مقالة منهجية

توليد عضيات الجلد المستوية الحاملة للشعر المستوية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان باستخدام نظام زراعة واجهة الهواء والسائل

3.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69088

⸱

أكتوبر 17, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Embryology, Leiden University Medical Center, 2The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center, 3CEA, Inserm, IRIG, UA13 BGE, Biomics, University of Grenoble Alpes

في هذه المقالة

ملخص

يحدد هذا البروتوكول طريقة لإنتاج عضيات الجلد التي تحتوي على بصيلات الشعر من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية باستخدام نظام زراعة واجهة الهواء والسائل المستوي ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية لتكرار بنية الجلد ووظيفته.

الملخص

توفر عضيات الجلد المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC) التي تحتوي على بصيلات الشعر نموذجا متطورا في المختبر للتحقيق في التفاعلات بين الخلايا داخل البيئة المكروية للجلد. تم تطويره في البداية في تكوين كيسي مقلوب ، حيث تتعرض الأدمة للبيئة وتواجه البشرة إلى الداخل باتجاه المركز العضوي ، ويمكن لاحقا نقل SOs إلى تكوين مستو في نظام زراعة واجهة الهواء والسائل (ALI) ، والذي يشبه إلى حد كبير فسيولوجيا جلد الإنسان. تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا شاملا لتوليد واختيار SOs الكيسية التي يمكن تشريحها إلى SOs مستوية وتطويرها بشكل أكبر في نظام زراعة ALI. يتضمن البروتوكول نقاط تفتيش محددة للتقييم النوعي العياني في المراحل الحرجة من تطور العضيات ، ويفصل الخطوات الفنية المطلوبة لتسطيح SOs الكيسية إلى جلد مستو ، ويحدد الظروف المثلى لزراعة ALI ، ويوضح النتائج من خلال التحليل الجزيئي. في اليوم 27 ، كشف تلطيخ التألق المناعي بعلامات خاصة بالنسب عن ظهارة مصطبغة متعددة الطبقات مع زوائد جلدية ، بما في ذلك بصيلات الشعر والهياكل الشبيهة بالغدد الدهنية. يوفر هذا البروتوكول طريقة قوية لتوليد SOs مستوية مع زوائد ، مما يوفر نموذجا فسيولوجيا ذا صلة في المختبر. يدعم هذا النظام التطبيقات المتنوعة في أبحاث الجلد وقد تم استخدامه بالفعل بنجاح لنمذجة عدوى مسببات الأمراض ، وتلف الأنسجة الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية ، والاستجابات للأدوية.

المقدمة

يشكل الجلد حاجزا وقائيا حاسما بين الكائنات الحية وبيئتها ، بينما ينظم أيضا درجة حرارة الجسم وتوازن الماء والمدخلات الحسية. يتكون من ثلاث طبقات رئيسية: البشرة ، ظهارة الخلايا الكيراتينية الطبقية ذات السطح المتقرن. الأدمة ، وهي نسيج ضام غني بالمصفوفة خارج الخلية ، والخلايا الليفية ، والأعصاب ، والأوعية الدموية ، والخلايا المناعية ؛ وتحت الجلد ، والذي يتكون بشكل أساسي من الخلايا الشحمية تحت الجلد. تعتمد وظيفة جلد الإنسان أيضا على الزوائد المتخصصة مثل بصيلات الشعر (HFs) والغدد الدهنية والغدد العرقية1.

تعد اضطرابات الجلد من بين الحالات الطبية الأكثر شيوعا في جميع أنحاء العالم2،3. تاريخيا ، تم إجراء معظم الدراسات التي تركز على الجلد باستخدام النماذج الحيوانية4 ، والتي تكرر التعقيد الفسيولوجي للعضو في سياق نظامي. ومع ذلك ، فإن الاختلافات الكبيرة بين الأنواع4 ، إلى جانب المخاوف الأخلاقية المتزايدة ، قد دفعت إلى تطوير نماذج الجلد البشري ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.

تنقسم نماذج الجلد البشري التقليدية إلى فئتين: البشرة البشرية المعاد بناؤها ، والتي تتكون من خلايا الكيراتينية الطبقية ، وجلد الإنسان المعاد بناؤه ، والذي يشتمل بالإضافة إلى ذلك على حجرة جلدية أساسية تتكون من الخلايا الليفية المضمنة في مصفوفة الكولاجين5. على الرغم من أن كلا النوعين قد عززا بشكل كبير فهمنا لفسيولوجيا الجلد ، إلا أنهما يفتقران إلى الدقة المعمارية الكاملة والتنوع الخلوي لجلد الإنسان الأصلي. يتمثل أحد القيود الرئيسية لهذه النماذج في عدم وجود زوائد جلدية مثل HFs ، مما يجعلها غير مناسبة للبحث واختبار الأدوية المتعلقة باضطرابات الجلد التي تنطوي على نمو الشعر وتجديده6. في حين تم الإبلاغ عن أنظمة أكثر تقدما تتضمن HFs ، فإنها إما تفشل في تلخيص تعقيد هيكل HF والبيئة الدقيقة بشكل كامل أو تعتمد على تقنيات معقدة مثل الطباعة الحيوية أو القولبة الدقيقة7،8،9،10.

نموذج الجلد الجديد الذي يعالج العديد من هذه التحديات هو عضوي الجلد (SO) ، الذي تم إنشاؤه من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان (hiPSCs) 11. بمحاكاة التطور الجنيني ، يمكن توجيه hiPSCs نحو الأديم الظاهر لسطح الجمجمة وسلالات القمة العصبية القحفية ، والتنظيم الذاتي في الهياكل الكيسية التي تشبه إلى حد كبير جلد الإنسان. تحتوي SOs هذه على جميع أنواع خلايا الجلد غير المناعية تقريبا ، منظمة في بشرة طبقية وأدمة غنية بالمصفوفة خارج الخلية. الأهم من ذلك ، أن SOs تدعم نمو الزوائد الجلدية: HFs والغدد الدهنية. نظرا لقابلية التوسع غير المحدودة تقريبا ل hiPSCs ، تسمح SOs بالهندسة الوراثية المتطورة وتطوير أدوات وظيفية جديدة. على هذا النحو ، تمثل المنظمات الداعمة تقدما كبيرا في هذا المجال وتعد بالتطبيقات في علم الأحياء التنموي ونمذجة الأمراض واختبار الأدوية والطب التجديدي.

ومع ذلك ، لا يزال هناك قيد كبير: تشكل SOs هياكل كيسية مقلوبة توجد فيها البشرة داخل الكيس الجلدي ، محمية من القوى الميكانيكية ومغمورة في وسط مائي. هذا التكوين ليس فقط غير دقيق من الناحية الفسيولوجية ولكنه يمنع أيضا إنشاء واجهة الهواء والسائل (ALI). نتيجة لذلك ، فإن SOs الكيسية لها تطبيق محدود للدراسات التي تنطوي على حاجز البشرة أو القوى الميكانيكية أو العلاجات القمية المباشرة. لمعالجة هذه المشكلة ، يتم عرض طريقة قابلة للتكرار لتسطيح SOs الكيسية ميكانيكيا ثم زراعتها لاحقا كجلد مستو تحت حالة ALI. هذا النهج ، الذي أبلغ عنه في الأصل Jung et al. ، يعيد تنظيم بنية الأنسجة بحيث تتعرض البشرة القمية للهواء ، وبالتالي تعزيز المزيد من التقسيم الطبقي ووظيفة الحاجز12. تحتفظ العضيات المستوية الحاملة للشعر الناتجة بالبنية المعقدة لجلد الإنسان بينما تعكس أيضا اتجاه الأنسجة الدقيق من الناحية الفسيولوجية ، مما يتيح الوصول التجريبي إلى السطح القمي. على الرغم من أن الإجراء طويل (~ 100 يوم) ويتضمن بعض الخطوات الصعبة تقنيا ، لا سيما عند تشريح SOs الكيسية إلى SOs مستوية ، فقد يكون ذا أهمية خاصة للباحثين الذين يعملون بالفعل مع SOs أو غيرهم من مكافئات الجلد البشري الذين يرغبون في زيادة الأهمية الفسيولوجية لأنظمتهم النموذجية.

البروتوكول

يعرض الشكل 1 سير العمل لإنشاء SOs مستوية باستخدام نظام زراعة ALI. يحدد القسم الأول توليد SOs الكيسية من hiPSCs بناء على المنهجية التي ابتكرها Karl R. Koehler11 ، مع تعديلات طفيفة (الشكل 2). يوضح القسم الثاني بالتفصيل الإجراء الخاص بتطوير SOs الكيسية إلى SOs مستوية باستخدام نظام زراعة ALI كما هو موضحسابقا 12 ، مع التعديلات (الشكل 3). جميع المواد الكيميائية والمواد مدرجة في جدول المواد. تم استخدام ثلاثة خطوط hiPSC الموصوفة سابقا (LUMCi001-A و LUMCi004-A و WT2) لتوليد SOs (https://hpscreg.eu/) 13.

1. توليد SOs الكيسية

يعرض الشكل 2 الأشكال المتوقعة والشاذة في الخطوات الرئيسية.

  1. تجميع الخلايا (اليوم -2)
    1. قم بزراعة hiPSCs في صفيحة قياسية مكونة من 6 آبار حتى تصل إلى 70-80٪ من التقاء.
    2. اغسل الخلايا ب 1 مل من محلول ملحي بالفوسفات (DPBS) من دولبيكو. أضف 1 مل من كاشف تفكك الخلية (CDR) واحتضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة ~ 6 دقائق لفك hiPSCs دون فصلها عن المصفوفة (تجنب فرط الهضم).
    3. استنشق CDR وأضف 1 مل من وسط صيانة hiPSC (hiMM) الذي يحتوي على 10 ميكرومتر مثبط ROCK. افصل الخلايا برفق عن طريق سحب العاصة لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة P1000 وقم بإعداد معلق خلية عند 3.5 × 103 خلايا/مل.
    4. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من لوحة التثبيت ذات القاع على شكل حرف U ذات 96 بئرا ومنخفضة للغاية باستخدام ماصة متعددة القنوات. قم بالطرد المركزي للطبق عند 110 × جم لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  2. تخفيف مثبطات الصخور (اليوم -1)
    1. تحضير هيم إم إم يحتوي على 100 ميكروغرام / مل من مكمل مضاد للمضادات الحيوية (AAS).
    2. قم بتوزيع 100 ميكرولتر لكل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  3. تحريض الأديم الظاهر السطحي (اليوم 0)
    1. قم بإذابة الحجم المناسب من مصفوفة غشاء الطابق السفلي على الجليد قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. قم بإعداد الحد الأدنى من الوسط hiPSC (hiMinM) المكمل بمصفوفة الغشاء القاعدي (2٪) ، BMP4 (2.5 نانوغرام / مل) ، SB431542 (10 ميكرومتر) ، و bFGF (4 نانوغرام / مل) (يشار إليها باسم hiMinM + SFB) على الجليد.
      ملاحظة: قد يلزم تعديل تركيز BMP4 اعتمادا على خط الخلية المستخدم (انظر المناقشة).
    2. اجمع مجاميع الخلايا في أنبوب دائري القاع سعة 2 مل باستخدام طرف ماصة P200 ذات فتحة عريضة.
      ملاحظة: استخدم أطراف الفتحة العريضة المتوفرة تجاريا. حدد فتحة بقطر داخلي لا يقل عن 2 مم لتقليل الضرر الذي يلحق بالركام. بدلا من ذلك ، قم بتسخين مشرط باستخدام معقم حلقة الأشعة تحت الحمراء واستخدمه لإنشاء فتحة واسعة من طرف الماصة التقليدي.
    3. اسمح للركام بالاستقرار في الجزء السفلي من الأنبوب. استنشق الوسط بعناية وأضف 2 مل من hiMinM لغسل الركام. كرر الغسيل ليصبح المجموع 3 مرات.
    4. انقل مجاميع الخلايا في hiMinM + SFB على البارد إلى بئر من لوحة ذات 6 آبار مبردة مسبقا باستخدام طرف ماصة P1000 ذات فتحة عريضة. بعد ذلك، انقل كل ركام في 100 ميكرولتر من hiMinM+SFB إلى لوحة ملحقة منخفضة للغاية ذات قاعدة U ذات 96 بئرا باستخدام طرف ماصة P200 ذات فتحة عريضة. ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
      ملاحظة: استخدم مجهره مجسما موضوعا تحت غطاء تدفق الهواء الرقائقي (LAF) لهذه الخطوة.
  4. تحريض مجموعات الخلايا غير الظهارية (اليوم 3)
    1. قم بإعداد hiMinM يحتوي على LDN193189 (1 ميكرومتر) و bFGF (250 نانوغرام / مل) و AAS (100 ميكروغرام / مل). قم بتوزيع 25 ميكرولتر في كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات.
    2. حرك اللوحة برفق لضمان التوزيع المتساوي للوسط. ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  5. توفير العناصر الغذائية (اليوم 6)
    1. قم بإعداد hiMinM يحتوي على AAS (100 ميكروغرام / مل). قم بتوزيع 75 ميكرولتر في كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات.
    2. حرك اللوحة برفق لضمان التوزيع المتساوي للوسط. ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  6. مرطبات متوسطة (اليوم 8 واليوم 10)
    1. قم بإعداد hiMinM يحتوي على AAS (100 ميكروغرام / مل). قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسط بعناية من كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من الوسط الطازج في كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات.
    2. حرك اللوحة برفق لضمان التوزيع المتساوي للوسط. ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  7. الانتقال إلى ألواح 24 بئرا منخفضة التعلق (اليوم 12)
    1. قم بإذابة الحجم المناسب لمصفوفة غشاء الطابق السفلي على الجليد قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. قم بإعداد وسط النضج العضوي (OMM) باستخدام وسيط متقدم (49٪ حجم / حجم) ، ووسط قاعدي عصبي (49٪ حجم / حجم) ، ومكملات الجلوتامين (1x) ، ومكملات B-27 ناقص فيتامين أ (0.5x) ، ومكملات N2 (0.5x) ، و 2-Mercaptoethanol (0.1 مليم) ، و AAS (100 ميكروغرام / مل). قم بإعداد الحجم المناسب من OMM البارد الذي يحتوي على 1٪ مصفوفة غشاء القاعدة (OMM1٪ M) واحتفظ بها على الثلج.
      ملاحظة: استخدم معدات الحماية الشخصية واعمل في منطقة جيدة التهوية عند التلاعب ب 2-mercaptoethanol.
    2. اجمع مجاميع الخلايا في أنبوب دائري القاع سعة 2 مل باستخدام طرف ماصة P1000 ذات فتحة عريضة.
    3. اسمح للركام بالاستقرار في الجزء السفلي من الأنبوب. استنشاق الوسط بعناية. أضف 1.5 مل من الوسط المتقدم لغسل الركام. كرر الغسيل ليصبح المجموع 3 مرات.
    4. انقل مجاميع الخلايا في OMM1٪ M البارد إلى بئر من صفيحة مكونة من 6 آبار مبردة مسبقا باستخدام طرف ماصة P1000 ذات فتحة عريضة. بعد ذلك، انقل كل ركام في 500 ميكرولتر من OMM1٪M إلى لوحة منخفضة التعلق ذات 24 بئرا باستخدام طرف ماصة P1000 ذات فتحة عريضة. ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
      ملاحظة: استخدم مجهريا مجسما موضوعا تحت غطاء LAF لهذه الخطوة.
  8. مرطبات متوسطة (يوم 15)
    1. قم بإذابة الحجم المناسب لمصفوفة غشاء الطابق السفلي على الجليد قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. تحضير الحجم المناسب من OMM1٪ M. استمر على الثلج.
    2. باستخدام أطراف P1000 ، قم بإزالة 250 ميكرولتر من الوسط بعناية من كل بئر. ثم أضف 250 ميكرولتر من OMM1٪ M إلى كل بئر. ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 على شاكر مداري مضبوطة عند 65 دورة في الدقيقة.
  9. بين اليوم 18 إلى اليوم 45 ، قم بإجراء تغيير نصف متوسط (250 ميكرولتر) باستخدام OMM أيام الاثنين والأربعاء والجمعة.
  10. بين اليوم 45 واليوم 90 ، قم بإجراء تغيير نصف متوسط (250 ميكرولتر) مع OMM يومي الاثنين والأربعاء وتغيير متوسط كامل يوم الجمعة.

2. الانتقال من SOs الكيسية إلى SOs المستوية

ملاحظة: تظهر SOs الكيسية مورفولوجيا مقلوبة ، حيث تواجه البشرة إلى الداخل باتجاه مركز الشكل العضوي والأدمة على اتصال مع البيئة الخارجية. بين اليوم 70 واليوم 90 ، اعتمادا على خط الخلية وكفاءة التمايز ، يكون التمايز فوق القاعدي المبكر للبشرة متقدما جيدا ، ويتم تطوير أوتاد الشعر. هذه هي المرحلة التي يتم فيها نقل SOs الكيسية إلى نظام زراعة ALI للحصول على أنسجة تشبه إلى حد كبير جلد الإنسان الأصلي.

  1. اختيار SOs الكيسية بين اليوم 70 واليوم 90 للانتقال إلى SOs المستوية
    1. اختر SOs الكيسية التي لا يقل قطرها عن 5 مم والحد الأدنى من محتوى المنتج الثانوي (الخلايا الوسيطة التي تتراكم في قطب واحد من الكيس وقد تحتوي أيضا على غضروف). استخدم وجود لوحات / أوتاد الشعر كمؤشر جودة لتطور الجلد العضوي (الشكل 1 أ والشكل 2 ب).
      ملاحظة: قم بتسطيح 2-4 SOs مستوية من كل SO كيسي ، حسب حجمها.
  2. تحضير ملحق مطلي بالكولاجين (تنسيق 12 بئرا)
    1. تحضير محلول هيدروكسيد الصوديوم (1 م) عن طريق إذابة الكمية المناسبة من كريات هيدروكسيد الصوديوم في الماء المقطر. قم بتعقيم محلول هيدروكسيد الصوديوم باستخدام مرشح غشاء بحجم المسام 0.2 ميكرومتر.
      ملاحظة: استخدم معدات الحماية الشخصية واعمل في منطقة جيدة التهوية عند معالجة محلول هيدروكسيد الصوديوم (1 متر).
    2. على الجليد ، قم بتخفيف محلول الكولاجين من النوع الأول إلى تركيز نهائي قدره 2 مجم / مل باستخدام 10x PBS (إلى تركيز نهائي 1x) ، وهيدروكسيد الصوديوم (5 ملليمتر) ، والماء المقطر لضبط الحجم النهائي. وزعي 150 ميكرولتر من محلول الكولاجين في كل ملحق يوضع في صفيحة قياسية مكونة من 12 بئرا. احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح لهلام الكولاجين بالبلمرة.
  3. تسطيح الكيس SO (الشكل 3)
    ملاحظة: استخدم مجهره مجسما موضوعا تحت غطاء LAF لهذه الخطوة.
    1. ضع الكيس SO المحدد بكمية صغيرة من الوسط على غطاء طبق بتري مقاس 10 سم باستخدام فتحة عريضة P1000. استئصال المنتجات الثانوية للSO بعناية باستخدام مشرط معقم. استخدم ملقطا معقما على الجانب الآخر لتثبيت العضو العضوي أثناء الاستئصال (الشكل 3 أ).
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، يشبه SO الكيسي بالونا مفرغا من الهواء مع وضع طبقتين من الجلد فوق الأخرى.
    2. استئصال حوالي 1 مم من نهايات العضو العضوي المجاور للشق الأول باستخدام مشرط (الشكل 3 ب ، و). افتح الطبقة العليا من الجلد برفق باستخدام ملقط معقم (الشكل 3C ، G).
    3. قطع قطعة المنديل إلى 2-4 قطع حسب الحجم. انقل كل قطعة من الأنسجة بدقة وضعها في ملحق مغطى بالكولاجين بحيث تكون البشرة متجهة لأعلى ، باستخدام ملقط معقم (الشكل 3D ، H).
      ملاحظة: قم بتقييم الأوتاد تحت المجهر المجسم لضمان الاتجاه الصحيح للبشرة.
    4. انقل الملحق مرة أخرى إلى لوحة قياسية مكونة من 12 بئرا تحتوي على 600 ميكرولتر من OMM. ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 (الشكل 3E).
  4. صيانة طويلة الأمد لثقافة واجهة الهواء والسائل
    1. بين اليوم 1 واليوم 21 بعد التسطيح ، قم بإجراء تغيير متوسط كامل (600 ميكرولتر) باستخدام OMM أيام الاثنين والأربعاء والجمعة. ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 و 95٪ رطوبة نسبية.
    2. بين اليوم 21 واليوم 27 بعد التسطيح ، ضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 بدون رطوبة لتقوية حاجز الجلد. قم بإجراء تغيير متوسط كامل (800 ميكرولتر) باستخدام OMM يوميا.

النتائج

تم وصف التحسين ونقاط التفتيش لتوليد SOs الكيسية على نطاق واسع14. لذلك ، تركز الطريقة المعروضة هنا على نقاط التفتيش الرئيسية التي يجب تقييمها أثناء تطور العضيات الكيسية (الشكل 2 أ) ، واختيار تلك المناسبة للانتقال إلى SOs المستوية (الشكل 2 ب) ، والمعايير المستخدمة لتقييم جودة SOs المستوية الناتجة (الشكل 1B-D والشكل 4).

تتمثل الخطوة الرئيسية الأولى في تطوير SOs الكيسية في تكوين ركام خلوي واحد كثيف يشتمل على غالبية الخلايا الموجودة في البئر في اليوم 0 (الشكل 2 أ). يتم تحقيق ذلك من خلال التعامل الدقيق والسريع مع hiPSCs ، جنبا إلى جنب مع الطرد المركزي الفعال ، مما يؤدي إلى توزيع متجانس للخلايا في مركز البئر (الشكل 2 أ ، اليوم -2). يؤدي الحث الصحيح للأديم الظاهر السطحي إلى تكوين ظهارة رقيقة وشفافة على الطبقة الخارجية من الركام بحلول اليوم 3 (الشكل 2 أ) ، والتي تتطور لاحقا ، بعد تحريض الخلايا الوسيطة ، إلى مجاميع كيسية شفافة تحتوي على نواة داكنة من الخلايا الوسيطة بحلول اليوم 8. بين اليومين 12 و 20 ، يصبح الكيس الظهاري مغطى بطبقة رقيقة من الخلايا الوسيطة التي تتراكم في قطب واحد من الكيس (الشكل 2 أ ، اليوم 12). يؤدي الحث المشترك الناجح للخلايا الظهارية واللحمة المتوسطة في النهاية إلى ظهارة طبقية ، مما يتيح تكوين لويحات وأوتاد الشعر ، والتي تصبح مرئية بين اليومين 50 و 80 (الشكل 2 أ ، ب). من خلال اختيار SOs المناسبة بناء على نقاط التفتيش التنموية هذه ، يمكن تقليل التباين المورفولوجي والحجم في وقت الانتقال إلى SOs المستوية.

يعد وجود لويحات الشعر أو الأوتاد هو معيار التضمين الأساسي لاختيار SOs الكيسية لمزيد من التطوير في SOs المستوية. عادة ما ينتج غياب اللويحات المرئية عن خلل في التقسيم الطبقي للبشرة ، والذي يظهر بعد ذلك رقيقا للغاية (الشكل 2 ب ، اليوم 50 ، اللوحة الوسطى). للتسطيح ، يتم استخدام الخراجات الكبيرة فقط (قطرها 5 مم على الأقل) مع المنتجات الثانوية المركزة في قطب واحد والحد الأدنى من المنتجات الثانوية بشكل عام ، بينما يتم استبعاد تلك التي تحتوي على منتجات ثانوية غير مستقطبة (الشكل 2 ب).

بمجرد دخولها في تكوينها المستوي ، يعتمد فحص الجودة الأولي للمنظمات الداعمة على المراقبة العيانية لنمو HF تحت المجهر الفراغي. تستطيل HFs تدريجيا طوال 27 يوما من ثقافة ALI ، حيث تصبح الغدد الدهنية مرئية في اليوم 14 ويزداد التصبغ تدريجيا بمرور الوقت (الشكل 1 ب ، ج). نظرا للقيود المكانية التي يفرضها غشاء الإدخال الموجود أسفل هلام الكولاجين الرقيق مباشرة ، يمكن أن تنمو HFs الموجودة في محيط SO المستوي فقط بشكل كامل ، وهي تفعل ذلك في اتجاه مواز للإدخال (الشكل 1 ج). والجدير بالذكر أن جذع الشعرة نادرا ما يبرز خارج سطح الجلد. لمزيد من تقييم جودة SOs المستوية المطورة ، يمكن تضمينها في البارافين أو OCT ، وتقسيمها ، وتلطيخها لفحص تكوينها وتشكلها. يكشف تلطيخ H&E أن هيكلها يشبه إلى حد كبير هيكل جلد الإنسان (الشكل 4 أ) ، مع ظهارة طبقية بالكامل وأدمة مفصولة بغشاء قاعدي. يؤكد تلطيخ التألق المناعي باستخدام علامات محددة لطبقات البشرة المختلفة والغدد الدهنية والخلايا الصباغية بنية الأنسجة الشبيهة بجلد الإنسان للSOs المستوية (الشكل 1 د والشكل 4 ب).

figure-results-1
الشكل 1: سير العمل لإنشاء SOs مستوية تحتوي على HFs من hiPSCs باستخدام نظام زراعة ALI. يتم عرض التمثيل التخطيطي والصور التمثيلية للخطوات الرئيسية. (أ) توليد SOs الكيسية ، بشكل أساسي كما هو موضحسابقا 10 ، حتى تتشكل لويحات / أوتاد الشعر المرئية في حوالي اليوم 80. (ب) يتم شق SOs الكيسية وتسويتها ، بحيث يكون جانب البشرة متجها لأعلى ، على إدراج ثقافة الخلايا المغلفة بالكولاجين من النوع الأول. يتم الحفاظ على مزارع ALI لمدة 21 يوما في ظل ظروف رطبة ، تليها 6 أيام في الظروف الجافة. (ج) عرض عالي التكبير للمنطقة الموضحة في (ب) ، يوضح نمو بصيلات الشعر ، وتطور بنية تشبه الغدة الدهنية (رؤوس الأسهم) ، والتصبغ التدريجي بمرور الوقت. (د) صور متحد البؤر لأقسام SO المستوية في اليوم 27 بعد التسطيح ، وصفت بجسم مضاد للكولاجين من النوع الرابع مع إما أحمر النيل ، الذي يشير إلى الهياكل الشبيهة بالغدة الدهنية ، أو الأجسام المضادة ل PMEL ، التي تلطخ الخلايا الصباغية. يتم مواجهة النوى مع DAPI. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر (A) ؛ 500 ميكرومتر (ب ، ج) ؛ 50 ميكرومتر (د). الاختصارات: SOs = عضيات الجلد; HFs = بصيلات الشعر. hiPSCs = الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان ؛ ALI = واجهة الهواء والسائل ؛ العمود الرابع = الكولاجين من النوع الرابع. PMEL = بروتين بريميلاناسوم; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: صور تمثيلية لمورفولوجيا تجميع الخلية في الخطوات الرئيسية أثناء إنتاج SO. (أ) صور تمثيلية للمنظمات الداعمة الكيسية ذات الأشكال المناسبة (اللوحات اليسرى) وغير الكافية (اللوحات الوسطى واليمنى) في مراحل مختلفة. في اليوم -2 ، يجب أن تعرض مجاميع الخلايا توزيعا موحدا (اللوحة اليسرى) ، في حين أن التعامل غير السليم مع اللوحة بعد الطرد المركزي قد يعطل توزيع الخلايا (اللوحة اليمنى). في اليوم 0 ، تظهر المجاميع جيدة التكوين كمجموعات خلوية مدمجة وكثيفة (اللوحة اليسرى) ، بينما تؤدي قابلية الخلية المنخفضة إلى موت الخلايا على نطاق واسع وفقدان الهياكل ثلاثية الأبعاد المدمجة (اللوحة اليمنى). في اليوم 3 ، تصبح الطبقة الظهارية الخارجية المميزة مرئية (اللوحة اليسرى) ، وقد يشير غيابها إلى أن تركيز BMP4 يحتاج إلى تحسين (اللوحة اليمنى). في اليوم 12 ، تتراكم الخلايا الوسيطة في قطب واحد وتهاجر لتغلف الكيس الظهاري (اللوحة اليسرى) ، في حين أن التمايز الظهاري المفرط (اللوحة الوسطى) أو اللحمة المتوسطة (اللوحة اليمنى) يعيق التقسيم الطبقي الظهاري المناسب. في اليوم 50 ، تظهر SOs مورفولوجيا ثنائية القطب ، مع جلد كيسي على جانب واحد ومنتجات ثانوية ، في الغالب غضروف ، على الجانب الآخر (اللوحة اليسرى). يعيق التمايز الظهاري المفرط (اللوحة الوسطى) أو اللحمة المتوسطة (اللوحة اليمنى) نمو الجلد بشكل صحيح. (ب) صور تمثيلية ل SOs الكيسية مع أوتاد الشعر المرئية في حوالي اليوم 80. لاحظ النسبة المتغيرة للمنتجات الثانوية (اليسار إلى المنحنى المتقطع) بالنسبة للجلد. تسمح اللوحات الثلاثة الموجودة في أقصى اليسار بتوليد 2-4 SOs مستوية ، بينما تظهر اللوحة الموجودة في أقصى اليمين SO بجودة غير كافية للتسطيح. قضبان المقياس: 500 ميكرومتر لليوم -2 واليوم 50 واليوم 80 ؛ 200 ميكرومتر لليوم 0 واليوم 3 واليوم 12. الاختصار: SO = عضوي الجلد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: تمثيل تخطيطي للخطوات الفنية لإنتاج SOs مستوية. قم بإجراء تسطيح للمنظمات الكيسية تحت المجهر المجسم داخل غطاء LAF. (أ) استئصال القطب المتراكم للمنتجات الثانوية من SO الكيسي باستخدام مشرط معقم. (ب) تقليم الأطراف العلوية والسفلية من SO لتسهيل تكشف الأنسجة. (ج) قطع الأنسجة المستوية إلى 2-4 قطع. انقلي كل قطعة وافرديها ، بحيث يكون جانب البشرة لأعلى ، على ملحق مغطى بالكولاجين باستخدام ملقط معقم. (د) ضع ملحق المزرعة الذي يحتوي على الأنسجة المسطحة في صفيحة قياسية مكونة من 12 بئرا تحتوي على 600 ميكرولتر من الوسط. (ه) احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. (و) منظر تخطيطي عرضي للجلد العضوي الموضح في (ب). (ز) منظر تخطيطي عرضي للجلد العضوي الموضح في (C). (ح) صورة SO مستو يوضع على هلام الكولاجين من النوع الأول يسكب على ملحق ثقافة خلوية موضوعة في صفيحة مكونة من 12 بئرا تحتوي على 600 ميكرولتر من الوسط. الاختصارات: SO = عضوية الجلد. LAF = تدفق الهواء الرقائقي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: توصيف SOs المستوية المشتقة من hiPSC. (أ) صور مميزة للمجال الساطع لمستو مستو ملطخ ب H&E في اليومين 1 و 27 بعد التسطيح. بحلول اليوم 27 ، تظهر SOs المستوية نضج الجلد مع بشرة متعددة الطبقات و HFs تحتوي على هياكل تشبه الغدد الدهنية (رؤوس الأسهم). (ب) تظهر الصور متحد البؤر لأقسام SO المستوية الملطخة بمضاد β4 إنتجرين وإما مضاد للكيراتين 10 أو الأجسام المضادة المضادة للوريكرين التمايز فوق القاعدي المبكر (خلايا KRT10 + ) في اليوم 1 والتمايز المتأخر (طبقة LOR + ) في اليوم 27. يتم مواجهة النوى مع DAPI. قضبان المقياس: 50 ميكرومتر (A) ؛ 100 ميكرومتر (م). الاختصارات: SO = عضوية الجلد. hiPSC = الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان ؛ H & E = الهيماتوكسيلين والأيوزين. β4 = ب4 إنتجرين. KRT10 = الكيراتين 10 ؛ LOR = لوريكرين. DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

يتغلب البروتوكول الموصوف هنا على قيد رئيسي لنظام SO الكيسي من خلال استعادة اتجاه الأنسجة الأصلية والبيئة من خلال تسطيح الأنسجة وتعريض البشرة القمية للهواء. تحافظ هذه الطريقة على التعقيد الخلوي والهيكلي الجوهري للجسم العضوي ، وتعزز التنظيم ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية ، وتوفر وصولا مباشرا إلى سطح البشرة متعدد الطبقات للتلاعب التجريبي.

تعد عدة خطوات في البروتوكول حاسمة لتحقيق SOs مستوية عالية الجودة ، بدءا من توليد SOs كيسية عالية الجودة. تم وصف فحوصات مراقبة الجودة الرئيسية ونقاط تعديل البروتوكول المحتملة على نطاق واسع قبل12. باختصار ، يجب أن تكون نقطة البداية هي مزارع hiPSC جيدة الصيانة وغير متمايزة عند التقاء 70-80٪ ، وعرض خلايا معبأة بإحكام مع نسبة عالية من النووي إلى السيتوبلازم. يتطلب توليد SOs الكيسية تعديلا دقيقا لإشارات BMP4 أثناء تحريض الأديم الظاهرالسطحي 12. نظرا لأن حساسية BMP4 يمكن أن تختلف بين خطوط hiPSC ، فقد تكون المعايرة بالتحليل الحجمي ضرورية للحصول على أفضل النتائج. يوصى باختبار تركيزات BMP4 بين 2.5 و 15 نانوغرام / مل ، حيث لم يتم الإبلاغ عن أي حالات ناجحة خارج هذا النطاق. الاتساق في مصدر الكاشف مهم أيضا. ولذلك، ينبغي إعداد مخزونات البضائع السائبة من مورد واحد وتخزينها في الظروف الموصى بها واستخدامها قبل تاريخ انتهاء صلاحيتها لضمان النشاط البيولوجي الكامل وتقليل التباين.

يعد اختيار SOs الكيسية ذات التشكل والحجم المناسبين أمرا بالغ الأهمية لتسطيح SO الناجح. قد يختلف نضوج SOs الكيسية وبالتالي تكوين الأوتاد ولوحات الشعر بين خطوط hiPSC ، وبالتالي ، يمكن أن يتراوح توقيت التسطيح من اليوم 70 إلى اليوم 90. يمكن النظر في إضافة CHIR99021 ، وهو مثبط GSK3 وناهض إشارات WNT ، في اليوم 3 من تكوين SO الكيسي ، حيث ثبت أنه يزيد من حجم العضوية ويقلل من تكوين الغضروف من خلال تعزيز التكاثر وتثبيط هجرة القمة العصبية12. على الرغم من أنه واعد ، إلا أننا لم نلاحظ نتائج متسقة مع هذا التعديل في ثقافاتنا.

تتطلب عملية التسطيح البراعة اليدوية والإلمام بالأنسجة. والجدير بالذكر أنه أثناء نقل جزء الجلد إلى الملحق المطلي ، يجب توخي الحذر لضمان التوجيه الصحيح للأنسجة. يوصى بالتحقق من الاتجاه باستخدام ملقط ناعم تحت المجهر المجسم وضبط الأنسجة برفق حتى يواجه الجانب القمي لأعلى. عند وضعها بشكل صحيح ، يجب أن تكون الأوتاد / لوحات الشعر متجهة لأسفل. بعد نقل SOs المستوية إلى ثقافة ALI ، تبدأ HFs عادة في إظهار نمو ملحوظ وتصبغ جذع الشعرة في غضون أيام قليلة.

تتمثل القيود الرئيسية للنموذج الموصوف في الوقت والمستوى العالي من الصيانة المطلوبة ، وعدم نضج النموذج. يستغرق تطوير SOs الكيسية التي تتمتع بأوتاد الشعر ما بين 70 إلى 90 يوما ويتبعها 4 أسابيع من ثقافة ALI. هذا الجدول الزمني الممتد ، جنبا إلى جنب مع إجراء التسطيح الشاق ، يجعل النظام أقل ملاءمة للتطبيقات عالية الإنتاجية ، خاصة بالمقارنة مع مكافئات جلد الإنسان المتوفرة تجاريا. في حين أن التحسينات الطفيفة قد تقلل قليلا من وقت الاستزراع ، إلا أنه من غير المحتمل حدوث انخفاض كبير. يعتمد التنوع الخلوي والهيكلي العالي للجلد على تسلسل معقد من التفاعلات الظهارية واللحمة المتوسطة والإشارات الميكانيكية ، والتي من المحتمل ألا يمكن تسريعها عن طريق إضافة عوامل خارجية في المختبر15،16،17،18. يتطلب تكوين SOs الكيسية وتطورها إلى الشكل المستوي مستوى عال من الصيانة. تحدث واحدة من أكثر الفترات كثافة في المناولة - بصرف النظر عن أول 18 يوما من الثقافة الكيسية - عندما يتم الحفاظ على SOs المستوية في جو منخفض الرطوبة وتتطلب تجديدا يوميا متوسطا. على غرار النماذج الأخرى المشتقة من hiPSC ، تحتفظ SOs بنمط ظاهري يشبه الجنين في المختبر. علاوة على ذلك ، فإن الغدد العرقية وعضلات الشعري المستقيم غائبة إلى حد كبير في SOs14 ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى نقص الأوعية الدموية والخلايا المناعية والقوى الميكانيكية مثل إجهاد القص والتمدد والاحتكاك - وكلها ضرورية للنضج السليم15،16،17،18،19. يمكن معالجة بعض هذه القيود عن طريق زيادة تعقيد النموذج. قد يساعد الزراعة المشتركة مع البلاعم المشتقة من hiPSCالذاتية 17 ، أو دمج نظام التروية9 ، أو تطبيق التمدد الميكانيكي17 في تعزيز نضج النموذج20،21.

وتجدر الإشارة إلى أن تنسيق إدراج الحفر يقيد إلى حد ما النمو الهبوطي للموجات العالية في SOs المستوية. نتيجة لذلك ، تميل HFs إلى الانتشار بشكل جانبي وقد تتعرض للهواء. نظرا لأن HFs عادة ما تكون محمية داخل الجلد في الجسم الحي ، فيجب مراعاة ذلك عند تصميم التجارب. قد يساعد تعديل طلاء الإدخال عن طريق تطبيق طبقة هيدروجيل أكثر سمكا في التخفيف من هذه المشكلة. بالإضافة إلى ذلك ، نادرا ما تبرز أعمدة الشعر خارج سطح الجلد في هذا النموذج. تشير ملاحظاتنا إلى أن HFs في SOs المستوية تظل في anagen ، مرحلة النمو النشط ، حتى اليوم 27 من ثقافة ALI. بالنظر إلى المدة الطويلة للتنامي في HFs البشرية ، فإن هذا ليس غير متوقع تماما. على الرغم من أن الثقافة طويلة المدى قد تدعم في النهاية انتقال المرحلة ، إلا أن هذا غير مرجح في غياب الإشارات النظامية. قد يؤدي تحديد واستكمال الإشارات الجزيئية المطلوبة لدورة الجريبات إلى تمكين الحث الاصطناعي لمراحل التيجين والكرب.

باختصار ، يتيح بروتوكول إنشاء SOs مستوية مجموعة واسعة من الأساليب التجريبية غير المجدية أو ذات الصلة في SO الكيسي. تم بالفعل استخدام Planar SOs بنجاح لنمذجة البكتيريا11 والالتهابات الفيروسية22 ، وتلف الأنسجة الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية22 ، والاستجابات الدوائية المرتبطةبه 12،22،23. تمثل القدرة على الوصول إلى السطح القمي لمكافئ الجلد المعقد ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية تقدما كبيرا في هذا المجال وتفتح الباب أمام مجموعة متنوعة من التطبيقات الجديدة في أبحاث الجلد.

الإفصاحات

ليس لدى أصحاب البلاغ تضارب في المصالح للإعلان.

شكر وتقدير

نشكر زملائنا في فندق hiPSC ، المركز الطبي بجامعة ليدن ، على توفير خطوط hiPSC. تم دعم هذا العمل من قبل مركز مؤسسة نوفو نورديسك لطب الخلايا الجذعية بدعم من مؤسسة نوفو نورديسك ، الدنمارك (المنحة رقم NNF21CC0073729) إلى K.R. K.R. هو القائم بالأعمال في المعهد الوطني للبحوث الطبية (INSERM).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEM/F12 المتقدمثيرمو فيشر العلمي#12634010ويشار إليها في النص باسم الوسيط المتقدم.
ALK5، تثبيت. TGFb النوع 1، SB431542توكريس للعلوم الحيوية#1614عليكوت، المتجر عند -20 ° ج و  ابق عند الساعة 4 ودرجة مئوية؛ C لمدة أقصاها 7 أيام 
الجسم المضاد وحيد النسيلة الجرذان المضاد ل CD104 439-9Bبكالوريوس العلوم الحيوية#555719NA
الأجسام المضادة متعددة النسيات المضادة للكولاجين النوع الرابعميرك ميليبور#Ab769NA
الأجسام المضادة متعددة النسيلات لأرانب مضاد السيتوكيراتين 10الأسطورة الحيوية#905401NA
الأجسام المضادة متعددة النسيلات لأرانب مضاد للوريكرينالأسطورة الحيوية#905101NA
الأجسام المضادة وحيدة النسيلة للفأر المضادة ل PMELنوفوس بيولوجيالز#NBP2-29407 NA
مكمل فيتامين B-27، بدون فيتامين أثيرمو فيشر العلمي#12587010عليكوت، المتجر عند -20 ° C 
إدخالات زراعة الخلاياغرينر بيو-ون#66564112-بئر، حجم المسام 0.4 وميكرو؛ m; شفاف (48 إدراج/صندوق)؛ https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/3d-cell-culture/thincert/3d-thincert-cell-culture-inserts/665641.html
الكولاجين النوع الأولكورنينج#354249حافظ على محلول المخزون عند 4 & درجة؛ C
مشرط معقم قابل للاستخدام مرة واحدة 0507 رقم 21سوان مورتون#0507NA
دولبيكو' محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS)ثيرمو فيشر العلمي#14190094NA
المتوسط السادس 6 (E6)ثيرمو فيشر العلمي#A1516401ويشار إليها باسم الوسط الأدنى لمستوى hiPSC (hiMinM)  في النص.
فاسوديلمختبرات LC#F-4660أليكوت حل مخزون 1000x وخزن عند -20 &20 درجة مئوية. بعد الذوبان، حافظ على درجة حرارة 4 ودرجة مئوية؛ C لمدة 14 يوما كحد أقصى  
تفكك الخلايا اللطيف   الكاشفتقنيات الخلايا الجذعية#100-0485NA
مكمل جلوتاماكسثيرمو فيشر العلمي#35050038NA
درجة FGF-2 الأساسية للبرينيوم البشريميلتيني بيوتيك#130-093-842Aliquot، المتجر عند -80 ° ج و  ابق عند الساعة 4 ودرجة مئوية؛ C لمدة أقصاها 7 أيام 
LDN 193189 ثنائي الهيدروكلوريدتوكريس#6053Aliquot، حساس للضوء، يخزن عند -20 ° C 
مصفوفة الغشاء القاعدي المخفضة بعامل نمو المادةكورنينج#354230عليكوت، المتجر عند -20 ° ج و  ابق عند الساعة 4 ودرجة مئوية؛ C لمدة أقصاها 7 أيام 
2-ميركابتوإيثانولثيرمو فيشر العلمي#21985023مادة خطرة، سامة، تآكلة، مهيجة، صحية وبيئية.
لا أوهميرك#567530-250MGمادة خطرة، مسببة للتآكل ومهيجة. جهز الحل بشكل عفوي.
الوسط العصبي القاعديثيرمو فيشر العلمي#21103049ويشار إليه باسم الوسط العصبي القاعدي  في النص.
نورموسين 50 ملغ/ملإنفيفوجين#ant-NR-1يشار إليها في الاختبار بمكمل مضاد حيوي-مضاد للفطريات. عليكوت، المتجر عند -20 ° ج و  ابق عند الساعة 4 ودرجة مئوية؛ C لمدة 14 يوما كحد أقصى  
نونكلون سفرا 96-ويليو-بوتوم ميكروبلايتثيرمو فيشر العلمي#174929NA
نونكلون سفيرا 174930 متعددة الأطباق ذات 24 بئرثيرمو فيشر العلمي#174930NA
ملحق N2ثيرمو فيشر العلمي#17502048Aliquot، المتجر عند -20 ° C 
هزاز المدارثيرمو فيشر العلمي#88881102NA
البنسلين-ستريبتوميسينثيرمو فيشر العلمي#15070063NA
بروتين BMP4 البشري المؤتلفR& دي سيستمز#314-BP-010Aliquot، المتجر عند -80 ° ج و  ابق عند الساعة 4 ودرجة مئوية؛ C لمدة أقصاها 7 أيام 
وسيط StemFlex (SF)ثيرمو فيشر العلمي#A3349401ويشار إليها باسم وسيط صيانة hiPSC (hiMM)  في النص.
SteriMax smart - معقم حلقات بالأشعة تحت الحمراءWLD-TEC#4.002.000 اختياري
الملقطميرك#T4537-1EAالنمط 5؛ الفولاذ المقاوم للصدأ الحاد بالإبرة الدقيقة ومضاد للمغناطيسية
فيترونكتينتقنيات الخلايا الجذعية#07180NA

المراجع

  1. Kolarsick, P. A. J., Kolarsick, M. A., Goodwin, C. Anatomy and physiology of the skin. J Dermatol Nurses Assoc. 3 (4), 203-213 (2011).
  2. Karimkhani, C., et al. Global skin disease morbidity and mortality: An update from the Global Burden of Disease Study 2013. JAMA Dermatol. 153 (5), 406(2017).
  3. Seth, D., et al. Global burden of skin disease: Inequities and innovations. Curr Dermatol Rep. 6 (3), 204-210 (2017).
  4. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing. J Invest Dermatol. 138 (10), 2095-2105.e1 (2018).
  5. Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).
  6. Vig, K., et al. Advances in skin regeneration using tissue engineering. Int J Mol Sci. 18 (4), 789(2017).
  7. Chu, X., et al. Functional regeneration strategies of hair follicles: Advances and challenges. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 77(2025).
  8. Motter Catarino, C., Cigaran Schuck, D., Dechiario, L., Karande, P. Incorporation of hair follicles in 3D bioprinted models of human skin. Sci Adv. 9 (41), eadg0297(2023).
  9. Kageyama, T., Miyata, H., Seo, J., Nanmo, A., Fukuda, J. In vitro hair follicle growth model for drug testing. Sci Rep. 13 (1), 4847(2023).
  10. Abaci, H. E., et al. Tissue engineering of human hair follicles using a biomimetic developmental approach. Nat Commun. 9 (1), 5301(2018).
  11. Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
  12. Jung, S., et al. Wnt-activating human skin organoid model of atopic dermatitis induced by Staphylococcus aureus and its protective effects by Cutibacterium acnes. iScience. 25 (10), 105150(2022).
  13. Zhang, M., et al. Recessive cardiac phenotypes in induced pluripotent stem cell models of Jervell and Lange-Nielsen syndrome: Disease mechanisms and pharmacological rescue. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (5), E5383-E5392 (2014).
  14. Lee, J., et al. Generation and characterization of hair-bearing skin organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 17 (5), 1266-1305 (2022).
  15. Hu, M. S., et al. Embryonic skin development and repair. Organogenesis. 14 (1), 46-63 (2018).
  16. Li, K. N., Tumbar, T. Hair follicle stem cells as a skin-organizing signaling center during adult homeostasis. EMBO J. 40 (11), e107135(2021).
  17. Biggs, L. C., Kim, C. S., Miroshnikova, Y. A., Wickström, S. A. Mechanical forces in the skin: Roles in tissue architecture, stability, and function. J Invest Dermatol. 140 (2), 284-290 (2020).
  18. Gopee, N. H., et al. A prenatal skin atlas reveals immune regulation of human skin morphogenesis. Nature. 635 (8039), 679-689 (2024).
  19. Tokuyama, E., Nagai, Y., Takahashi, K., Kimata, Y., Naruse, K. Mechanical stretch on human skin equivalents increases the epidermal thickness and develops the basement membrane. PLoS One. 10 (11), e0141989(2015).
  20. Bai, X., et al. Organoid research: Theory, technology, and therapeutics. Organoid Res. 1 (1), 025040007(2025).
  21. Wang, Y., et al. Organoid research breakthroughs in 2024: A review. Organoid Res. 1 (2), 025040005(2025).
  22. Li, P., et al. Mpox virus infection and drug treatment modelled in human skin organoids. Nat Microbiol. 8 (11), 2067-2079 (2023).
  23. Kim, M. J., Ahn, H. J., Kong, D., Lee, S., Kim, D. H., Kang, K. S. Modeling of solar UV-induced photodamage on the hair follicles in human skin organoids. J Tissue Eng. 15, 20417314241248753(2024).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة