التحليل الأمثل للبروتينات من بويضات Xenopus والأجنة عن طريق التنشيف المناعي

يتطلب فهم الآليات الخلوية مراقبة أنواع معينة من البروتين. تشمل الاستفسارات الشائعة كيف تتغير في التعبير مكانيا وزمانيا ، وما هي البروتينات التي تتفاعل معها ، وما إذا كانت معدلة استجابة لظروف مختلفة. النشاف المناعي ، المعروف بالعامية باسم "النشاف الغربي" ، هو منهجية رئيسية لمواجهة هذه التحديات. تفصل تجربة اللطخة المناعية البروتينات عن عينة معقدة - على سبيل المثال ، محللة الخلية الكاملة - وتحددها باستخدام الأجسام المضادة. على وجه التحديد ، يتم تغيير طبيعة البروتينات ثم فصلها عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل الصوديوم - بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) حسب الحجم. يتم نقل البروتينات المجزأة بحجم إلى دعامة صلبة ، مثل غشاء النيتروسليلوز ، ويتم تحديد البروتين محل الاهتمام باستخدام كواشف الأجسام المضادة. أصبح التنشيف المناعي جزءا قياسيا من مجموعة أدوات عالم الأحياء الجزيئية. يستخدم بشكل شائع لمراقبة تعبير البروتين في سياقات مختلفة أو كنقطة نهاية لتجارب مثل فحوصات الترسيب المناعي. على الرغم من هذه المزايا ، فإن تحليل مستويات بروتين الحالة المستقرة مع التنشيف المناعي يمثل تحديا ، حيث يجب تحسين الاختبار لكل خطوة وسياق تجريبي (الشكل 1).

أحد السياقات الصعبة هو تحليل المواد من الضفدع الأفريقي المخالب Xenopus laevis. X. laevis هو كائن حي مهم لدراسة تفاعلات بروتين الحمض النووي الريبي. يتمتع هذا النظام بالعديد من المزايا ، أهمها أن X. laevis تنتج مئات البويضات وبالتالي تتطور الأجنة بشكل متزامن في وقت واحد. تحتوي كل بويضة على ~ 25 ميكروغرام من البروتين غير الصفار¹ ، مما يوفر مادة وفيرة للتجارب الكيميائية الحيوية. الحجم الكبير (~ 1250 ميكرومتر) ¹ من البويضات والأجنة يسهل أيضا الحقن المجهري للحمض النووي الريبوزي المرسال للتعبير عن البروتينات الموسومة أو المتحولة خارجيا على المقياس². تمكن هذه الصفات من إجراء تجارب قوية لفحص التحكم الانتقالي في X. laevis ، مثل مقايسة الوظيفة المربوطة ، حيث يمكن فحص تأثير البروتين التنظيمي الانتقالي على mRNA بغض النظر عن قدرة هذا البروتين على ربط الحمض النووي الريبي^3،4،5،6. ومع ذلك ، فإن التنشيف المناعي في بويضات Xenopus والأجنة يأتي مع صعوبات ، بما في ذلك التداخل من كتل كبيرة من الصفائح الدموية الصفار في هذه الخلايا^{المبكرة 7} ، والتي ستحجب النتائج إذا لم تتم إزالتها.

هنا ، نقدم بروتوكولا محسنا للنشاف المناعي الفعال في X. laevis، مع التركيز على اكتشاف البروتينات التنظيمية الانتقالية. نحن نقدم تعليمات حول كيفية جمع ومعالجة البويضات والأجنة لتصوير اللطخة المناعية النهائية. كما يتم تضمين تعليمات مفصلة لتحميل البروتين وتصويره على النحو الأمثل ، بالإضافة إلى منع تلوث صفار العينة. بالإضافة إلى ذلك ، نناقش تعديلات البروتوكول والاستراتيجيات المحتملة للعثور على الأجسام المضادة المتوافقة مع بروتينات Xenopus . نعتزم تزويد المحققين بالإرشادات لإجراء التنشيف المناعي دون عناء كجزء من تجاربهم الخاصة في هذا الكائن الحي النموذجي غير المستغل.

الشكل 1: سير العمل لإعداد عينة Xenopus وتحليل اللطخة المناعية اللاحقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

جميع الأعمال مع (X. laevis) الممثلة في هذا البروتوكول متوافقة مع لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في جامعة واشنطن ماديسون تمت الموافقة عليها من قبلها. يتم سرد تفاصيل المعدات والكواشف المستخدمة وتركيزات الأجسام المضادة المستخدمة في جدول المواد. يمكن الاطلاع على مجموعة مختارة من المعدات في الشكل 2 أدناه.

