مقالة منهجية

التحليل الأمثل للبروتينات من بويضات Xenopus والأجنة عن طريق التنشيف المناعي

DOI:

10.3791/69139

⸱

سبتمبر 19, 2025

 , 
1Department of Biomolecular Chemistry, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه المقالة بروتوكولا لتحليل البروتينات من بويضات Xenopus والأجنة عن طريق السحب المناعي. يتم وصف خطوات التجميع ، متبوعة بخطوات تتوافق مع معالجة العينات ، و SDS-PAGE ، والنقل ، وتلوين الأجسام المضادة ، والتصوير. يؤكد البروتوكول على دراسة مجمعات البروتين التنظيمية الانتقالية مع الأجسام المضادة الداخلية والأجسام المضادة ضد علامات تقارب البروتين.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد تحليل البروتينات بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS-PAGE) متبوعا بالنشاف المناعي (النشاف الغربي) جزءا حيويا من مجموعة أدوات عالم الأحياء الجزيئية. تفصل هذه التقنية خليط البروتين المعقد بالوزن الجزيئي ثم تفحص وجود البروتينات المستهدفة باستخدام أجسام مضادة محددة. يحتوي النشاف المناعي على مجموعة متنوعة من التطبيقات. تشمل الأمثلة الاستخدام كنهج مستهدف لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين أو كعنصر تحكم لتأكيد التعبير عن أهداف البروتين أو استنفاده. ومع ذلك ، فإن التنفيذ الناجح للتنشيف المناعي يتطلب تجارب معقدة ومتعددة الخطوات. يجب تحسين البروتوكولات لكل كائن حي وبروتين مستهدف وتطبيق. لذلك ، توجد فجوات معرفية لاستخدام اللطخات المناعية في العديد من النماذج ، بما في ذلك الضفدع النموذجي Xenopus laevis.

نظرا لحجمها الكبير ، والمواد الوفيرة للتجارب الكيميائية الحيوية ، والتعامل السهل ، فإن X. laevis كانت البويضات والأجنة حيوية لدراسة مبادئ التحكم الانتقالي. ومع ذلك ، يفتقر هذا النوع إلى بروتوكولات محددة للاستمتاع المناعي القوي والروتيني. هنا ، نقدم بروتوكولا متعمقا للنشاف الغربي المحسن لعينات من مراحل نمو Xenopus المتعددة. ثم نقوم بتحليل المنظمين الانتقاليين عبر التنمية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب فهم الآليات الخلوية مراقبة أنواع معينة من البروتين. تشمل الاستفسارات الشائعة كيف تتغير في التعبير مكانيا وزمانيا ، وما هي البروتينات التي تتفاعل معها ، وما إذا كانت معدلة استجابة لظروف مختلفة. النشاف المناعي ، المعروف بالعامية باسم "النشاف الغربي" ، هو منهجية رئيسية لمواجهة هذه التحديات. تفصل تجربة اللطخة المناعية البروتينات عن عينة معقدة - على سبيل المثال ، محللة الخلية الكاملة - وتحددها باستخدام الأجسام المضادة. على وجه التحديد ، يتم تغيير طبيعة البروتينات ثم فصلها عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل الصوديوم - بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) حسب الحجم. يتم نقل البروتينات المجزأة بحجم إلى دعامة صلبة ، مثل غشاء النيتروسليلوز ، ويتم تحديد البروتين محل الاهتمام باستخدام كواشف الأجسام المضادة. أصبح التنشيف المناعي جزءا قياسيا من مجموعة أدوات عالم الأحياء الجزيئية. يستخدم بشكل شائع لمراقبة تعبير البروتين في سياقات مختلفة أو كنقطة نهاية لتجارب مثل فحوصات الترسيب المناعي. على الرغم من هذه المزايا ، فإن تحليل مستويات بروتين الحالة المستقرة مع التنشيف المناعي يمثل تحديا ، حيث يجب تحسين الاختبار لكل خطوة وسياق تجريبي (الشكل 1).

أحد السياقات الصعبة هو تحليل المواد من الضفدع الأفريقي المخالب Xenopus laevis. X. laevis هو كائن حي مهم لدراسة تفاعلات بروتين الحمض النووي الريبي. يتمتع هذا النظام بالعديد من المزايا ، أهمها أن X. laevis تنتج مئات البويضات وبالتالي تتطور الأجنة بشكل متزامن في وقت واحد. تحتوي كل بويضة على ~ 25 ميكروغرام من البروتين غير الصفار1 ، مما يوفر مادة وفيرة للتجارب الكيميائية الحيوية. الحجم الكبير (~ 1250 ميكرومتر) 1 من البويضات والأجنة يسهل أيضا الحقن المجهري للحمض النووي الريبوزي المرسال للتعبير عن البروتينات الموسومة أو المتحولة خارجيا على المقياس2. تمكن هذه الصفات من إجراء تجارب قوية لفحص التحكم الانتقالي في X. laevis ، مثل مقايسة الوظيفة المربوطة ، حيث يمكن فحص تأثير البروتين التنظيمي الانتقالي على mRNA بغض النظر عن قدرة هذا البروتين على ربط الحمض النووي الريبي3،4،5،6. ومع ذلك ، فإن التنشيف المناعي في بويضات Xenopus والأجنة يأتي مع صعوبات ، بما في ذلك التداخل من كتل كبيرة من الصفائح الدموية الصفار في هذه الخلاياالمبكرة 7 ، والتي ستحجب النتائج إذا لم تتم إزالتها.

هنا ، نقدم بروتوكولا محسنا للنشاف المناعي الفعال في X. laevis، مع التركيز على اكتشاف البروتينات التنظيمية الانتقالية. نحن نقدم تعليمات حول كيفية جمع ومعالجة البويضات والأجنة لتصوير اللطخة المناعية النهائية. كما يتم تضمين تعليمات مفصلة لتحميل البروتين وتصويره على النحو الأمثل ، بالإضافة إلى منع تلوث صفار العينة. بالإضافة إلى ذلك ، نناقش تعديلات البروتوكول والاستراتيجيات المحتملة للعثور على الأجسام المضادة المتوافقة مع بروتينات Xenopus . نعتزم تزويد المحققين بالإرشادات لإجراء التنشيف المناعي دون عناء كجزء من تجاربهم الخاصة في هذا الكائن الحي النموذجي غير المستغل.

figure-introduction-1
الشكل 1: سير العمل لإعداد عينة Xenopus وتحليل اللطخة المناعية اللاحقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع الأعمال مع (X. laevis) الممثلة في هذا البروتوكول متوافقة مع لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في جامعة واشنطن ماديسون تمت الموافقة عليها من قبلها. يتم سرد تفاصيل المعدات والكواشف المستخدمة وتركيزات الأجسام المضادة المستخدمة في جدول المواد. يمكن الاطلاع على مجموعة مختارة من المعدات في الشكل 2 أدناه.

figure-protocol-1
الشكل 2: مستخلص الجنين المعالج ومعدات السحب المناعي. (أ) مستخلص بويضة X . laevis بالطرد المركزي المرحلة السادسة. ترتفع الدهون والبروتينات القابلة للذوبان في الدهون إلى الأعلى بينما يشكل الفيتيلوجينين (صفار البيض) والحطام المصطبغ حبيبات. (ب) معدات SDS-PAGE لفصل البروتينات حسب الوزن الجزيئي. (ط) مزود الطاقة ، (ثانيا) خزان الرحلان الكهربائي العمودي ، (ثالثا) غطاء خزان الرحلان الكهربائي ، (4) مجموعة القطب الكهربائي ، (5) السد العازلة ، (6) جل الرحلان الكهربائي مسبقة الصب ؛ لاحظ المشط الأخضر (الأعلى) والملصق الأزرق (الأسفل) ، ويجب إزالة كل منهما. (ج) معدات نقل الغشاء. يتم إعادة استخدام خزان الرحلان الكهربائي الرأسي والغطاء للنقل بعد الشطف الشامل. (ط) الأسطوانة لإزالة الفقاعات ، (2) مشبك النقل ، (3) قضيب تحريك صغير ، (4) غشاء النيتروسليلوز بين ورقتين زرقاء واقية من الورق ، (5) ورق ترشيح كروماتوغرافيا السليلوز ، (6) وسائد إسفنجية نقل ، (7) طبق خبز زجاجي لتجميع النقل ، (8) عبوة ثلج ، (9) قلب النقل. (د) معدات أخرى. (ط) محرر الجل (لتقليم آبار الجل قبل النقل) ، (ثانيا) ذراع فتح كاسيت الجل ، (ثالثا) ملقط (لمناولة الغشاء) ، (رابعا) حاوية (لغشاء الإمساك) ، (خامسا) غطاء الحاوية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. مجموعة من بويضات Xenopus والأجنة

  1. تحضير البويضات
    1. الحصول على بويضات X. laevis منزوعة الحبيبات من مورد تجاري (Ecocyte Bio Science ، أوستن ، تكساس) أو عزلها وإزالة الجريبات كما هو موضح8.
    2. البويضات المعزولة في محلول بارث المعدل (MBS ؛ 88 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي KCl ، 0.4 ملي كالسيوم2 ، 0.33 ملي مولار كالسيوم (NO3) 2 ، 0.8 ملي مولار MgSO4 ، 5 ملي مولار Tris-HCl ، 2.4 ملي هيدروكلوريدالصوديوم 3 ، الرقم الهيدروجيني 7.4) حتى الاستخدام.
  2. تحضير الأجنة
    1. عزل X. laevis البيض وتخصيبه كما هو موضح9،10.
    2. الأجنة المخصبة في محلول Marc Modified Ringer11 (MMR) 0.25x (1x MMR: 0.1 M NaCl ، 2.0 mM KCl ، 1 mM MgSO4 ، 2 mM CaCl2 ، 5 mM HEPES).
    3. قم بإعداد محلول 2٪ سيستين في 0.1x MMR مع تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 8.2 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم.
    4. قم بإزالة 0.25x MMR من الطبق المستخدم في الإخصاب وقم بتغطية الأجنة بمحلول السيستين لإزالة طبقة الهلام12. امزج المحلول برفق حتى تتعرض الأجنة بالتساوي.
    5. راقب الأجنة عن كثب باستخدام مجهر مجسم من 2x إلى 25x. بعد ذوبان طبقة الهلام (عادة 3-5 دقائق) ، سوف تتجمع الأجنة معا عن كثب. تجنب التعرض المطول للسيستين.
    6. قم بإزالة محلول السيستين وشطف الأجنة عدة مرات باستخدام 0.25x MMR.
    7. الاستزراع في 0.25x MMR حتى مرحلة النمو المطلوبة.
  3. اجمع العدد المطلوب من الأجنة أو البويضات (موصى به بخمس على الأقل لكل عينة) في أنبوب 1.5 مل.
  4. قم بإزالة الوسائط الزائدة باستخدام ماصة ، وتجنب إتلاف الخلايا.
  5. استخدم العينات على الفور أو قم بتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. يمكن تخزين البويضات والأجنة لعدة سنوات.

2. تحضير مستخلص Xenopus

  1. قم بإذابة العينات على الجليد إذا تم تجميدها.
  2. أضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا المبرد 10x المخفف إلى 1x بماء منزوع الأيونات المزدوج (انظر جدول المواد) لكل جنين / بويضة وتجانس العينات باستخدام مدقة دقيقة على الجليد.
  3. قم بتدوير العينات عند 5000 جم عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي على الطاولة لمدة 10 دقائق لبقايا الحبيبات ، بما في ذلك صفار البيض والأصباغ غير القابلة للذوبان.
  4. قم بإزالة المادة الطافية إلى أنبوب منفصل سعة 1.5 مل ، مع الحرص على تجنب الحبيبات (الشكل 2 أ).
  5. أضف حجما متساويا من 2x Laemmli عينة مؤقتة مكملة ب 5٪ w / v 2-mercaptoethanol إلى المادة الطافية واتركها تغلي لمدة 10 دقائق عند 95-100 درجة مئوية لتشويه بروتينات العينة.
  6. استخدم العينات على الفور أو قم بتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية لأشهر إلى سنوات.

3. صفحة SDS

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت للتشغيل SDS: 1x مخزن مؤقت Tris-MOPS-SDS (6.06 جم من قاعدة Tris ، 10.46 جم من 3- (N-morpholino) حمض بروبانسلفونيك [MOPS] ، 1.0 جم من SDS ، 0.3 جم من حمض الإيثيلين ديامين رباعي الخليك [EDTA] ، ماء منزوع الأيونات المزدوج إلى 1000 مل).
  2. قم بإزالة جل مسبقة الصب 4-12٪ من العبوة. قم بإزالة الملصق الموجود أسفل الجل.
  3. أدخل الجل في مجموعة القطب الكهربائي مقابل سد عازل. ضع مجموعة القطب الكهربائي في خزان الرحلان الكهربائي الرأسي (الشكل 2 ب).
  4. املأ مجموعة القطب الكهربائي والجزء السفلي من خزان الرحلان الكهربائي بمخزن مؤقت تشغيل 1x Tris-MOPS-SDS.
  5. قم بإزالة مشط الجل برفق من المخزن المؤقت للهلام والماصة في الآبار لإزالة الفقاعات وتوازن المخزن المؤقت.
  6. قم بتحميل 5 ميكرولتر من معايير البروتين الملطخ مسبقا في البئر الأول بعناية و 10 ميكرولتر من كل عينة في الآبار الإضافية.
  7. (اختياري) قم بتحميل الآبار المتبقية ب 10 ميكرولتر من 1x Laemmli عينة مؤقتة لجعل الجل يعمل بشكل متساو.
  8. ضع الغطاء على خزان الرحلان الكهربائي وقم بتوصيله بمصدر طاقة. تطبيق 200 فولت.
  9. أوقف الرحلان الكهربائي عندما تخرج مقدمة صبغة العازلة العينية من الجل.

