مقالة منهجية

في المختبر تمايز الخلايا التائية في ذاكرة CD8 المقيمة باستخدام نظام الزراعة المشتركة لخلايا العضو الظهاري العضوي التائي

DOI:

10.3791/69120

⸱

فبراير 3, 2026

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Brown University, 2Pathobiology Graduate Program, Brown University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لدراسة تمايز ووظيفة خلايا CD8 التائية في المختبر، يمكن عزل خلايا CD8 التائية من الفأر لزراعتها لفترة طويلة مع الأعضاء الظهارية المهبلية المصابة مسبقا في فئران. هنا، نصف هذه العملية ونقيم اكتساب علامات خلايا T في الذاكرة المقيمة أثناء الزراعة المشتركة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب أنسجة الحاجز المخاطي دورا مهما في تمايز ووظيفة الخلايا التائية المقيمة. من بين تجمعات الخلايا المتنوعة داخل هذه الأنسجة، تعد الخلايا الظهارية المحركات الرئيسية لتمايز الخلايا التائية. ومع ذلك، لا يزال فهمنا للإشارات المشتقة من الخلايا الطهارية التي تشكل بيولوجيا الخلايا التائية في البيئات المخاطية محدودا، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى نقص الأدوات المحددة وتعقيد أنظمة النماذج المتاحة. هنا، نصف نظام زراعة الخلايا التائية العضوي العضوي في الفأر في الفأر الذي يمثل نمذجة التفاعلات الديناميكية بين الظهارة المصابة وخلايا CD8 التائية الخاصة بالفيروس. يتيح هذا البروتوكول التحليل الظاهري والوظيفي لاستجابات الخلايا التائية ضمن بيئة دقيقة ثلاثية الأبعاد ذات صلة فسيولوجية. باستخدام هذا النظام، نثبت تمايز خلايا CD8 T المؤثرة إلى خلايا ذاكرة تائية مقيمة في الأنسجة (TRM). يوفر هذا النظام متعدد الاستخدامات في الزراعة المختبرية فرصا تقليلية للتحقيق في التفاصيل الجزيئية للإشارات الظهارية وراء تمايز خلايا CD8 التائية التي تحكم المناعة الوقائية وأمراض المناعة في الأعضاء الحاجزة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل خلايا الذاكرة التائية المقيمة في CD8 مجموعة فريدة من خلايا الذاكرة CD8 التي تحتفظ بها بشكل دائم في الأنسجة الطرفية دون أن تدور بشكل روتيني عبر الدم والأنسجة اللمفاوية. توضع هذه الخلايا الاستراتيجية في الأعضاء الحاجزة، بما في ذلك الجلد والرئتين والأمعاء والجهاز التناسلي، حيث تعمل كحراس ضد مسببات الأمراض والأورام الناشئة 1,2. عند اكتشاف الممرض، تطلق خلايا CD8 TRM حبيبات سامة للخلايا بشكل مباشر للقضاء على الخلايا المصابة مع إفراز سيتوكينات التهابية تنبه الخلايا الأنسجة المحيطة وتستعين بمؤثرات مناعية تدور حولها لاحتواء انتشار الممرض 3,4. لقد تم بالفعل إثبات فعالية TRMs من CD8 في مناعة مضادات الأمراض وكذلك العلاج المناعي للسرطان 5,6. وبالتالي، فإن وضع كمية وفيرة من CD8 TRM الفعال وظيفيا في الأنسجة المخاطية الحاجزة هو هدف حيوي للقاحات واستراتيجيات العلاج المناعي.

يعتمد تكوين وصيانة TRM من CD8 في الأعضاء الطرفية بشكل حاسم على البرمجة المحلية الخاصة بالنسيج. تشمل هذه الإشارات البيئية المحلية سيتوكينات فريدة مشتقة من الأنسجة وعوامل أيضية، بالإضافة إلى تفاعلات بين الخلايا تفرض بشكل جماعي هوية TRM الخاصة بالنسيج 7,8,9. تسمح هذه البرمجة الأنسجة ل TRM بالتكيف مع متطلبات الأنسجة الخاصة أثناء أداء مهامهم في المراقبة المناعية. ومع ذلك، فإن فهمنا لطبيعة هذه التفاعلات غير مكتمل، بسبب نقص أنظمة النماذج القوية التي تلتقط هذه العمليات بدقة. نماذج الصغيرة، رغم أنها مفيدة جدا، غالبا ما تعاني من شبكة مترابطة ومعقدة من التفاعلات التي تعيق الدراسات السريعة عالية الإنتاجية.

هنا، نصف بديلا في المختبر لنموذج الفأر يسمح بالتحقيق في التفاصيل الجزيئية للإشارات المشتقة من الخلايا الظهارية وراء تمايز TRM في CD8. من خلال دمج الأعضاء الظهارية المهبلية المكونة مسبقا (VEOs) مع خلايا CD8 T المنشطة، قمنا بتوليد TRM من CD8 في المختبر. سيسمح وصف مفصل لعملية تنشيط وزراعة خلايا CD8 التائية باعتماد أوسع لهذه العملية عبر الأنسجة، مما يؤدي إلى فهم أعمق للتفاعلات الخلوية التي تشكل ذاكرة خلايا CD8 في الأنسجة الأمامية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة وموافقة جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في جامعة براون (رقم البروتوكول 22-10-0001).