الشكل 2: مستخلص الجنين المعالج ومعدات السحب المناعي. (أ) مستخلص بويضة X . laevis بالطرد المركزي المرحلة السادسة. ترتفع الدهون والبروتينات القابلة للذوبان في الدهون إلى الأعلى بينما يشكل الفيتيلوجينين (صفار البيض) والحطام المصطبغ حبيبات. (ب) معدات SDS-PAGE لفصل البروتينات حسب الوزن الجزيئي. (ط) مزود الطاقة ، (ثانيا) خزان الرحلان الكهربائي العمودي ، (ثالثا) غطاء خزان الرحلان الكهربائي ، (4) مجموعة القطب الكهربائي ، (5) السد العازلة ، (6) جل الرحلان الكهربائي مسبقة الصب ؛ لاحظ المشط الأخضر (الأعلى) والملصق الأزرق (الأسفل) ، ويجب إزالة كل منهما. (ج) معدات نقل الغشاء. يتم إعادة استخدام خزان الرحلان الكهربائي الرأسي والغطاء للنقل بعد الشطف الشامل. (ط) الأسطوانة لإزالة الفقاعات ، (2) مشبك النقل ، (3) قضيب تحريك صغير ، (4) غشاء النيتروسليلوز بين ورقتين زرقاء واقية من الورق ، (5) ورق ترشيح كروماتوغرافيا السليلوز ، (6) وسائد إسفنجية نقل ، (7) طبق خبز زجاجي لتجميع النقل ، (8) عبوة ثلج ، (9) قلب النقل. (د) معدات أخرى. (ط) محرر الجل (لتقليم آبار الجل قبل النقل) ، (ثانيا) ذراع فتح كاسيت الجل ، (ثالثا) ملقط (لمناولة الغشاء) ، (رابعا) حاوية (لغشاء الإمساك) ، (خامسا) غطاء الحاوية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. مجموعة من بويضات Xenopus والأجنة

1. تحضير البويضات
   1. الحصول على بويضات X. laevis منزوعة الحبيبات من مورد تجاري (Ecocyte Bio Science ، أوستن ، تكساس) أو عزلها وإزالة الجريبات كما هو موضح⁸.
   2. البويضات المعزولة في محلول بارث المعدل (MBS ؛ 88 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي KCl ، 0.4 ملي كالسيوم₂ ، 0.33 ملي مولار كالسيوم (NO₃) ₂ ، 0.8 ملي مولار MgSO₄ ، 5 ملي مولار Tris-HCl ، 2.4 ملي هيدروكلوريد_{الصوديوم 3} ، الرقم الهيدروجيني 7.4) حتى الاستخدام.
2. تحضير الأجنة
   1. عزل X. laevis البيض وتخصيبه كما هو موضح^9،10.
   2. الأجنة المخصبة في محلول Marc Modified Ringer¹¹ (MMR) 0.25x (1x MMR: 0.1 M NaCl ، 2.0 mM KCl ، 1 mM MgSO₄ ، 2 mM CaCl₂ ، 5 mM HEPES).
   3. قم بإعداد محلول 2٪ سيستين في 0.1x MMR مع تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 8.2 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم.
   4. قم بإزالة 0.25x MMR من الطبق المستخدم في الإخصاب وقم بتغطية الأجنة بمحلول السيستين لإزالة طبقة الهلام¹². امزج المحلول برفق حتى تتعرض الأجنة بالتساوي.
   5. راقب الأجنة عن كثب باستخدام مجهر مجسم من 2x إلى 25x. بعد ذوبان طبقة الهلام (عادة 3-5 دقائق) ، سوف تتجمع الأجنة معا عن كثب. تجنب التعرض المطول للسيستين.
   6. قم بإزالة محلول السيستين وشطف الأجنة عدة مرات باستخدام 0.25x MMR.
   7. الاستزراع في 0.25x MMR حتى مرحلة النمو المطلوبة.
3. اجمع العدد المطلوب من الأجنة أو البويضات (موصى به بخمس على الأقل لكل عينة) في أنبوب 1.5 مل.
4. قم بإزالة الوسائط الزائدة باستخدام ماصة ، وتجنب إتلاف الخلايا.
5. استخدم العينات على الفور أو قم بتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. يمكن تخزين البويضات والأجنة لعدة سنوات.

2. تحضير مستخلص Xenopus

1. قم بإذابة العينات على الجليد إذا تم تجميدها.
2. أضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا المبرد 10x المخفف إلى 1x بماء منزوع الأيونات المزدوج (انظر جدول المواد) لكل جنين / بويضة وتجانس العينات باستخدام مدقة دقيقة على الجليد.
3. قم بتدوير العينات عند 5000 جم عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي على الطاولة لمدة 10 دقائق لبقايا الحبيبات ، بما في ذلك صفار البيض والأصباغ غير القابلة للذوبان.
4. قم بإزالة المادة الطافية إلى أنبوب منفصل سعة 1.5 مل ، مع الحرص على تجنب الحبيبات (الشكل 2 أ).
5. أضف حجما متساويا من 2x Laemmli عينة مؤقتة مكملة ب 5٪ w / v 2-mercaptoethanol إلى المادة الطافية واتركها تغلي لمدة 10 دقائق عند 95-100 درجة مئوية لتشويه بروتينات العينة.
6. استخدم العينات على الفور أو قم بتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية لأشهر إلى سنوات.

3. صفحة SDS

1. قم بإعداد المخزن المؤقت للتشغيل SDS: 1x مخزن مؤقت Tris-MOPS-SDS (6.06 جم من قاعدة Tris ، 10.46 جم من 3- (N-morpholino) حمض بروبانسلفونيك [MOPS] ، 1.0 جم من SDS ، 0.3 جم من حمض الإيثيلين ديامين رباعي الخليك [EDTA] ، ماء منزوع الأيونات المزدوج إلى 1000 مل).
2. قم بإزالة جل مسبقة الصب 4-12٪ من العبوة. قم بإزالة الملصق الموجود أسفل الجل.
3. أدخل الجل في مجموعة القطب الكهربائي مقابل سد عازل. ضع مجموعة القطب الكهربائي في خزان الرحلان الكهربائي الرأسي (الشكل 2 ب).
4. املأ مجموعة القطب الكهربائي والجزء السفلي من خزان الرحلان الكهربائي بمخزن مؤقت تشغيل 1x Tris-MOPS-SDS.
5. قم بإزالة مشط الجل برفق من المخزن المؤقت للهلام والماصة في الآبار لإزالة الفقاعات وتوازن المخزن المؤقت.
6. قم بتحميل 5 ميكرولتر من معايير البروتين الملطخ مسبقا في البئر الأول بعناية و 10 ميكرولتر من كل عينة في الآبار الإضافية.
7. (اختياري) قم بتحميل الآبار المتبقية ب 10 ميكرولتر من 1x Laemmli عينة مؤقتة لجعل الجل يعمل بشكل متساو.
8. ضع الغطاء على خزان الرحلان الكهربائي وقم بتوصيله بمصدر طاقة. تطبيق 200 فولت.
9. أوقف الرحلان الكهربائي عندما تخرج مقدمة صبغة العازلة العينية من الجل.

4. النقل الرطب للبروتينات على الغشاء

1. أثناء الرحلاب الكهربائي للعينات ، قم بإعداد 1 لتر من المخزن المؤقت للنقل (3.0 جم من قاعدة تريس ، 4.08 جم من البيسين ، 900 مل من الماء منزوع الأيونات المزدوج ، 100 مل من الميثانول). قم بتبريد المخزن المؤقت للنقل مسبقا عند 4 درجات مئوية.
   تنبيه: تعامل مع مخزون الميثانول المركز في غطاء الدخان وتجنب ملامسة الجلد. يمكن استبدال الميثانول بالإيثانول.
2. قبل اكتمال الرحلان الكهربائي ، ابدأ في تجميع "شطيرة" النقل في مشبك النقل (الشكل 2 ج).
   1. املأ طبق خبز زجاجي بمخزن مؤقت للنقل المبرد. في خطوات تجميع الساندويتش اللاحقة ، تأكد من غمر المواد في هذا المخزن المؤقت.
   2. ضع مشبك النقل في الطبق مع وضع النصف الأسود على قاع الطبق ، والنصف الأبيض مفتوحا وموجه لأعلى ، ومشبك النقل مفتوحا إلى اليسار.
   3. ضع إسفنجة أو اثنتين من الألياف بشكل مسطح على النصف الأسود من مشبك النقل.
   4. قم بقص ورقتين كروماتوغرافيا السليلوز 0.35 مم (أوراق الترشيح) حسب الحجم وضع واحدة فوق الإسفنج.
3. بعد اكتمال الرحلان الكهربائي ، قم بإزالة الجل من خزان الرحلان الكهربائي.
4. قم بفصل ألواح الجل بعناية باستخدام ذراع فتح كاسيت الجل ، مما يضمن بقاء الجل متصلا بإحدى الألواح (الشكل 2 د). تقليم الآبار من أعلى الجل باستخدام محرر الجل.
5. ضع الجل ، الذي لا يزال متصلا بنصف الكاسيت البلاستيكي ، على ورق الترشيح. قم بإزالة نصف الكاسيت حتى يبقى الجل على ورق الترشيح.
6. قطع مربع غشاء النيتروسليلوز 0.45 ميكرومتر ليناسب أبعاد الجل. قم بإزالة الغشاء من الورق الواقي ، وبلله لفترة وجيزة في مخزن مؤقت للنقل ، وضعه على الجل.
   ملاحظة: تعامل مع الغشاء بعناية من الزوايا بالقفازات أو الملقط لتجنب تلوث الغشاء بالبروتين غير المرغوب فيه.
7. ضع ورق ترشيح ثان فوق غشاء النيتروسليلوز. قم بإزالة أي فقاعات برفق ولكن بقوة باستخدام بكرة أعلى ورق الترشيح.
8. قم بتكديس إسفنجة أو إسفنجتين من الألياف فوق ورق الترشيح.
9. أغلق كاسيت النقل وأغلقه بإحكام ، لإكمال "الساندويتش".
10. أدخل شطيرة النقل في قلب النقل بحيث يكون مشبك النقل متجها لأعلى والجانب الأسود من مشبك النقل مواجها للجانب الأسود من القلب.
11. ضع قلب النقل في خزان الرحلان الكهربائي. أضف كيس ثلج وقضيب تقليب إلى الخزان حتى يدور قضيب التحريك بحرية.
    ملاحظة: بالإضافة إلى كيس الثلج أو بدلا منه ، يمكن إجراء النقل في غرفة باردة عند 4 درجات مئوية في الخطوة 4.13.
12. املأ الخزان بمخزن مؤقت للنقل المبرد. ثبتي الغطاء بإحكام في الأعلى.
13. قم بتوصيل جهاز النقل بمصدر الطاقة ، مع التأكد من محاذاة ألوان القطب. قم بتشغيل النقل لمدة 1 ساعة ، 100 فولت ، عند 4 درجات مئوية ، مع تدوير قضيب التحريك.

5. معالجة غشاء ما بعد النقل

1. تحضير 10x محلول ملحي Tris-Buffered (100 ملي مولار قاعدة تريس ؛ 1.5 مليون كلوريد الصوديوم). اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8 وقم بتعقيم الفلتر.
2. قم بإعداد 1x محلول ملحي Tris-Buffered مع Tween-20 (TBSTw) عن طريق تخفيف محلول 10x TBS 1:10 في 500 مل من الماء منزوع الأيونات المزدوج وإضافة 500 ميكرولتر من Tween-20.
3. تحضير المخزن المؤقت (500 مل TBSTw ، 25 جم من مسحوق الحليب الخالي من الدسم).
   ملاحظة: يمكن استبدال الحليب الخالي من الدسم ب 2-5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) في المخزن المؤقت المانع. يجب استخدام BSA إذا كان التطبيق التجريبي يتضمن تصور البروتينات البيوتينيل ، حيث يحتوي الحليب على البيوتين.
4. بمجرد اكتمال النقل ، قم بإزالة الساندويتش وتفكيكه بعناية وإزالة غشاء النيتروسليلوز. حدد أي جانب من الغشاء كان يلامس الجل ، وحافظ على هذا الجانب متجها لأعلى في الخطوات اللاحقة.
5. قم بإعداد 50 مل من صبغة Ponceau (0.5٪ Ponceau S ، 1٪ حمض الخليك) ، وهي صبغة قابلة للعكس لتصور البروتين.
   تحذير: بقعة بونسو أكالة. تجنب ملامسة الجلد.
6. ضع الغشاء في وعاء صغير (كما هو موضح في الشكل 2D) بحيث يكون متدفقا على قاع الحاوية. قم بتغطية الغشاء بصبغة Ponceau للغمر والصخور برفق على الروك لمدة 5-10 دقائق.
7. اسكب بقعة بونسو.
   ملاحظة: يمكن إعادة استخدام بقعة بونسو عدة مرات.
8. اشطف الغشاء بغسلات متكررة من الماء منزوع الأيونات المزدوج حتى تتم إزالة بونسو الزائد وتبدأ أشرطة البروتين في الممرات في الحل.
9. تأكد من كفاءة النقل من خلال وجود ممرات مستقيمة ومتساوية ذات نطاقات تم حلها بوضوح.
10. اسكب أي سائل متبقي واغمس اللطخة في المخزن المؤقت لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة بالغشاء في خطوات مجرى النهر.
11. صخر برفق على الروك لمدة 30-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

