مقالة منهجية

مجموعة متعددة الأعضاء من نماذج الفئران لدراسات الشيخوخة

DOI:

10.3791/69128

⸱

ديسمبر 12, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول طريقة موحدة لجمع الأعضاء في الفئران الصغيرة والشيخخة لتقييم التغيرات التشريحية والنسيجية المرتبطة بالعمر عبر عدة أنسجة، مما يدعم تصميم التجارب الأخلاقي والفعال من حيث التكلفة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الشيخوخة هي عملية بيولوجية نظامية ومتعددة العوامل تؤثر تدريجيا على معظم الأعضاء والأنسجة، مما يؤدي إلى تغييرات بنيوية وخلاوية وجزيئية. يحدد هذا البروتوكول نهجا موحدا وقابلا للتكرار لتقييم التغيرات التشريحية والشكلية المرتبطة بالعمر في الفئران من خلال جمع شامل للأعضاء لإجراء تحليلات نسيجية وجزيئية لاحقة. باستخدام فئران صغيرة (عمرها 2-3 أشهر) وعمرها (20-24 شهرا)، نستعرض إجراءات خطوة بخطوة للتشريح الشامل والحصاد المنهجي للأعضاء الرئيسية للتقسيمات اللاحقة، والصبغ النسيجي، والتقييم المجهري. يتيح البروتوكول جمع مجموعة واسعة من الأعضاء والأنسجة (بما في ذلك الدماغ، العيون، المريء، الغدة الزعترية، القلب، الشريان الأبهر، الرئتين، العقد اللمفاوية، الكبد، البنكرياس، المعدة، الأمعاء الدقيقة، القولون، الطحال، الكلى، المثانة، الجلد، العضلات الهيكلية، العظم، والأنسجة الدهنية) من واحد. من خلال تعظيم إنتاج البيانات لكل شخص، يدعم هذا السير العمل الاستخدام الأخلاقي للحيوانات من خلال التقليل، ويعزز قابلية التكرار عبر الدراسات، ويسهل التحليلات التكاملية لشيخوخة الكائنات الحية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الشيخوخة هي عملية نظامية تؤثر على معظم الأعضاء، ومع ذلك تركز معظم الدراسات التجريبية على نسيج واحد، مما يحد من الرؤية حول كيفية حدوث التغيرات المرتبطة بالعمر أو تفاعلها عبر الجسم. يظهر التقدم في العمر في تغيرات خاصة بالنسيج وتغيرات جهازية، بما في ذلك ضعف المناعة، والتحولات الأيضية، وفقدان القدرة التجديدية، والتنكس البنيوي 1,2. بينما قدمت الدراسات الخاصة بالأعضاء رؤى قيمة، هناك حاجة إلى منظور أوسع لفهم كيف يساهم شيخوخة الخلايا عبر الأنظمة في تدهور الكائن الحي بالكامل. تحليل الأعضاء المتعددة في نماذج ما قبل السريرية في الجسم الحي، مثل الفئران، ضروري لتحديد التغيرات الهيكلية والخلوية والجزيئية المنسقة التي تساهم في الأمراض المرتبطة بالعمر وفقدان المرونة الفسيولوجية 3,4.

يظل فأر المختبر نموذجا أساسيا وراسخا جيدا لأبحاث الشيخوخة بسبب قابليته الوراثية، وقصر عمره، ومسارات الشيخوخة المحفوظة، وقدرته على إعادة تلخيص السمات الرئيسية لشيخوخة الإنسان، بما في ذلك ضعف المناعة، وتليف الأنسجة، وتدهور الأيض، وزيادة الأورام 5,6,7. ومع ذلك، فإن بروتوكولات التشريح المتعدد الأعضاء الفعالة والموحدة ليست مستخدمة على نطاق واسع. هذه البروتوكولات ضرورية لتحسين المقارنات الأنسجة، وتقليل استخدام، ودمج مجموعات بيانات الأوميكس عبر الأنسجة من نفس الموضوع 8,9.

هنا، نقدم بروتوكولا قابلا للتكرار وفعال في الوقت لتروية متعددة الأعضاء والتشريح والحفظ في الفئران. يوفر هذا البروتوكول دليلا خطوة بخطوة لعملية تشريح وجمع الأعضاء الرئيسية من الفئران الصغيرة (2-3 أشهر) والفئران العمرية (20-24 شهرا)، بما في ذلك الدماغ، والعينين، والغترتر، والقلب، والرئتين، والأبهر الأورطي، والعقد اللمفاوية الإربية، والجهاز الهضمي (المريء، المعدة، الأمعاء الدقيقة، القولون)، الكبد، البنكرياس، الطحال، الكلى، المثانة، الأنسجة الدهنية، العضلات الهيكلية، العظم، والجلد. تتضمن تعليمات مفصلة لحفظ الأنسجة متوافقة مع سير العمل النسيجي والجزيئي والتشريح بالتجميد. يتيح هذا النهج الموحد للباحثين تقييم السمات المميزة للشيخوخة في الأعضاء والجهازية ضمن نفس المشاركين التجريبيين، داعما للأبحاث المتكاملة وعالية الجودة حول الشيخوخة 4,10,11,12.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم صيانة فئران C57BL/6J في جامعة كاليفورنيا، سان فرانسيسكو. تمت الموافقة على جميع إجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية (IACUC) وأشرف عليها مركز موارد المختبرية. تم إيواء الفئران ضمن دورة من الضوء إلى الظلام لمدة 12 ساعة، مع أقل من خمسة فئران بالغة في كل قفص. تم تنفيذ القتل الرحيم وفقا لإرشادات الجمعية الأمريكية للطب البيطري (AVMA) لقتل13. لهذا البروتوكول، تم التضحية بالفئران الصغيرة في عمر 3 أشهر، والفئران المسنة عند عمر 22 شهرا. قبل المضي قدما في التشريح وجمع الأعضاء، قم بطباعة وإكمال قائمة التحقق من التحضير (الجدول 1) وقائمة جمع الأنسجة (الجدول 2). المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. خلع عنق الرحم

ملاحظة: يجب أن يقوم فرد مدرب بخلع عنق الرحم لتقليل الضرر المفرط على هياكل عنق الرحم.

