وعدم تنظيمها ، مما يتيح توصيف الاضطرابات الخاصة بنوع الخلية المسؤولة عن أمراض العدسة المرتبطة بالعمر.
المقدمة
عدسة العين هي عضو شفاف يركز الضوء بدقة على شبكية العين لإنتاج صورة واضحة. تتكون العدسة من نوعين رئيسيين من الخلايا: طبقة أحادية من الخلايا الظهارية التي تغطي نصف الكرة الأمامي والخلايا الليفية التي تشكل الكتلة السائبة للأنسجة (الشكل 1). العدسة مغلفة بغشاء قاعدي كولاجيني يعرف باسم كبسولة العدسة ، والتي تلتصق بها الخلايا الظهارية بإحكام. مع نمو العدسة ، تتكاثر الخلايا الظهارية في خط الاستواء وتتمايز إلى قذائف ناشئة من الخلايا الليفية التي يتم وضعها في طبقات على العدسة بطريقة متحدة المركز1،2،3. يعتمد نمو العدسة مدى الحياة على التكاثر المستمر لهذه المجموعة الصغيرة من الخلايا الظهارية الاستوائية التي تشكل منطقة الإنبات4. عندما تنضج خلايا الألياف ، تتحلل جميع العضيات الخلوية للتخلص من الأجسام المشتتة للضوء5،6،7،8،9،10،11 والحفاظ على شفافية الأنسجة ، ويتم ضغط خلايا الألياف الأعمق في النهاية ، مما ينتج عنه مركز عدسة صلب9،12. بسبب كبسولة العدسة المحيطة ، لا يوجد دوران للخلايا في العدسة ، وتبقى الألياف المنوية في مركز العدسة طوال الحياة حيث يتم إضافة ألياف جديدة في محيط الأنسجة أو القشرة. تتمتع الخلايا الليفية للعدسة بخصائص بصرية مختلفة اعتمادا على عمرها ويمكن أن توفر لقطة زمنية للخصائص البيولوجية المختلفة في كل مرحلة13.
على الرغم من الخيارات الجراحية المتاحة ، فإن إعتام عدسة العين ، الذي يعرف بأنه أي عتامة في العدسة الشفافة عادة ، يظل السبب الرئيسي للعمى في العالم14. يمكن أن يظهر إعتام عدسة العين في ظهارة العدسة أو القشرة أو النواة مع اختلاف الفيزيولوجيا المرضية15. ومع ذلك ، فإن الآليات الخلوية والجزيئية لتكوين إعتام عدسة العين لا تزال غير واضحة16،17. لفهم كيفية منع هذه الأنواع المختلفة من إعتام عدسة العين بشكل أفضل وتطوير بدائل للجراحة ، يجب أن نفهم بشكل أفضل كيف تحافظ هذه الأنواع المختلفة من الخلايا على توازنها في العدسة.
تلعب الخلايا الظهارية والألياف أدوارا فسيولوجية مختلفة في العدسة. يتصارع تكاثر الخلايا ، على سبيل المثال ، على ظهارة العدسة18. وفي الوقت نفسه ، تشتمل ألياف العدسة على الكتلة السائبة للعدسة ، مما يوفر الهيكل وخصائص الانكسار للعدسة9. للحصول على منظور أكثر دقة للعمليات البيولوجية التي تنطوي عليها المقصورات المختلفة للعدسة ، يجب فحص الخلايا الظهارية والألياف بشكل منفصل. هنا ، نقدم طريقة لعزل الظهارة من الكتلة السائبة للخلايا الليفية ، واستخراج mRNA من كل جزء ، وتحليل هذه النصوص باستخدام تفاعل البوليميراز الكمي الكمي للنسخ العكسي (RT-qPCR).
الشكل 1: مخطط تشريح العدسة. تتكون العدسة من نوعين من الخلايا ، خلايا ظهارية أحادية الطبقة (زرقاء وبرتقالية) تغطي نصف الكرة الأمامي وكتلة كبيرة من ألياف العدسة (بيضاء). النسيج محاط بغشاء كولاجيني رقيق يعرف باسم كبسولة العدسة (تان). الخلايا الظهارية الأمامية (الزرقاء) هادئة بينما تتكاثر الخلايا الظهارية الاستوائية (البرتقالية) وتتمايز وتتمدد لتصبح طبقات جديدة من الخلايا الليفية (بيضاء) في محيط العدسة. يتم تراكب الأجيال الجديدة من الخلايا الليفية على الأجيال السابقة من الألياف في قذائف متحدة المركز. يتم ضغط أقدم خلايا ألياف العدسة في وسط الأنسجة. تم تعديل هذا الرقم من Cheng (2024) 38. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء جميع التجارب على وفقا ل "دليل رعاية واستخدام المختبر" التابع للمعاهد الوطنية للصحة وبروتوكول معتمد من اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها (IACUC) بجامعة إنديانا.