6. حضانة الأجسام المضادة

1. قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي في 10 مل من المخزن المؤقت الحجب الطازج إلى التركيز المطلوب.
   ملاحظة: يجب تحديد التركيز الأمثل تجريبيا لكل جسم مضاد جديد. نقطة البداية النموذجية هي 1: 1000 ، أو اتبع توصيات الشركة المصنعة.
2. قم بإزالة المخزن المؤقت الحاجب واستبدله بخليط الأجسام المضادة. احتضان ، هزاز برفق ، طوال الليل (~ 16 ساعة) عند 4 درجات مئوية.
3. اسكب محلول الجسم المضاد الأساسي واشطف الغشاء باستخدام TBSTw عن طريق غمره في المحلول وصبه بسرعة.
   ملاحظة: يمكن حفظ معظم مخاليط الأجسام المضادة وإعادة استخدامها مرتين إلى ثلاث مرات. يجب تحديد ذلك تجريبيا لكل جسم مضاد.
4. اغسل الغشاء عن طريق غمره في TBSTw وهززه برفق في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. قم بإجراء ثلاث عمليات غسيل لمدة 5 دقائق.
5. تمييع الجسم المضاد الثانوي في 30 مل من TBSTw إلى التركيز المطلوب.
   ملاحظة: يجب تحديد التركيز تجريبيا لكل جسم مضاد. عادة ما نستخدم 1: 30,000.
6. اسكب محلول الغسيل TBSTw واستبدله بخليط الأجسام المضادة الثانوي. احتضان ، هزاز برفق ، لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
7. اشطف الغشاء بسرعة مرة واحدة باستخدام TBSTw متبوعا بثلاث غسلات لمدة 5 دقائق.

7. تصوير الغشاء على مطور فيلم

1. في غرفة مظلمة ، قم بتشغيل مطور الفيلم واسمح له بالإحماء.
2. قطع مربعين من غلاف بلاستيكي كبير بما يكفي ليشمل الغشاء. باستخدام الملقط ، ضع غشاء النيتروسليلوز "وجهه لأعلى" على المربع الأول من الغلاف البلاستيكي.
3. في أنبوب سعة 1.5 مل ، امزج كميات متساوية من كواشف Luminol و Enhancer المحسنة للتلطؤ الكيميائي (ECL). يجب أن يغطي استخدام 1 مل من المحلول المختلط معظم الأغشية.
4. قم بلصق كاشف ECL على الغشاء وقم بمعالجة الغشاء برفق باستخدام الغلاف البلاستيكي لضمان التغطية الكاملة. احتضان لمدة 1 دقيقة.
5. قم بإزالة كاشف ECL الزائد عن طريق الإمساك بالغشاء بالملقط والتخلص من السائل برفق أو فتل السائل عن طريق لمس زاوية الغشاء بمنشفة ورقية.
6. ضع الغشاء ووجهه لأعلى على المربع الثاني من الغلاف البلاستيكي وقم بطي الغلاف البلاستيكي فوق الغشاء حتى يتم إغلاقه بشكل غير محكم. قم بلصق الغشاء الملفوف بإحكام في شريط التصوير الشعاعي الذاتي.
7. في الغرفة المظلمة ، ضع فيلما داخل الكاسيت ، ويغطي الغشاء المسجل. أغلق الكاسيت بإحكام وقم بتعريض الفيلم للغشاء لمدة 1 دقيقة.
8. قم بإزالة الفيلم بعناية ، مع الحرص على عدم سحب الفيلم المكشوف على طول الغشاء. قم بإطعامه في مطور الفيلم.
9. عند تقييم الفيلم المطور ، اضبط وقت التعرض مع الأفلام اللاحقة حتى يتم تحقيق تصور البروتين المطلوب. إذا كان تصور البروتين يوفر إشارة ضعيفة ، كرر خطوة حضانة كاشف ECL باستخدام كاشف ECL أكثر حساسية وإعادة الصورة.
10. قم بمحاذاة الفيلم المطور مع علامات التوهج في الظلام واستخدم هذا المرجع لتحديد موضع معايير البروتين الملطخة مسبقا على الغشاء على الفيلم.
11. بمجرد اكتمال التصوير ، قم بإزالة الغشاء بعناية من الغلاف البلاستيكي وغمره في TBSTw لغسل كاشف ECL المتبقي.

8. (اختياري) حضانات إضافية للأجسام المضادة

ملاحظة: يشير تجريد اللطخة المناعية إلى إزالة الأجسام المضادة الأولية والثانوية بمحلول تغيير طبيعة (المخزن المؤقت للتجريد) بحيث يمكن إعادة فحص اللطخة بجسم مضاد مختلف. تسمح إعادة الفحص بتحليل نفس اللطخة المناعية للتعبير عن أهداف البروتين المختلفة ومقارنة البروتينات غير المعروفة بالبروتينات المميزة جيدا التي تعمل كمعايير. قم بالتحقيق باستخدام الجسم المضاد الذي ينتج الإشارة الأضعف نسبيا أولا. يمنع القيام بذلك القطع الأثرية الناتجة عن الأجسام المضادة المجردة بشكل غير كامل في التعرضات اللاحقة ويقلل من تأثير فقدان البروتين من التجريد المتكرر من اللطخة.

1. قم بتجريد الأجسام المضادة المرتبطة عن طريق غمر الغشاء في المخزن المؤقت للتجريد والتأرجح برفق لمدة 5-10 دقائق.
2. قم بإزالة الغشاء من المخزن المؤقت للتجريد واشطفه لفترة وجيزة في TBSTw لإزالة أي محلول تجريد متبقي.
3. اغمر الغشاء في المخزن المؤقت والصخور برفق لمدة 30 دقيقة.
4. اصنع محلولا جديدا للأجسام المضادة الأولية في حجب المخزن المؤقت بالتركيز المطلوب.
5. أضف تخفيف الجسم المضاد الأولي الجديد إلى الغشاء واحتضان التأرجح برفق طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
6. تابع من الخطوة 6.3 فصاعدا. يمكن تجريد الغشاء وإعادة فحصه حتى ثلاث مرات إضافية.

لإثبات كفاءة بروتوكول التنشيف المناعي الخاص بنا ، قمنا بتحليل بروتينات التحكم الانتقالية ذات العلامات التقاربية والداخلية في ثلاثة أنواع من X. عينات laevis : بويضات المرحلة السادسة ، وأجنة المرحلة 7 (الأريمة) ، وأجنة المرحلة 10.5 (المعدة). تم اختيار هذه المراحل لأنها تمتد على انتقال منتصف الأريمة (المرحلة 8.5) ، والتي تمثل بداية النسخ الزيجوتي القوي13،14. نظرا لأن التطور قبل انتقال منتصف الأريمة يحدث في غياب النسخ ، فإن الأجنة قبل الوجنحة (أي التي تتحكم فيها الأم) تعتمد بشكل كبير على آليات التحكم الانتقالية للتعبير عن بروتينات مصير الخلية بالدقة الزمنية والمكانيةالصحيحة 15. لذلك ، فإن انتقال منتصف الأريمة هو سياق حيوي لدراسة تفاعلات بروتين الحمض النووي الريبي.

لتحليل تعبير البروتين عن طريق الصبغة المناعية ، X . laevis تم حقن البويضات والأجنة ب 500 بيكوغرام من mRNA التي تشفر النصف الطرفي C من X. laevis Bicaudal-C (Bicc1) مدمجة في 3x علامات تقارب الهيماجلوتينين (HA). اخترنا تحليل Bicc1 نظرا لأهميته ببيولوجيا Xenopus وتفاعلات البروتين والحمض النووي الريبي. Bicc1 هو بروتين مرتبط بالحمض النووي الريبوزي المرسال ومثبط انتقالي يوجه قرارات مصير الخلية في الجنين المبكر16،17،18. في وقت لاحق من التطوير ، يؤثر على الزخرفة اليسرى واليمين19،20،21 ووظيفة الأعضاء ، بما في ذلك الكلى22،23،24،25. يحتوي Bicc1 على منطقة توجه مجالات التماثلالانتقالي 5 و hnRNP K (KH) التي تتوسط الارتباط ب mRNAs محددة5،26،27،28.

تم تحضير المستخلصات من خمس بويضات أو أجنة محقونة ب HA-Bicc1 ، جنبا إلى جنب مع العينات المقابلة غير المحقونة كضوابط سلبية. تم تحويل عشر كل مستخلص بالكهرباء على هلام ثنائي تريس متدرج بنسبة 4-12٪ وتم نقله رطبا إلى غشاء النيتروسليلوز. أكد تلطيخ بونسو للغشاء للكشف عن البروتين الكلي النقل الناجح (الشكل 3 أ). كجزء من دراساتنا ، قمنا بإنشاء جسم مضاد في الأرانب يتعرف على النصف الطرفي C من بروتين Bicc1 البشري. تم استخدام هذا الجسم المضاد للكشف عن بروتين Xl-Bicc1 الداخلي والخارجي (الشكل 3 ب). أظهر العمل السابق أن بروتين Bicc1 غائب عن X. بويضات laevis ، ولكن يتم التعبير عنه في أجنة ما قبل MBT ، قبل أن يكون الجينوم البيضي نشطا16. يشير هذا إلى أنه بينما يتراكم Bicc1 mRNA أثناء تكوين البويضات ، يتم قمعه بشكل متعد. بالاتفاق مع هذا العمل السابق ، لم يتم اكتشاف Bicc1 الداخلي في البويضات. في المقابل ، تعرف الجسم المضاد على Bicc1 الداخلي (~ MW 107 kDa) في كل من الأجنة 7 و 10.5. مجتمعة ، تؤكد هذه النتائج أن الجسم المضاد يتعرف على بروتين Bicc1 الداخلي (الشكل 3 ب ، اللوحة العلوية ، رأس السهم الأحمر). تعرف الجسم المضاد Bicc1 على بروتين أصغر يبلغ حوالي 70 كيلو دالتون في مقتطفات محضرة من عينات حقن mRNA (الشكل 3 ب ، اللوحة العلوية ، رأس السهم الأسود ، قارن الممرات 2 و 4 و 6 مع الممرات 1 و 3 و 5). كعنصر تحكم في خصوصية الجسم المضاد Bicc1 ، تم تجريد الغشاء وإعادة فحصه بجسم مضاد ضد علامة تقارب HA. حدد الجسم المضاد HA بروتين 70 كيلو دالتون في العينات المحقونة لكنه لم يتعرف على Bicc1 الداخلي (الشكل 3 ب ، اللوحة الثانية ، رأس السهم الأسود). يختلف اكتشاف مصطلح HA-Bicc1 C في شدته عبر المراحل بسبب الاختلافات في تعبير البروتين من mRNA المحقون في أنواع الخلايا المختلفة.

بعد ذلك ، قمنا بتوسيع النتائج من خلال اختبار التعبير عن البروتينات التنظيمية الانتقالية الداخلية التي تتفاعل مع Bicc1. أولا ، قمنا بتحليل التعبير عن الوحدة الفرعية 1 (Cnot1) ، وهو بروتين سقالة كبير وجزء من مركب Ccr4-Not deadenylase (CNOT). يعد مركب CNOT متعدد الوحدات الفرعية أحد الديتينيلز حقيقيات النواة الرئيسية وهو معروف في المقام الأول بتقليم ذيل بولي (أ) في نهاية مرنا المرسال كمقدمة لتدهورها. ومع ذلك ، فإن هذا المجمع له أدوار متنوعة في التحكم الانتقالي الذي يمتد إلى ما هو أبعد من deadenylation29. كنا مهتمين بفحص تعبير Cnot1 نظرا لأهمية مركب CNOT لتنظيم mRNA والملاحظات السابقة بأن Cnot1 يتفاعل مع Bicc120،30. لتحليل تعبير Cnot1 ، استخدمنا جسما مضادا يتعرف على بروتين Cnot1 الداخلي. حددت بروتينين عند 250 كيلو دالتون و 270 كيلو دالتون في كل عينة ، الحجم المتوقع ل Cnot1 (الشكل 3 ب ، اللوحة الثالثة). وبالتالي ، يسمح لنا هذا البروتوكول بتحديد مكون حاسم في المجمع التنظيمي بسهولة. بالإضافة إلى ذلك ، تدعم هذه البيانات قدرة البروتوكول على تحديد البروتينات عالية الوزن الجزيئي بنجاح.

لمزيد من الاختبار لتعميم هذه النتائج ، قمنا بعد ذلك بتحليل العينات لوجود هليكاز DEAD-box بارز متورط في القمع الانتقالي ، DEAD-box helicase 6 (Ddx6 ، المعروف سابقا باسم xp54 في Xenopus و me31b في ذبابة الفاكهة). Ddx6 هو عنصر مهم في حبيبات البروتين النووي الريبي ، ويشارك في تخزين mRNA ، ويتفاعل مع Bicc1 و Cnot16،31،32. حدد الجسم المضاد الذي يتعرف على Ddx6 الداخلي بروتينا يبلغ حوالي 54 كيلو دالتون في كل عينة (الشكل 3 ب ، اللوحة الرابعة). تم تقليل التعبير في الأجنة الوجنحة (الشكل 3 ب ، قارن بين الممرات 5 و 6 إلى 1-4) ، كما ورد سابقا33.

أخيرا ، للتأكد من أن الاختلافات التي لاحظناها بين العينات كانت بسبب الاختلافات في التعبير ، قمنا بتجريد اللطخة المناعية وإعادة فحصها بجسم مضاد يتعرف على إنزيم نازعة هيدروجين الجلسرين 3-فوسفات (Gapdh). يعمل Gapdh بمثابة "تحكم في التحميل" في كل مكان. تؤكد المستويات المكافئة لتعبير Gapdh تلطيخ Ponceau: يتم تحليل كمية متساوية من البروتين الكلي عبر العينات (الشكل 3 ب ، اللوحة الخامسة).

تؤكد هذه النتائج معا فعالية طريقة اللطخة المناعية هذه. تمكنا من تحديد Bicc1 الخارجية والذاتية عبر العديد من مراحل نمو X. laevis ذات الصلة بدراسة تفاعلات بروتين الحمض النووي الريبي: البويضات وأجنة ما قبل MBT ، والتي تحتوي فقط على mRNAs المودعة من قبل الأم ، وأجنة ما بعد MBT ، والتي تشمل أيضا mRNAs المنسوخة وزيجوت. تمكنا من تعميم هذه النتائج من خلال تحليل التعبير عن بروتينات التحكم الانتقالية المتعددة في مجموعة متنوعة من الأوزان الجزيئية (Bicc1 و Cnot1 و Ddx6) وعنصر تحكم التحميل (Gapdh). نوضح أيضا أنه يمكن استخدام هذا البروتوكول ل X. tropicalis الأجنة مع التعديل لزيادة كمية المواد المستخدمة لحساب حجمها الأصغر (الشكل التكميلي 1).

الشكل 3: تحديد مستويات البروتينات التنظيمية الانتقالية من خلال التنشيف المناعي في X. laevis. (أ) تلطيخ بونسو للطخة المناعية لتحديد البروتين الكلي من X. بويضات المرحلة السادسة ، وأجنة المرحلة 7 ، وأجنة المرحلة 10.5. يمثل كل حارة 10٪ من البروتين المحضر من مستخلص (0.5 بويضة أو جنين). (ب) تحليل اللطخة المناعية للبروتينات التنظيمية الانتقالية المختارة X. laevis في بويضات المرحلة السادسة ، وأجنة المرحلة 7 ، وأجنة المرحلة 10.5. تتوافق الممرات 2 و 4 و 6 مع العينات التي تم حقنها بميكروغر باستخدام HA-Bicc1 mRNA قبل التحليل ، بينما تعمل الممرات 1 و 3 و 5 كعناصر تحكم سلبية (غير محقنة). تم استخدام الجسم المضاد α-Bicc1 لفحص التعبير عن Bicc1 الداخلي عبر المراحل (اللوحة العلوية). تم تجريد اللطخة لاحقا وإعادة فحصها بجسم مضاد لعلامة تقارب HA كعنصر تحكم لخصوصية الأجسام المضادة α-Bicc1 (اللوحة الثانية). تم تجريد البقع وإعادة فحصها بحثا عن بروتينات تنظيمية إضافية باستخدام α-Cnot1 (اللوحة الثالثة) و α-Ddx6 (اللوحة الرابعة). α-Gapdh (اللوحة السفلية) بمثابة عنصر تحكم لتحميل البروتين المتساوي. تشير رؤوس الأسهم الحمراء إلى موقع Bicc1 الداخلي ، بينما تشير رؤوس الأسهم السوداء إلى موقع مصطلح HA-Bicc1 C-term المعبر عنه خارجيا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: تحليل اللطخة المناعية لبروتين Bicc1 في Xenopus laevis مقابل Xenopus tropicalis. تم استخدام الجسم المضاد α-Bicc1 لفحص التعبير عن Bicc1 الداخلي والخارجي عبر كميات مختلفة من X. laevis و X. tropicalis مستخلص الجنين. الممر 1: 0.5 جنين X. laevis غير المحقون. حارة 2: 0.5 HA-Bicc1 حقن X. جنين laevis . حارة 3: 3 أجنة X. tropicalis غير المحقونة. حارة 4: 1 جنين X. tropicalis غير المحقون. حارة 5: 0.5 جنين X. tropicalis غير المحقون. تم استخدام جسمين مضادين يتعرفان على Bicc1 الداخلي: أحدهما مرفوع ضد الإنسان Bicc1 (اللوحة العلوية) والآخر مرفوع ضد X. laevis Bicc1 (اللوحة الوسطى). تم استخدام α-Gapdh (اللوحة السفلية) للتحكم في تحميل البروتين بشكل متساو. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.