  1. قيد الفأر بالإمساك بقاعدة الذيل بيد واحدة بقوة.
  2. ضع الإبهام والسبابة لليد المقابلة عند قاعدة الجمجمة.
  3. اضغط بقوة وسرعة لخلع الفقرات العنقية. قم بتحسس الرقبة لتأكيد الانفصال بين الجمجمة والفقرات المجاورة.
  4. تأكيد نجاح القتل الرحيم (وفقا للبروتوكولات المعتمدة من المؤسسات) من خلال ضمان توقف التنفس وعدم الاستجابة للمحفزات الضارة قبل المتابعة.
  5. سجل وزن جسم الفأر قبل التروية وجمع الأنسجة.

2. استئصال الصدر والتروية

ملاحظة: التروية اختيارية. قم بجميع الإجراءات المتعلقة بالبارافورمالديهايد (PFA) في غطاء بخار كيميائي معتمد مع ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك معطف المختبر، وقفازات النيتريل، ونظارات السلامة. التخلص من محاليل PFA وفقا لإرشادات السلامة الكيميائية المؤسسية. اجمع جميع النفايات التي تنتج عن PFA والمواد الملوثة (مثل القفازات، المناديل، الحاويات) في حاوية نفايات خطرة معلمة بوضوح والتخلص منها من خلال مكتب الصحة والسلامة البيئية في المؤسسة، وفقا للبروتوكولات المتوافقة مع اللوائح المحلية والولائية والفيدرالية.

تحذير: إذا كنت تستخدم بارافورمالديهايد (PFA) للتثبيت، قم بجميع الخطوات تحت غطاء الأبخرة لتجنب التعرض لأبخرة الفورمالديهايد.

  1. ضع غطاء من الفوم مغطى بمادة ماصة لجمع السوائل من التصريف في صينية جمع. ضع الفأر على سطح التشريح هذا في وضعية الاستلقاء على الظهر وثبت الأطراف بدبابيس لتثبيت الجسم: الأطراف الأمامية موضوعة جانبيا لفتح تجويف الصدر، والأطراف الخلفية ممتدة إلى الذيلية لخلق توتر لطيف عبر جدار البطن.
    ملاحظة: هذا الوضع يحسن الرؤية، ويقلل من الانسداد، ويعظم مساحة العمل لجمع الأعضاء.
  2. ضع 70٪ إيثانول على منطقة الصدر.
  3. استخدم مقصا حادا لعمل شق عرضي على مستوى الحجاب الحاجز، يليه جرحين على شكل حرف V يمتدان لكشف القفص الصدري (الشكل 1A).
  4. باستخدام ملقط غير حاد، ارفع الجلد بلطف واقطع أي ملحقات متبقية لكشف المنطقة الصدرية بالكامل.
  5. قم بعمل شقين على شكل حرف V بطول حوالي 2 سم على جانبي القفص الصدري لفتح التجويف الصدري.
  6. اسحب عظمة القص وثبته فوق كتف الفأر بجانب الرأس.
  7. باستخدام ملقط غير مباشر، كشف القلب بعناية. قم بإزالة أي فقاعات هواء محبوسة من خط التروية، ثم أدخل إبرة فراشة أو قنية في طرف البطين الأيسر بعمق يقارب 3-4 مم. قم بعمل شق بطول حوالي 5 مم في الأذين الأيمن للسماح بخروج البرفوسات (الشكل 1B).
  8. ابدأ التروية بمحلول فسيولوجي خال من الكالسيوم والمغنيسيوم (مثل PBS، محلول ملحي، أو HBSS) لتنظيف الجهاز الدوري.
    ملاحظة: يمكن إجراء التفريغ باستخدام حقنة 20 مل أو مضخة أو نظام تغذية بالجاذبية. في المتوسط، يتطلب كل فأر 15-20 مل من محلول التروية لتحقيق تطهير كامل للدم من الأوعية الدموية. يشير التروية الجيدة إلى التصفية السريعة (التشفير) للكبد والرئتين، بالإضافة إلى ظهور منطقة الفم واللسان بمظهر الشاحب. التروية الكاملة ستؤدي إلى تدفق شفاف وخالي من الدم من القلب.
  9. إذا رغبت، ابدأ بتروية PFA عن طريق تحويل خط التروية من محلول فسيولوجي خال من الكالسيوم والمغنيسيوم (المستخدم في الغسل قبل الغسل وإزالة الدم) إلى حقنة 50 مل تحتوي على 4٪ بارافورمالديهايد (PFA)، مع إبقاء الإبرة في مكانها. احرص على تجنب إدخال فقاعات هواء في الخيط. استمر في التغذية مع 4٪ من PFA حتى يتم تحديد درجة التثبيت المطلوبة بناء على التصلب التدريجي للجسم. حوالي 30 مل من المثبت تكفي لفأرة واحدة.