1. الإعداد الأساسي وتحضير لوحة التفعيل

  1. قبل يوم واحد من بدء التجربة، جهز لوحة زراعة أنسجة غير معالجة للزرع بخلايا CD8 T الساذجة. جهز محلول للأجسام المضادة المنشطة في dPBS المعقمة بتركيز نهائي 1 ميكروغرام/مل لمضاد CD3ε (2C11) و0.167 ميكروغرام/مل ل B7-1 Fc. بالنسبة للوحة تحتوي على 24 بئر، يتم صرف 600 ميكرولتر من هذا المحلول لكل بئر. حضن الغرفة طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
  2. تحضير مخزن إثراء الخلايا اللمفاوية في dPBS المعقم بإضافة 2٪ FBS مجرد بالفحم و1 مللي مولار EDTA إلى dPBS المعقم. خزن عند 4 درجات مئوية حتى يكون جاهزا للاستخدام.
  3. تحضير محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (ACK RBC) في DDH2O بإضافة 10 ملليموتر بيكربونات البوتاسيوم، و155 ملليمول كلوريد الأمونيوم، و0.1 ملليموتر EDTA. قم بالتصفية بتعقيم وحافظ على درجة حرارة الغرفة.
  4. جهز الكمية المناسبة من وسائط الحصاد في RPMI عن طريق إضافة 5٪ من مواد FBS المجزية بالفحم. خزن عند 4 درجات مئوية حتى يكون جاهزا للاستخدام. لكل فأر يتم حصاده، يوصى ب 50 مل من وسط الحصاد.
    ملاحظة: البنسلين/الستربتوميسين والأمفوتيرسين B اختياريان، لكن التركيز النهائي 100 وحدة/مل من البنسلين، 100 ميكروغرام/ملتر ستريبتومايسين، و0.2 ميكروغرام/مل من الأمفوتيرسين B قد يساعد في منع التلوث البكتيري والفطري لزراعة الخلايا التائية أثناء عزل الأنسجة إذا كان ذلك يسبب مشكلة.
  5. تحضير وسط الخلايا التائية في RPMI بإضافة 10٪ من FBS مقشر بالفحم، 2 ملليمولار L-جلوتامين، 100 وحدة/ملتر بنسلين، 100 ميكروغرام/مل من الستربتومايسين، 1x أحماض أمينية غير ضرورية، و1 ملليمول بيروفات الصوديوم. للوحة تحتوي على 24 بئر، استخدم 2 مل من وسط خلايا T لكل بئر و50 مل من وسط خلايا T لصفيحة كاملة. خزن عند 4 درجات مئوية حتى يكون جاهزا للاستخدام.
  6. جهز أدوات التشريح (مقص تشريح دقيق بقطر 0.4 مم وملقط مسننة منحنية دقيقة بحجم 0.8 مم) عن طريق التعقيم في كيس تعقيم أو نقع في 70٪ إيثانول.

2. حصاد وتفكك الأعضاء اللمفاوية الثانوية للفئران البالغة

  1. قم بتبريد الطرد المركزي بسرعة إلى 4 درجات مئوية مع محولات مناسبة لحمل أنابيب مخروطية بحجم 15 مل.
  2. تحضير الثلج لنقل الأنسجة والخلايا اللمفاوية خلال فترات الحصاد والحضانة.
  3. جهز أنبوبا مخروطيا معقما بسعة 15 مل يحتوي على ما لا يقل عن 5 مل من وسط الحصاد لكل فأر ليتم تشريحه.
  4. قم بتخدير وقتل فأر بالغ متحول وراثيا من خلايا CD8 T (~8 أسابيع) وفقا لبروتوكول المؤسسة في غطاء تدفق طبقي.
  5. ثبت أطراف الفأر على سطح نظيف من رغوة البوليسترين باستخدام أي حجم من الإبر، ورش الجذع بنسبة 70٪ إيثانول لمنع الفرو من انسداد الشق والالتصاق بالأدوات.
  6. باستخدام مقص دقيق نظيف وملقط، قم بعمل شق عمودي للبطن وافصل الجلد عن الطبقة الرقيقة من النسيج الضام تحته. ثبت الجلد على سطح رغوة البوليسترين باستخدام أي حجم من الإبر، واقطع أي نسيج ضام متبق لكشف الأعضاء داخل الجذع.
  7. حدد موقع الطحال واستئصاله بعناية، وأزل الدهون الزائدة باستخدام الملقط المنحني، وانقله إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل يحتوي على وسط حصاد. اترك الطحال على الجليد وعزل أكبر عدد ممكن من العقد اللمفاوية (مثل الحرقفي والإربي) لتتحد مع الطحال في نفس الأنبوب المخروطي على الجليد.
    ملاحظة: تقع العقد اللمفاوية الحرقفية على جانبي الوريد الأجوف الذيلي في المنطقة السفلية من البطن تحت الجهاز الهضمي، وتقع العقد اللمفاوية الإربية بالقرب من تفرع الوريد فوق المعدي السطحي على جانبي الجلد السفلي للجذع البطني. عزل المزيد من العقد اللمفاوية لتحسين إنتاجية خلايا CD8 T بعد الإثراء؛ ومع ذلك، فإن عزل الطحال وحده عادة ما يكون كافيا لتوفير عدة ملايين من خلايا CD8 التائية.
  8. انقل الطحال والعقد اللمفاوية إلى طبق محدد بطول 60 مم، وباستخدام الطرف المسطح لمكبس حقنة بسعة 3 مل، قم بفصل الطحال والعقد اللمفاوية ميكانيكيا عن طريق طحن الأنسجة حتى لا تبقى شظايا كبيرة.
  9. اجمع التعليق عن طريق تمريره عبر مصفاة خلايا معقمة بسعة 70 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي معقم جديد بسعة 15 مل. اغسل طبق 60 مم بسعة 5 مل من وسط الحصاد لضمان نقل الخلايا المفككة والفلتر بالكامل إلى نفس الأنبوب المخروطي بحجم 15 مل.
  10. قم بعمل جهاز التعليق المركزي عند 584 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة وقم بتثبيت الأنبوب عن طريق تمرير القاع بسرعة وبقوة عبر شبكة حامل أنبوب الطرد المركزي لتخفيف الحبيبة.
  11. تقوم كريات الدم الحمراء بإعادة تعليق الحبيبات المرتخية في 2 مل من محلول تحليل ACK RBC. الدوامة واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين.
  12. بعد دقيقتين، قم بتحييد مخزن التحلل بإضافة 2 مل من وسط الحصاد. استنشق نظام التعليق باستخدام ماصة مصلية بسعة 5 مل وفلتر عبر فلتر معقم بقطر 70 ميكرومتر مرة أخرى إلى نفس الأنبوب المخروطي بسعة 15 مل.
    ملاحظة: هذا الترشيح مهم لضمان إزالة جميع التكتلات.
  13. قم بعمل جهاز التعليق المركزي عند 584 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة في سعة 950 ميكرولتر من مخزن تخصيب الخلايا اللمفاوية.

3. إثراء وتنشيط خلايا T في CD8

  1. تابع إثراء خلايا CD8 T الساذجة من الخلايا اللمفاوية باستخدام مجموعة عزل تجارية متاحة. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة.
  2. بمجرد إثراء خلايا CD8 T الآن، انقل التعليق المخصب إلى أنبوب مخروطي جديد معقم بحجم 15 مل واملأ الحجم حتى 10 مل بوسائط حصاد.
  3. العد باستخدام جهاز قياس الدم الخلوي.
    ملاحظة: من فأر بالغ واحد، من الممكن عزل ما لا يقل عن 5-10 ملايين خلية CD8 T ساذجة عند نقاء >95٪.
  4. ضع على الأقل 500,000 خلية في 2 مل من وسط خلايا T لكل بئر من صفيحة ذات 24 بئرا. اخلط خلايا T جيدا قبل الطلاء لضمان وجود تعليق خلوي واحد متجانس. تكمل وسط الخلايا التائية بتركيز نهائي 100 وحدة/مل IL-2، 2.5 نانوغرام/مل IL-12، و55 ميكرومولار بيتا-ميركابتوإيثانول.
  5. قم بإزالة لوحة زراعة الأنسجة المغطاة سابقا بالأجسام المضادة من درجة حرارة 4 درجات مئوية واستنشق محلول الطلاء بعناية دون لمس قاع الآبار.
  6. قم بطلاء خلايا T فورا. حضن على حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة يومين.

4. إزالة إشارات التنشيط وراحة خلايا CD8 T المفعلة

  1. راقب الآبار المنشطة تحت المجهر الضوئي. بعد يومين من التفعيل، ابحث عن مجموعات صغيرة من خلايا T في جميع أنحاء الآبار. المجموعات الأكبر تشير إلى زيادة التفعيل. إذا لم يكن هناك أو كان هناك عدد قليل من العنانق، حضن الصفيحة على حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة يوم إضافي قبل البدء في الراحة.
  2. حضر الثلج لتخزين تعليق الخلايا التائية خلال فترات الحضانة وعند عدم الاستخدام.
  3. أعد تعليق خلايا T باستخدام ماصة P1000 عن طريق التوصيل صعودا وهبوطا عدة مرات في كل زاوية من البئر. عندما ترتفع الخلايا التائية، انقل محتويات البئر إلى أنبوب مخروطي معقم بحجم 50 مل واعد.
    ملاحظة: غسل كل بئر ب 1 مل من dPBS اختياري، لكن تجميع غسيل dPBS مع تعليق الخلايا T قد يزيد من إنتاجية الخلايا التائية.
  4. أعد طلاء الخلايا التائية بنفس التركيز المذكور في الخطوة 3.4، 250,000 خلية/مل عند 2 مل لكل بئر. جهز الكمية المناسبة من وسط خلية T مع 100 وحدة/ملتر IL-2 و55 ميكرومولار بيتا-ميركابتوإيثانول.
  5. قم بعمل الطرد المركزي للتعليق عند 584 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، ثم تخلص من السوبرناتانت، وأعد تعليق الحبيبة في الحجم المناسب من وسط خلية T المعد في الخطوة السابقة لعدد الآبار التي سيتم تغطيتها. اخلط جيدا لضمان وجود تعليق خلوي واحد متجانس.
  6. صفيحة 2 مل من تعليق خلايا T (500,000 خلية/بئر) في صفيحة زراعة أنسجة جديدة غير معالجة بدون طبقة أجسام مضادة. حضن على حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة يومين.

5. إصابة الأعضاء الطهارية المهبلية المجهزة بالفيروس

ملاحظة: لقد استخدمنا كل من فيروس الهربس البسيط-2 (HSV-2) وفيروس التهاب السحايا اللمفاوي (LCMV) لإجراء عدوى فيروسية للعضويات. كلاهما يعتبر وكلاء من مستوى السلامة الحيوية 2 (BSL-2). قم بتنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بالعوامل المعدية داخل خزانة سلامة حيوية معتمدة من نوع BSL-2. نظف مناطق العمل بنسبة 70٪ إيثانول قبل الاستخدام وبعده، وتخلص من جميع المواد وفقا لإرشادات السلامة الحيوية المؤسسية. لهذا البروتوكول، قمنا بتحديد نتائج VEOs من خلايا الظهارة المهبلية المستخرجة من ظهارة المهبل لدى فئران C57BL/6 كما هو موصوف قبل10.

  1. يتم تحليل VEOs في الألواح بكثافة 10,000 خلية في 20 ميكرولتر من مستخلص الغشاء القاعدي (BME) لكل بئر من صفيحة تحتوي على 24 بئرا قبل 7-10 أيام من العدوى.
  2. قبل يوم واحد من الزراعة المشتركة، خصص بئرا واحدا من VEOs ليتم تحويله إلى تربسين وحساب للحصول على تعدد دقيق للعدوى (MOI). تسخين مسبق بجرعة تريبسين-EDTA بنسبة 0.25٪ في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: 0.25٪ من تريبسين-إيدتا لن يستخدم أثناء العدوى؛ بل هو ضروري فقط لفصل VEOs أثناء حسابات MOI. تغليف الأواني البلاستيكية (مثل رؤوس الماصات، الأنابيب المخروطية) بنسبة 2.5٪ BSA في dPBS اختياري في هذه المرحلة، لكنه قد يساعد في تقليل فقدان الخلايا العضوية والخلايا لتحقيق عد أكثر دقة.
  3. استنشاق وسائط زراعة الخلايا من البئر المخصص واغسله باستخدام dPBS.
  4. قم بتوزيع 600 ميكرولتر من تريبسين-إيدتا المسخن مسبقا بنسبة 0.25٪ في البئر وأعد تعليقها جيدا باستخدام ماصة P1000 مغطاة ب BSA لتعطيل الميكانيكا في الميكروفون الحيوي. انقل محتويات البئر إلى أنبوب مخروطي معقم مغطى ب BSA بسعة 15 مل.
  5. حضن في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد 5 دقائق، أضف 10 مل من 10٪ FBS في RPMI لتبريد التريبسين.
  6. قم بعمل الطرد المركزي في نظام التعليق عند 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليقها باستخدام طرف ماصة مطلية ب BSA في 100-300 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا التائية العضوية أو DMEM/F12 العادي.
    ملاحظة: الحجم يعتمد على حجم الحبيبة. إذا كانت الحبيبة بالكاد مرئية، أعد تعليقها بحجم أقل.
  7. العد باستخدام جهاز قياس الدم الخلوي. احسب الكمية المناسبة من الفيروس المطلوبة لتحقيق 0.1 MOI باستخدام العيار الفيروسي المعروف وكثافة الخلايا لكل بئر من VEOs وفقا للمعادلة التالية:
    figure-protocol-1
  8. يتم استنشاق وسائط زراعة الخلايا من آبار VEO ليتم إصابتها وغسلها ب 500 ميكرولتر من dPBS المسخن مسبقا (37 درجة مئوية). حضن الآبار باستخدام dPBS لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  9. بعد 5 دقائق، تخلص من dPBS وأضف 500 ميكرولتر من الوسائط العضوية لكل بئر يحتوي على كمية كافية من الجسيمات الفيروسية لتحقيق MOI 0.1. حضن عند حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة ساعة مع تدوير يدوي لطيف لطبق زراعة الأنسجة كل 20-30 دقيقة.
  10. بعد فترة الحضانة لمدة ساعة واحدة، يتم استنشاق وسط العضوية الفيروسي وغسل الوسط ب 500 ميكرولتر من dPBS المسخن مسبقا (37 درجة مئوية). استنشاق dPBS واستبدله بوسائط عضوية جديدة.

