محور Mettl3 / Nrf2 يمنع تطور مرض باركنسون عن طريق تثبيط داء القلى الناجم عن NLRP3 في الخلايا العصبية السيروتونين

يصنف مرض باركنسون (PD) على أنه ثاني أكثر الاضطرابات التنكسية العصبية انتشارا بين كبار السن ، حيث يصيب حوالي 2-3٪ من الأفراد الذين تتراوح أعمارهم بين 65 عاما وما فوق ، مما يشكل عبئا كبيرا على كل من العائلات والمجتمع¹. على الرغم من أن الآليات الدقيقة وراء مرض باركنسون لا تزال مفهومة جزئيا ، إلا أن الأدلة المتراكمة تشير إلى وجود صلة بين تطور مرض باركنسون والتحديات في انتقال الخلايا العصبية ، جنبا إلى جنب مع الالتهاب العصبي المدفوع بالخلايا الدبقية الصغيرة ، وهي سمة شائعة تظهر في أدمغة الشيخوخة والأمراض التنكسية العصبية المختلفة ، بما في ذلك^{PD 2،3،4،5}. تعمل الخلايا الدبقية الصغيرة كخلايا مناعية فطرية داخل الجهاز العصبي المركزي (CNS) وهي حيوية للحفاظ على توازن الدماغ⁶. ومع ذلك ، فإن التنشيط المفرط المستمر لهذه الخلايا الدبقية الصغيرة يمكن أن يؤدي إلى استجابات التهابية عصبية مزمنة ، مما يساهم في النهاية في تطور مرض التنكس العصبي.

تؤثر كل من العمليات الالتهابية المركزية والطرفية بشكل كبير على أمراض مرض باركنسون^7،8. يؤدي تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة إلى استجابات التهابية تؤثر على بقاء الخلايا العصبية⁹ ، مع وجود أدلة ناشئة تسلط الضوء على تحضيرها بواسطة ubiquitin ligases¹⁰. من بين المسارات الالتهابية المختلفة ، يعمل تنشيط الالتهاب المحتوي على مجال NOD و LRR- و Pyrin 3 (NLRP3) كمساهم أساسي في تنظيم الالتهابات الدبقية الصغيرة¹¹. يؤدي التنشيط إلى تعبير NLRP3 والتجميع اللاحق لمركب الالتهابات المكون من بروتين محول مجال تنشيط وتجنيد الكاسبيز (CARD) و pro-caspase-1 ، ويبلغ ذروته في انقسام البروتين وإطلاق السيتوكين¹². لوحظ ارتفاع تنشيط NLRP3 في مرضى باركنسون والنماذج الحيوانية المختلفة للمرض ، مما أدى إلى موت الخلايا العصبية. والجدير بالذكر أن تثبيط NLRP3 أظهر تأثيرات وقائية ضد أمراض مرض باركنسون في نماذج الفئران ، مما يؤكد الدور الحاسم لالتهاب NLRP3 في ظهور مرض باركنسون^13،14.

تعد إشارات السيروتونين (5-HT) آلية مهمة للتنظيم العصبي ، وتؤثر على العديد من السلوكيات والوظائف الفسيولوجية من خلال التفاعلات مع ما لا يقل عن 14 نوعا فرعيا من مستقبلات ما بعد المشبكي^15،16 ، بما في ذلك الأدوار في علم أمراض الجهاز العصبي المركزي كما هو مفصل في لمحات عامة شاملة¹⁷. يحكم التأثير العصبي الشامل لنظام 5-HT ما يقرب من 26,000 الخلايا العصبية في دماغ القوارض¹⁸. في حين أن الأدبيات الكبيرة تربط مرض باركنسون في الغالب بفقدان الخلايا العصبية الدوبامين ، فإن العلاقة بين الخلايا العصبية 5-HT و PD يتم فحصها بشكل أقل شمولا.

يعد تعديل N6-methyladenosine (m6A) ، وهو تعديل mRNA الأكثر انتشارا في الخلايا حقيقية النواة ، مفتاحا لتنظيم تضفير mRNA والاستقرار والتصدير ، وبالتالي التأثير على الأنشطة الخلوية المختلفة¹⁹. يتم تعديل مستويات m6A بواسطة ميثيل ترانسفيراز وديميثيلاز. تم ربط تعديلات m6A المرتفعة في الدماغ بالنمو العصبي ، حيث يرتبط خلل التنظيم ارتباطا وثيقا بالحالات التنكسية العصبية^20،21 ، بما في ذلك تعبير METTL3 المتغير في نماذج الزهايمر²². على سبيل المثال ، ارتبط تراكم الميثيل ترانسفيراز الشبيه بالميثيل ترانسفيراز 3 (METTL3) في الجزء غير القابل للذوبان من أنسجة المخ بعد الوفاة من مرضى الزهايمر ارتباطا إيجابيا بمستويات بروتين تاو²³ غير القابل للذوبان. وعلاوة على ذلك, انخفاض كبير في مستويات m6A في المخطط يمكن أن يؤدي إلى انخفاض كبير في مستويات الناقل العصبي الدوبامين²⁴. والجدير بالذكر أن اثني عشر تعدد أشكال أحادية النوكليوتيدات مرتبطة ب m6A أظهرت ارتباطات كبيرة مع القابلية للإصابة بمرض باركنسون²⁵. يضع هذا البروتوكول منهجيات شاملة للتحقيق في كيفية تنظيم تعديلات m6A بوساطة METTL3 لالتهاب الخلايا الدبقية الصغيرة من خلال محور Nrf2 / NLRP3 ، مما يؤثر في النهاية على بقاء الخلايا العصبية السيروتونين في نماذج PD. تم اختيار نموذج MPTP الحاد في الجسم الحي ونموذج LPS في المختبر للتحريض القوي للاستجابات الالتهابية العصبية ، على الرغم من أن النماذج المزمنة يمكن أن تكمل الدراسات المستقبلية كما هو موضح أدناه.

تم إجراء جميع التجارب على بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها في مستشفى Feicheng الشعبي (رقم الموافقة IACUC-2024-118) وتم إجراؤها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والمبادئ الأخلاقية الراسخة لأبحاث المختبرية. ضمنت بروتوكولات الدراسة الرعاية الإنسانية والعلاج لجميع ، مع التركيز بشكل خاص على تقليل المعاناة والضيق ، مع الالتزام بكل من المعايير المؤسسية وإرشادات ARRIVE لممارسات البحث الحيوانية المسؤولة.

1. زراعة الخلايا ونموذج التنشيط الدبقي الدقيق

1. تحضير خلايا BV2 وصيانتها
   1. قم بإذابة مخزون الخلايا الدبقية الصغيرة المجمدة BV2 بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين، مما يضمن الدوران اللطيف لمنع الصدمة الحرارية.
   2. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية المذاب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) لإزالة واقي التبريد.
   3. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من وسط DMEM عالي الجلوكوز الكامل المكمل ب 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين و 2 ملي لتر جلوتامين.
   4. قم بإجراء تقييم لجدوى الخلية باستخدام طريقة استبعاد التربان الأزرق (امزج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من 0.4٪ من التريبان الأزرق ، والعد باستخدام مقياس الخلايا الدموية) ، مما يضمن >95٪ من الجدوى قبل المتابعة.
   5. الخلايا الصفيحية في قوارير ثقافة T75 بكثافة 1 × 10⁶ خلايا لكل قارورة وتحتفظ بها في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   6. خلايا المرور كل 48 ساعة عند الوصول إلى 80-85٪ من التقاء باستخدام إجراءات التربسين القياسية.
      ملاحظة: حافظ على أرقام المقاطع المتسقة (المقاطع 3-8) لضمان الاستجابات الالتهابية القابلة للتكرار. تكررت جميع تجارب زراعة الخلايا بشكل مستقل ثلاث مرات على الأقل ، مع ثلاثة تكرارات تقنية لكل حالة لتقليل التباين.
2. تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة الناجم عن LPS
   1. بذور BV2 خلايا في 6 آبار في 2 × 10⁵ خلايا لكل بئر في 2 مل من الوسط الكامل قبل 24 ساعة من العلاج.
   2. قم بإعداد محلول مخزون LPS عند 1 مجم / مل في PBS المعقم ، وقم بتعقيمه بالترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر ، وتخزينه في حصص تستخدم مرة واحدة عند -20 درجة مئوية.
   3. التحقق من صحة نشاط LPS باستخدام مقايسة Limulus Amebocyte Lysate (LAL) لتأكيد تركيز السموم الداخلية قبل كل تجربة²⁶.
   4. قم بتخفيف مخزون LPS إلى تركيز عمل 1 ميكروغرام / مل في DMEM الخالي من المصل مباشرة قبل الاستخدام.
   5. قم بإزالة وسط الاستزراع من الآبار واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS المعقم.
   6. أضف 2 مل من الوسط المحتوي على LPS (تركيز نهائي 1 ميكروغرام / مل) إلى آبار المعالجة و DMEM الخالي من المصل للتحكم في الآبار.
   7. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ للتنشيط الالتهابي.
   8. قم بتضمين آبار التحكم الإيجابية المعالجة بعامل نخر الورم 100 نانوغرام / مل (TNF) -α وآبار التحكم السلبية مع السيارة فقط (PBS) للتحقق من صحة الاستجابة الالتهابية.
      ملاحظة: قم بإعداد محلول LPS جديد لكل تجربة للحفاظ على نشاط حيوي متسق. إذا كانت الاستجابة الالتهابية ضعيفة (على سبيل المثال ، <زيادة السيتوكين بمقدار 2 ضعف) ، فتحقق من استقرار الكاشف أو قم بتمديد فترة الحضانة إلى 48 ساعة.
3. Mettl3 المبالغة في التعبير والضربة القاضية
   1. تصميم وتوليف تسلسلات صغيرة متداخلة للحمض النووي الريبي (siRNA) تستهدف Mettl3 وتسلسلات التحكم المختلطة باستخدام بروتوكولات تخليق قليل النوكليوتيدات القياسية. حدد التسلسلات المستهدفة من منطقة ترميز Mettl3 mRNA (وصول GenBank: NM_019721) بطول 19-21 نيوكليوتيد ، مما يضمن محتوى GC من 40-60٪ ²⁷.
   2. تحقق من صحة تسلسلات siRNA باستخدام تحليل BLAST لتأكيد الخصوصية وتجنب التأثيرات غير المستهدفة (تأكد من <70٪ تماثل مع الجينات غير المستهدفة).
   3. قم بإعداد ناقلات الإفراط في التعبير تحتوي على Mettl3 (كدنا) كامل الطول مستنسخ في متجه pcDNA3.1 باستخدام مواقع التقييد EcoRI و XhoI.
   4. انقاذ الخلايا عند التقاء 70-80٪ باستخدام كاشف تعداء الدهون الكاتيوني:
      1. امزج 2 ميكرولتر من كاشف تعداء الدهون الموجبة مع 50 pmol siRNA أو 2 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد في 100 ميكرولتر من وسط Opti-MEM.
      2. احتضن الخليط لمدة 15 دقيقة في RT.
      3. أضف مركب التعداء بالتنقيط إلى الخلايا واحتضنه لمدة 4-6 ساعات قبل التغيير إلى وسط كامل جديد.
   5. احتضان الخلايا المنقولة لمدة 48 ساعة قبل علاج LPS للسماح بتغييرات كافية في التعبير عن البروتين.
   6. تأكد من كفاءة التعداء باستخدام التعداء المشترك لمراسل الفلورسنت (100 نانوغرام من pEGFP-C1 لكل بئر) ، مستهدفا كفاءة >70٪ عن طريق الفحص المجهري الفلوري قبل المتابعة.

2. تطوير نموذج والتصميم التجريبي

1. تحضير والتوزيع العشوائي
   1. احصل على فئران C57BL / 6J من مختبر Vital River ، مما يضمن نسب متساوية بين الذكور والإناث ، تتراوح أعمارهم بين 8 أسابيع ، بوزن 19-26 جم.
   2. المنزل في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) مع دورة ضوء غامق 12:12 ساعة ، ودرجة حرارة خاضعة للتحكم (22 ± 2 درجة مئوية) ، ورطوبة (50-60٪).
   3. اسمح بفترة تأقلم مدتها 7 أيام مع الوصول إلى الطعام والماء القياسيين.
   4. إجراء تقييمات سلوكية أساسية أثناء التأقلم: قم بإجراء تقييمات سلوكية شاملة ، بما في ذلك اختبار وضع الأطراف الأمامية (10 تجارب لكل جانب) ، وتسريع تقييم الدوار (4-40 دورة في الدقيقة على مدار 5 دقائق) ، وتحليل النشاط الحركي في المجال المفتوح (جلسات مدتها 10 دقائق في جهاز 50 سم × 50 سم × 50 سم) ^28،29،30.
   5. قم بتعيين عشوائيا إلى مجموعات تجريبية (ن = 6 لكل مجموعة) باستخدام التوزيع العشوائي المحوسب لتقليل التحيز: الوهمية ، النموذج ، النموذج + Nrf2-KD ، النموذج + oe-Nrf2.
   6. تنفيذ تصميم تجريبي أعمى حيث لا يكون المحققون الذين يجرون تقييمات سلوكية على دراية بمهام المجموعة.
2. 1-ميثيل-4-فينيل-1،2،3،6-تتراهيدروبيريدين (MPTP) نموذج مرض باركنسون الناجم عن
   1. تحضير محلول MPTP بمعدل 30 مجم / كغ في محلول ملحي معقم مباشرة قبل الحقن عن طريق إذابة 15 مجم من هيدروكلوريد MPTP في 5 مل من المحلول الملحي المعقم وضبط الحجم بناء على وزن.
      تنبيه: MPTP شديد السمية العصبية. مقبض في غطاء دخان كيميائي مع معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك القفازات المزدوجة ومعطف المختبر.
   2. يتم تطبيق MPTP عن طريق الحقن داخل الصفاق عند 30 ملغ/كغ من وزن الجسم (حجم الحقن 10 مل/كغ) لمدة ثلاثة أيام متتالية في نفس الوقت يوميا (09:00 ± 30 دقيقة).
   3. حقن المجموعة الوهمية بكميات مكافئة من المحلول الملحي المعقم باتباع جدول حقن مماثل.
   4. راقب بحثا عن علامات الضيق أو فقدان الوزن (>15٪ تعتبر نقطة نهاية) أو ردود الفعل السلبية يوميا خلال فترة إدارة MPTP باستخدام أوراق تسجيل موحدة.
   5. الحفاظ على لمدة 8 أيام بعد الحقن النهائي للسماح بتطور التنكس العصبي.
      ملاحظة: يمكن إيواء بشكل طبيعي خلال هذه الفترة مع المراقبة المستمرة.
3. الحقن الفيروسي التجسيمي
   1. تحضير النواقل الفيروسية AAV9 عن طريق تعداء ثلاثي لخلايا HEK293T باستخدام البولي إيثيلينمين (PEI ؛ نسبة 1: 3 DNA: PEI) ، والحصاد في 72 ساعة بعد التعداء ، والتنقية باستخدام الطرد المركزي الفائق المتدرج اليوديكسانول (177,000 × جم لمدة ساعتين) ، والتركيز باستخدام أجهزة ترشيح الطرد المركزي لتحقيق 1 × 10¹² نسخة جينوم / مل.
   2. التحقق من صحة العيار الفيروسي عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (PCR) باستخدام بادئات تستهدف مناطق ITR ، مما يضمن وصول العيار إلى 1 × 10¹² نسخ جينوم / مل مع تحليل المنحنى القياسي.
   3. التحقق من صحة العيار الفيروسي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي المستند إلى SYBR Green مع البادئات الخاصة ب ITR ، وإجراء التخفيفات التسلسلية للمعايير المعروفة وحساب نسخ الجينوم باستخدام تحليل المنحنى القياسي. تأكد من عدم وجود تلوث بالفيروس المختص بالتكاثر باستخدام p24 ELISA.
   4. قم بتخدير الفئران باستخدام الأيزوفلوران (تحريض 3٪ ، 1.5-2٪ صيانة) يتم تسليمها بمعدل تدفق الأكسجين 0.8-1.0 لتر / دقيقة من خلال مخروط الأنف ، ومراقبة معدل التنفس (60-100 نفس / دقيقة) ومنعكس قرصة إصبع القدم طوال العملية. قم بتثبيت الماوس في الإطار التجسيمي واستخدم مرهما للعين لمنع جفاف القرنية.
   5. قم بتثبيت الماوس في الإطار التجسيمي واستخدم مرهما للعين لمنع جفاف القرنية.
   6. قم بعمل شق في منتصف فروة الرأس بطول 1.5 سم باستخدام شفرة مشرط معقمة وحدد علامة بريجما باستخدام إحداثيات تجسيمية بدقة 0.1 مم.
   7. احسب إحداثيات الحقن للمخطط الأمامي الخلفي -0.5 مم ، الإنسي الجانبي ±2.0 مم ، الظهري البطني -3.0 مم من الشقيق.
   8. قم بإجراء الحقن التجريبية باستخدام متتبع الفلورسنت (على سبيل المثال ، بروتين الفلورسنت الأخضر [GFP]) للتحقق من صحة دقة الاستهداف ، وتأكيد >80٪ من التوطين المشترك مع علامات الخلايا الدبقية الصغيرة (Iba1) عبر الكيمياء المناعية قبل الحقن التجريبية.
   9. إبرة حقن منخفضة (33-G) لاستهداف العمق بمعدل 1 مم / دقيقة وحقن 2 ميكرولتر من المعلق الفيروسي عند 0.2 ميكرولتر / دقيقة باستخدام مضخة حقنة صغيرة مع وحدة تحكم آلية. اخفض إبرة الحقن إلى العمق المستهدف وحقن 2 ميكرولتر من المعلق الفيروسي بمعدل 0.2 ميكرولتر / دقيقة باستخدام مضخة حقنة دقيقة.
   10. حافظ على وضع الإبرة لمدة 5 دقائق بعد الحقن لمنع التدفق العكسي.
   11. اسحب الإبرة ببطء بمعدل 0.5 مم / دقيقة ، وأغلق الشق ب 4-0 خيوط حريرية باستخدام نمط متقطع ، واسمح بالتعافي من التخدير على وسادة استرداد ساخنة.
   12. تطبيق مسكنات الألم بعد العملية الجراحية (كاربروفين 5 ملغ/كغ تحت الجلد مرة واحدة يوميا لمدة 3 أيام) ومراقبة التعافي لمدة 24 ساعة باستخدام أوراق الملاحظة التفصيلية.

3. تقنيات البيولوجيا الجزيئية والتحقق من الصحة

1. استخراج الحمض النووي الريبي ومراقبة الجودة
   1. حصاد الخلايا أو عينات أنسجة المخ المخططة مباشرة بعد نقاط النهاية التجريبية عن طريق القتل الرحيم للحيوانات بطريقة إنسانية عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون₂ متبوعا بخلع عنق الرحم ؛ قم بتشريح الأنسجة على الثلج ، وافرمها جيدا ، وفصلها إنزيميا مع 0.25٪ التربسين لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في حالة حصاد الخلايا.
   2. استخرج الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام كاشف TRIzol (1 مل لكل 1 10 أو⁶ خلايا أو 100 مجم من الأنسجة) مع التجانس الميكانيكي (20-25 ضربة في الخالط المرتد) وفصل طور الكلوروفورم (0.2 مل من الكلوروفورم لكل 1 مل من TRIzol).
   3. تقييم جودة الحمض النووي الريبي باستخدام قياس الطيف الضوئي (نسبة A260 / A280 1.8-2.0) والرحلان الكهربائي للهلام (1٪ agarose) لتأكيد النطاقات الريبوزومية 28S و 18S.
   4. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
   5. قم بتخزين عينات الحمض النووي الريبي في درجة حرارة -80 درجة مئوية في ماء خال من النوكلياز عند -80 درجة مئوية مع إضافة مثبط RNase (40 وحدة / ميكرولتر) حتى التحليل.
2. التجزئة النووية السيتوبلازمية
   1. حصاد الخلايا (2 × 10⁶ كحد أدنى) واغسلها مرتين باستخدام PBS المثلج (5 مل لكل غسلة ، 5 دقائق من الطرد المركزي عند 300 × جم).
   2. استخدم مجموعة تجزئة الخلايا التجارية مع البروتوكول التالي.
      1. أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج السيتوبلازمي مع مثبطات البروتياز
      2. احتضن على الثلج لمدة 10 دقائق مع دوامة كل 3 دقائق.
      3. جهاز طرد مركزي عند 16,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وجمع المادة الطافية (جزء السيتوبلازمي).
      4. اغسل الحبيبات مرتين باستخدام مخزن استخلاص السيتوبلازمي.
      5. أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج النووي.
      6. احتضن على الثلج لمدة 40 دقيقة مع دوامة كل 10 دقائق.
      7. جهاز طرد مركزي عند 16,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية واجمع المادة الطافية (الكسر النووي)
   3. التحقق من كفاءة التجزئة من خلال تحليل توزيع العلامة النووية (U6) والعلامة السيتوبلازمية (GAPDH) باستخدام اللطخة الغربية.
   4. استخراج الحمض النووي الريبي من الكسور النووية والسيتوبلازمية بشكل منفصل.
   5. تحليل مستويات Nrf2 mRNA في كل جزء باستخدام RT-qPCR مع الجينات المرجعية الخاصة بالكسر.
3. تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (RT-qPCR)
   1. قم بتصنيع (كدنا) من 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة كاشف النسخ العكسي مع بادئات عشوائية.
   2. قم بإجراء qPCR باستخدام مجموعة Premix Ex Taq II مع مواد أولية خاصة بالجينات على نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي.
   3. التحقق من صحة خصوصية التمهيدي باستخدام تحليل منحنى الذوبان وتأكيد أمبليكون واحد عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام.
   4. استخدم شروط التدوير الحراري التالية: التمسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، متبوعا ب 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
   5. احسب مستويات تعبير mRNA النسبية باستخدام طريقة ^2-ΔΔCt مع β-actin كمرجع داخلي.
   6. قم بتضمين عناصر تحكم بدون قالب والتحقق من صحة استقرار الجينات المرجعية عبر الظروف التجريبية باستخدام تحليل geNorm (قيمة الاستقرار M < 0.5).
      ملاحظة: درجات التكرار: معامل التباين داخل الفحص (CV) <10٪ عبر ثلاثة عمليات مستقلة.
4. MeRIP-qPCR لتحليل تعديل m6A
   1. استخرج إجمالي الحمض النووي الريبي (20 ميكروغرام كحد أدنى) وقم بتجزئته إلى 100-200 نيوكليوتيد باستخدام كاشف تجزئة الحمض النووي الريبي (10 ملي مولار ZnCl₂ ، 10 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.0) عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   2. قم بإجراء الترسيب المناعي باستخدام الأجسام المضادة الخاصة ب m6A (2 ميكروغرام لكل 20 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي) طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الدوران (10 دورة في الدقيقة) في المخزن المؤقت للترسيب المناعي (50 ملي مولار Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، 750 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.5٪ NP-40).
   3. التحقق من صحة خصوصية الأجسام المضادة باستخدام عناصر تحكم الحمض النووي الريبي المعدلة وغير المعدلة المعروفة m6A.
   4. اغسل المجمعات المنعية خمس مرات باستخدام مخزن الغسيل.
   5. الحمض النووي الريبي المرتبط ب Elute والنسخ العكسي باستخدام الاشعال العشوائية.
   6. يقوم النسخ العكسي للحمض النووي الريبي المملوء باستخدام بادئات عشوائية وإجراء تحليل qPCR باستخدام البادئات الخاصة ب Nrf2 التي تغطي مواقع m6A المحتملة.
   7. قم بإجراء تحليل qPCR باستخدام البادئات الخاصة ب Nrf2 وحساب التخصيب بالنسبة إلى الحمض النووي الريبي المدخل.
      ملاحظة: إذا كان الاكتشاف غير متسق ، فقم بتحسين وقت التجزئة (4-6 دقائق) لتحسين قابلية التكاثر. المعيار الكمي: نسبة الإشارة إلى الضوضاء >15: 1 مقارنة بعناصر تحكم IgG.

4. تحليل البروتين والتحقق من صحته

1. استخراج البروتين وقياسه كميا
   1. خلايا محللة (1 × 10⁶ خلايا) أو تجانس عينات الأنسجة (100 مجم من الأنسجة المخططة) في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لمقايسة الترسيب المناعي المشع (RIPA) التي تحتوي على مثبطات البروتياز (1 ملي مولار فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) ، 1 ميكروغرام / مل ليوببتين ، 1 ميكروغرام / مل بيبستاتين أ) ومثبطات الفوسفاتيز (1 ملي مولار أورثوفاندات الصوديوم ، 5 ملي فلوريد الصوديوم).
   2. احتضان التحلل على الجليد لمدة 30 دقيقة مع دوامة دورية (كل 10 دقائق لمدة 10 ثوان).
   3. جهاز طرد مركزي عند 12,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة الحطام الخلوي وجمع المواد الطافية.
   4. حدد تركيز البروتين باستخدام مقايسة حمض البيسينشونيك (BCA) مع معايير ألبومين مصل البقر (0 ، 25 ، 125 ، 250 ، 500 ، 750 ، 1000 ، 1500 ، 2000 ميكروغرام / مل) في قياسات ثلاثية.
   5. تحقق من سلامة البروتين من خلال تحليل مستويات بروتين التدبير المنزلي (GAPDH ، ميغاواط المتوقع: 36 كيلو دالتون) عبر جميع العينات باستخدام اللطخة الغربية.
2. تحليل اللطخة الغربية
   1. قم بإعداد عينات البروتين بتحميل متساو (30-50 ميكروغرام) في المخزن المؤقت للتحميل الكهربائي لهلام دوديسيل كبريتات الصوديوم - بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) (التركيزات النهائية: 62.5 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 6.8 ، 2٪ SDS ، 10٪ جلسرين ، 5٪ β-ميركابتوإيثانول ، 0.003٪ بروموفينول أزرق) وتغيير طبيعتها عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   2. افصل البروتينات بواسطة SDS-PAGE باستخدام جل بولي أكريلاميد بنسبة 10٪ ، تعمل عند 80 فولت لمدة 30 دقيقة متبوعا ب 120 فولت لمدة 90 دقيقة في المخزن المؤقت Tris-glycine-SDS.
   3. نقل البروتينات إلى أغشية فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) باستخدام نظام نقل شبه جاف (400 مللي أمبير لمدة 90 دقيقة) في مخزن مؤقت للنقل (25 ملي مولار تريس ، 192 ملي جلايسين ، 20٪ ميثانول).
   4. تأكد من كفاءة النقل باستخدام تلطيخ البروتين القابل للانعكاس (Ponceau S: 0.1٪ في 5٪ حمض الخليك لمدة 5 دقائق) قبل الشروع في حضانة الأجسام المضادة.
   5. قم بحظر الأغشية ب 5٪ حليب خالي الدسم في TBST (TBS + 0.1٪ Tween-20) لمدة ساعة واحدة في RT مع تحريك لطيف.
   6. احتضان الأجسام المضادة الأولية المخففة 1: 1000 في حجب المخزن المؤقت طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع تحريض لطيف.
   7. غسل الأغشية ثلاث مرات باستخدام TBST (10 دقائق لكل منهما) واحتضان الأجسام المضادة الثانوية المترافقة ب HRP (تخفيف 1: 5000) لمدة ساعة واحدة عند RT.
   8. اكتشف نطاقات البروتين باستخدام التلألؤ الكيميائي المحسن وحدد كميا باستخدام قياس الكثافة.
   9. تطبيع تعبير البروتين المستهدف إلى التحكم في التحميل (GAPDH) والتحقق من خصوصية الأجسام المضادة باستخدام الضوابط المناسبة (حجب الببتيد للأجسام المضادة الأولية ، والضوابط الثانوية فقط).

5. التقييم السلوكي والتحليل الوظيفي

1. اختبار وضع الطرف الأمامي
   1. اسمح للماوس بالتأقلم مع بيئة الاختبار (غرفة هادئة ، 22 درجة مئوية ، إضاءة خافتة) لمدة 30 دقيقة قبل التقييم.
   2. أمسك الماوس برفق من الجلد الظهري ، وقم بتعليق الأطراف الأربعة على ارتفاع 0.5 سم تقريبا فوق حافة الطاولة مع التأكد من عدم تمكن الماوس من رؤية سطح الطاولة.
   3. قم بتنظيف الاهتزازات على كل جانب على حافة الطاولة لتشغيل رد الفعل الموضع وتسجيل وضع الطرف الأمامي بنجاح في غضون 2 ثانية.
   4. قم بإجراء 10 تجارب لكل جانب بفواصل زمنية 30 ثانية بين التجارب ، بالتناوب بين الجانبين الأيسر والأيمن.
   5. قم بإجراء الاختبار في ظروف إضاءة متسقة (50-100 لوكس) والوقت من اليوم (13:00-17:00) لتقليل تأثيرات الساعة البيولوجية.
   6. احسب معدل النجاح كنسبة مئوية من المواضع الناجحة: (المواضع الناجحة/إجمالي التجارب) × 100.
2. تسريع اختبار الروتارود
   1. اضبط جهاز الدوار على سرعة ابتدائية قدرها 4 دورات في الدقيقة مع تسارع خطي إلى 40 دورة في الدقيقة على مدار 5 دقائق.
   2. قم بتدريب الفئران على الدوارة لمدة 3 أيام متتالية (3 تجارب في اليوم ، وفواصل زمنية مدتها 15 دقيقة) قبل الاختبار لتقليل تأثيرات التعلم.
   3. توحيد ظروف الاختبار ، بما في ذلك RT (22 ± 2 درجة مئوية) والإضاءة (100 لوكس) ومستويات ضوضاء الخلفية (<50 ديسيبل).
   4. ضع الماوس على القضيب الدوار متجها للأمام وابدأ بروتوكول التسارع على الفور.
   5. سجل زمن الوصول إلى السقوط (الوقت من البداية حتى سقوط الفأر أو إكمال التجربة لمدة 5 دقائق) لكل تجربة ، واختبار 5 مرات لكل بفترات راحة مدتها 15 دقيقة.
   6. احسب متوسط زمن الوصول من أطول ثلاث تجارب لتقليل التباين بسبب العوامل التحفيزية.
3. اختبار المجال المفتوح
   1. استخدم جهازا مفتوحا (50 سم × 50 سم × 50 سم صندوق أكريليك شفاف) مع نظام تتبع الفيديو الموجود على ارتفاع 1 متر فوق الساحة.
   2. قم بتنظيف الجهاز بنسبة 70٪ من الإيثانول بين (الرش والمسح ، تجفيف الهواء لمدة 5 دقائق) للتخلص من إشارات الرائحة.
   3. ضع الماوس في وسط الجهاز وسجل النشاط لمدة 10 دقائق تحت إضاءة متسقة (200 لوكس) مع التقاط الفيديو بمعدل 30 إطارا في الثانية.
   4. تحليل معلمات متعددة باستخدام برنامج التتبع الآلي:
      إجمالي المسافة المقطوعة (سم)
      وقت المنطقة المركزية (يعرف بأنه 10 سم من الجدران ، تم الإبلاغ عنه باللغة الثانية)
      سرعة الحركة (سم / ثانية)
      الوقت الذي يقضيه في المناطق المحيطة مقابل المناطق المركزية
4. حدد المنطقة المركزية على أنها 10 سم من الجدران وحدد الوقت الذي يقضيه والمسافة المقطوعة في المركز مقابل المناطق المحيطة.

6. الفحص المجهري والتصوير المتقدم

1. تلطيخ DHE للكشف عن ROS
   1. تحضير محلول ثنائي هيدرو إيثيديوم الطازج (DHE) عند 10 ميكرومتر في PBS مباشرة قبل الاستخدام (حماية من الضوء).
   2. أداء تلطيخ التألق المناعي المشترك الجمع بين DHE مع التربتوفان هيدروكسيلاز 2 (TPH2) الأجسام المضادة (1:500 تخفيف) لتحديد الخلايا العصبية السيروتونين على وجه التحديد.
      ملاحظة: يتيح نهج الملصقات المزدوجة هذا التمييز بين إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل أجسام الخلايا العصبية الإيجابية TPH2 من الإجهاد التأكسدي في الخلايا الدبقية المحيطة ، بناء على مبدأ أن DHE ، عند الأكسدة بواسطة الأكسيد الفائق ، تشكل منتجات فلورسنت غير منفذة للغشاء تظل موضعية داخل الخلية الأصلية.
   3. احتضان أقسام الأنسجة (سمك 20 ميكرومتر) بمحلول DHE لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في ظروف مظلمة في غرفة رطبة.
   4. قم بتضمين الضوابط السلبية (بدون DHE) والضوابط الإيجابية (علاج 100 ميكرومتر H₂O₂ لمدة 30 دقيقة) للتحقق من خصوصية اكتشاف أنواع الأكسجين التفاعلية.
   5. اغسل الأقسام ثلاث مرات باستخدام PBS وقم بتثبيتها بوسط تثبيت مضاد للبهتان.
   6. الصورة باستخدام الفحص المجهري الفلوري (DHE: إثارة 518 نانومتر / انبعاث 605 نانومتر ، TPH2: إثارة 488 نانومتر / انبعاث 525 نانومتر) مع إعدادات تعرض متسقة (200 مللي ثانية) عبر العينات ؛ تمت معايرة أنظمة التصوير أسبوعيا باستخدام حبات التألق القياسية (نسبة الإشارة إلى الضوضاء > 20: 1).
   7. حدد شدة التألق في الخلايا الموجبة TPH2 فقط باستخدام برنامج ImageJ مع بروتوكولات التحليل القياسية (العتبة: 50-255 ، حجم الجسيمات: 10-∞ بكسل²). ضع حدود عائد الاستثمار بناء على النشاط المناعي TPH2 لضمان قياس الإجهاد التأكسدي على وجه التحديد داخل الخلايا العصبية السيروتونينية مع استبعاد الإشارة من الخلايا الدبقية الصغيرة المجاورة أو الخلايا النجمية أو أنواع الخلايا الأخرى. لكل ، قم بتحليل ما لا يقل عن 50 خلية عصبية إيجابية TPH2 عبر أقسام أنسجة متعددة.
2. الكيمياء المناعية
   1. إصلاح أقسام الأنسجة في 4٪ بارافورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة 24 ساعة عند 4 درجة مئوية مع تحريض لطيف.
   2. قم بتجفيف البارافين من خلال سلسلة إيثانول متدرجة (70٪ ، 80٪ ، 90٪ ، 95٪ ، 100٪ × 2 ، 1 ساعة لكل منهما) وتضمينها في البارافين باستخدام معالج آلي.
   3. قم بقص أقسام 5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم وقم بتثبيتها على شرائح زجاجية مشحونة ، مما يضمن 3-4 أقسام لكل شريحة.
   4. قم بإزالة البارافين من الأقسام باستخدام الزيلين (2 × 10 دقائق) وإعادة الترطيب من خلال الإيثانول المتدرج إلى الماء.
   5. قم بإجراء استرجاع المستضد باستخدام عازلة السترات (10 ملي سترات الصوديوم ، درجة الحموضة 6.0) في الميكروويف (750 واط لمدة 10 دقائق مع فترات تبريد مدتها دقيقتان).
   6. التحقق من صحة خصوصية الأجسام المضادة باستخدام الضوابط السلبية المناسبة (بدون جسم مضاد أولي) وأنسجة التحكم الإيجابية (أقسام الدماغ المعروفة بالتعبير عن البروتينات المستهدفة).
   7. منع نشاط البيروكسيديز الداخلي مع 3٪ بيروكسيد الهيدروجين في الميثانول لمدة 10 دقائق عند RT.
   8. يتم تطبيق الأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 درجات مئوية في غرفة مرطبة.
   9. اكتشف باستخدام الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع HRP (تخفيف 1: 500 ، 1 ساعة في RT) وكروموجين DAB (احتضان حتى يتطور اللون البني ، عادة 2-5 دقائق).
   10. قم بإزالة البقع باستخدام الهيماتوكسيلين (30 ثانية) ، وتجفيفها ، وتنظيفها ، وتركيبها بوسط تثبيت دائم.
   11. تحديد الخلايا الموجبة باستخدام الطرق المجسمة مع أخذ العينات العشوائية المنهجية (كل قسم خامس ، 3 إطارات عد لكل قسم ، تكبير 40×).

7. التحليل الإحصائي والتحقق من صحة البيانات

1. التصميم والتحليل الإحصائي
   1. قم بإجراء تحليل الطاقة لتحديد أحجام العينات المناسبة للكشف عن الاختلافات ذات المغزى البيولوجي (حجم التأثير ≥ 0.8 ، ≥ الطاقة 0.80 ، α = 0.05) باستخدام برنامج G * Power 3.1.9.7.
   2. التحقق من صحة البيانات الطبيعية باستخدام اختبار شابيرو ويلك وتقييم تجانس التباين باستخدام اختبار ليفين قبل التحليل البارامتري.
   3. تحليل البيانات باستخدام برنامج إحصائي مع اختبارات إحصائية مناسبة بناء على التصميم التجريبي وتوزيع البيانات.
   4. تطبيق تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) للمقارنات أحادية العامل و ANOVA ثنائي الاتجاه للتصاميم العاملية (على سبيل المثال ، العلاج × التفاعلات الزمنية).
   5. استخدم اختبار Tukey اللاحق لمقارنات متعددة عندما تظهر ANOVA أهمية (ص < 0.05) ، مع تطبيق تصحيح Bonferroni عند الاقتضاء.
   6. حدد عتبة الدلالة الإحصائية عند p < 0.05 لجميع التحليلات مع تدوين إضافي ل p < 0.01 و p < 0.001.
   7. أحجام تأثير الإبلاغ (كوهين d أو^{η 2}) وفترات ثقة 95٪ جنبا إلى جنب مع قيم p لتوفير تفسير إحصائي شامل.
   8. قدم البيانات كمتوسط ± SEM من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل ، مع عرض نقاط البيانات الفردية عند n ≤ 10.
      ملاحظة: يجب تكرار جميع تجارب زراعة الخلايا بشكل مستقل ثلاث مرات على الأقل ، مع كل تجربة بما في ذلك الضوابط المناسبة والتكرارات التقنية المتعددة ، وتم تقليل التباين الملحوظ (على سبيل المثال ، السيرة الذاتية <15٪ للبيانات السلوكية) من خلال التعمية والتوقيت الموحد.

يوضح البروتوكول بنجاح أن تعبير Mettl3 ينخفض في الخلايا الدبقية الصغيرة المعالجة ب LPS (الشكل 1) ، كما يتضح من كل من تخفيضات مستوى mRNA والبروتين مقارنة بالمجموعات الضابطة (الشكل 1 ب ، ج). يؤكد تحليل ELISA التنشيط الالتهابي الناجح بوساطة LPS من خلال مستويات IL-6 و TNF-α المرتفعة في المواد الطافية المزرعة (الشكل 1 أ).

يكشف تحليل MeRIP-qPCR أن الإفراط في التعبير عن Mettl3 يعزز مثيلة Nrf2 mRNA m6A ، مما يزيد بشكل متناقض من استقرار البروتين والتعبير عنه بدلا من تعزيز التدهور ، بما يتفق مع الأدلة الناشئة على أن تعديلات m6A يمكن أن تعزز كفاءة الترجمة في سياقات خلوية محددة (الشكل 2 أ ، ب). تظهر تجارب التجزئة النووية السيتوبلازمية أنه بينما يظل توزيع Nrf2 mRNA دون تغيير عبر المقصورات الخلوية ، يتم تعديل مستويات البروتين بشكل كبير بواسطة حالة تعبير Mettl3 (الشكل 2C ، D).

تظهر التجارب في الجسم الحي باستخدام نماذج PD التي يسببها MPTP أن العجز السلوكي يرتبط بالتغيرات الجزيئية في محور Mettl3 / Nrf2. تم الحصول على جميع عينات الأنسجة من المنطقة المخططة (الإحداثيات: +0.5 إلى -0.5 مم من بريجما ، ±1.5 إلى ±2.5 مم جانبي ، -2.5 إلى -3.5 ملم بطني). تظهر الفئران في مجموعة النموذج دقة انخفاض في وضع الطرف الأمامي ، وانخفاض أداء الدوار ، وانخفاض نشاط المجال المفتوح مقارنة بالضوابط الزائفة (الشكل 3 أ). يؤدي ضربة قاضية Nrf2 إلى تفاقم هذا العجز ، بينما يوفر الإفراط في التعبير عن Nrf2 حماية جزئية. يكشف التحليل الكيميائي المناعي عن انخفاض مجموعات الخلايا الدبقية الصغيرة (الخلايا الإيجابية Iba1) في المناطق المخططة لنماذج PD ، مع Nrf2 تعديل يؤثر على بقاء الخلايا الدبقية الصغيرة وفقا لذلك (الشكل 3 ب).

تزداد مستويات السيتوكين المؤيدة للالتهابات (IL-1β ، IL-18 ، TNF-α) بشكل ملحوظ في نماذج المرض كما هو متوقع ، حيث أظهرت مجموعة النموذج مستويات مرتفعة مقارنة بعناصر تحكم Sham ، و Nrf2 يوفر الإفراط في التعبير تأثيرات مضادة للالتهابات (الشكل 3 ج). يوضح التحليل الجزيئي علامات ارتفاع الحمى ، بما في ذلك GSDMD-N و cleftd-caspase-1 و NLRP3 في المعالجة ب MPTP ، مع نتائج اللطخة الغربية المصححة التي تظهر علامات الوزن الجزيئي المناسبة (الشكل 3 د). يؤكد الفحص المجهري الإلكتروني الماسح زيادة تكوين الجسم الحراري في المريضة ، مع Nrf2 التعديل الذي يؤثر على مدى موت الخلايا الحرارية (الشكل 3E).

يكشف تلطيخ DHE جنبا إلى جنب مع التألق المناعي TPH2 عن مستويات مرتفعة من ROS على وجه التحديد في الخلايا العصبية السيروتونين لنماذج PD (الشكل 4 أ). يشير التوطين المشترك لمنتجات أكسدة DHE داخل أجسام الخلايا الإيجابية TPH2 إلى توليد أكسيد فائق داخلي في هذه الخلايا العصبية ، بما يتفق مع الخلل الوظيفي للميتوكوندريا الناجم عن السيتوكينات الالتهابية وضعف الدفاعات المضادة للأكسدة. يتطابق التوزيع المكاني لإشارة DHE مع مورفولوجيا الخلايا العصبية بدلا من أكسدة الأنسجة المنتشرة ، مما يدعم الإجهاد التأكسدي الخاص بنوع الخلية. تظهر الكيمياء المناعية انخفاضا في التعبير عن علامات الخلايا العصبية السيروتونين TPH2 و SLC6A4 في مجموعات النموذج والنموذج + Nrf2-KD ، مع ملاحظة تأثيرات وقائية في مجموعة النموذج + oe-Nrf2 (الشكل 4 ب). تشير هذه النتائج إلى أن داء الحمى الدبقية الصغيرة يؤدي إلى الإجهاد التأكسدي وتلف الخلايا العصبية السيروتونين اللاحق.

يتم تلخيص المسار الميكانيكي العام في الشكل 5 ، والذي يوضح كيف أن تعديل M6A بوساطة Mettl3 ل Nrf2 يثبط داء الخلايا الدبقية الصغيرة ويحمي الخلايا العصبية السيروتونين.

تظهر التجارب الناجحة عادة علاقات واضحة بين الجرعة والاستجابة بين مستويات تعبير Mettl3 / Nrf2 وعلامات الالتهاب النهائية. قد تحدث نتائج دون المستوى الأمثل بسبب التحويل الفيروسي غير المكتمل ، أو عدم كفاية تنشيط LPS ، أو المشكلات الفنية أثناء معالجة الأنسجة. تظهر تجارب التحكم باستمرار خصوصية الجسم المضاد المناسبة وغياب الارتباط غير المحدد في التحليلات الكيميائية المناعية. تم التحقق من كفاءة العدوى الفيروسية في المخطط من خلال التوطين المشترك مع علامات Iba1 و NeuN ، مما يؤكد الاستهداف السائد للدبقية الدقيقة.

الشكل 1: نقص التعبير عن Mettl3 في الخلايا الدبقية الصغيرة التي يسببها LPS. (أ) قياس ELISA لمستويات IL-6 و TNF-α في الخلايا الدبقية الصغيرة المعالجة ب LPS. (ب) قياس RT-qPCR لمستويات Mettl3 mRNA في الخلايا الدبقية الصغيرة المعالجة ب LPS. (ج) قياس اللطخة الغربية لمستويات بروتين Mettl3 في الخلايا الدبقية الصغيرة المعالجة ب LPS تظهر Mettl3 عند 64 كيلو دالتون و GAPDH عند 36 كيلو دالتون. ** تمثل البيانات متوسط ± SEM ، n = 6 لكل مجموعة. * P < 0.05 ، P < 0.01 مقابل المجموعة الضابطة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: يؤثر Mettl3 على ترجمة Nrf2 من خلال تعديل m6A في الخلايا الدبقية الصغيرة التي يسببها LPS. (أ) قياس RT-qPCR لمستويات Nrf2 mRNA في مجموعات oe-NC و oe-Mettl3. (ب) قياس MeRIP-qPCR لمستويات مثيلة Nrf2 في مجموعات oe-NC و oe-Mettl3. (ج) قياس RT-qPCR لمستويات Nrf2 mRNA في النواة والسيتوبلازم للمجموعات التجريبية. (د) قياس اللطخة الغربية لمستويات بروتين Nrf2 في المجموعات التجريبية التي تظهر Nrf2 عند 110 كيلو دالتون و GAPDH عند 36 كيلو دالتون. ** تمثل البيانات متوسط ± SEM ، n = 6 لكل مجموعة. * P < 0.05 ، P < 0.01 مقابل المجموعة الضابطة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: عرض في الجسم الحي لمحور Mettl3 / Nrf2 الذي يؤدي إلى التهاب الخلايا الدبقية الصغيرة من خلال التهاب NLRP3. (أ) التقييمات السلوكية بما في ذلك وضع الأطراف الأمامية ، والروتارود ، واختبارات المجال المفتوح. (ب) الكشف عن الكيمياء المناعية لتعبير بروتين Iba في أنسجة المخ (شريط المقياس = 50 ميكرومتر). (ج) كشف ELISA للسيتوكينات الالتهابية في أنسجة المخ يظهر ارتفاعا متوقعا في مجموعات النماذج مع انخفاض عند الإفراط في التعبير عن Nrf2. (د) الكشف عن اللطخة الغربية لعلامات الكم مع التعليقات التوضيحية للوزن الجزيئي: NLRP3 عند 110 كيلو دالتون ، وكاسباس 1 المشقوق عند 22 كيلو دالتون ، و GSDMD-N عند 31 كيلو دالتون ، و GAPDH عند 36 كيلو دالتون. (ه) الكشف المجهري الإلكتروني عن الأجسام النارية (يشار إليها بأسهم بيضاء تظهر الحويصلات المرتبطة بالغشاء بحجم 1-5 ميكرومتر). القياس الكمي بناء على 5 حقول لكل قسم ، ن = 6 / مجموعة. ** تمثل البيانات متوسط ± SEM ، n = 6 لكل مجموعة. *النقطة < 0.05، نقطة < 0.01 مقابل مجموعة الشام. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: يتسبب داء الخلايا الدبقية الصغيرة في تلف الميتوكوندريا ويعزز موت الخلايا المبرمج للخلايا العصبية 5-HT. (أ) تلطيخ DHE جنبا إلى جنب مع التألق المناعي TPH2 للكشف عن ROS على وجه التحديد في الخلايا العصبية 5-HT (شريط المقياس = 50 ميكرومتر). يتيح نهج التوطين المشترك تمييز الإجهاد التأكسدي داخل أجسام الخلايا العصبية الإيجابية TPH2 من الخلايا الدبقية المحيطة. (ب) الكشف عن الكيمياء المناعية لتعبير بروتين TPH2 و SLC6A4 في الخلايا العصبية 5-HT (شريط المقياس = 50 ميكرومتر). ** تمثل البيانات متوسط ± SEM ، n = 6 لكل مجموعة. *النقطة < 0.05، نقطة < 0.01 مقابل مجموعة الشام. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: تمثيل تخطيطي لقمع تطور مرض باركنسون بوساطة Mettl3 من خلال تعديل m6A ل Nrf2 وتثبيط الموت العصبي 5-HT. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يعلن المؤلفون عن عدم وجود مصالح مالية متنافسة أو تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذا العمل. لا يوجد مؤلف لديه أي علاقة مالية مع الشركات التي تم ذكر منتجاتها في هذه المقالة.