3. جمع الأعضاء والأنسجة

ملاحظة: تسلسل جمع الأعضاء أمر حاسم عند مقارنة الفئران الصغيرة والمتقدمة في السن. تميل الأعضاء في المسنة إلى أن تكون هشة وعرضة للتحلل الذاتي أو التلف الميكانيكي، مما يجعل التعامل السريع والمتسق مع الأنسجة أمرا ضروريا. توحيد ترتيب الجمع يقلل من تباين ما بعد الوفاة، ويقلل من القطع الأثرية في التعامل معها، ويضمن جودة تثبيت موحدة عبر14،15. الاتساق ضروري لاكتشاف التغيرات الشكلية الطفيفة المرتبطة بالعمر، حيث يمكن أن يؤدي التأخير أو عدم الاتساق إلى حدوث انحياز. إذا لم يتم إجراء تروية PFA، يجب جمع الأعضاء بسرعة. البنكرياس والمعدة والرئتان والدماغ معرضة بشكل خاص للتحلل الذاتي السريع والتدهور النسيجي إذا لم تعالج فورا. نظرا لأن الفئران المسنة غالبا ما تتطور لآفات ورمية، افحص الطحال، الكبد، العقد اللمفاوية، الرئتين، والغدة الزعترية بعناية بحثا عن عدم تماثل أو تضخم أو عقيدات أو تغير لون. سجل هذه النتائج كجزء من العبء العام للمرض (انظر الجدول 2).

  1. ابدأ بالحيوان في وضعية الاستلقاء على الظهر بعد التروية أو خلع عنق الرحم لجمع الأعضاء الرئيسية في تجاويف الصدر والبطن (الشكل 1C).
  2. ضع 70٪ إيثانول بلطف باستخدام الشاش أو زجاجة رش بعد التثبيت، مما يقلل من تلوث الفراء ويحافظ على ترطيب الأنسجة في المناطق الحساسة. أثبتت هذه الطريقة فعاليتها في أيدينا في تقليل بقايا الفراء وتحسين الرؤية أثناء التشريح مع تجنب سلبيات الغمر الكامل.
  3. باستخدام المقص والملاقط ذات الطرف العريض، افتح تجويف البطن بحذر عن طريق عمل شق منتصف الخط من الحجاب الحاجز إلى الحوض، يليه شقان جانبيان كما هو موضح في الخطوط الحمراء في الشكل 1A. اسحب الجلد وجدار البطن لكشف الأعضاء الداخلية بالكامل.
  4. المعدة والأمعاء الدقيقة والقولون: افصل المعدة عند نقطة التقاء المريء مع ترك الطرف الببوبي متصلا مع الأمعاء الدقيقة. حرر الجهاز الهضمي بلطف عن طريق قطع الأربطة الداعمة، ثم قم بإزالة المجرى بما في ذلك الأمعاء الدقيقة والقولون. اقطع باتجاه البعد عند المستقيم.
    1. لإزالة محتويات اللومين، اقطع الأمعاء الدقيقة بالقرب من نقطة انثناء الاثنين والصلب وعلى البعد عند نقطة الالتقاء اللفائفي. بالنسبة للقولون، اقطع بالقرب من السيكوم. غسل الأمعاء الدقيقة والقولون بحوالي 20 مل من المحلول الفسيولوجي باستخدام حقنة مزودة بإبرة تغذية، مع تثبيت الأنسجة بلطف بملقط رفيع لتجنب التلف.
  5. المريء: عزل المريء من العنق إلى الوصلة المعدية.
  6. الطحال والبنكرياس: عزل الطحال والبنكرياس عن الأنسجة المحيطة باستخدام تشريح دقيق، لتقليل الضرر الميكانيكي. افصل البنكرياس بحذر عن الطحال. قم بتشريح وقص البنكرياس فورا إلى قطع صغيرة (≤5 مم) وغمرها في مادة تثبيت خلال 5 دقائق من القتل الرحيم لتقليل التحلل الذاتي والحفاظ على شكل الأنسجة المثالي. افحص الطحال، ولاحظ الحجم واللون والشكل ووجود أي شذوذات ظاهرة.
  7. الكبد: باستخدام ملقط الطرف الدقيق، أمسك النسيج الضام المركزي بين فصوص الكبد واسحب بلطف للأعلى لخلق التوتر. باستخدام مقص التشريح، اقطع بعناية جميع الوصلات بين الكبد والأعضاء المجاورة. افحص الكبد بحثا عن اللون والتقوام ووجود عقيدات أو شذوذات أخرى.
  8. الدهون الحشوية: اجمع عينات من مستودعات الدهون الحشوية.
    ملاحظة: الصغيرة عادة ما تحتوي على دهون حشوية قليلة، بينما المسنة غالبا ما تظهر تراكم الدهون بشكل متزايد، خاصة حول الأمعاء والكلى ومناطق الغدد التناسلية.
  9. الكلى والمثانة: استئصال كلتا الكليتين مع الحالبين والمثانة الملتصقة. افصل الكليتين بعناية عن الأنسجة الدهنية المحيطة والهياكل الضامة باستخدام مقص دقيق أو ملقط غير مباشر. اتبع الحالب بعيدا إلى المثانة، واقطع أي وصلات متبقية لعزل المسالك البولية بالكامل. افحص الكلى والمثانة بحثا عن الحجم واللون والشذوذات قبل المعالجة الإضافية.
  10. العقد اللمفاوية: اسحب الجلد من الصفاق لكشف المنطقة الإربية. حدد العقد اللمفاوية داخل وسادة الدهون الثديية على طول الأوعية اللمفاوية. عزل وإزالة العقد باستخدام ملقط رفيع الأطراف، مما يقلل من اضطراب الدهون المحيطة والأنسجة الضامة.
  11. القلب: قم بإزالة القلب بحذر عن طريق قطع الأوعية الرئيسية.
  12. الزعتر: قم بإزالة الزعتر بعناية للحفاظ على تركيبه. كن على علم أن الغدة الزعترية تمر بالانفجار مع التقدم في العمر، وفي الفئران المسنة، قد يكون هناك نسيج غدة زدة قليل أو معدوم.
  13. الرئتان: باستخدام مقص حاد وملقط رفيع، قم بإزالة الرئتين مع القصبة الهوائية المرفقة بحذر في قطعة واحدة.
  14. الشريان الأبهر: أدخل ملقط مغلق بين الشريان الأبهر والعمود الفقري وأزيح الشريان الأبهر برفق، مفصلا إياه على الجانب الظهري. احرص على تجنب تمزيق الوعاء. باستخدام ملقط الطرف الرفيع، قم بإزالة الأنسجة الدهنية والضامة المحيطة من الشريان الأبهر بحذر تحت مجهر التشريح.
  15. العضلة الهيكلية: استئصال الجلد فوق الأطراف الخلفية لكشف عظم الفخذ والعضلات المحيطة. باستخدام مقص دقيق، عزل العضلات المتصلة بعظم الفخذ بعناية عن طريق فصلها عن الأنسجة الضامة المحيطة وقطع عند إدخال الأوتار للحفاظ على سلامة الألياف.
  16. العظم (الظنبوب): باستخدام مقص التشريح، قم بإزالة الجلد والعضلة المغطاة لكشف عظم الساق. باستخدام مقص التشريح والملقط القوي، افصل الساق بعناية عند مفاصل الركبة والكاحل. قم بإزالة أي نسيج رخو متبق دون إتلاف العظم.
  17. العيون: باستخدام مقص تشريح كبير، اقطع رأس الفأر. قم بإزالة العينين بعناية باستخدام ملقط رفيع الأطراف.
  18. الدماغ: استئصال فروة الرأس لكشف الجمجمة الأمامية. باستخدام مقص حاد أو مشرطا، اتبع الغرز القحفية وارفع أجزاء العظم لكشف الدماغ (الشكل 1D). اقطع المصابيح الشمية والوصلات البطنية. استخرج الدماغ بلطف من تجويف الجمجمة. يعالج النسيج فورا للحفاظ على الشكل.
  19. الجلد: إذا كان إزالة الشعر مطلوبا للتطبيقات اللاحقة، قم بإزالة الشعر باستخدام آلة قص كهربائية. قرص جزء من الجلد الخلفي بملقط غير حاد، ثم اقتلع بالمقص، واجمع الأنسجة لمزيد من المعالجة.
  20. بعد إزالة جميع الأعضاء المعنية، ضع جثة الفأر بالكامل في حاوية بسعة 450 مل مملوءة مسبقا ب 4٪ من PFA لأرشفة النتائج غير المتوقعة أو للإجابة على أسئلة المراجعين التي قد تتطلب العودة إلى الأنسجة المثبتة في الرطوبة فقط.