6. تزامن خلايا T في CD8 مع عضويات الظهارة المهبلية المصابة بالفيروس والمقبلة

  1. قبل الزراعة المشتركة (ويفضل 4-24 ساعة قبل التحضير)، انقل الطب الحيوي من -80 درجة مئوية إلى 4 درجات مئوية للذوبان. توقع الكمية المناسبة من المكلة الحيوية لتذوب بناء على تصميم التجربة في الزراعة المشتركة: خطط لتغطية 8 ميكرولتر من البكتيريا الحيوية لكل بئر من صفيحة تحتوي على 96 بئرا و20 ميكرولتر من الميكانيكا الحيوية لكل بئر من صفيحة بها 24 بئرا.
    ملاحظة: الطب الحيوي لزج، وفترة الذوبان الأطول عند 4 درجات مئوية ستقلل اللزوجة وتحسن من القدرة على المناورة.
  2. جهز 2.5٪ BSA في dPBS وقم بتعقيمه. استخدم هذا الحل لتغليف كل سطح بلاستيكي يلامس الأنابيب المخروطية (مثل رؤوس الماصات أو الأنابيب المخروطية).
    ملاحظة: هذا الطلاء سيمنع التصاق VEOs بالسطح البلاستيكي وفقدانه أثناء التعامل.
  3. تحقق من VEOs تحت المجهر الضوئي لمعرفة الحجم والصحة العامة. تأكد من أن VEOs بعد 7-10 أيام من الزراعة ويبلغ قطرها في المتوسط ~100 ميكرون. ال VEOs الأصحاء ستظهر خلايا منفردة قليلة أو معدومة وتتميز بشكل موحد ومستدير.
    ملاحظة: إعادة طلاء VEOs بنسبة 1:1 في الزراعة المشتركة إذا زرعت في صفيحة بها 24 بئرا وإعادة الطلاء في صفيحة بها 24 بئر (أي أن بئر واحد من VEOs سيعيد زراعة بئر واحد من الزراعة المشتركة لخلايا T وعضوية). إذا تم إعادة الطلاء في صفيحة ب 96 بئر من صفيحة بها 24 بئر، أعد طلاء VEOs بنسبة 1:2 (أي أن بئر واحد من VEOs سيعيد زراعة بئرين من الزراعة المشتركة بين الخلايا التائية والعضوية).
  4. ضع العدد اللازم من ألواح زراعة الأنسجة المعقمة التي تحتوي على 96 أو 24 بئرا لاستخدامها في الزراعة المشتركة في الحاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: اللوح المسخن سيسرع من التصاق وتصلب الطب الحيوي.
  5. جهز وسط زراعة الخلايا التائية العضوية في DMEM/F12 بإضافة 2٪ مكمل B-27، 2 ملليمولار L-جلوتامين، 100 وحدة/مل بنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستريبتوميسين، 1x أحماض أمينية غير ضرورية، 1 ملليمول بيروفات الصوديوم، و0.2 ميكروغرام/مل أمفوتريسين B. خزنها في 4 درجات مئوية حتى تكون جاهزة للاستخدام.
  6. يتم سحب وسائط زراعة الخلايا من آبار VEO وغسل كل بئر ب 500 ميكرولتر من dPBS المعقم البارد (2-8 درجات مئوية).
  7. استنشق dPBS وأضف 200-500 ميكرولتر من محلول جمع العضويات البارد (2-8 درجة مئوية) (على الأقل 10 أضعاف حجم قطرة BME العضوية). تقوم الماصنة صعودا وهبوطا باستخدام ماصة P200 مغطاة ب BSA لتعطيل الميكروفون الميكانيكي الميكانيكي.
  8. حضانة اللوحة مع هز خفيف (~100 دورة في الدقيقة) على هزاز مداري عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. إذا لم يكن هناك هزاز بارد مداري متوفر، قم بحضانة اللوحة على الثلج مع هز يدوي كل 5 دقائق. إذا لم يتم إزالة البلمرة بعد 20 دقيقة، قم بإطالة فترة الحضانة حسب الحاجة.
  9. نقل محتويات الآبار باستخدام طرف الماصة المطلي ب BSA إلى أنبوب مخروطي معقم مطلى ب BSA بسعة 15 مل أو 50 مل على الجليد. قم بعمل جهاز الطرد المركزي في نظام التعليق عند 500 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  10. تخلص من المادة الفائقة واغسل VEOs ب 5-10 مل من dPBS البارد (2-8 درجة مئوية) (على الأقل 10 أضعاف حجم قطرات BME العضوية المجمعة). قم بعمل جهاز الطرد المركزي في نظام التعليق عند 500 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  11. تخلص من dPBS وأعد تعليق الحبيبة في 1 مل من وسط زراعة الخلايا التائية العضوية باستخدام طرف ماصة P1000 مطلية ب BSA. اترك تعليق VEO على التجميد حتى تصبح الخلايا التائية جاهزة للزراعة المشتركة.
  12. ابدأ بجمع الخلايا التائية للزراعة المشتركة. تحقق من خلايا T المريحة تحت المجهر الضوئي لمعرفة الحجم والصحة العامة. بدون تنشيط الإشارات، ستبطئ الخلايا التائية تكاثرها لكنها يجب أن تكون قد تشكلت بعض التجمعات. تأكد من عدم وجود شظايا أو حطام خلوي، وأن الخلايا التائية لها شكل متضخم. أعد تعليق الخلايا التائية باستخدام ماصة P1000 عن طريق التوصيل صعودا وهبوطا عدة مرات في كل زاوية من البئر وعد العدد الإجمالي لخلايا CD8 T الحية.
    ملاحظة: لكل بئر من صفيحة تحتوي على 96 بئرا، ازرع 100,000 خلية T لكل زراعة مشتركة في 8 ميكرولتر من التيار الحيوي. لكل بئر من صفيحة تحتوي على 24 بئرا، يتم زرع 200,000 خلية T لكل زراعة مشتركة في 20 ميكرولتر من الطب الحيوي.
  13. قم بعمل جهاز التعليق المركزي عند 584 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة في وسط زراعة الخلايا التائية العضوية بحجم 10 مل. دمج خلايا T مع VEOs عن طريق نقل عدد مناسب من خلايا T ليتم طلاء الآبار في الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على VEOs.
  14. جهاز الطرد المركزي عند 584 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق VEOs وخلايا T بالكمية المناسبة من BME. اخلط جيدا باستخدام رأس ماصة مطلية ب BSA، وطبق على لوحة زراعة أنسجة مسخنة مسبقا، 20 ميكرولتر لكل بئر من صفيحة بسعة 24 بئر أو 8 ميكرولتر لكل بئر من صفيحة بسعة 96 بئر.
    ملاحظة: حافظ على BME على الثلج أو في كتلة تبريد عند 4 درجات مئوية أثناء الطبق. وضع رؤوس الماصات في الثلاجة بدرجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الطلاء قد يساعد في منع التصلب المبكر للجسم الحيوي.
  15. ضع الصفيحة مقلوبة في الحاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وانتظر 30 دقيقة حتى التصاق الطب الحيوي الكامل والتصلب الكامل.
  16. خلال فترة الحضانة هذه، حضر وسط زراعة الخلايا التائية العضوية بالكامل بإضافة 100 نانوغرام/مل من جرعة الفئران العضوية، و55 ميكرومولار بيتا-ميركابتوإيثانول، و10 وحدات/مل من المورس IL-2 إلى وسط زراعة الخلايا التائية-العضوية الجاهزة.
  17. بعد فترة الحضانة، أضف بعناية 500 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا التائية العضوية الكامل لكل بئر من صفيحة مكونة من 24 بئر أو 250 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا التائية العضوية الكاملة لكل بئر من صفيحة بئر 96 بئرا. قم بتوزيع الوسائط على جوانب البئر لتجنب تعطيل قطرة الطب الحيوي. غير الوسائط كل يومين حتى يتم حصادها للتحليل.

7. جمع خلايا CD8 T المزرعة معا لتحليل التدفق الخلوي

  1. بمجرد أن تصل الزراعة المشتركة إلى اليوم السابع على الأقل في الزراعة، يتم الحصاد للتحليل. إذا لم تعبر خلايا T عن علامات شبيهة ب TRM في الزراعة المشتركة بحلول اليوم السابع، قم بتحسين موعد الحصاد بين اليوم 7-14، حسب اكتساب الظاهرة وقدرة VEO وخلايا T.
  2. تحضير مخزن فرز الخلايا المنشطة بالفلورية (FACS) للتلوين والتحليل الخلوي بتدفق التدفق عن طريق إضافة 0.2٪ مع ألبومين مصل البقر و0.1٪ مع أزيد الصوديوم إلى dPBS.
    ملاحظة: أزيد الصوديوم مادة كيميائية شديدة السمية. اتباع التوصيات المؤسسية في التعامل مع جميع النفايات والتخلص منها بما يتوافق مع لوائح السلامة البيولوجية المؤسسية.
  3. حضر كوكتيل أجسام مضادة فلورية في مخزن FACS لتلوين السطح، حسب العلامات المطلوبة للتحليل. لكل بئر، يجب أن تأخذ في الاعتبار ما لا يقل عن 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة.
  4. حضر صبغة فلورية للحياة في dPBS. لكل بئر، يجب أن تأخذ في الاعتبار على الأقل 50 ميكرولتر من صبغة القابلية للحياة.
  5. قم بإزالة الوسائط بعناية من كل بئر وأعد تعليقها جيدا في مخزن FACS البارد (2-8 درجات مئوية)، مع التوصيل بأنبوب 10-20 مرة لزيادة وخفض الإضاءة لتفكيك الميكروفون الميكانيكي الميكانيكيا. انقل محتويات كل بئر إلى صفيحة ذات قاع دائري ب 96 بئرا معنونة.
  6. الطرد المركزي عند 859 × جرام لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. خفض منحدر التباطؤ لجميع خطوات الطرد المركزي لتجنب فقدان العينة بسبب إعادة خلط الحبيبات.
  7. إزالة المادة الفائقة عن طريق قلب الصفيحة وطرد السائل بحركة واحدة ثابتة للأسفل. أعد تعليق 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة. قم بعمل الماصنة للأعلى والأسفل على الأقل 5 مرات باستخدام ماصة متعددة القنوات لضمان إعادة تعليق دقيقة لحبيبات الخلية.
  8. حضن لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية أو درجة حرارة الغرفة حسب الحاجة، محميا من الضواء. في نهاية فترة الحضانة، أضف 150 ميكرولتر من dPBS إلى كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات وجهاز طرد مركزي بقوة 859 × جرام لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية.
  9. قم بتفريغ السوبرناتينت عن طريق قلب اللوحة رأسا على عقب ونقذها للأسفل مرة واحدة بحركة مستمرة. أعد تعليقها في 50 ميكرولتر من صبغة القابلية للحياة. قم بعمل الماصنة للأعلى والأسفل على الأقل 5 مرات باستخدام ماصة متعددة القنوات لضمان إعادة تعليق دقيقة لحبيبات الخلية.
  10. حضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محميا من الضواء. في نهاية فترة الحضانة، أضف 150 ميكرولتر من مخزن FACS لكل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات وطرد مركزي بقوة 859 × جرام لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية.
  11. قم بتفريغ المادة الفائقة كما كان من قبل، وأعد تعليقها في 150 ميكرولتر من مخزن FACS إذا تم تشغيل العينات على مقياس تدفق خلوي فورا أو تثبيتها في 150 ميكرولتر من بارافورمالديهايد 0.5٪ وتترك عند 4 درجات مئوية. قم بعمل الماصنة للأعلى والأسفل على الأقل 5 مرات باستخدام ماصة متعددة القنوات لضمان إعادة تعليق دقيقة لحبيبات الخلية. يقوم بمرشح العينات الثابتة لمنع انسداد الأجهزة ويشغل على جهاز قياس تدفق خلال 12-36 ساعة لمنع فقدان الفلورة.
    ملاحظة: يعتبر بارافورمالديهايد مادة كيميائية خطيرة. اتباع لوائح السلامة البيولوجية المؤسسية في التعامل مع وإزالة المعلومات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصور المجهري لزراعة العضوية المصابة بخلايا T في CD8
تم إصابة VEOs المجهولين مسبقا للفئران ب LCMV وتم زراعتها معا مع خلايا CD8 T الخاصة ب LCMV. كما أجرينا هذه الزراعة المشتركة مع نموذج عدوى HSV-2 لتحديد مرونة البروتوكول، لكننا نعرض بيانات مجهرية لنموذج LCMV وأدرجنا بيانات تمايز الخلايا التائية في نموذج HSV-2 أدناه. يعبر LCMV عن بروتين فلوري أصفر (YFP)، بحيث يمكن رؤية الخلايا المصابة باستخدام المجهر الفلوري الروتيني. لهذا الغرض، أصيبت الخلايا المتحركة ذات السلوك المبك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتمد نماذج CD8 TRM على الإشارات البيئية المحلية للتميز والصيانة. تغرس هذه الإشارات برمجة خاصة بالأنسجة تسمح لأجهزة المراقبة المناعية الخاصة ب CD8 بالتكيف مع محيطها وأداء مهامها في المراقبة المناعية حسب الحاجة. للأسف، لم تستطع TRMs البقاء في المختبر بعد استخراجها من الأنسجة، وهذا حد من تحليلها التفصيلي12,13. في هذا البروتوكول، قدمنا طريقة يمكن من خلالها زراعة خلايا CD8 التائية مع الخلايا الظهارية لتطور إلى TRMs ذات خصائص...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد لدى المؤلفين مصالح متنافسة ليعلنوا عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل منحة المعاهد الوطنية للصحة R01AI177704-01A1 و R21AI183017-01، ومنحة بذور جامعة براون (ل L.K.B.) ومنحة F31AI186444 (ل Y.L.). نود أن نشكر الدكتور دوريان ب. مكغافرن (NINDS، NIH) على توفير فيروس التهاب السحايا اللمفاوي الذي يعبر عن YFP. نشكر مساعدة الدكتور سانغهيون لي ومختبره على المساعدة في تصوير سيتيشن-5 ونواة قياس تدفق الخلايا في جامعة براون لتسهيل الفحوصات القائمة على التدفق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول مائي 16٪ بارافورمالديهايدعلوم المجهر الإلكتروني15710-S
ألواح زراعة تيسوشي متعددة البئر غير معالجة من البوليسترين ب 24 بئرVWR الدولية10861-558
2-ميركابتوإيثانولجيبكو21985023
حقن معقمة بسعة 3 ملفيشر ساينتيفك14-955-457
5 مل،   سناب كاب،  أنابيب اختبار بوليسترين معقمة ذات قاع مستديرفالكون352058
أطباق بتري 60 ممفيشر ساينتيفكFB0875713A 
70 & mu; مصفات الخلايا المعقمةفيشر ساينتيفك22-363-548
ألواح دقيقة من البوليسترين غير المعالجة ذات قاع دائري بسعة 96 بئرغرينر بيو-ون650101
ألواح زراعة أنسجة متعددة بئر بوليسترين 96 بئر غير معالجةVWR الدولية10861-562
الألبومين البقري/الكسر Vالكيمياويات العلمية الحراريةJ6465518
كلوريد الأمونيومفيشر ساينتيفكA661-500
أمفوتيرسين B سيغما-ألدرتشA9528-100MG
ملحق B-27جيبكو17504044
قارئ التصوير متعدد الأنماط ioTek Cytation 5 Cell
DMEM/F12 متوسط 1:1سيتيفاSH30271. FS
محلول الملح المخزن بالفوسفات من دولبيكو 1xكورنينغ21031CV
حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (محلول 0.5 م/درجة حموضة 8.0)فيشر ساينتيفكBP2482-500
مقص دقيق جدا للتحليل الدقيقشركة روبوز للأدوات الجراحيةRS-5882
مصل الأبقار الجنيني - معالج بالفحم/الدكسترانR& دي سيستمزS11650
برنامج فلوجو v10بيكتون، ديكنسون وشركاهفلوجو (RRID:SCR_008520)
ملقط جريفشركة روبوز للأدوات الجراحيةRS-5135
حل HEPESسيتيفاSH30237.01
إل-جلوتامين (200 ملليمتر)جيبكوA2916801
مغناطيس 5 ملالأسطورة الحيوية480019
قرص ماوس CD8 Naï مجموعة عزل الخلايا التائيةالأسطورة الحيوية480044
بروتين EGF المؤتلف في الفأرجيبكو315091MG
محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية (100x)جيبكو11140050
محلول البنسلين-ستريبتوميسينسيتيفاSV30010
بيكربونات البوتاسيومMP Biomedicals0215255780
CD3 وEPSILON المضاد للفئران المنقي؛ الأجسام المضادةالأسطورة الحيوية100360
فأر مؤتلف B7.1 (CD80)-Fc كيميرا (خال من حامل)الأسطورة الحيوية555406
فأر مؤتلف IL-12 (ص70) (خالي من الحامل)الأسطورة الحيوية577004
فأر مؤتلف IL-2 (خال من الحامل)الأسطورة الحيوية575406
مستخلص غشاء القاعدة بعامل نمو منخفضR& دي سيستمزBME001-10
وسائط RPMI 1640سيتيفاSH30027.LS
أزيد الصوديومفيشر ساينتيفكS227I-25
بيروفيات الصوديوم (100 ملم متر)جيبكو11360070
تريبسين 0.25٪ بروتياز مع تريبسين خنزيريسيتيفاSH30042.02
صبغة قابلية الاستخدام (Red 780)سايتك للعلوم الحيوية13-0865-T100

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rosato, P. C., Beura, L. K., Masopust, D. Tissue resident memory T cells and viral immunity. Curr Opin Virol. 22, 44-50 (2017).
  2. Park, C. O., Kupper, T. S. The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease. Nat Med. 21, 688-697 (2015).
  3. Schenkel, J. M., et al. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses. Science. 346 (6205), 98-101 (2014).
  4. Ariotti, S., et al. Skin-resident memory CD8 + T cells trigger a state of tissue-wide pathogen alert. Science. 346 (6205), 101-105 (2014).
  5. Christo, S. N., Park, S. L., Mueller, S. N., Mackay, L. K. The Multifaceted Role of Tissue-Resident Memory T Cells. Annu Rev Immunol. 42 (1), 317-345 (2024).
  6. Gavil, N. V., Cheng, K., Masopust, D. Resident memory T cells and cancer. Immunity. 57 (8), 1734-1751 (2024).
  7. Christo, S. N., et al. Discrete tissue microenvironments instruct diversity in resident memory T cell function and plasticity. Nat Immunol. 22 (9), 1140-1151 (2021).
  8. Pan, Y., et al. Survival of tissue-resident memory T cells requires exogenous lipid uptake and metabolism. Nature. 543, 252-256 (2017).
  9. Hasan, M. H., Beura, L. K. Cellular interactions in resident memory T cell establishment and function. Curr Opin Immunol. 74, 68-75 (2022).
  10. Ulibarri, M. R., et al. Epithelial organoid supports resident memory CD8 T cell differentiation. Cell Rep. 43 (8), 114621(2024).
  11. Evrard, M., et al. Single-cell protein expression profiling resolves circulating and resident memory T cell diversity across tissues and infection contexts. Immunity. 56 (7), 1664-1680.e9 (2023).
  12. Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8+ T Cell and Invariant NKT Subsets. J Immunol. 202 (7), 2153-2163 (2019).
  13. Künzli, M., et al. Long-lived T follicular helper cells retain plasticity and help sustain humoral immunity. Sci Immunol. 5 (45), eaay5552(2020).
  14. Kang, J. S., et al. Generation of induced alveolar assembloids with functional alveolar-like macrophages. Nat Commun. 16, 3346(2025).
  15. Lin, M., et al. Establishment of gastrointestinal assembloids to study the interplay between epithelial crypts and their mesenchymal niche. Nat Commun. 14, 3025(2023).
  16. Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 364 (6444), 960-965 (2019).
  17. Quintard, C., et al. A microfluidic platform integrating functional vascularized organoids-on-chip. Nat Commun. 15, 1452(2024).
  18. Vincenti, I., et al. Tissue-resident memory CD8+ T cells cooperate with CD4+ T cells to drive compartmentalized immunopathology in the CNS. Sci Transl Med. 14 (640), eabl6058(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD8

مقالات ذات صلة