4. النقل الرطب للبروتينات على الغشاء

  1. أثناء الرحلاب الكهربائي للعينات ، قم بإعداد 1 لتر من المخزن المؤقت للنقل (3.0 جم من قاعدة تريس ، 4.08 جم من البيسين ، 900 مل من الماء منزوع الأيونات المزدوج ، 100 مل من الميثانول). قم بتبريد المخزن المؤقت للنقل مسبقا عند 4 درجات مئوية.
    تنبيه: تعامل مع مخزون الميثانول المركز في غطاء الدخان وتجنب ملامسة الجلد. يمكن استبدال الميثانول بالإيثانول.
  2. قبل اكتمال الرحلان الكهربائي ، ابدأ في تجميع "شطيرة" النقل في مشبك النقل (الشكل 2 ج).
    1. املأ طبق خبز زجاجي بمخزن مؤقت للنقل المبرد. في خطوات تجميع الساندويتش اللاحقة ، تأكد من غمر المواد في هذا المخزن المؤقت.
    2. ضع مشبك النقل في الطبق مع وضع النصف الأسود على قاع الطبق ، والنصف الأبيض مفتوحا وموجه لأعلى ، ومشبك النقل مفتوحا إلى اليسار.
    3. ضع إسفنجة أو اثنتين من الألياف بشكل مسطح على النصف الأسود من مشبك النقل.
    4. قم بقص ورقتين كروماتوغرافيا السليلوز 0.35 مم (أوراق الترشيح) حسب الحجم وضع واحدة فوق الإسفنج.
  3. بعد اكتمال الرحلان الكهربائي ، قم بإزالة الجل من خزان الرحلان الكهربائي.
  4. قم بفصل ألواح الجل بعناية باستخدام ذراع فتح كاسيت الجل ، مما يضمن بقاء الجل متصلا بإحدى الألواح (الشكل 2 د). تقليم الآبار من أعلى الجل باستخدام محرر الجل.
  5. ضع الجل ، الذي لا يزال متصلا بنصف الكاسيت البلاستيكي ، على ورق الترشيح. قم بإزالة نصف الكاسيت حتى يبقى الجل على ورق الترشيح.
  6. قطع مربع غشاء النيتروسليلوز 0.45 ميكرومتر ليناسب أبعاد الجل. قم بإزالة الغشاء من الورق الواقي ، وبلله لفترة وجيزة في مخزن مؤقت للنقل ، وضعه على الجل.
    ملاحظة: تعامل مع الغشاء بعناية من الزوايا بالقفازات أو الملقط لتجنب تلوث الغشاء بالبروتين غير المرغوب فيه.
  7. ضع ورق ترشيح ثان فوق غشاء النيتروسليلوز. قم بإزالة أي فقاعات برفق ولكن بقوة باستخدام بكرة أعلى ورق الترشيح.
  8. قم بتكديس إسفنجة أو إسفنجتين من الألياف فوق ورق الترشيح.
  9. أغلق كاسيت النقل وأغلقه بإحكام ، لإكمال "الساندويتش".
  10. أدخل شطيرة النقل في قلب النقل بحيث يكون مشبك النقل متجها لأعلى والجانب الأسود من مشبك النقل مواجها للجانب الأسود من القلب.
  11. ضع قلب النقل في خزان الرحلان الكهربائي. أضف كيس ثلج وقضيب تقليب إلى الخزان حتى يدور قضيب التحريك بحرية.
    ملاحظة: بالإضافة إلى كيس الثلج أو بدلا منه ، يمكن إجراء النقل في غرفة باردة عند 4 درجات مئوية في الخطوة 4.13.
  12. املأ الخزان بمخزن مؤقت للنقل المبرد. ثبتي الغطاء بإحكام في الأعلى.
  13. قم بتوصيل جهاز النقل بمصدر الطاقة ، مع التأكد من محاذاة ألوان القطب. قم بتشغيل النقل لمدة 1 ساعة ، 100 فولت ، عند 4 درجات مئوية ، مع تدوير قضيب التحريك.

5. معالجة غشاء ما بعد النقل

  1. تحضير 10x محلول ملحي Tris-Buffered (100 ملي مولار قاعدة تريس ؛ 1.5 مليون كلوريد الصوديوم). اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8 وقم بتعقيم الفلتر.
  2. قم بإعداد 1x محلول ملحي Tris-Buffered مع Tween-20 (TBSTw) عن طريق تخفيف محلول 10x TBS 1:10 في 500 مل من الماء منزوع الأيونات المزدوج وإضافة 500 ميكرولتر من Tween-20.
  3. تحضير المخزن المؤقت (500 مل TBSTw ، 25 جم من مسحوق الحليب الخالي من الدسم).
    ملاحظة: يمكن استبدال الحليب الخالي من الدسم ب 2-5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) في المخزن المؤقت المانع. يجب استخدام BSA إذا كان التطبيق التجريبي يتضمن تصور البروتينات البيوتينيل ، حيث يحتوي الحليب على البيوتين.
  4. بمجرد اكتمال النقل ، قم بإزالة الساندويتش وتفكيكه بعناية وإزالة غشاء النيتروسليلوز. حدد أي جانب من الغشاء كان يلامس الجل ، وحافظ على هذا الجانب متجها لأعلى في الخطوات اللاحقة.
  5. قم بإعداد 50 مل من صبغة Ponceau (0.5٪ Ponceau S ، 1٪ حمض الخليك) ، وهي صبغة قابلة للعكس لتصور البروتين.
    تحذير: بقعة بونسو أكالة. تجنب ملامسة الجلد.
  6. ضع الغشاء في وعاء صغير (كما هو موضح في الشكل 2D) بحيث يكون متدفقا على قاع الحاوية. قم بتغطية الغشاء بصبغة Ponceau للغمر والصخور برفق على الروك لمدة 5-10 دقائق.
  7. اسكب بقعة بونسو.
    ملاحظة: يمكن إعادة استخدام بقعة بونسو عدة مرات.
  8. اشطف الغشاء بغسلات متكررة من الماء منزوع الأيونات المزدوج حتى تتم إزالة بونسو الزائد وتبدأ أشرطة البروتين في الممرات في الحل.
  9. تأكد من كفاءة النقل من خلال وجود ممرات مستقيمة ومتساوية ذات نطاقات تم حلها بوضوح.
  10. اسكب أي سائل متبقي واغمس اللطخة في المخزن المؤقت لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة بالغشاء في خطوات مجرى النهر.
  11. صخر برفق على الروك لمدة 30-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

6. حضانة الأجسام المضادة

  1. قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي في 10 مل من المخزن المؤقت الحجب الطازج إلى التركيز المطلوب.
    ملاحظة: يجب تحديد التركيز الأمثل تجريبيا لكل جسم مضاد جديد. نقطة البداية النموذجية هي 1: 1000 ، أو اتبع توصيات الشركة المصنعة.
  2. قم بإزالة المخزن المؤقت الحاجب واستبدله بخليط الأجسام المضادة. احتضان ، هزاز برفق ، طوال الليل (~ 16 ساعة) عند 4 درجات مئوية.
  3. اسكب محلول الجسم المضاد الأساسي واشطف الغشاء باستخدام TBSTw عن طريق غمره في المحلول وصبه بسرعة.
    ملاحظة: يمكن حفظ معظم مخاليط الأجسام المضادة وإعادة استخدامها مرتين إلى ثلاث مرات. يجب تحديد ذلك تجريبيا لكل جسم مضاد.
  4. اغسل الغشاء عن طريق غمره في TBSTw وهززه برفق في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. قم بإجراء ثلاث عمليات غسيل لمدة 5 دقائق.
  5. تمييع الجسم المضاد الثانوي في 30 مل من TBSTw إلى التركيز المطلوب.
    ملاحظة: يجب تحديد التركيز تجريبيا لكل جسم مضاد. عادة ما نستخدم 1: 30,000.
  6. اسكب محلول الغسيل TBSTw واستبدله بخليط الأجسام المضادة الثانوي. احتضان ، هزاز برفق ، لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  7. اشطف الغشاء بسرعة مرة واحدة باستخدام TBSTw متبوعا بثلاث غسلات لمدة 5 دقائق.

7. تصوير الغشاء على مطور فيلم

  1. في غرفة مظلمة ، قم بتشغيل مطور الفيلم واسمح له بالإحماء.
  2. قطع مربعين من غلاف بلاستيكي كبير بما يكفي ليشمل الغشاء. باستخدام الملقط ، ضع غشاء النيتروسليلوز "وجهه لأعلى" على المربع الأول من الغلاف البلاستيكي.
  3. في أنبوب سعة 1.5 مل ، امزج كميات متساوية من كواشف Luminol و Enhancer المحسنة للتلطؤ الكيميائي (ECL). يجب أن يغطي استخدام 1 مل من المحلول المختلط معظم الأغشية.
  4. قم بلصق كاشف ECL على الغشاء وقم بمعالجة الغشاء برفق باستخدام الغلاف البلاستيكي لضمان التغطية الكاملة. احتضان لمدة 1 دقيقة.
  5. قم بإزالة كاشف ECL الزائد عن طريق الإمساك بالغشاء بالملقط والتخلص من السائل برفق أو فتل السائل عن طريق لمس زاوية الغشاء بمنشفة ورقية.
  6. ضع الغشاء ووجهه لأعلى على المربع الثاني من الغلاف البلاستيكي وقم بطي الغلاف البلاستيكي فوق الغشاء حتى يتم إغلاقه بشكل غير محكم. قم بلصق الغشاء الملفوف بإحكام في شريط التصوير الشعاعي الذاتي.
  7. في الغرفة المظلمة ، ضع فيلما داخل الكاسيت ، ويغطي الغشاء المسجل. أغلق الكاسيت بإحكام وقم بتعريض الفيلم للغشاء لمدة 1 دقيقة.
  8. قم بإزالة الفيلم بعناية ، مع الحرص على عدم سحب الفيلم المكشوف على طول الغشاء. قم بإطعامه في مطور الفيلم.
  9. عند تقييم الفيلم المطور ، اضبط وقت التعرض مع الأفلام اللاحقة حتى يتم تحقيق تصور البروتين المطلوب. إذا كان تصور البروتين يوفر إشارة ضعيفة ، كرر خطوة حضانة كاشف ECL باستخدام كاشف ECL أكثر حساسية وإعادة الصورة.
  10. قم بمحاذاة الفيلم المطور مع علامات التوهج في الظلام واستخدم هذا المرجع لتحديد موضع معايير البروتين الملطخة مسبقا على الغشاء على الفيلم.
  11. بمجرد اكتمال التصوير ، قم بإزالة الغشاء بعناية من الغلاف البلاستيكي وغمره في TBSTw لغسل كاشف ECL المتبقي.

8. (اختياري) حضانات إضافية للأجسام المضادة

ملاحظة: يشير تجريد اللطخة المناعية إلى إزالة الأجسام المضادة الأولية والثانوية بمحلول تغيير طبيعة (المخزن المؤقت للتجريد) بحيث يمكن إعادة فحص اللطخة بجسم مضاد مختلف. تسمح إعادة الفحص بتحليل نفس اللطخة المناعية للتعبير عن أهداف البروتين المختلفة ومقارنة البروتينات غير المعروفة بالبروتينات المميزة جيدا التي تعمل كمعايير. قم بالتحقيق باستخدام الجسم المضاد الذي ينتج الإشارة الأضعف نسبيا أولا. يمنع القيام بذلك القطع الأثرية الناتجة عن الأجسام المضادة المجردة بشكل غير كامل في التعرضات اللاحقة ويقلل من تأثير فقدان البروتين من التجريد المتكرر من اللطخة.

  1. قم بتجريد الأجسام المضادة المرتبطة عن طريق غمر الغشاء في المخزن المؤقت للتجريد والتأرجح برفق لمدة 5-10 دقائق.
  2. قم بإزالة الغشاء من المخزن المؤقت للتجريد واشطفه لفترة وجيزة في TBSTw لإزالة أي محلول تجريد متبقي.
  3. اغمر الغشاء في المخزن المؤقت والصخور برفق لمدة 30 دقيقة.
  4. اصنع محلولا جديدا للأجسام المضادة الأولية في حجب المخزن المؤقت بالتركيز المطلوب.
  5. أضف تخفيف الجسم المضاد الأولي الجديد إلى الغشاء واحتضان التأرجح برفق طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  6. تابع من الخطوة 6.3 فصاعدا. يمكن تجريد الغشاء وإعادة فحصه حتى ثلاث مرات إضافية.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لإثبات كفاءة بروتوكول التنشيف المناعي الخاص بنا ، قمنا بتحليل بروتينات التحكم الانتقالية ذات العلامات التقاربية والداخلية في ثلاثة أنواع من X. عينات laevis : بويضات المرحلة السادسة ، وأجنة المرحلة 7 (الأريمة) ، وأجنة المرحلة 10.5 (المعدة). تم اختيار هذه المراحل لأنها تمتد على انتقال منتصف الأريمة (المرحلة 8.5) ، والتي تمثل بداية النسخ الزيجوتي القوي13،14. نظرا لأن التطور قبل انتقال منتصف الأريمة يحدث في غياب النسخ ، فإن الأجنة قبل الوجنحة (أي التي تتحكم فيها الأم) تعتمد بشكل كبير على آليات التحكم الانتقالية للتعبير عن بروتينات مصير الخلية بالدقة الزمنية والمكانيةالصحيحة 15. لذلك ، فإن انتقال منتصف الأريمة هو سياق حيوي لدراسة تفاعلات بروتين الحمض النووي الريبي.

لتحليل تعبير البروتين عن طريق الصبغة المناعية ، X . laevis تم حقن البويضات والأجنة ب 500 بيكوغرام من mRNA التي تشفر النصف الطرفي C من X. laevis Bicaudal-C (Bicc1) مدمجة في 3x علامات تقارب الهيماجلوتينين (HA). اخترنا تحليل Bicc1 نظرا لأهميته ببيولوجيا Xenopus وتفاعلات البروتين والحمض النووي الريبي. Bicc1 هو بروتين مرتبط بالحمض النووي الريبوزي المرسال ومثبط انتقالي يوجه قرارات مصير الخلية في الجنين المبكر16،17،18. في وقت لاحق من التطوير ، يؤثر على الزخرفة اليسرى واليمين19،20،21 ووظيفة الأعضاء ، بما في ذلك الكلى22،23،24،25. يحتوي Bicc1 على منطقة توجه مجالات التماثلالانتقالي 5 و hnRNP K (KH) التي تتوسط الارتباط ب mRNAs محددة5،26،27،28.

تم تحضير المستخلصات من خمس بويضات أو أجنة محقونة ب HA-Bicc1 ، جنبا إلى جنب مع العينات المقابلة غير المحقونة كضوابط سلبية. تم تحويل عشر كل مستخلص بالكهرباء على هلام ثنائي تريس متدرج بنسبة 4-12٪ وتم نقله رطبا إلى غشاء النيتروسليلوز. أكد تلطيخ بونسو للغشاء للكشف عن البروتين الكلي النقل الناجح (الشكل 3 أ). كجزء من دراساتنا ، قمنا بإنشاء جسم مضاد في الأرانب يتعرف على النصف الطرفي C من بروتين Bicc1 البشري. تم استخدام هذا الجسم المضاد للكشف عن بروتين Xl-Bicc1 الداخلي والخارجي (الشكل 3 ب). أظهر العمل السابق أن بروتين Bicc1 غائب عن X. بويضات laevis ، ولكن يتم التعبير عنه في أجنة ما قبل MBT ، قبل أن يكون الجينوم البيضي نشطا16. يشير هذا إلى أنه بينما يتراكم Bicc1 mRNA أثناء تكوين البويضات ، يتم قمعه بشكل متعد. بالاتفاق مع هذا العمل السابق ، لم يتم اكتشاف Bicc1 الداخلي في البويضات. في المقابل ، تعرف الجسم المضاد على Bicc1 الداخلي (~ MW 107 kDa) في كل من الأجنة 7 و 10.5. مجتمعة ، تؤكد هذه النتائج أن الجسم المضاد يتعرف على بروتين Bicc1 الداخلي (الشكل 3 ب ، اللوحة العلوية ، رأس السهم الأحمر). تعرف الجسم المضاد Bicc1 على بروتين أصغر يبلغ حوالي 70 كيلو دالتون في مقتطفات محضرة من عينات حقن mRNA (الشكل 3 ب ، اللوحة العلوية ، رأس السهم الأسود ، قارن الممرات 2 و 4 و 6 مع الممرات 1 و 3 و 5). كعنصر تحكم في خصوصية الجسم المضاد Bicc1 ، تم تجريد الغشاء وإعادة فحصه بجسم مضاد ضد علامة تقارب HA. حدد الجسم المضاد HA بروتين 70 كيلو دالتون في العينات المحقونة لكنه لم يتعرف على Bicc1 الداخلي (الشكل 3 ب ، اللوحة الثانية ، رأس السهم الأسود). يختلف اكتشاف مصطلح HA-Bicc1 C في شدته عبر المراحل بسبب الاختلافات في تعبير البروتين من mRNA المحقون في أنواع الخلايا المختلفة.

بعد ذلك ، قمنا بتوسيع النتائج من خلال اختبار التعبير عن البروتينات التنظيمية الانتقالية الداخلية التي تتفاعل مع Bicc1. أولا ، قمنا بتحليل التعبير عن الوحدة الفرعية 1 (Cnot1) ، وهو بروتين سقالة كبير وجزء من مركب Ccr4-Not deadenylase (CNOT). يعد مركب CNOT متعدد الوحدات الفرعية أحد الديتينيلز حقيقيات النواة الرئيسية وهو معروف في المقام الأول بتقليم ذيل بولي (أ) في نهاية مرنا المرسال كمقدمة لتدهورها. ومع ذلك ، فإن هذا المجمع له أدوار متنوعة في التحكم الانتقالي الذي يمتد إلى ما هو أبعد من deadenylation29. كنا مهتمين بفحص تعبير Cnot1 نظرا لأهمية مركب CNOT لتنظيم mRNA والملاحظات السابقة بأن Cnot1 يتفاعل مع Bicc120،30. لتحليل تعبير Cnot1 ، استخدمنا جسما مضادا يتعرف على بروتين Cnot1 الداخلي. حددت بروتينين عند 250 كيلو دالتون و 270 كيلو دالتون في كل عينة ، الحجم المتوقع ل Cnot1 (الشكل 3 ب ، اللوحة الثالثة). وبالتالي ، يسمح لنا هذا البروتوكول بتحديد مكون حاسم في المجمع التنظيمي بسهولة. بالإضافة إلى ذلك ، تدعم هذه البيانات قدرة البروتوكول على تحديد البروتينات عالية الوزن الجزيئي بنجاح.

لمزيد من الاختبار لتعميم هذه النتائج ، قمنا بعد ذلك بتحليل العينات لوجود هليكاز DEAD-box بارز متورط في القمع الانتقالي ، DEAD-box helicase 6 (Ddx6 ، المعروف سابقا باسم xp54 في Xenopus و me31b في ذبابة الفاكهة). Ddx6 هو عنصر مهم في حبيبات البروتين النووي الريبي ، ويشارك في تخزين mRNA ، ويتفاعل مع Bicc1 و Cnot16،31،32. حدد الجسم المضاد الذي يتعرف على Ddx6 الداخلي بروتينا يبلغ حوالي 54 كيلو دالتون في كل عينة (الشكل 3 ب ، اللوحة الرابعة). تم تقليل التعبير في الأجنة الوجنحة (الشكل 3 ب ، قارن بين الممرات 5 و 6 إلى 1-4) ، كما ورد سابقا33.

أخيرا ، للتأكد من أن الاختلافات التي لاحظناها بين العينات كانت بسبب الاختلافات في التعبير ، قمنا بتجريد اللطخة المناعية وإعادة فحصها بجسم مضاد يتعرف على إنزيم نازعة هيدروجين الجلسرين 3-فوسفات (Gapdh). يعمل Gapdh بمثابة "تحكم في التحميل" في كل مكان. تؤكد المستويات المكافئة لتعبير Gapdh تلطيخ Ponceau: يتم تحليل كمية متساوية من البروتين الكلي عبر العينات (الشكل 3 ب ، اللوحة الخامسة).

تؤكد هذه النتائج معا فعالية طريقة اللطخة المناعية هذه. تمكنا من تحديد Bicc1 الخارجية والذاتية عبر العديد من مراحل نمو X. laevis ذات الصلة بدراسة تفاعلات بروتين الحمض النووي الريبي: البويضات وأجنة ما قبل MBT ، والتي تحتوي فقط على mRNAs المودعة من قبل الأم ، وأجنة ما بعد MBT ، والتي تشمل أيضا mRNAs المنسوخة وزيجوت. تمكنا من تعميم هذه النتائج من خلال تحليل التعبير عن بروتينات التحكم الانتقالية المتعددة في مجموعة متنوعة من الأوزان الجزيئية (Bicc1 و Cnot1 و Ddx6) وعنصر تحكم التحميل (Gapdh). نوضح أيضا أنه يمكن استخدام هذا البروتوكول ل X. tropicalis الأجنة مع التعديل لزيادة كمية المواد المستخدمة لحساب حجمها الأصغر (الشكل التكميلي 1).

figure-results-1
الشكل 3: تحديد مستويات البروتينات التنظيمية الانتقالية من خلال التنشيف المناعي في X. laevis. (أ) تلطيخ بونسو للطخة المناعية لتحديد البروتين الكلي من X. بويضات المرحلة السادسة ، وأجنة المرحلة 7 ، وأجنة المرحلة 10.5. يمثل كل حارة 10٪ من البروتين المحضر من مستخلص (0.5 بويضة أو جنين). (ب) تحليل اللطخة المناعية للبروتينات التنظيمية الانتقالية المختارة X. laevis في بويضات المرحلة السادسة ، وأجنة المرحلة 7 ، وأجنة المرحلة 10.5. تتوافق الممرات 2 و 4 و 6 مع العينات التي تم حقنها بميكروغر باستخدام HA-Bicc1 mRNA قبل التحليل ، بينما تعمل الممرات 1 و 3 و 5 كعناصر تحكم سلبية (غير محقنة). تم استخدام الجسم المضاد α-Bicc1 لفحص التعبير عن Bicc1 الداخلي عبر المراحل (اللوحة العلوية). تم تجريد اللطخة لاحقا وإعادة فحصها بجسم مضاد لعلامة تقارب HA كعنصر تحكم لخصوصية الأجسام المضادة α-Bicc1 (اللوحة الثانية). تم تجريد البقع وإعادة فحصها بحثا عن بروتينات تنظيمية إضافية باستخدام α-Cnot1 (اللوحة الثالثة) و α-Ddx6 (اللوحة الرابعة). α-Gapdh (اللوحة السفلية) بمثابة عنصر تحكم لتحميل البروتين المتساوي. تشير رؤوس الأسهم الحمراء إلى موقع Bicc1 الداخلي ، بينما تشير رؤوس الأسهم السوداء إلى موقع مصطلح HA-Bicc1 C-term المعبر عنه خارجيا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: تحليل اللطخة المناعية لبروتين Bicc1 في Xenopus laevis مقابل Xenopus tropicalis. تم استخدام الجسم المضاد α-Bicc1 لفحص التعبير عن Bicc1 الداخلي والخارجي عبر كميات مختلفة من X. laevis و X. tropicalis مستخلص الجنين. الممر 1: 0.5 جنين X. laevis غير المحقون. حارة 2: 0.5 HA-Bicc1 حقن X. جنين laevis . حارة 3: 3 أجنة X. tropicalis غير المحقونة. حارة 4: 1 جنين X. tropicalis غير المحقون. حارة 5: 0.5 جنين X. tropicalis غير المحقون. تم استخدام جسمين مضادين يتعرفان على Bicc1 الداخلي: أحدهما مرفوع ضد الإنسان Bicc1 (اللوحة العلوية) والآخر مرفوع ضد X. laevis Bicc1 (اللوحة الوسطى). تم استخدام α-Gapdh (اللوحة السفلية) للتحكم في تحميل البروتين بشكل متساو. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من بساطته في المفهوم ، إلا أن التنشيف المناعي صعب في الممارسة العملية بسبب الخطوات المتعددة التي تمتد لعدة أيام. على هذا النحو ، غالبا ما يكون تحقيق نتائج متسقة وعالية الجودة أمرا صعبا. ومع ذلك ، فإن التنشيف المناعي هو عنصر حيوي ومنتشر في كل مكان في علم الأحياء الحديث. على سبيل المثال ، يعد التنشيف المناعي أمرا بالغ الأهمية لتأكيد الترجمة الناجحة والتعبير عن mRNA المحقون في X. laevis البويضات والأجنة ، مما يسلط الضوء على أهميته ل X. laevis البحث. علاوة على ذلك ، تستخدم تجارب الترسيب المناعي التنشيف المناعي لتحليل تفاعلات البروتين والبروتين في الجسم الحي . يعتمد الكشف الفعال عن بروتينات معينة إلى حد كبير على وفرة وجودة كواشف الكشف عن الأجسام المضادة. في هذه الدراسة ، تتراوح التركيزات المقدرة للبروتين الداخلي الذي قمنا بتحليله بمقدار 500 ضعف تقريبا في بيضة Xenopus (Bicc1: 37.22 نانومتر ، Cnot1: 115.08 نانومتر ، Ddx6: 980.55 نانومتر ، Gapdh: 17،907.26 نانومتر) 34 ، ولكن تم اكتشافها جميعا بسهولة. تحت هذا النطاق ، يمكن إجراء تعديلات على سير العمل في كل خطوة من اللطخة المناعية - من جمع العينات إلى التصوير - لتحسين دقة وكفاءة الكشف ، إذا لزم الأمر.

يعد نوع هلام SDS-PAGE والغشاء الذي يجب استخدامه من الاعتبارات الرئيسية لأي تجربة نشاف مناعي. من واقع خبرتنا ، تعتبر المواد الهلامية مسبقة الصب أكثر سهولة وقابلية للتكرار من المواد الهلامية المنتجة داخليا. تتميز المواد الهلامية مسبقة الصب بميزة إضافية تتمثل في توفرها بتنسيقات متدرجة حيث تزداد المواد الهلامية تدريجيا في تركيز بولي أكريلاميد من أعلى إلى أسفل. تسمح المواد الهلامية المتدرجة للباحثين بحل وتحليل مجموعة واسعة من البروتينات بأوزان جزيئية مختلفة إلى حد كبير. يؤدي القيام بذلك إلى تجنب المقايضة النموذجية بين اختيار هلام منخفض نسبة الأكريلاميد (<7٪) ، والذي يحل البروتينات ذات الوزن الجزيئي العالي ، مقابل نسبة عالية من الجل (>12٪) ، وهو أفضل في حل البروتينات ذات الوزن الجزيئي المنخفض. من المهم أيضا التفكير فيما إذا كان سيتم استخدام غشاء فلوريد النيتروسليلوز أو البولي فينيلدين (PVDF) لنقل البروتين. تمت مناقشة آلية ومزايا كل نوع من أنواع الأغشية على نطاق واسع35،36. باختصار ، يتمتع PVDF بقدرة ربط بروتين أعلى (وبالتالي حساسية أعلى) من غشاء النيتروسليلوز وهو أكثر متانة للاستخدام المتكرر. ومع ذلك ، يتطلب PVDF معالجة إضافية في شكل تنشيط عن طريق حضانة الميثانول وهو أكثر تكلفة. بينما نجد أن كلا الغشاءين مناسبان لمعظم التطبيقات ، فإننا نستخدم النيتروسليلوز بشكل روتيني بسبب اعتبارات التكلفة.

يعد تصوير اللثة المناعية مكونا حاسما في البروتوكول. خلال هذه الخطوة ، يجب على الباحثين ممارسة الحكم لالتقاط صورة لطخة مناعية تنقل جميع المعلومات الضرورية ولكنها تحافظ على ضوضاء الخلفية إلى الحد الأدنى. هناك طريقتان رئيسيتان للتصوير للأجسام المضادة القياسية المقترنة ب HRP: فيلم الأشعة السينية أو أنظمة التصوير الرقمي. من واقع خبرتنا ، فإن التقاط الصور بفيلم الأشعة السينية له فوائد عديدة. تعتبر أفلام الأشعة السينية بشكل عام أكثر حساسية بكثير من أنظمة التصوير الرقمي ، مما يسهل الكشف عن البروتينات منخفضة الوفرة. تنتج أفلام الأشعة السينية أيضا سجلا ماديا للتجربة يمكن شرحه ورقمنته بدقة عالية. ومع ذلك ، سيكون لنظام التصوير الرقمي نطاق خطي أعلى بكثير - العلاقة بين قوة الإشارة وشدة الصورة - من مطور الأفلام. نظرا لحساسيته ، يمكن أن يتعرض فيلم الأشعة السينية بشكل مفرط بسرعة ، ويفقد المعلومات الكمية. لذلك ، يجب على الباحث الذي يبحث عن تقدير كمي دقيق لنتائجه استخدام نظام تصوير رقمي أو توخي الحذر بشكل خاص لعدم الإفراط في تعريض اللطخات المناعية النامية بفيلم الأشعة السينية.

إذا كانت نتائج التنشيف المناعي غير مرضية بعد اتباع البروتوكول كما أوضحنا ، مثل الأشرطة الباهتة أو "الضبابية" عند التصوير ، فيمكن إجراء تعديلات متعددة لتحسين النتيجة. على سبيل المثال ، يمكن تعديل كمية خليط بروتين Xenopus التي تم تحليلها. يمكن أن يؤدي إجمالي البروتين من أقل من خمس الجنين إلى نتائج قوية ، على الرغم من أنه من الممكن تحميل ما يصل إلى جنين أو بويضات لكل ممر جل. قد يؤدي تحميل الكثير من البروتين إلى المصنوعات اليدوية أو إشارات خلفية عالية زائفة أثناء التصوير. بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي الرحلان الكهربائي بجهد منخفض (100 فولت) لفترة تشغيل أطول بشكل عام إلى نطاقات بروتينية أكثر حدة. وبالمثل ، فإن إجراء نقل البروتين بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية عند الجهد المنخفض (30 فولت) بدلا من ساعة عند 100 فولت قد يحسن اكتشاف البروتين ، خاصة بالنسبة للأنواع ذات الوزن الجزيئي العالي. أخيرا ، تكتشف بعض حضانات الأجسام المضادة الأولية أهدافها بشكل أكثر قوة باستخدام حضانات لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، بدلا من 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. يجب اختبار تعديل البروتوكول هذا لكل جسم مضاد أساسي.

يمثل تحديد الأجسام المضادة للكشف عن البروتينات الداخلية تحديا كبيرا للنشاف المناعي في Xenopus ، حيث يتوفر عدد قليل نسبيا من الأجسام المضادة الخاصة ب Xenopus تجاريا. يمكن للباحثين الاستفادة من المصادر غير التجارية للأجسام المضادة Xenopus مثل Xenbase37 (https://www.xenbase.org/xenbase/) ، وبنك الدراسات التنموية للورم الهجين (https://dshb.biology.uiowa.edu/) ، والمركز الأوروبي لموارد Xenopus (https://xenopusresource.org/). بدلا من ذلك ، قد تكون الأجسام المضادة المتولدة للتعرف على بروتين الإنسان أو الفأر مفيدة للكشف عن بروتينات Xenopus المتجانسة ، اعتمادا على الحفاظ على المناطق المستخدمة لإنتاج الأجسام المضادة. على سبيل المثال ، تم رفع جسم مضاد Bicc1 المقدم في هذا البروتوكول ضد بروتين Bicc1 البشري. بالنسبة لمثل هذه الكواشف ، يجب تحديد القدرة على التفاعل المتبادل مع بروتينات Xenopus تجريبيا. على الرغم من أن الحاتمة الدقيقة التي تستخدمها الشركات لإنشاء الأجسام المضادة مملوكة بشكل عام ، إلا أن العديد منها سيوفر مجموعة من الأحماض الأمينية للحاتمة عند الطلب. يمكن بعد ذلك محاذاة هذه المنطقة مع المنطقة المقابلة لبروتين Xenopus المتماثل. في حين أن النجاح غير مضمون ، إلا أننا حققنا النجاح عادة عندما تظهر الحاتمة المستخدمة لإنتاج الأجسام المضادة في الأنواع المستهدفة تشابها لا يقل عن 75٪ أو أعلى مع امتداد التسلسل المماثل في Xenopus. يجب التحقق من صحة الأجسام المضادة المتولدة ضد البروتينات غير Xenopus قبل الاستخدام المكثف ، حيث أن التحقق غير السليم من الأجسام المضادة هو مساهم رئيسي في البحث غير القابل للتكرار38،39. يمكن القيام بذلك عن طريق التعبير عن بروتين Xenopus الموسوم الذي يثير اهتمام الأجنة من خلال الحقن المجهري mRNA40. ثم يتم استخدام تحليل نفس العينات باستخدام جسم مضاد تجاه علامة التقارب للتأكد من أن الجسم المضاد للبروتين الداخلي والجسم المضاد للبروتين الموسوم كلاهما يتعرفان على نفس الكيان (كما في الشكل 3 ب).

يمكن أن يكون تحليل البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي ، خاصة تلك التي لها وظائف تنظيمية مثل Bicc1 ، أمرا صعبا بسبب ندرة الكواشف وعادة ما يكون التعبير المنخفض عن الجزيئات التنظيمية القوية. تصبح هذه المشكلة أكثر وضوحا في المسح المناعي ، حيث يجب تحسين كل كاشف على حدة ، وقد يكون من الصعب العثور على أجسام مضادة ذات خصوصية وحساسية كافية. هدفنا من هذا البروتوكول هو معالجة قيود محددة للانتشاف المناعي في Xenopus وتوضيح الخطوات المطبقة على الأنظمة الأخرى ، بحيث يمكن للباحثين التغلب على صعوبات تحليل البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر لورا فاندربلوغ على إعداد الأرقام ومختبر بيل بيمنت لتوفير بويضات زينوبوس . نشكر أيضا ماركو هورب ، وكيلسي كوبنراث ، ومورد Xenopus الوطني ، المختبر البيولوجي البحري ، وودز هول ، ماساتشوستس ، لتوفير أجنة Xenopus tropicalis . نود أيضا أن نشكر إميلي تي جونسون على تعليقاتها الثاقبة على المخطوطة. واستفاد هذا العمل من دعم Xenbase (http://www.xenbase.org/; RRID: SCR_003280). يتم دعم العمل في مختبر جداول البيانات من قبل NICHD (R01HD091921) و NIGMS (R01GM152615). يتم دعم شارلوت كانزلر من قبل برنامج التدريب على التكنولوجيا الحيوية من خلال المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة (T32GM135066).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
غلاف بريميوم ثقيل بمساحة 100 قدم مربعساران2570000130
مخزن تحلل الخلايا 10xتقنية الإشارة الخلوية#9803
2-ميركابتوإيثانولسيغما-ألدرتشM3148
طبق خبز/تقديم بيضاوي بسعة 2 كوارتبايركس71160010116
مخزن عينات Laemmli 2xبيو-راد#1610737
الأجسام المضادة عالية التقارب المضادة لحمض الهيدروجينيومروش11867423001تم تحضيره حسب التعليمات واستخدامه عند تخفيف 1:10,000.
IgG مضاد الأرنب، الأجسام المضادة المرتبطة ب HRPتقنية الإشارة الخلوية7074Sيستخدم عند تخفيف 1:30,000.
شريط التصوير الذاتي (Autoradiography)، 5 × 7 إنشمنتجات البحث الدولية420057ليس ضروريا إذا كنت تستخدم نظام تصوير رقمي.
مدقات بيل-آرت القابلة للتخلص منهاميليبور سيغماBAF199230001
بيكودال-سي (الإنسان) الأجسام المضادة للأرنبإنفيغو بيوبرودكتس (الآن إينوتيف)لا يوجدتم الطلب حسب الطلب. يستخدم عند تخفيف 1:20,000.
الأجسام المضادة للأرنب بيكودال-سي (زينوبوس)إنفيغو بيوبرودكتس (الآن إينوتيف)لا يوجدتم الطلب حسب الطلب. يستخدم عند تخفيف 1:20,000. مرجع: بارك وآخرون، 2016
مصل البقر ألبومينسيغما-ألدرتشA3294بديل للحليب الخالي من الدسم في محلول حاجز للحاجز.
جهاز الطرد المركزي 5425إبندورف13-864-456
فيلم CL-XPosureثيرموفيشر ساينتيفيك34091ليس ضروريا إذا كنت تستخدم نظام تصوير رقمي.
CNOT1 (D5M1K) الأجسام المضادة أحادية النسيلة للأرنبتقنية الإشارة الخلوية#44613يستخدم عند تخفيف بنسبة 1:2,000.
DDX6/RCK (D26C11) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة للأرنبتقنية الإشارة الخلوية#8988يستخدم عند تخفيف بنسبة 1:5,000.
متجر E-Z ومطور الصبتصوير MXR103633ليس ضروريا إذا كنت تستخدم نظام تصوير رقمي.
متجر E-Z ومثبت الصبتصوير MXR114511ليس ضروريا إذا كنت تستخدم نظام تصوير رقمي.
الجسم المضاد وحيد النسيلة GAPDHبروتين تك60004-1-Igيستخدم عند تخفيف 1:40,000.
محرر جلبيو-راد#1653320
الجسم المضاد الثانوي المضاد للفأر IgG (H+L) للماعز، HRPإنفيتروجينA16066تم تحضيره حسب التعليمات واستخدامه عند تخفيف 1:40,000.
كيس ثلج، 8 أونصات، 5 × 3 × 1"يولينS-18256
إل-سيستينسيغما-ألدرتشC7352
معالج الأفلام الطبيةكونيكا مينولتاSRX-101Aليس ضروريا إذا كنت تستخدم نظام تصوير رقمي.
ميني-بروتين  ذراع فتح الكاسيتبيو-راد#4560000
ميني-بروتين  خلية الرحلان الكهربائي الرأسية تترابيو-راد#1658004
خزان الرحلان الكهربائي MSE PRO 700 مل من نوع Western Blotإم إس إي بليزاتBB2369
غشاء النيتروسليلوز، 0.45 وميكرو؛ mبيو-راد#1620115
الحليب الجاف خالي الدسمسانالاك1570000180
بيروكسيداز أفيني بيور ماعز مضاد للفئران IgG (H+L)جاكسون إيمينوسيرسيرش112-035-003تم تحضيره حسب التعليمات واستخدامه عند تخفيف 1:100,000.
بوليسوربات (التوين) 20كواشف فيشر الحيويةBP337-500
بونسو إسعلوم الحياة في VWRK793-500MLيمكن إجراء تقريب باستخدام 0.5٪ بونسو S، و1٪ حمض الأسيتيك
مزود الطاقة الأساسي لباور باكبيو-راد1645050
جهاز هزاز PR1MA ثنائي الأبعاد بالسرعة المتغيرةميدسيكيR2D-30
سلم معايير الألوان المزدوجة من بروتين بريسيجن بلسبيو-راد#1610374يمكن استخدام أي سلم بروتين مفضل.
ورق فلتر كروماتوغرافيا السليلوز النقي، 0.35 ممفيشر ساينتيفك05-714-4
استعادة مخزن إزالة البقعة الغربيةثيرموفيشر ساينتيفيك#21059
كلوريد الصوديومفيشر كيميكالS640-10
صندوق التخزين 300 ملروستي ميبالRST46608لحجب غشاء النيتروسيلولوز، حضانة الأجسام المضادة، والغسولات
ركيزة سوبرسيجنال ويست فيمتو ذات الحساسية القصوىثيرموفيشر ساينتيفيك#34094ركيزة كيميائية مضيئة معززة (ECL) تحتوي على مكونين: لومينول ومحسن. هذا الكاشف ECL له حساسية منخفضة للفيمتوغرام.
ركيزة كيميائية مضيئة من SuperSignal West Pico PLUSثيرموفيشر ساينتيفيك#34580ركيزة كيميائية مضيئة معززة (ECL) تحتوي على مكونين: لومينول ومحسن. هذا الكاشف ECL له حساسية بيكوغرام إلى الفيمتوغرام.
SurePAGE، Bis-Tris، 10 x 8، 4&ndash؛ 12٪، 10 جل بولي أكريلاميد بئرGenScriptM00652
مسحوق العزل الناقلGenScriptM00652
تريس بيس ألترا بيوريو إس بيولوجيولوجي77-86-1
مسحوق المخزن الكهربائي Tris-MOPS-SDSGenScriptM00138

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gurdon, J. B., Wickens, M. P. The use of Xenopus oocytes for the expression of cloned genes. Methods Enzymol. 101, 370-386 (1983).
  2. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Microinjection of Xenopus embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), (2010).
  3. Coller, J., Wickens, M. Tethered function assays: an adaptable approach to study RNA regulatory proteins. Methods Enzymol. 429, 299-321 (2007).
  4. Minshall, N., Allison, R., Marnef, A., Wilczynska, A., Standart, N. Translational control assessed using the tethered function assay in Xenopus oocytes. Methods. 51 (1), 165-169 (2010).
  5. Zhang, Y., Cooke, A., Park, S., Dewey, C. N., Wickens, M., Sheets, M. D. Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs. RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).
  6. Waghray, S., Williams, C., Coon, J. J., Wickens, M. Xenopus CAF1 requires NOT1-mediated interaction with 4E-T to repress translation in vivo. RNA. 21 (7), 1335-1345 (2015).
  7. Neff, A. W., Wakahara, M., Jurand, A., Malacinski, G. M. Experimental analyses of cytoplasmic rearrangements which follow fertilization and accompany symmetrization of inverted Xenopus eggs. Development. 80 (1), 197-224 (1984).
  8. Newman, K., Aguero, T., King, M. L. Isolation of Xenopus oocytes. Cold Spring Harb Protoc. 2018 (2), (2018).
  9. Shaidani, N. -I., McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Obtaining Xenopus laevis eggs. Cold Spring Harb Protoc. 2021 (3), (2021).
  10. Shaidani, N. -I., McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Obtaining Xenopus laevis embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2021 (3), (2021).
  11. Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs. Development. 77 (1), 15-37 (1983).
  12. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Dejellying Xenopus laevis embryos. CSH Protoc. 2007, (2007).
  13. Zahn, N., et al. Normal table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), dev200356(2022).
  14. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
  15. Kojima, M. L., Hoppe, C., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition: reprogramming of the cytoplasm and nucleus. Nat Rev Genet. 26 (4), 245-267 (2025).
  16. Park, S., Blaser, S., Marchal, M. A., Houston, D. W., Sheets, M. D. A gradient of maternal Bicaudal-C controls vertebrate embryogenesis via translational repression of mRNAs encoding cell fate regulators. Development. 143 (5), 864-871 (2016).
  17. Bull, A. L. Bicaudal, a genetic factor which affects the polarity of the embryo in Drosophila melanogaster. J Exp Zool. 161 (2), 221-241 (1966).
  18. Mohler, J., Wieschaus, E. F. Dominant maternal-effect mutations of Drosophila melanogaster causing the production of double-abdomen embryos. Genetics. 112 (4), 803-822 (1986).
  19. Maisonneuve, C., et al. Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow. Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).
  20. Minegishi, K., et al. Fluid flow-induced left-right asymmetric decay of Dand5 mRNA in the mouse embryo requires a Bicc1-Ccr4 RNA degradation complex. Nat Commun. 12 (1), 4071(2021).
  21. Maerker, M., et al. Bicc1 and Dicer regulate left-right patterning through post-transcriptional control of the Nodal inhibitor Dand5. Nat Commun. 12 (1), 5482(2021).
  22. Piazzon, N., Maisonneuve, C., Guilleret, I., Rotman, S., Constam, D. B. Bicc1 links the regulation of cAMP signaling in polycystic kidneys to microRNA-induced gene silencing. J Mol Cell Biol. 4 (6), 398-408 (2012).
  23. Kraus, M. R. -C., et al. Two mutations in human BICC1 resulting in Wnt pathway hyperactivity associated with cystic renal dysplasia. Hum Mutat. 33 (1), 86-90 (2012).
  24. Tran, U., et al. The RNA-binding protein Bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity. Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).
  25. Bouvrette, D. J., Sittaramane, V., Heidel, J. R., Chandrasekhar, A., Bryda, E. C. Knockdown of Bicaudal C in zebrafish (Danio rerio) causes cystic kidneys: a nonmammalian model of polycystic kidney disease. Comp Med. 60 (2), 96-106 (2010).
  26. Mahone, M., Saffman, E. E., Lasko, P. F. Localized Bicaudal-C RNA encodes a protein containing a KH domain, the RNA binding motif of FMR1. EMBO J. 14 (9), 2043-2055 (1995).
  27. Dowdle, M. E., Park, S., Blaser Imboden, S., Fox, C. A., Houston, D. W., Sheets, M. D. A single KH domain in Bicaudal-C links mRNA binding and translational repression functions to maternal development. Development. 146 (10), dev172486(2019).
  28. Saffman, E. E., Styhler, S., Rother, K., Li, W., Richard, S., Lasko, P. Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein Bicaudal-C. Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).
  29. Chalabi Hagkarim, N., Grand, R. J. The regulatory properties of the Ccr4-Not complex. Cells. 9 (11), E2379(2020).
  30. Chicoine, J., Benoit, P., Gamberi, C., Paliouras, M., Simonelig, M., Lasko, P. Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression. Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).
  31. Kugler, J. -M., Chicoine, J., Lasko, P. Bicaudal-C associates with a Trailer Hitch/Me31B complex and is required for efficient Gurken secretion. Dev Biol. 328 (1), 160-172 (2009).
  32. Kamenska, A., et al. The DDX6-4E-T interaction mediates translational repression and P-body assembly. Nucleic Acids Res. 44 (13), 6318-6334 (2016).
  33. Ladomery, M., Wade, E., Sommerville, J. Xp54, the Xenopus homologue of human RNA helicase p54, is an integral component of stored mRNP particles in oocytes. Nucleic Acids Res. 25 (5), 965-973 (1997).
  34. Wühr, M., et al. Deep proteomics of the Xenopus laevis egg using an mRNA-derived reference database. Curr Biol. 24 (13), 1467-1475 (2014).
  35. Kurien, B. T., Dorri, Y., Dillon, S., Dsouza, A., Scofield, R. H. An overview of western blotting for determining antibody specificities for immunohistochemistry. Methods Mol Biol. 717, 55-67 (2011).
  36. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Western blotting: an introduction. Methods Mol Biol. 1312, 17-30 (2015).
  37. Fisher, M., et al. Xenbase: key features and resources of the Xenopus model organism knowledgebase. Genetics. 224 (1), iyad018(2023).
  38. Baker, M. Antibody anarchy: a call to order. Nature. 527 (7579), 545-551 (2015).
  39. Baker, M. Reproducibility crisis: blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
  40. Martin, S. A., Page, S. J., Piccinni, M. Z., Guille, M. J. Confirming antibody specificity in Xenopus. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (12), (2020).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Xenopus SDS

مقالات ذات صلة