1. منطقة العمل والمعدات وإعداد الكاشف
- قم بتخصيص أطراف ماصة الأوتوكلاف قبل الاستخدام وتخصيص صناديق من الأطراف المعقمة لتجارب الحمض النووي الريبي لتجنب تلوث الحمض النووي الريبي (RNase).
- عالج مساحة سطح العمل في غطاء الدخان ومدقات تجانس الأنسجة بمحلول إزالة التلوث RNase ، واشطفها جيدا بالماء منزوع الأيونات ، وجففها.
- انقع أدوات التشريح (ملقط منحني ، ملقط مستقيم ، ومقص تشريح دقيق) في 70٪ إيثانول لمدة 5 دقائق وجففها بمسح دقيق قبل الاستخدام.
- استخدم صواني تشريح وأطباق بتري جديدة تماما لخطوات التشريح وعزل الأنسجة.
- Aliquot 400 ميكرولتر من كاشف حمض التريزول البارد والجوانيدينيوم والفينول في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الخالية من الحمض النووي والحمض النووي الريبي سعة 1.5 مل في غطاء الدخان.
2. تشريح عدسة الماوس
- القتل الرحيم للفئران البالغة باستخدام جرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون2 متبوعا بخلع عنق الرحم كمقياس ثانوي.
- نزع نواة العينين باستخدام ملقط منحني.
- اضغط برفق على الأنسجة المحيطة بالعين بالملقط ، مما يتسبب في بروز العين من التجويف. أغلق الملقط أسفل العين وقم بإزالته عن طريق السحب بثبات لأعلى.
- انقل العينين إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل مع 750-1000 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن للفوسفات 1x (PBS).
- للتشريح ، انقل العينين إلى الآبار في صينية تشريح مع 1x PBS طازجة.
- تحت مجهر التشريح ، استخدم ملقطا مستقيما لتثبيت قاعدة العصب البصري وقطع العصب بالقرب من العين قدر الإمكان باستخدام مقص تشريح دقيق حاد.
- أدخل ملقطا مستقيما ناعما بعناية في الفتحة حيث تم توصيل العصب البصري ، واضغط لتثبيت الأنسجة في مكانها.
- أدخل طرف مقص التشريح الدقيق في نفس الفتحة واقطعها بعناية من القطب الخلفي للعين باتجاه تقاطع القرنية والصلبة. لا تقم بإدخال الأجهزة بعمق شديد لتجنب إتلاف العدسة.
ملاحظة: تشغل عدسة القوارض حجما كبيرا في العين ، وبالتالي ، يوصى بإجراء جروح ضحلة لمنع ثقب العدسة. - قطع على طول تقاطع القرنية والصلبة باستخدام مقص التشريح الدقيق ، مع فصل نصف محيط العين على الأقل.
- استخدم الملقط المستقيم لقلب أنسجة العين برفق أثناء الضغط على القرنية ، وبثق العدسة من خلال شق القرنية الصلبي.
- قم بإزالة أي مناديل كبيرة متصلة بعناية من العدسة باستخدام ملقط مستقيم ناعم.
- إذا لزم الأمر ، قم بلف العدسة برفق على مسح نظيف ودقيق باستخدام ملقط منحني لإزالة أي أنسجة خارجية ملتصقة متبقية.
ملاحظة: قم بلف الأنسجة بسرعة عبر مسح المهمة ، ولا تسمح بالجفاف المفرط للأنسجة. قد يكون هناك عتامة صغيرة على سطح العدسة بسبب البقع الجافة على كبسولة العدسة. يمكن عكس هذه العتامة بشكل عام عند وضع العدسة مرة أخرى في 1x PBS ولن تؤثر على الخطوات اللاحقة. - انقل العدسة النظيفة إلى طبق بتري مقاس 6 سم مع 1x PBS.
- باستخدام ملقط مستقيم ناعم ، اخترق كبسولة العدسة بشكل ضحل بالقرب من خط الاستواء ، وقشر كبسولة العدسة برفق بعيدا عن كتلة الألياف السائبة. ستظل الخلايا الظهارية للعدسة متصلة بالكبسولة. قم بإزالة أي قطع ألياف كبيرة من الكبسولة برفق قد تكون قد خرجت من إزالة الكبسولة.
- أمسك الكبسولة برفق بملقط مستقيم ناعم وقم بتدوير 1x PBS لإزالة أي ألياف متبقية. أي خلايا ليفية متصلة بشكل فضفاض سوف تنفصل عن الكبسولة والخلايا الظهارية.
3. عزل الحمض النووي الريبي
ملاحظة: يظهر سير عمل ملخص لعزل الحمض النووي الريبي في الشكل 2.
- قم بإيداع 2 كبسولة عدسة أو 2 كتل سائبة من الألياف في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل التي تحتوي على 400 ميكرولتر من كاشف TRIzol البارد.
ملاحظة: يجب نقل كتل الألياف من الطبق إلى الأنبوب باستخدام ملقط منحني لالتقاط الأنسجة. - قم بتغطية الأنابيب بإحكام وانقلها إلى غطاء الدخان الكيميائي للخطوات اللاحقة.
- قم بتجانس الكتل السائبة لألياف العدسة برفق باستخدام مدقة بيليه نظيفة.
ملاحظة: تأكد من تفتيت كتلة الألياف تماما. - احتضان عينات (كبسولات العدسة أو كتل الألياف السائبة المتجانسة) في TRIzol لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غطاء الدخان.
- في غطاء الدخان ، أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم لكل 400 ميكرولتر من كاشف TRIzol إلى كل أنبوب. أغلق الأنابيب بإحكام ورجها بقوة باليد لمدة 15 ثانية ، مع إبقاء الإبهام في الجزء السفلي من الأنبوب والسبابة على الغطاء.
ملاحظة: يتم استخدام أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل المذكورة في قائمة المواد بسبب الختم المحيد. إذا كنت تستخدم ماركات أخرى من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، فاختبر إغلاق الأنبوب وختمه قبل الاهتزاز ، حيث يمكن أن يتسرب محلول TRIzol والكلوروفورم من تحت غطاء الأنابيب التي لا تحتوي على ختم محكم. - احتضان العينات لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح بفصل المرحلة.
ملاحظة: يجب أن تكون هناك طبقة كاشف TRIzol وردية اللون في الجزء السفلي من الأنبوب تحتوي على الدهون والبروتين ، وطبقة بيضاء بين المراحل التي تحتوي على الحمض النووي ، ومرحلة مائية شفافة في الأعلى تحتوي على الحمض النووي الريبي. قد يكون من الصعب رؤية طبقة الحمض النووي البيضاء في عينات الخلايا الظهارية. - عينات أجهزة الطرد المركزي عند 14,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: حرك الأنابيب بعناية داخل وخارج جهاز الطرد المركزي ، مع الحرص على عدم إزعاج مراحل النقل. - قم بتجميع الأنابيب والكواشف من مجموعة تنظيف ومكثف الحمض النووي الريبي. يتم تركيب أنابيب عمود الدوران في أنبوب تجميع من المجموعة.
- في غطاء الدخان ، انقل بعناية المرحلة المائية الصافية (الطبقة العليا) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف سعة 1.5 مل ، مع ملاحظة الحجم.
ملاحظة: تجنب إزعاج أو لمس أو رسم طبقة الحمض النووي البيضاء أسفل المرحلة المائية. قم بإمالة الأنبوب عند نقل المرحلة المائية لتجنب إزعاج الطبقة البيضاء. يفضل ترك كمية صغيرة من المرحلة المائية في الأنبوب بدلا من تلويث العينة. عادة ، بالنسبة ل 200 ميكرولتر من الكلوروفورم المضاف ، يمكن استرداد 180-190 ميكرولتر من الطور المائي. - أضف 200 إيثانول مقاوم إلى المرحلة المائية بنسبة حجمية 1: 1.
ملاحظة: يمكن إضافة المخزن المؤقت لربط الحمض النووي الريبي من مجموعة المكثف بنسبة حجمية 2: 1 إلى المرحلة المائية قبل إضافة الإيثانول. يتم تخطي هذه الخطوة لزيادة إنتاجية الحمض النووي الريبي ولأن الحمض النووي الريبي لديه نقاء كاف بعد العزل. - امزج برفق عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات أو عن طريق سحب المحلول لأعلى ولأسفل. انقل المحلول المختلط إلى عمود دوران الحمض النووي الريبي باستخدام ماصة.
ملاحظة: احرص على عدم لمس الفلتر بطرف الماصة. - أعمدة دوران أجهزة الطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يوصى بتسمية غطاء العمود وجانب أنبوب التجميع للحفاظ على مجموعات الأنابيب منظمة وفي حالة انقطاع الغطاء في خطوة الطرد المركزي اللاحقة. - تخلص من التدفق وأضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت ل RNA Prep إلى عمود الدوران.
- أعمدة دوران أجهزة الطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من التدفق وأضف 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسيل الحمض النووي الريبي إلى عمود الدوران.
- أعمدة دوران أجهزة الطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من التدفق وأضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسيل الحمض النووي الريبي إلى عمود الدوران.
- أجهزة الطرد المركزي تدور الأعمدة عند 16,000 × جم لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من التدفق وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 16,000 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية لضمان جفاف عمود الدوران.
- انقل عمود الدوران إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد مسمى 1.5 مل.
- أضف 15 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase إلى مرشح الغشاء. احتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: احرص على عدم لمس الفلتر بطرف الماصة. - قم بالطرد المركزي لعمود الدوران عند 16,000 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية لإزالة الحمض النووي الريبي المنقى.
ملاحظة: سيظل غطاء أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل مفتوحا أثناء الطرد المركزي. ضع أعمدة الدوران وأنابيب الطرد المركزي الدقيقة بعناية بحيث تستقر الأغطية المفتوحة على غطاء الدوار حتى لا تتأرجح وتنكسر أثناء الطرد المركزي. يجب أن تتبع الأغطية اتجاه دوران الدوار. - قم بإزالة أعمدة الدوران وتجاهلها. سيكون الحمض النووي الريبي في السائل الذي تم جمعه في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل.
- أغلق بإحكام أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل واحتضان عينات الحمض النووي الريبي عند درجة حرارة 55-65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتعزيز الذوبان.
- ضع العينات على الفور على الثلج بعد خطوة التسخين.
- قم بتخزين العينات في درجة حرارة -80 درجة مئوية أو نسخها عكسيا إلى (كدنا) للتخزين طويل الأجل.
ملاحظة: تم تخزين عينات الحمض النووي الريبي لمدة تصل إلى 3 أشهر دون فقدان ملحوظ للتركيز. قم بتحويل عينات الحمض النووي الريبي إلى أحجام أصغر للتخزين لتقليل دورات التجميد والذوبان ومنع التدهور.
4. قياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية
- احتفظ بعينات الحمض النووي الريبي على الجليد ، وقم بتشغيل NanoDrop (مقياس الطيف الضوئي UV-Vis) ، واسمح للأداة بالتهيئة.
- ضمن قائمة الأحماض النووية ، حدد وحدة كمية الحمض النووي الريبي.
- قم بإفراغ مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية عن طريق سحب 2.0 ميكرولتر من مادة النظف من خطوة تركيز الحمض النووي الريبي على قاعدة التمثال ، وفي هذه الحالة ، الماء الجزيئي. اخفض ذراع الجهاز واقرأ العينة الفارغة.
- ارفع ذراع الجهاز ، ونظف قاعدة المستشعر باستخدام مسح نظيف وجاف ، متبوعا بمسح آخر مبلل بالماء منزوع الأيونات ، متبوعا بمسح جاف مرة أخرى.
- إذا رغبت في ذلك ، أدخل تفاصيل العينة في واجهة مقياس الطيف الضوئي UV-Vis.
- قم بتحميل 2.0 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي على قاعدة التمثال ، وقم بخفض الذراع ، وقم بقياسه.
- كرر الخطوات من 4.4 إلى 4.6 لتنظيف قاعدة التمثال بين العينات.
- عند الانتهاء، احفظ التجربة وقم بتصديرها لمزيد من القياس الكمي إذا لزم الأمر.
5. النسخ العكسي
- باستخدام نسخ عكسي عالي المعالجة ومقاوم للحرارة ، قم بالنسخ العكسي 2.0 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لألياف العدسة وجميع الحمض النووي الريبي الظهاري المستخرج باستخدام البروتوكول الموصى به من الشركة المصنعة. امزج الكواشف والحمض النووي الريبي لكل عينة في أنبوب PCR نظيف. احتفظ بجميع المحاليل وعينات الحمض النووي الريبي على الجليد.
ملاحظة: يمكن لهذا النسخ عكس نسخ ما يصل إلى 2.5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لكل تفاعل. يفترض التحويل الكامل من الحمض النووي الريبي إلى (كدنا) ، لذلك يتم استخدام تركيز بدء الحمض النووي الريبي كتركيز افتراضي لنظام (كدنا). - قم بتشغيل التفاعل في جهاز التدوير الحراري باستخدام الشروط المدرجة في الجدول 1.
- قم بتخزين (كدنا) المنسوخ العكسي عند -80 درجة مئوية أو انتقل إلى خطوة qPCR.
ملاحظة: تم تخزين عينات (كدنا) لمدة تصل إلى 4 أشهر دون أي تدهور ملحوظ ، حيث أن (كدنا) أكثر استقرارا من الحمض النووي الريبي. من المحتمل تخزين العينات لفترة أطول ، بشرط تقليل دورات التجميد والذوبان.
| درج | درجة الحرارة (درجة مئوية) | الوقت (دقيقة) | دورات |
| الصلب | 25 | 10 | 1 |
| النسخ العكسي | 50 | 10 | 1 |
| تعطيل الإنزيم | 85 | 5 | 1 |
| مسك | 4 | ∞ | 1 |
الجدول 1: شروط التدوير الحراري للنسخ العكسي. تتناغم هذه الشروط مع نسخ عكسي محدد وعالي المعالجة وقابل للحرارة. قد تختلف ظروف التشغيل حسب الإنزيم والمجموعة المستخدمة.
6. PCR الكمي في الوقت الحقيقي
- قبل بدء التفاعلات ، قم بإعداد محاليل مخزون (كدنا) إلى التركيز المطلوب عن طريق تخفيفها بالماء الجزيئي. في هذه التجارب ، سيتم استخدام 1 ميكرولتر من (كدنا) عند 5 نانوغرام / ميكرولتر لتفاعلات 5 نانوغرام / بئر. احتفظ بجميع المحاليل وعينات (كدنا) على الجليد.
ملاحظة: يوصى باستخدام لوحات مصفوفة TaqMan (تنسيق 0.1 مل) لاستيعاب تفاعلات 5-50 نانوغرام (كدنا) لكل بئر. يعد عمل حصص من (كدنا) مفيدا للحد من دورات التجميد والذوبان. في هذه الدراسة ، اقتصرت العينات على 5 دورات تجميد ذوبان كحد أقصى. - قم بإعداد مزيج رئيسي عامل يتكون من Advanced Master Mix وتحقيقات للتوصيات التجارية. انظر القسم 7 للحصول على مثال على التحضير. احتفظ بجميع المحاليل وعينات (كدنا) على الجليد.
ملاحظة: يشيع استخدام زوج من المجسات مع صبغتين مختلفتين لكل بئر. على سبيل المثال ، في هذه الدراسة ، تم استخدام Crygs-FAM-MGB كمسبار للجين ذي الأهمية ، و Ppia-VIC-MGB كعنصر تحكم داخلي. التوصيات التجارية لتركيزات المسبار والتمهيدي النهائية هي 250 نانومتر و 900 نانومتر على التوالي. إذا تم التعبير عن الهدف بشكل كبير ، فقد تكون هناك حاجة إلى مسبار محدود التمهيدي لمنع استنفاد كواشف التفاعل. - قم بتحميل مخزون (كدنا) (1 ميكرولتر) في الآبار المناسبة على لوحة qPCR ، متبوعا بمزيج رئيسي عامل (9 ميكرولتر). امزج المحاليل عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل ببطء أثناء إضافة المزيج الرئيسي. تأكد من خلط قطرة (كدنا) في المحلول وتجنب الفقاعات.
ملاحظة: اعتمادا على حساسية الهدف ، قد تحتاج اللوحة إلى تحميلها على الجليد. - أغلق لوحة qPCR عن طريق تطبيق غطاء لاصق بصري بعناية. استخدم قضيب فيلم لاصق لتنعيم الغطاء وضمان إحكام إحكام حول كل بئر.
- لوحات دوامة عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان للخلط.
- ألواح الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة لضمان عدم وجود فقاعات هواء في قاع الآبار.
- قم بتحميل اللوحة في جهاز تدوير حراري كمي PCR وتشغيله باستخدام الدورات المدرجة في الجدول 2.
ملاحظة: عادة ما تقتصر بروتوكولات qPCR التقليدية على 40 دورة. من غير المرجح أن تؤدي زيادة عدد الدورات إلى نتائج ذات مغزى ، حيث يمكن لنسخة مستهدفة واحدة نظريا أن تنتج ما يقرب من 1 تريليون أمبليكون19.
| درج | درجة الحرارة (درجة مئوية) | الوقت (التوقيت) | دورات |
| تعطيل Uracil-N-Glycosylase (UNG) | 50 | 120 | 1 |
| التمسخ | 95 | 120 | 1 |
| التمسخ | 95 | 1 | 45 |
| الصلب | 60 | 20 | |
| مسك | 4 | ∞ | 1 |
الجدول 2: شروط التدوير الحراري لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. تتناغم هذه الشروط مع سلسلة محددة من فحوصات التعبير الجيني التجارية. يتم استخدام المعلمات الافتراضية ، باستثناء زيادة دورات التضخيم من 40 إلى 45.
7. مثال على حساب الحجم ل qPCR
ملاحظة: يتوفر رمز مصدر R لآلة حاسبة الحجم للمعادلات الموضحة أدناه في الملف التكميلي 1. هذه الآلة الحاسبة مخصصة لمجسات Taqman والمزيج الرئيسي المدرج في جدول المواد.
- حدد عدد الآبار المراد سحب الآبار واحسب ما لا يقل عن 12.5٪ فائض. يعوض هذا الثابت الزائد (kالزائد) عن خطأ سحب العينة ويضمن وجود حل كاف. في هذا المثال ، سيتم استخدام 96 بئرا كهدف لإعداد العينة.
معادلة:
مثل:
ملاحظة: إذا لم يكن الفائض بنسبة 12.5٪ عددا صحيحا ، فإن الطريقة السهلة لضمان الأرقام "اللطيفة" في الخطوات اللاحقة هي التقريب إلى أقرب بئر وضبط kExcess وفقا لذلك. - احسب حجم المزيج الرئيسي العامل. في هذه التجارب ، يتم استخدام 1 ميكرولتر من (كدنا) و 9 ميكرولتر من المزيج الرئيسي العامل لكل بئر. يمكن تعديل أحجام (كدنا) والخلط الرئيسي حسب الحاجة.
معادلة:
مثل:
- احسب معدل التركيز (kConc). يستخدم هذا المعدل لإنشاء مزيج رئيسي أكثر تركيزا يعمل يخفف إلى 1x عند مزجه مع (كدنا).
معادلة:
مثل:
- احسب حجم المسبار (20x).
معادلة:
مثل:
- احسب حجم مخزون المزيج الرئيسي (2x).
معادلة:
مثل:
- ارفع المزيج الرئيسي العامل إلى الحجم المحسوب باستخدام H2O من الدرجة الجزيئية.
معادلة:
مثل:
الملف التكميلي 1: كود مصدر R لحاسبة الحجم. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم عزل ظهارة العدسة والألياف من الفئران البرية التي يبلغ عمرها 6 إلى 7 أسابيع. تم استخدام ثلاثة فئران في هذه التجارب ، وتم تجميع كبسولتين من العدسة أو كتلتين من الخلايا الليفية من كل فأر معا للحصول على تكرار بيولوجي واحد. كما هو موضح في البروتوكول ، تم استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام فصل طور كاشف TRIzol. في المتوسط ، أنتج زوج من ظهارة العدسة والكتل السائبة من الألياف 0.8 ميكروغرام (SD ± 0.2) و 9.7 ميكروغرام (SD ± 2.3) من الحمض النووي الريبي ، على التوالي. كان متوسط التركيز في شطف 15 ميكرولتر 55.4 نانوغرام / ميكرولتر...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
توضح الخطوات المعروضة هنا القدرة على عزل الحمض النووي الريبي من مقصورات العدسة المنفصلة التي يمكن عكسها بنجاح إلى (كدنا) لطرق البيولوجيا الجزيئية. نظرا للطبيعة الحساسة لطرق التحليل ، من الضروري أن تكون العدسة نظيفة من الأنسجة المرفقة في مرحلة التشريح. قد يتطلب ذلك بعض التكرارات من لف العدسة على Kimwipe لتحقيق النظافة المناسبة. يجب توخي الحذر حتى لا تخترق العدسة بعمق شديد أثناء فصل الكبسولة الكولاجينية عن حقسم الكتلة السائبة الليفية لتجنب تلويث عينات الخلايا الظهارية بكميات كبيرة من الخلا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل من خلال منحة R01 EY032056 (إلى CC) من المعهد الوطني للعيون.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أجهزة الطرد المركزي والدوار | فيشر العلمية | 14285554 م | |
| الكلوروفورم ، درجة HPLC | ألفا عيصر | 22920 | |
| الإيثانول (190 مقاوم) | مختبرات ديكون | 2801 | |
| الإيثانول (200 برهان) | فيشر الريكواشف الحيوية | BP2818 | |
| فيشربراند بيليه مدقة | فيشر العلمية | 12-141-363 | |
| ملقط منحني. ملاقط الطلاب # 7 | الأدوات الدقيقة العالمية | 501981 | |
| ملقط ، مستقيم. دومون # 5 | أدوات العلوم الجميلة | 11252-40 | |
| ملقط ، مستقيم. ملاقط الطلاب # 4 | الأدوات الدقيقة العالمية | 501978 | |
| Kimwipes صغير | كيمبرلي كلارك | 34155 | مسح المهام الدقيق |
| MicroAmp قضيب فيلم لاصق | الأنظمة الحيوية التطبيقية | 4333183 | |
| MicroAmp EnduraPlate لوحة تفاعل واضحة سريعة 96 بئر مع الباركود | الأنظمة الحيوية التطبيقية | 4483485 | |
| الماصات الدقيقة | إيبندورف | 01-671-120 | |
| مجهر ، تشريح | كارل زايس | SteREO ديسكفري.V8 | |
| غطاء لاصق بصري صغير أمبير | الأنظمة الحيوية التطبيقية | 4360954 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | الأنظمة الحيوية التطبيقية | أ37834 | |
| MixMate لوحة دوامة خلاط | إيبندورف | 5353000529 | |
| المياه الجزيئية | فيشر العلمية | BP28191 | |
| Nanodrop مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية Microvolume | ثيرمو ساينتفيك | ND-ONE-W | |
| نوك ميكروويل ميني صواني | فيشر العلمية | 12-565-154 | علبة تشريح |
| أنابيب PCR | VWR | 201007-012 | |
| طبق بتري ، 60 مم × 15 مم | فيشر العلمية | FB0875713A | |
| محلول ملحي من الفوسفات ، 1x دولبيكو | جيبكو | 14190-136 | |
| نصائح ماصة ، 10 & تخرج L | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 1161-3700 | |
| نصائح ماصة ، 1250 & تخرج L XL | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 1161-1720 | |
| نصائح ماصة ، 200 & تخرج الملف الشخصي | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 1163-1700 | |
| نظام QuantStudio 3 PCR في الوقت الحقيقي | الأنظمة الحيوية التطبيقية | ط28567 | |
| النسخ العكسي ، SuperScript IV VILO ؛ | إنفيتروجين | 11756050 | نسخ عكسي عالي المعالجة ومقاوم للحرارة |
| مجموعة RNA النظيفة والمكثفة 5 | زيمو | ز1013 | |
| RNase خالية من المياه | فيشر الريكواشف الحيوية | BP2819 | |
| RNaseZap | سيغما | التوصية 2020 | محلول إزالة التلوث RNase |
| أجهزة الطرد المركزي الدقيقة SealRite 1.5 مل أنابيب | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 1615-5500 | |
| سوبر فاين فاناس 8 سم | الأدوات الدقيقة العالمية | 501778 | مقص |
| TaqMan FAST Advanced Master Mix ل qPCR | الأنظمة الحيوية التطبيقية | 4444557 | |
| مسبار TaqMan للتعبير الجيني (FAM) (MTO) | ثيرموفيشر العلمية | 4448892 | |
| تريزول | إنفيتروجين | 15596026 | محلول حمض الجوانيدينيوم والفينول |
| خلاط دوامة | ثيرمو ساينتفيك | 88880017 |
المراجع
- Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the Ocular Lens. , Cambridge University Press. (2004).
- Bassnett, S., Winzenburger, P. A. Morphometric analysis of fibre cell growth in the developing chicken lens. Exp Eye Res. 76 (3), 291-302 (2003).
- Kuszak, J. R. The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens. Int Rev Cytol. 163, 305-350 (1995).
- Yamamoto, N., Majima, K., Marunouchi, T. A study of the proliferating activity in lens epithelium and the identification of tissue-type stem cells. Med Mol Morphol. 41 (2), 83-91 (2008).
- Bassnett, S. On the mechanism of organelle degradation in the vertebrate lens. Exp Eye Res. 88 (2), 133-139 (2009).
- Bassnett, S. The fate of the Golgi apparatus and the endoplasmic reticulum during lens fiber cell differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (9), 1793-1803 (1995).
- Bassnett, S. Lens organelle degradation. Exp Eye Res. 74 (1), 1-6 (2002).
- Bassnett, S., Beebe, D. C. Coincident loss of mitochondria and nuclei during lens fiber cell differentiation. Dev Dyn. 194 (2), 85-93 (1992).
- Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: Structural determinants of eye lens transparency. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
- Vrensen, G. F., Graw, J., De Wolf, A. Nuclear breakdown during terminal differentiation of primary lens fibres in mice: A transmission electron microscopic study. Exp Eye Res. 52 (6), 647-659 (1991).
- Counis, M. F., et al. Analysis of nuclear degradation during lens cell differentiation. Cell Death Differ. 5 (4), 251-261 (1998).
- Piatigorsky, J. Lens differentiation in vertebrates. A review of cellular and molecular features. Differentiation. 19 (3), 134-153 (1981).
- Al-Khudari, S., Donohue, S. T., Al-Ghoul, W. M., Al-Ghoul, K. J. Age-related compaction of lens fibers affects the structure and optical properties of rabbit lenses. BMC Ophthalmol. 7, 19(2007).
- World Report on Vision. , World Health Organization. Geneva. (2019).
- Hashemi, H., et al. Global and regional prevalence of age-related cataract: A comprehensive systematic review and meta-analysis. Eye (Lond). 34 (8), 1357-1370 (2020).
- Cheng, C., Gong, X. Diverse roles of eph/ephrin signaling in the mouse lens. PLoS One. 6 (11), e28147(2011).
- Ibaraki, N. A brighter future for cataract surgery. Nat Med. 3 (9), 958-960 (1997).
- Scullica, L., Grimes, P., Mcelvain, N. Further autoradiographic studies of the lens epithelium. Normal and x-irradiated rat eyes. Arch Ophthalmol. 70, 659-665 (1963).
- Caraguel, C. G., Stryhn, H., Gagne, N., Dohoo, I. R., Hammell, K. L. Selection of a cutoff value for real-time polymerase chain reaction results to fit a diagnostic purpose: Analytical and epidemiologic approaches. J Vet Diagn Invest. 23 (1), 2-15 (2011).
- 60/280 and 260/230 ratios. , Thermo Scientific. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/Product-Bulletins/T123-NanoDrop-Lite-Interpretation-of-Nucleic-Acid-260-280-Ratios.pdf (2009).
- Beyer, E. C., Kistler, J., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Antisera directed against connexin43 peptides react with a 43-kd protein localized to gap junctions in myocardium and other tissues. J Cell Biol. 108 (2), 595-605 (1989).
- Gong, X., Cheng, C., Xia, C. H. Connexins in lens development and cataractogenesis. J Membr Biol. 218 (1-3), 9-12 (2007).
- Leonard, M., Zhang, L., Bleaken, B. M., Menko, A. S. Distinct roles for n-cadherin linked c-src and fyn kinases in lens development. Dev Dyn. 242 (5), 469-484 (2013).
- Leonard, M., et al. Modulation of n-cadherin junctions and their role as epicenters of differentiation-specific actin regulation in the developing lens. Dev Biol. 349 (2), 363-377 (2011).
- Logan, C. M., et al. N-cadherin regulates signaling mechanisms required for lens fiber cell elongation and lens morphogenesis. Dev Biol. 428 (1), 118-134 (2017).
- Maddala, R., Nagendran, T., Lang, R. A., Morozov, A., Rao, P. V. Rap1 gtpase is required for mouse lens epithelial maintenance and morphogenesis. Dev Biol. 406 (1), 74-91 (2015).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178(2022).
- Paul, D. L., Ebihara, L., Takemoto, L. J., Swenson, K. I., Goodenough, D. A. Connexin46, a novel lens gap junction protein, induces voltage-gated currents in nonjunctional plasma membrane of xenopus oocytes. J Cell Biol. 115 (4), 1077-1089 (1991).
- Rong, P., et al. Disruption of gja8 (alpha8 connexin) in mice leads to microphthalmia associated with retardation of lens growth and lens fiber maturation. Development. 129 (1), 167-174 (2002).
- Terrell, A. M., et al. Molecular characterization of mouse lens epithelial cell lines and their suitability to study RNA granules and cataract associated genes. Exp Eye Res. 131, 42-55 (2015).
- White, T. W., Bruzzone, R., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Mouse cx50, a functional member of the connexin family of gap junction proteins, is the lens fiber protein mp70. Molecular Biology of the Cell. 3 (7), 711-720 (1992).
- Xia, C. H., et al. Altered cell clusters and upregulated Aqp1 in connexin 50 knockout lens epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (11), 27(2024).
- Beyer, E. C., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Connexin43: A protein from rat heart homologous to a gap junction protein from liver. J Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2621-2629 (1987).
- Gong, X., et al. Disruption of Alpha3 connexin gene leads to proteolysis and cataractogenesis in mice. Cell. 91 (6), 833-843 (1997).
- Xu, L., Overbeek, P. A., Reneker, L. W. Systematic analysis of E-, N- and P-cadherin expression in mouse eye development. Exp Eye Res. 74 (6), 753-760 (2002).
- Nishina, S., et al. Pax6 expression in the developing human eye. Br J Ophthalmol. 83 (6), 723-727 (1999).
- Wistow, G., et al. Gamman-crystallin and the evolution of the betagamma-crystallin superfamily in vertebrates. FEBS J. 272 (9), 2276-2291 (2005).
- Cheng, C. Tissue, cellular, and molecular level determinants for eye lens stiffness and elasticity. Front Ophthalmol (Lausanne). 4, 1456474(2024).
- Huynh, P. N., Cheng, C. Spatial-temporal comparison of eph/ephrin gene expression in ocular lenses from aging and knockout mice. Front Ophthalmol (Lausanne). 4, 1410860(2024).
- Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. J Vis Exp. (31), e1519(2009).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