4. حفظ الأنسجة ومعالجتها

ملاحظة: للحفاظ على سلامة الأنسجة، قلل الوقت بين التشريح والحفظ. يمكن أن تؤثر التأخيرات على شكل الأنسجة وجودة الجزيئات؛ تظهر تفاصيل إضافية حول التوقيت الحرج لجمع الأنسجة وحفظها في الجدول 2.

تحذير: إذا كنت تستخدم بارافورمالديهايد (PFA) للتثبيت، قم بجميع الخطوات داخل غطاء الأبخرة لتجنب التعرض لأبخرة الفورمالديهايد.

  1. يعالج الأنسجة مباشرة بعد التشريح، مع اختيار البروتوكول المناسب (الخطوة 4.1، 4.2، أو 4.3) وفقا للتطبيق المقصود في مرحلة الانتقال.
    1. تثبيت بارافورمالديهايد (PFA): وضع الأنسجة المخصصة للتحليل النسيجي في 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية لمدة 12-24 ساعة. بعد التثبيت، غسل الأنسجة جيدا باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لإزالة المثبت المتبقي، ثم انقلها إلى 70٪ إيثانول للتخزين حتى يتم ترسيخ البارافين وتقسيمه.
  2. تضمين مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT): تضمين الأنسجة الطازجة في مركب OCT. ضع الأنسجة في قوالب مملوءة بمركب OCT، لإزالة فقاعات الهواء، ثم حضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم تجميد النيتروجين السائل في طور بخار النيتروجين. قم بإحكام بورق الألمنيوم وتخزين كتل OCT عند −80 درجة مئوية حتى يتم تقسيمها.
  3. التجميد السريع في طور بخار النيتروجين السائل: أنسجة تجميد مفاجئ مخصصة لتحليل الحمض النووي الريبي أو البروتين أو المستقلبات في طور البخار للنيتروجين السائل لتقليل تكوين بلورات الجليد. ضع الأنسجة في أنابيب تجميد معنونة وعلقها فوق النيتروجين السائل للتجميد السريع. بمجرد تجميد الكامل، انقل العينات إلى تخزين بدرجة حرارة −80 درجة مئوية.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أثناء التشريح، تظهر الفئران المسنة غالبا آفات ورمية وتتطلب فحصا دقيقا لتوثيق النتائج المرضية 13,14,16,17,18. يظهر الشكل 2A فأرا ذكرا يبلغ من العمر 22 شهرا من نوع C57BL/6 في وضعية الاستلقاء على الظهر بعد التروية. يؤكد التصويب الكامل للرئتين فعالية التروية، بينما يظهر في الكبد تبييضا جزئيا فقط. كشف الفحص الدقيق للكبد عن عدة عقيدات خبيثة (الشكل 2B)، مصحوبة بحويصلات منوية متضخمة (الشكل 2A) وتضخم الطحال (الشكل 2C). هذه النتائج شائعة في الفئران المسنة ويجب توثيقها كجزء من العبء الكلي للمرض18.

يصور الشكل 3 أعضاء طبيعية بشكل كبير تم جمعها بعد التشريح والتروية، مما يسمح بتقييم السلامة التشريحية وكفاءة التروية. تم غسل الجهاز الهضمي بمحلول فسيولوجي لإزالة المحتويات المهضومة، مما أدى إلى مظهر نظيف وشفاف للمعدة والقولون والأمعاء الدقيقة (الشكل 3A). كانت الهياكل الإضافية، بما في ذلك المريء، والبنكرياس، والطحال، ومخازن الدهون الحشوية، والكلى التي تحتوي على المثانة، والعقد اللمفاوية، والقلب، والغدة الزعترية، واضحة التعرف عليها ويمكن عزلها سليمة للتحليلات اللاحقة (الشكل 3B، C، E-I).

تم تقييم جودة التروية من خلال فحص السلق في الأنسجة ذات الوعاءات الدموية المرتفعة. كما هو موضح في الشكل 3D و3J، أظهر الكبد والرئتان فروقا واضحة بين الحالات غير المثقبة، والمختربة جيدا، والحالات التي تحتوي على فيود جزئي. أكد التصويب الكامل نجاح التروية، بينما أشار الترويش غير الكامل إلى تغير تقني أو تشوهات كامنة. تم عزل أنسجة أخرى، بما في ذلك الشريان الأبهري، وعضلة الهيكل، وعظم الظنبوب، والدماغ، والعين، والجلد، مع الحفاظ على شكلها، وهو مناسب لمزيد من التطبيقات النسيجية أو الجزيئية أو التصويرية (الشكل 3K-P). يوفر هذا الإجراء الموحد للتشريح استعادات منتظمة للأنسجة والأعضاء السليمة والمحفوظة جيدا، ويتيح التقييم التشريحي العام لدعم مجموعة متنوعة من التحليلات اللاحقة. استغرق التشريح وجمع الأعضاء حوالي 40-60 دقيقة لكل، حسب خبرة المشغل ووجود النتائج المرضية.

يوضح الشكل 4 التغيرات النموذجية المرتبطة بالشيخوخة في الأعضاء المجمعة بعد دمج البارافين، والتقسيم، وتلوين الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E). في مقاطع الجلد من الفئران المسنة، لوحظ ترقق الظهارة وفقدان بصيلات الشعر مقارنة بمجموعة مراقبة صغار (الشكل 4A). كشفت مقاطع الكلى عن تضخم كبسولات بومان مع تغيرات ليفية ونخرية، بالإضافة إلى مناطق متوافقة مع اللمفومات (الشكل 4B). في أقسام البنكرياس، لوحظ زيادة في الأجسام الموتمة19 والمناطق اللمفاوية في المسنة، مما يشير إلى تدهور سلامة الأنسجة مع التقدم في العمر (الشكل 4C). أظهرت مقاطع الطحال ترسبات الأميلويد ومناطق اللمفوما في المسنة، مما يعكس علامات إضافية لعلم الأمراض المرتبطة بالعمر (الشكل 4D).

تسلط هذه النتائج الضوء على الخصائص النسيجية المرضية الممثلة للشيخوخة عبر عدة أنسجة، مما يثبت فائدة هذا البروتوكول في اكتشاف العلامات الهيكلية للتدهور المرتبط بالعمر.

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على تشريح الفأر وإجراءات تعرض الأعضاء. (أ) مواقع الشقوق لفتح تجاويف الصدر والبطن (خطوط حمراء)، بما في ذلك شق عرضي على مستوى الحجاب الحاجز، يليه شق على شكل حرف V على جانبي القفص الصدري لفتح التجويف الصدري، وشق منتصف الشكل من الحجاب الحاجز إلى الحوض مع جروح ثنائية الجانب لكشف تجويف البطن بالكامل. (ب) إعداد التروية الذي يظهر إدخال إبرة فراشة في البطين الأيسر وشق الأذين الأيمن لتمكين تصريف الدم بشكل فعال. (ج) التخطيط التشريحي للأعضاء الصدرية والبطنية الرئيسية بعد التعرض للتجويف. (د) خطوات تشريح الرأس، بما في ذلك إزالة فروة الرأس وفتح الجمجمة على طول الغرز القحفية لتعريض الدماغ. تشير الخطوط الحمراء إلى مواقع الشق. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: تحديد آفات الأورام في الفئران المسنة. (أ) فأر ذكر ممثل عمره 22 شهرا من نوع C57BL/6 في وضعية الاستلقاء بعد التروية مع 4٪ من PFA. التصويب الكامل للرئتين (رأس سهم وردي) يؤكد فعالية التروية، بينما يظهر الكبد (رأس السهم الأخضر) تبييضا جزئيا فقط. رؤوس الأسهم الزرقاء تدل على تضخم الحويصلات المنية. (ب) منظر تفصيلي للكبد يكشف عن عدة عقيدات خبيثة (رؤوس سهام سوداء). (ج) طحال مضخم من فأر مسن C57BL/6 (الجانب الأيمن) مقارنة بالطحال الطبيعي من صغير (الجانب الأيسر). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: نظرة عامة على الأعضاء الرئيسية للفئران وسلامة الأنسجة بعد التشريح والتروية. (أ) المعدة والأمعاء الدقيقة والقولون قبل وبعد الغسل بالمحلول الفسيولوجي لإزالة المحتويات المهضومة. (ب) المريء. (ج) البنكرياس مع الطحال الملتصق. (د) الكبد بدون تروية، مع تقشر كامل بعد التروية الفعالة، ومع تقشر جزئي يشير إلى عدم اكتمال التروية أو مرض كامن. (ه) نسيج دهني حشوي. (أنثى) الكلى مع مثانة متصلقة. (G) العقد اللمفاوية الأرجيية. (ح) القلب. (I) الزعتر. (ج) الرئتان بدون تروية، مع تقشر كامل بعد التروية الفعالة، ومع تقشر جزئي. (ك) الشريان الأبهر. (L) العضلة العظمية معزولة عن الطرف الخلفي. (M) عظم الساق مع بنية عظمية محفوظة. (ن) الدماغ. (O) العين. (P) الجلد. أشرطة المقياس: 5 مم في A، C، D، E، F، J، L، N، P؛ 1 مم في جميع اللوحات الأخرى. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: تحليل نسيجي للأعضاء الرئيسية باستخدام تلوين الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E). (أ) مقاطع الجلد من فئران عمرها 3 أشهر (صغيرة) و22 شهرا (مسنة). تظهر المقاطع من المسنة ترققا في الظهارة وفقدان بصيلات الشعر. (ب) أقسام الكلى التي تبرز كبسولات بومان. تظهر مقاطع المسنة تضخما في الكبسولات، وتغيرات ليفية ونخرية، وأورام لمفاوية (رؤوس سهام برتقالية). (ج) أقسام البنكرياس من الصغيرة والمسنة، مع المسنة التي تظهر أجسامها الموتمة (رؤوس سهام زرقاء) ومناطق لمفوما (رؤوس سهام برتقالية). (د) أقسام الطحال من فئران صغيرة تبلغ من العمر 3 أشهر (صغيرة) و22 شهرا (مسنة). تظهر مقاطع من المتقدمة رواسب الأميلويد (رؤوس سهام خضراء ليمونية) ومناطق من اللوم اللمفاوي. شريط المقياس (A-C) 100 ميكرومتر. شريط المقياس (D) 500 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: قائمة التحضير للتحضير. قائمة خطوة بخطوة بالتحضيرات الأساسية لتشريح أنسجة الفئران وحفظها، بما في ذلك وضع علامات الأنابيب والعفن، تحضير المخزن والثبيت، إعداد التضمين بالتجميد، تعقيم أدوات التشريح، ترتيب محطات العمل، وتخطيط التوثيق. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: قائمة فحص جمع الأنسجة. استخدم الجدول لتسجيل المناديل المجمعة. أضف وقت الجمع وملاحظات عن الحالة أو الشذوذات. أعط الأولوية للأنسجة الحيوية لدراستك؛ اجمع الأعضاء الأكثر أهمية ضمن الفترة الزمنية الموصى بها لتجنب تحلل أو تحلل الأنسجة.*لاحظ أي تشوهات (بما في ذلك تغير لون الأعضاء، العقيدات، النمو الخبيث، حجم الأعضاء غير الطبيعي). **فكر في توثيق طريقة الحفظ (بما في ذلك تثبيت PFA، تضمين OCT، أو التجميد المفاجئ). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول استراتيجية قابلة للتكرار لجمع أنظمة الأعضاء المتعددة بشكل منهجي في الفئران الصغيرة والمسنة، مما يمكن من إجراء تحليلات تشريحية ونسيجية وجزيئية. قد تؤثر عدة اعتبارات تقنية على جودة النتائج ومعالجة حدود الطريقة الموصوفة. أولا، التفاوت في جودة التروية عامل مهم يجب أخذه في الاعتبار. قد يترك التروية غير الكاملة بقايا دم تؤثر سلبا على علم الأنسجة، والكيمياء المناعية، والتحليلات الجزيئية. يمكن أن يسبب التروية بعد خلع عنق الرحم صدمة للأنسجة العنقية ويؤدي إلى تلوث دم الرئتين. لذا يجب أن يتم خلع عنق الرحم فقط بواسطة أفراد مدربين. للحصول على أفضل النتائج، يجب إجراء التروية تحت تخدير نهائي كما هو موضح في مكان آخر 20,21 وفقا لإرشادات IACUC وAVMA13. ثانيا، التثبيت هو عامل حاسم محدد لسلامة الأنسجة. على الرغم من أن 4٪ بارافورمالديهيد (PFA) يستخدم على نطاق واسع، إلا أنه قد يخترق الأعضاء الكبيرة أو الكثيفة بشكل غير كاف، مما يؤدي إلى ضعف في علم النسيجة وحفظ المستضدات. يمكن التخفيف من هذا القيد باستخدام الفورمالين المحايد 10٪ (NBF) أو تقطيع الأنسجة إلى مقاطع ≤5 مملتحسين الاختراق. ثالثا، تخضع بعض الأنسجة، خصوصا البنكرياس والمعدة والدماغ، لعملية تحلل ذاتي سريع، مما يتطلب التثبيت أو التجميد خلال 5-10 دقائق من القتل الرحيم واستخدام أدوات التشريح المبردةمسبقا. في الفئران المسنة، قد يؤدي الورم إلى تشويه التشريح أكثر وتعقيد التشريح. قد تنشأ تشوهات إضافية من حجم تثبيت غير كاف أو تجمد، مما يؤدي إلى انكماش وتأثيرات الحواف؛ يمكن تقليل هذه المشاكل بالحفاظ على نسبة التثبيت إلى الأنسجة لا تقل عن 10:1، وتجنب الازدحام، وتبريد قوالب OCT مسبقا قبل التثبيت. وأخيرا، يثير استخدام PFA والفورمالين مخاوف تتعلق بالسلامة والتخلص منه؛ المثبتات القائمة على الجليوكسال تقدم بدائل أقل سمية. لذلك، فإن التعامل الموحد، والتثبيت المحسن، والتوقيت الدقيق ضرورية لتعظيم قابلية التكرار، وجودة الأنسجة، وموثوقية التحليلات اللاحقة24.

من خلال جمع الأنسجة من أكثر من 15 عضوا في نفس، يعظم هذا السير الإنتاج البيولوجي لكل شخص ويتماشى مع المتطلبات الأخلاقية لتقليل استخدام. يمكن بسهولة توسيع الإجراء المنهجي إلى دراسات متوسطة الإنتاجية التي تفحص التدهور الفسيولوجي المرتبط بالعمر والأمراض الخاصة بالأعضاء25.

المعالجة السريعة للأنسجة المعرضة للتحلل الذاتي ضرورية للحفاظ على السلامة النسيجة. استخدام المحاليل الفسيولوجية الخالية من الكالسيوم والمغنيسيوم، تليها 4٪ من PFA، يحافظ بشكل موثوق على بنية الأعضاء ويقلل من التحلل الذاتي في الأنسجة الحساسة مثل البنكرياس والجهاز الهضمي. على عكس البروتوكولات التي تركز على الأعضاء الفردية أو نماذج الأمراض، يتيح هذا النهج جمعا سريعا ومتسقا لعدة أعضاء، مما يقلل من التباين ويحسن معدل الإنتاجية. يمكن إكمال التشريح بالكامل، من التروية إلى الاستئصال النهائي للأنسجة، خلال 60 دقيقة لكل، مما يجعله مناسبا للدراسات واسعة النطاق أو الحساسة للوقت 3,11,26. الالتزام بتسلسل تثبيت دقيق بالتروية يقلل من التشوهات ويتيح نتائج قابلة للتكرار.

الاتساق في جمع الأنسجة، وتقليمها، وتركيبها أمر ضروري لتقييم نسيجي مرضي دقيق، خاصة في الدراسات الطولية أو متعددة المراكز. يمكن أن يؤدي التفاوت في كيفية التعامل مع الأنسجة إلى ظهور عيوب أثرية، أو اكتشافات مرضية غامضة، أو إلى سوء تفسير عبء الأمراض. توفر الأدلة المعدلة لأخذ عينات الأعضاء وتقليمها في الفئران والفئران، مثل أدلة التريم RENI، بروتوكولات مفصلة وموحدة لتقليل مثل هذه التناقضات22. إن اعتماد هذه الطرق المتناسقة يحسن قابلية مقارنة البيانات عبر الدراسات والمؤسسات، ويعزز قابلية التكرار، ويعزز نزاهة النتائج القائمة على علم الأمراض في أبحاث الشيخوخة 4,9.

جمع العديد من الأعضاء مهم بشكل خاص في أبحاث الشيخوخة، حيث يعد فهم كيفية تفاعل أنظمة الأعضاء أمرا ضروريا لكشف العمليات التي تدفع تدهور الجسم الفسيولوجي بالكامل مع التقدم في العمر. بينما يمكن أن يكون هذا النهج مفيدا أيضا لمجموعة متنوعة من الأسئلة البحثية الأخرى، يركز هذا البروتوكول على دعم دراسات الشيخوختة حيث قد تؤثر التغيرات المرتبطة بالعمر على عدة أعضاء في نفس الوقت. ومع ذلك، يمكن تطبيقه أيضا على الدراسات التي تركز على التليف، والتجدد، والشيخوخة، خاصة تلك التي تدمج علم النسخ أو اكتشاف العلامات الحيوية متعددة الأنسجة 9,27,28.

كشفت التقييمات الأنسجة عن تغيرات مميزة مرتبطة بالعمر عبر عدة أنسجة (الشكل 4). في الجلد، أظهرت المسنة ترقق ظهاري وفقدان بصيلات الشعر. في الكلى، أظهرت مقاطع من فئران مسنة تضخم كبسولة بومان إلى جانب تغيرات ليفية، نخرية، ولمفاوية. أظهرت أنسجة البنكرياس من المسنة تراكما لأجسام استماتة ولمفاوما، بينما كشفت مقاطع الطحال عن ترسبات الأميلويد ومناطق إضافية من اللمفاوما. تتوافق هذه الملاحظات مع الأنماط الظاهرية المعروفة لشيخوخة الفأر وتظهر فائدة هذا البروتوكول في اكتشاف العلامات النسيجية المرضية الممثلة لعمرالفئران 1,18,19,27,29,30,31,32,33,34.

باختصار، يقدم هذا البروتوكول إطارا موثوقا وقابلا للتوسع لجمع وحفظ الأنسجة في نماذج الشيخوخة قبل السريرية. يمكن اعتماده في الدراسات الاستكشافية والمدفوعة بالفرضيات لكشف آليات خاصة بالنسيج والنظامية للشيخوخة والتنكس والمرونة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل منحة مؤسسة لاري إل. هيلبلوم للناشئة، ومنحة AFAR ومؤسسة غلين للأبحاث الطبية لأعضاء هيئة التدريس المبتدئين، وجائزة إدوارد مالينكروت جونيور للباحث المبتدئ، وجائزة برنامج الأبحاث الطبية الحيوية المبتكرة (PBBR) للأبحاث الجديدة لهانا مارتنز. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
وسادة الامتصاص
عمري C57BL/6J فئران  مختبر جاكسون  #000664
صواني الجمع وnbsp;
ماكينة التشذيب اللاسلكيBravMini+ CLP-41590لإزالة الشعر
رذاذ الإيثانول 70٪فيشر ساينتيفك50-163-3592
ملقط إضافي 5 INOXدومونF6521-1EAملقط الطرف الرفيع جدا للعقد اللمفاوية
الملقطميليبورسيغماXX6200006Pملقط الطرف العريض
الملقط 5 INOXدومونF6521-1EAملقط الطرف الدقيق
محلول الملح المتوازن هانك (HBSS) 1×500 ملجيبكو14025092
مقص دقيق التشريح (مستقيم، حاد/حاد، 25 مم)روبوز سريجيكالRS-5668مقص دقيق قياسي، من الفولاذ المقاوم للصدأ، شفرة 25 مم (M-37)
مقص دقيق التشريح (مستقيم، حاد/حاد، شفرات دقيقة)روبوز سريجيكالRS-5918مقص دقيق للتشريح، بطول 4.5" (H-327)
NBFسيغما & nbsp;HT501128للتثبيت
محلول ملحي عاديسيتيفا76081-514
درجة حرارة القطع المثلى (OCT)فيشر ساينتيفك23730571
بارافورمالديهايد (PFA) 4٪علوم المجهر الإلكتروني15710للتثبيت
أطباق بيتري 100 مل × 15 ملميليبورسيغماP5856-500EA
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)جيبكو10010023
الدبابيسمختبرات إيسكوDISPINS1لتأمين الفأرة أثناء التشريح
حقنة بلاستيكية بطول 20 مل، قفل لويرفيشر براند302830للتروية
صندوق سيل إن فريز (حاوية تجميد)شركة تيد بيلا، إنك.20956
سيل إن فريز كريوترايشركة تيد بيلا، إنك.20956-1لوضع العينات في حاوية التجمد
إبرة فراشة سول-فيت مع محولسول-ميلينيوم ميديكال110301070003للتروية
غطاء من الفوم
نسيج تيك سيرومولد (خزعة)ساكورا25608-922
فئران صغيرة C57BL/6Jمختبر جاكسون  #000664

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lopez-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. Hallmarks of aging: An expanding universe. Cell. 186 (2), 243-278 (2023).
  2. Schafer, M. J., et al. The senescence-associated secretome as an indicator of age and medical risk. JCI Insight. 5 (12), e133668(2020).
  3. Sladitschek-Martens, H. L., et al. Yap/taz activity in stromal cells prevents aging by controlling cGAS-STING. Nature. 607 (7920), 790-798 (2022).
  4. Tabula Muris, C. A single-cell transcriptomic atlas characterizes aging tissues in the mouse. Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).
  5. Farooqi, I. S., Xu, Y. Translational potential of mouse models of human metabolic disease. Cell. 187 (16), 4129-4143 (2024).
  6. Marttala, J., Andrews, J. P., Rosenbloom, J., Uitto, J. Keloids: Animal models and pathologic equivalents to study tissue fibrosis. Matrix Biol. 51, 47-54 (2016).
  7. Yuan, R., Peters, L. L., Paigen, B. Mice as a mammalian model for research on the genetics of aging. ILAR J. 52 (1), 4-15 (2011).
  8. Wang, Q., et al. The mouse multi-organ proteome from infancy to adulthood. Nat Commun. 15 (1), 5752(2024).
  9. Zhuang, J., et al. Comparison of multi-tissue aging between human and mouse. Sci Rep. 9 (1), 6220(2019).
  10. Basisty, N., et al. A proteomic atlas of senescence-associated secretomes for aging biomarker development. PLoS Biol. 18 (1), e3000599(2020).
  11. Wu, C., et al. Spatially resolved transcriptome of the aging mouse brain. Aging Cell. 23 (5), e14109(2024).
  12. Yousefzadeh, M. J., et al. Tissue specificity of senescent cell accumulation during physiologic and accelerated aging of mice. Aging Cell. 19 (3), e13094(2020).
  13. Treuting, P. M., Snyder, J. M. Mouse necropsy. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (3), 223-233 (2015).
  14. Antal, C., et al. Tissue collection for systematic phenotyping in the mouse. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 29 (Unit 29A), 24(2007).
  15. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Mouse tissue fixation. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), pdb.prot073403(2014).
  16. Brayton, C., Justice, M., Montgomery, C. A. Evaluating mutant mice: Anatomic pathology. Vet Pathol. 38 (1), 1-19 (2001).
  17. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Limited mouse necropsy. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), pdb.prot073395(2014).
  18. Pettan-Brewer, C., Treuting, P. M. Practical pathology of aging mice. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 1, (2011).
  19. Xiong, Y., et al. Arginase-II promotes tumor necrosis factor-alpha release from pancreatic acinar cells causing beta-cell apoptosis in aging. Diabetes. 66 (6), 1636-1649 (2017).
  20. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65, e3564(2012).
  21. Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR J. 62 (1-2), 238-273 (2021).
  22. Morawietz, G., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 3. A joint publication of the Rita and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55 (6), 433-449 (2004).
  23. Zhao, H., et al. Identifying specific functional roles for senescence across cell types. Cell. 187 (25), 7314-7334 (2024).
  24. Aversa, Z., et al. Biomarkers of cellular senescence in idiopathic pulmonary fibrosis. Respir Res. 24 (1), 101(2023).
  25. Aghali, A., Koloko Ngassie, M. L., Pabelick, C. M., Prakash, Y. S. Cellular senescence in aging lungs and diseases. Cells. 11 (11), 1781(2022).
  26. Travaglini, K. J., et al. A molecular cell atlas of the human lung from single-cell RNA sequencing. Nature. 587 (7835), 619-625 (2020).
  27. Chen, S., et al. Integration of spatial and single-cell data across modalities with weakly linked features. Nat Biotechnol. 42 (7), 1096-1106 (2024).
  28. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).
  29. Hoj, K., et al. Age-related decline in pancreas regeneration is associated with an increased proinflammatory response to injury. Gastro Hep Adv. 3 (7), 973-985 (2024).
  30. Roeder, S. S., et al. Changes in glomerular parietal epithelial cells in mouse kidneys with advanced age. Am J Physiol Renal Physiol. 309 (2), F164-F178 (2015).
  31. Russell-Goldman, E., Murphy, G. F. The pathobiology of skin aging: New insights into an old dilemma. Am J Pathol. 190 (7), 1356-1369 (2020).
  32. Sparks, J., et al. Presence of systemic amyloidosis in mice with partial deficiency in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) in aging. App Sci. 11 (16), 7373(2021).
  33. Sun, P., Juskevicius, R. Histological and immunohistochemical features of the spleen in persistent polyclonal B-cell lymphocytosis closely mimic splenic B-cell lymphoma. Diagn Pathol. 7, 107(2012).
  34. Vannan, A., et al. Spatial transcriptomics identifies molecular niche dysregulation associated with distal lung remodeling in pulmonary fibrosis. Nat Genet. 57 (3), 647-658 (2025).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة