يوضح هذا البروتوكول كيفية إجراء بتر تحت الركبة في الفئران وإجراء إعادة تعصيب عضلي مستهدف (iTMR) فورا لدراسة استراتيجيات علاج ومنع الألم المرتبط بالبتر ولفهم آليات الألم المرتبطة بالبتر بشكل أفضل.
مقالة منهجية
يوضح هذا البروتوكول كيفية إجراء بتر تحت الركبة في الفئران وإجراء إعادة تعصيب عضلي مستهدف (iTMR) فورا لدراسة استراتيجيات علاج ومنع الألم المرتبط بالبتر ولفهم آليات الألم المرتبطة بالبتر بشكل أفضل.
يقلل الألم المرتبط بالبتر من جودة حياة المريض، ويساهم في استخدام المواد الأفيونية، ويمكن أن يقلل من إعادة التأهيل الوظيفي واستخدام الأطراف الصناعية. النماذج ما قبل السريرية التي تنتج ألما بعد البتر بشكل موثوق مع الحفاظ على الحركة ضرورية لدراسة الآليات البيولوجية الكامنة وراء هذه النتائج. هنا، نقدم بروتوكولا جراحيا مفصلا وقابلا للتكرار باستخدام فئران سبراج-داولي لنمذجة بتر الأطراف الخلفية تحت الركبة. تتضمن العملية عزل وقطع فروع العصب الوركي، بما في ذلك العصب الظنبوبي، والأعصاب الشظوية المشتركة، والأعصاب السورالية، مما يؤدي إلى أمراض عصبية مستمرة بعد البتر وسلوكيات مرتبطة بالألم. تتعافى الفئران جيدا من هذا الإجراء ويمكنها التجول فورا بعد العملية دون صعوبة في الأكل أو الشرب. يمكن تقييم الحيوانات لاحقا باستخدام تدابير الألم الانعكاسية والتلقائية. سلوكيات الألم الناتجة عن هذا الإجراء قوية مع مرور الوقت، ويمكن الحصول على سلوكيات الألم الانعكاسية القياسية من الجذع. ومن المهم أن الحفاظ على الحركة يتيح إجراء اختبارات سلوكية طولية دون إرباك ضعف الحركة. بينما يركز هذا البروتوكول على البتر، يمكن تكييفه بسهولة لدمج إعادة تعصيب العضلات المستهدف (TMR) كتدخل بعد البتر عن طريق ربط الأعصاب المقطوعة بفروع حركية قريبة من الأعصاب إلى عضلة البايسبس الفخذية وشبه الغشاءية، مما يمكن من دراسة تدخلات إعادة التعصيب وتأثيرها على الألم بعد البتر. لقد استخدمنا هذا النموذج بنجاح سابقا لتقييم الفروق الخاصة بالجنس في سلوكيات الألم بعد البتر ولدراسة تأثيرات TMR. يوفر هذا البروتوكول منصة قوية ومرنة للتحقيق في الألم المرتبط بالبتر، وتكوين الأورام العصبية، والنتائج الوظيفية، مع إمكانية تطبيقه على الدراسات الانتقالية التي تهدف إلى تحسين ألم ما بعد البتر.
الألم المزمن هو أحد أكثر المضاعفات إعاقة بعد بتر الأطراف الكبرى، حيث يصيب ما يصل إلى 70٪ من المرضى 1,2,3. غالبا ما توفر استراتيجيات إدارة الألم التقليدية مثل التدخلات الدوائية، والعلاج الطبيعي، ومنع الأعصاب، والعلاجات النفسية راحة محدودة أو مؤقتة4. لذا، لا تزال هناك حاجة سريرية كبيرة لاستراتيجيات فعالة لإدارة الألم طويلة الأمد.
إعادة تعصيب العضلات المستهدفة (TMR)، التي تم تطويرها في البداية لتعزيز التحكم في الأطراف الصناعية العضلية، برز كنهج واعدة لتخفيف الألم بعد بتر الأطراف5. تتضمن التقنية الجراحية إعادة توجيه الأعصاب الحركية-الحسية المختلطة المقطوعة إلى الفروع الحركية القريبة. سريريا، أظهر TMR انخفاضات كبيرة في ألم الأطراف الوهمية، وألم الأطراف المتبقي، وأعراض الورم العصبي 6,7,8. واجهات الأعصاب الطرفية التجددية (RPNI) هي تدخل جراحي آخر يستخدم لعلاج إصابات الأعصاب والألم المرتبط بالبتر. يتم خياطة نهايات الأعصاب المبتورة ثم لفها بطعم عضلي حر (غير معصب، وعائي وعائي)9. تقوم المحاور العصبية المبتورة بعصبية الوصلات العصبية العضلية غير المعصبة لخلق انقباض عضلي في الطعم يمكن استخدامه لخلق إشارة للتحكم في العضلة العضلية. على عكس TMR، تم دراسة RPNI بشكل موسع في نموذج القوارض. مماثل ل TMR، ثبت أن RPNI يمنع تكون الأورام العصبية ويقلل الألم المرتبط بإصابة قطع الأعصاب10،11. سريريا، ثبت أن RPNI يقلل من الألم الوهمي والباقي في الأطراف لدى المبتوري12.
على الرغم من التبني السريري، لا تزال الآليات البيولوجية الكامنة وراء التأثيرات المسكنة ل TMR وRPNI غير مفهومة بشكل جيد. تعد النماذج ما قبل السريرية ضرورية لتوضيح هذه الآليات. استخدمت أبحاث سابقة نماذج قطع الأعصاب مع تعديلات لتسوية العصب لاختبار ألم الورم العصبي مباشرة10,11. يمكن لهذه النماذج قياس الألم العصبي من خلال التحفيز المباشر والألم العصبي من خلال تقييم سلوكيات الانعكاسات الشوكية في توزيع الأعصاب السليم المتبقي في القدم. على سبيل المثال، تحافظ إصابة العصب المحفوظ على العصب السورالي، ويتم قطع العصب الظنبوبي والعصب الشظوي المشترك. يتم إجراء اختبار سلوك الألم على القدم الجانبية13. نموذج بتر الطرف الخلفي يمثل أشد إصابة ممكنة للطرف. وبالتالي، هناك فقدان واسع النطاق للعصبون ومتطلبات التهابية وشفاء كبيرة مرتبطة بإصابة من هذا النوع. عندما يحدث إصابة عصبية، تساعد الخلايا العصبية السليمة في DRG في الحفاظ على الخلايا العصبية المصابة. مع البتر، يقل عدد الخلايا العصبية السليمة المتاحة بشكل كبير، ولكل عصب مصاب، يكون هناك فقدان عصبي أكبر مقارنة بإصابة عصب واحد فقط14،15،16. التقارير السابقة عن جراحة بتر الأطراف الخلفية للقوارض نادرة17,18. ومع ذلك، هناك مزايا مقارنة ببتر الطرف العلوي، مثل وفرة البيانات التاريخية التي تفحص الألم والتجدد المرتبط بالعصب الوركي، بالإضافة إلى اختبارات سلوك متحركةمتعددة 19,20.
ولمعالجة هذه الفجوة، طورنا مؤخرا نموذج بتر الطرف الخلفي للفئران يدمج TMR الفوري (الشكل 1). تم نشر تقنية إنشاء RPNI سابقا ويمكن تكييفها مع نموذج بتر الأطراف الخلفية21. يعكس هذا النموذج الإجراءات السريرية بشكل وثيق، مما يسمح لنا بتقييم سلوكيات الألم المختلفة، وتكوين الأورام العصبية، والحفاظ على الخلايا العصبية (الشكل 2)22. أظهرت أعمالنا فوائد كبيرة في المسكنات لعلاج TMR مقارنة بالبتر التقليدي، والوقاية من الأورام العصبية، وأظهرت استجابات جنسية متغيرة في حساسية البرد22,23.
يوفر البروتوكول المعروض هنا عرضا بصريا مفصلا وموحدا للتقنية الجراحية، مما يضمن قابلية التكرار والاتساق في الأساليب التجريبية. من خلال توضيح خطوات رئيسية بوضوح، بما في ذلك عزل الأعصاب، والقطع الدقيق، وتركيب الأعصاب بدون توتر، يقدم هذا البروتوكول للباحثين إطارا قويا للتحقيق في الآليات الكامنة وراء تخفيف الألم والوقاية من الأورام العصبية الذي ينظمه TMR.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يجب أن تتم الموافقة على جميع إجراءات الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) والامتثال لدليل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
1. التحضير قبل العملية
ملاحظة: تم استخدام ذكور وإناث فئران سبراج-داولي (مختبرات تشارلز ريفر)، تتراوح أعمارهم بين 8–10 أسابيع ووزنهم 250–300 جرام.
2. بتر تحت الركبة (الشكل 1)
3. جراحة التدخل بتقنية TMR (الشكل 1)
4. مجموعة البتر فقط
5. الرعاية بعد العملية
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
وقد أثار نموذج بتر الأطراف الخلفية هذا سلوكيات متعلقة بالألم العصبي بشكل موثوق مع الحفاظ على القدرة على المشي والاستكشاف لدى الفئران. كما هو موضح في الشكل 2، يؤدي قطع العصب الطرفي أثناء البتر دون وجود هدف بعيد إلى نمو محوري غير منظم وتكوين أورام عصبية في موقع الربط، كما يظهر من خلال صبغ المناعة باستخدام ب-التوبولين والببتيدات المرتبطة بالجين الكالسيتونين (CGRP). على النقيض من ذلك، أظهرت الأعصاب المبتورة ب TMR نموا محوريا منظما في الفرع المستقبل، مع وجود محاو...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يوضح هذا البروتوكول خطوات جراحية أساسية لضمان قابلية تكرار نموذج بتر الطرف الخلفي ويظهر الحفاظ على حركة المشي والسلوك في اختبارات ما بعد البتر. يتم التركيز على المبادئ الجراحية الرئيسية، بما في ذلك التحديد التشريحي الدقيق، وتقليل التلاعب بالأعصاب، والتعامل الخالي من التوتر مع الأعصاب المقطوعة، لضمان الاتساق وقابلية التكرار بين الجراحين. تعد هذه الاعتبارات التقنية حاسمة لتحفيز أمراض الأعصاب بعد البتر بشكل موثوق وتقليل التغيرات غير المقصودة المرتبطة بالصدمات الجراحية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.
وقد دعم هذا البحث مركز أبحاث علوم الأعصاب في كلية الطب في ويسكونسن، ومؤسسة ريتا ألين، ومؤسسة جراحة التجميل. يشكر المؤلفون وحدة الطب المقارن على رعايتهم ودعمهم للحيوانات.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 10-0 nylon microsuture (Arosurgical) | AROSurgical | T04A10N07-13 | غرز الربط العصبي الدقيقة. غرز ميكروي 10-0. |
| 4-0 polyglycolic acid suture | Ethicon | AQ1268 | غرز إغلاق للعضلات والجلد. غرز قابلة للامتصاص 4-0. |
| 5-0 silk surgical suture | Generic | Generic | غرز ربط الأعصاب |
| Adult Sprague-Dawley rats | Charles River Laboratories | Generic | حيوان تجريبي |
| Alcohol prep pads | Dukal Corporation | Generic | مطهر الجلد |
| Betadine 10% | Avrio Health LP | Generic | مطهر |
| Bone scissors | FST | 16030 | أداة قص العظام |
| Cautery device | FST | 18010-00 | جهاز إيقاف النزيف |
| Cotton tip applicator (ProAdvantage) | ProAdvantage | Ref 76100 | التلاعب بالأنسجة |
| Curved microdissector scissors | FST | 15019-10 | مقص ناعم لتفتيت الأعصاب |
| Forceps (fine Dumont) | FST | 11254-20 | أداة تعامل مع الأعصاب |
| Forceps (suture tying Dumont) | FST | 11063-07 | أداة تعامل مع الغرز |
| Gauze USP type VII (Cardinal Health) | Cardinal Health | Ref 2146 | الحفاظ على المجال المعقم |
| Heating pad warmer (TC1000 temperature controller) | Generic | TC1000 | جهاز التحكم في درجة الحرارة |
| Induction chamber (Braintree Scientific) | Braintree Scientific Inc. | Generic | لإحضار التخدير |
| Isoflurane (Isospire) | Phoenix | Generic | عامل التخدير |
| Meloxicam (Ostilox) | VetONE | 5 mg/mL | عامل مسكن للألم |
| Ruler | Generic | Generic | أداة قياس لعلامات التشريح |
| Sterile saline | Baxter | 0.9 Sodium Lot Y425131 | محلول الري |
| Surgical blade 15 | FST | 10015-00 | أداة شق الجلد |
| Tuberculin syringe | Generic | Generic | إعطاء الدواء |
| Vaporizer (Surgivet model 100) | Surgivet | Model 100 S/N W2211123 | للحفاظ على التخدير |
| Vetbond tissue adhesive | World Precision Instruments | Generic | لاصق الجلد |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن