مقالة منهجية

طريقة مبتكرة لعزل الجسيم الداخلي عن أنسجة قلب الفأر والثقافة المشتركة مع خلايا عضلة القلب

DOI:

10.3791/69146

⸱

أكتوبر 10, 2025

 ,  ,  , 
1Pharmacological and Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Houston

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجسيمات الداخلية عبارة عن مجموعة من عضيات الفرز داخل الخلايا وهي جزء من مسار نقل الغشاء الداخلي. أنشأنا طريقة جديدة لعزل الجسيمات الداخلية عن أنسجة القلب باستخدام معدات الترشيح النانوي الأوتوماتيكية وحققنا في امتصاص الخلايا للجسيمات الداخلية عن طريق مزرعتها مع خلايا عضلة القلب الأولية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجسيمات الداخلية عبارة عن عضيات مرتبطة بالغشاء تلعب أدوارا أساسية في الاتجار داخل الخلايا ، ونقل الإشارات ، وإعادة تدوير الغشاء. على الرغم من أن وظائفها في بيولوجيا القلب والأوعية الدموية تكتسب اعترافا ، إلا أن العزل الفعال للجسيمات الداخلية عن أنسجة القلب لا يزال يمثل تحديا تقنيا كبيرا. قمنا بتطوير بروتوكول سريع وعالي الإنتاجية لعزل الجسيمات الداخلية من أنسجة قلب الفأر من خلال الجمع بين التجزئة تحت الخلوية ومنصة عزل الترشيح النانوي فائقة السرعة. تتضمن هذه الطريقة الطرد المركزي المتسلسل ، والترشيح النانوي ، واسترجاع الحويصلات النانوية القائمة على الغشاء المسامي. تميزت الجسيمات الداخلية المعزولة بالنشاف الغربي ، وتشتت الضوء الديناميكي (DLS) ، وتحليل قياس التدفق الخلوي بالتدفق النانوي (NanoFCM). لتقييم النشاط الحيوي ، تم استزراع الجسيمات الداخلية المنقاة مع خلايا عضلة القلب الأولية لحديثي الولادة. تم إثراء العلامات الداخلية EEA1 و Rab7 بشكل كبير في الحويصلات المعزولة. كشف تحليل DLS عن متوسط قطر الحويصلة 187.30 ± 23.42 نانومتر وإمكانات زيتا تبلغ -26.60 ± 5.79 مللي فولت (ن = 12). أسفر القياس الكمي ل NanoFCM عن ما يقرب من 1.07 ± 0.31 × 1012 جسيما / مل (ن = 12) من 100 مجم من أنسجة القلب. لوحظ امتصاص وظيفي للجسيمات الداخلية بواسطة خلايا عضلة القلب بعد الزراعة المشتركة في المختبر ، مما يشير إلى الحفاظ على سلامة الحويصلة ونشاطها. توفر منصة العزل المتكاملة هذه طريقة قابلة للتكرار وفعالة لاستخراج الجسيمات الداخلية عالية النقاء من أنسجة القلب. يسهل البروتوكول الدراسات الكيميائية الحيوية والوظيفية النهائية ، مما يوفر أداة قيمة للتحقيق في أدوار الجسيمات الداخلية في فسيولوجيا القلب والأوعية الدموية والأمراض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجسيمات الداخلية هي عضيات أساسية داخل الخلايا تنظم الالتقام الخلوي وفرز البضائع ومسارات الإشارات1،2. يتم فرز مستقبلات الإشارات المنشطة والبروتينات الأخرى التي تم تنظيمها بشكل منخفض في البداية إلى حويصلات داخل التجويف (ILVs) داخل الجسيمات الداخلية المبكرة (EEs) ، والتي تنضج بعد ذلك إلى أجسام متعددة الحويصلات (MVBs) أو حويصلات حاملة داخلية (ECVs). تندمج هذه الحويصلات لاحقا مع الجسيمات الداخلية المتأخرة (LEs) ، والتي تعمل كمراكز فرز ثانوية لتوجيه البضائع نحو التحلل الليزوزومي أو المسارات البديلة. يمكن أيضا إفراز ILVs على شكل إكسوسومات بعد اندماج الجسيم الداخلي مع غشاء البلازما3،4 . في موازاة ذلك ، يقوم مسار الالتهام الذاتي بتوصيل مادة العصارة الخلوية إلى LEs عبر البلعمة الذاتية ، والتي تكتسب قدرة تحللية عند الاندماج مع المقصورات الداخلية المتأخرة5. يتم التعرف على الجسيمات الداخلية الآن على أنها منظمات مهمة لإعادة تدوير المستقبلات6 ، وتوطين القناة الأيونية7 ، والتكوين الحيوي للجسيم الإكزوزومي8 ، وعمليات الاتصالبين الخلايا 9 ذات الصلة بشكل خاص بالخلايا المتخصصة مثل الخلايا العصبية وخلايا عضلة القلب.

سلطت الأدلة الناشئة الضوء على الدور المحوري للمسارات الداخلية في وظيفة القلب والأوعية الدموية. ينظم بروتين Eps15 Homoology Domain 3 (EHD3) إعادة تدوير الصبغات الداخلية لناقلات أيونات القلب الرئيسية ، بما في ذلك مبادل Na + / Ca2+ وقنوات Ca2+ من النوع L. يؤدي نقص EHD3 في الفئران إلى بطء القلب ، وتشوهات التوصيل ، وتغيير التعامل مع Ca2+ 10. يمنع الاتجار الوظيفي بالجسيم الداخلي في خلايا العضلات الملساء الوعائية التكلس الإنسي الناجم عن الفوسفات ، والذي يتعلق بأمراض الكلى المزمنة وتصلب الشرايين11. ومع ذلك ، فإن الأدوار الوظيفية للجسيمات الداخلية في أمراض القلب والأوعية الدموية وإمكاناتها كأهداف علاجية لا تزال غير مفهومة تماما ، مما يستدعي مزيدا من التحقيق.

مكنت الطرق المتعددة من العزل الكيميائي الحيوي للجسيمات الداخلية السليمة وظيفيا. قام مارش وزملاؤه أولا بدمج الطرد المركزي المتدرج في الكثافة مع الرحلان الكهربائي للتدفق الحر لاستعادة الجسيمات الداخلية المبكرة والمتأخرة ، والحفاظ على تسميضها وسلامتها الهيكلية12. تقدم المنهجيات الحديثة ، مثل نهج تدرج السكروز ، مسارا موحدا لفصل مجموعات الصبغات الداخلية المبكرة والمتأخرة ، وهو أمر ضروري للدراسات البروتينية والدهون في اتجاه مجرى النهر13. تم تطوير مجموعات تجارية قائمة على عمود الدوران للتطبيقات عالية الإنتاجية.

يستخدم عزل الإكسوسوم عبر نظام العزل الأوتوماتيكي فائق السرعة تقنية الترشيح النانوي بالموجات فوق الصوتية المبتكرة ، والتي تحتوي على نظام ترشيح نانوي ثنائي الغشاء مدمج مع تذبذب الضغط السلبي الدوري والتذبذبات التوافقية المزدوجة لتمكين عزل الإكسوسومات عالية النقاء من السوائل الحيوية14. هنا ، قمنا بدمج التجزئة تحت الخلوية مع عزل الجسيم الداخلي باستخدام نظام العزل الأوتوماتيكي فائق السرعة لتحقيق طريقة جديدة لعزل الجسيمات الداخلية السريع مع إنتاجية عالية ونقاء عالي من أنسجة قلب الفأر.

علاوة على ذلك ، قمنا بزراعة الجسيمات الداخلية المستخرجة مع خلايا عضلة القلب الأولية (CM) في المختبر ووجدنا أن الجسيمات الداخلية الخارجية دخلت CM بنجاح. باستخدام مراسل الجسيم الداخلي ، حيث تم دمج البروتين الموضعي في الجسيم الداخلي Numb مع بروتين الفلورسنت الأحمر mCherry15،16 ، لاحظنا تألق mCherry موضعيا داخل CMs بنمط نقطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع التجارب على وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة بشأن استخدام المختبر وبموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها في جامعة هيوستن.

ملاحظة: قبل البدء في إجراء العزل ، من الضروري التأكد من أن جميع المخازن المؤقتة المطلوبة قد تم تحضيرها حديثا وتبريدها إلى 4 درجات مئوية. يجب ترتيب الأدوات المعقمة وألواح زراعة الأنسجة والأنابيب المناسبة في محطات عمل معينة ، مع الحفاظ على جميع المواد على الجليد أو عند 4 درجات مئوية ما لم ينص على خلاف ذلك. يجب موازنة أجهزة الطرد المركزي والدوارات مسبقا إلى 4 درجات مئوية لمدة لا تقل عن 2-3 ساعات قبل الاستخدام. يجب تحضير المخزن المؤقت للتجزئة قبل يوم التجربة وتخزينه عند 4 درجات مئوية ، والاحتفاظ به على الجليد أثناء التجربة لحين الحاجة. ما لم يذكر خلاف ذلك ، يجب إجراء جميع خطوات الحضانة والطرد المركزي عند 4 درجات مئوية.

1. تحضير محللة القلب

  1. تطهير المنطقة الجراحية باستخدام 70٪ إيثانول ، متبوعا بوضع وسادة ماصة معقمة على سطح العمل ، حيث يتم ترتيب الأدوات الجراحية المعقمة.
  2. القتل الرحيم للفئران (C57BL / 6 ذكور ، 8-12 أسبوعا ، 20-25 جم ، و mCherry: ذكور NumbKI ، 8-12 أسبوعا ، 20-25 جم) عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون2 (10-30٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 3-5 دقائق) أو بطريقة بديلة معتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسي المعني.
    تنبيه: يرجى التشغيل في مكان مفتوح والتأكد من إغلاق أسطوانة ثاني أكسيد الكربون2 في الوقت المناسب لمنع التسرب. يجب مراقبة الفئران أثناء القتل الرحيم لتأكيد فقدان الوعي والإجراء المناسب. بمجرد فقدان الوعي ، استخدم طريقة ثانوية ، مثل خلع عنق الرحم أو بضع الصدر أو الاستبعاد ، لضمان الموت.
  3. ضع الماوس في وضع ضعيف ونظف منطقة الصدر بنسبة 70٪ إيثانول.
    1. افتح التجويف الصدري بسرعة لحصاد القلب ، وانقل القلب إلى محلول الملح المتوازن من هانك المثلج (HBSS) في طبق 60 مم يوضع على الثلج.
    2. قم بإزالة الدم المتبقي برفق من غرف القلب باستخدام الملقط واغسل القلب جيدا حتى لا يبقى المزيد من الدم في الغرف. حافظ على القلب على الجليد طوال فترة المعالجة.
      ملاحظة: احتفظ ب 50-100 مجم من أنسجة القلب لتحليل اللطخة الغربية (WB) كعنصر تحكم إيجابي. يمكن تجميد القلب في النيتروجين السائل وتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  4. أضف 8 مل من عازلة التجزئة (الجدول 1) إلى أنبوب 50 مل على الثلج. انقل 100-120 مجم من أنسجة قلب الفأر الطازجة أو المجمدة إلى أنبوب يحتوي على المخزن المؤقت للتجزئة.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي جزء من أنسجة قلب الفأر لاستخراج الجسيمات الداخلية. مطلوب ما لا يقل عن 100 مجم من أنسجة القلب لإنتاج جسيمات داخلية كافية للتحليلات اللاحقة. لضمان الاتساق عبر المجموعات التجريبية ، يجب وزن الأنسجة بدقة قبل الإضافة إلى المخزن المؤقت للتجزئة.
    تنبيه: ارتد معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند تشغيل المخزن المؤقت للتجزئة لتجنب أي اتصال مباشر بالجسم.
  5. افرم الأنسجة إلى حوالي 1 مم3 قطع باستخدام مقص الجراحة المجهرية في مخزن تجزئة على الثلج طوال الوقت.
  6. قم بالتجانس باستخدام الخالط الكهربائي بسرعة متوسطة ، في دورة توقف لمدة 40 ثانية لمدة 30 ثانية. التجانس لمدة 5-7 دورات (الشكل 1 أ).
    ملاحظة: تعد عملية التجانس الشاملة ضرورية وستساعد على زيادة التركيز النهائي للإندوسومات.
  7. صوتنيك محللة القلب المتجانسة لمدة 10 دقائق في حمام الماء المثلج مع حمام بالموجات فوق الصوتية (الشكل 1 أ).

2. التجزئة تحت الخلوية

  1. ضع مصفاة خلية 40 ميكرومتر فوق أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل وقم بتصفية محللة القلب المتجانسة من خلال المصفاة (الشكل 1 أ).
  2. للحبيبات النووية: جهاز طرد مركزي للقلب محللة عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الطافية وضعها في أنبوب جديد مكتوب عليها.
    ملاحظة: اجمع الحبيبات ، وهي الجزء النووي ، وأعد تعليق الحبيبات النووية في 200 ميكرولتر WB Lysis Bufferإذا كان الجزء النووي مطلوبا ل WB. قم بماصة الحبيبات النووية برفق باستخدام مقايسة الترسيب المناعي الراديوي (RIPA) لأعلى ولأسفل 20 مرة وصوتن لمدة 10 دقائق. قم بالطرد المركزي للمحللة النووية عند 14,000 × جم لمدة 10 دقائق. اجمع المادة الطافية واحفظها في درجة حرارة -80 درجة مئوية لاستخدامها مرة أخرى. الخطوة 2.2 اختيارية. يمكن تخطيها إذا كانت الحويصلات مطلوبة فقط.
  3. بالنسبة لكسر الميتوكوندريا: قم بالطرد المركزي للمادة الطافية مرة أخرى عند 10,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تحتوي الحبيبات على جزء الميتوكوندريا. انقل المادة الطافية وضعها في أنبوب طرد مركزي جديد.
    ملاحظة: إذا كان جزء الميتوكوندريا مطلوبا ل WB, احفظ الحبيبات كخطوة 2.2 كما هو موضح في الملاحظة السابقة.
  4. موازنة الأنابيب بعناية. قم بوزن كل أنبوب وأضف عازلة تجزئة باردة إضافية إلى الأنبوب الأخف وزنا لضمان وزن متساو. قم بتبريد دوار ومحولات الطرد المركزي الفائق لمدة 2-3 ساعات عند 4 درجات مئوية. جهاز الطرد المركزي الفائق عند 160,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: أثناء خطوة الطرد المركزي الفائق ، من الأهمية بمكان التأكد من أن جميع أنابيب الطرد المركزي فائقة متوازنة بشكل صحيح ومملوءة بمخزن مؤقت حتى حوالي 0.5-1 سم أسفل الحافة. قد يؤدي عدم كفاية الملء إلى تشوه الأنبوب أو انهياره بسبب قوى الطرد المركزي العالية المطبقة.
  5. قم بإزالة المادة الطافية في أنبوب جديد. يحتوي الطافي على الجسيمات الداخلية. قم بإعداد حقنة سعة 10 مل متصلة بفلتر حقنة 0.45 ميكرومتر فوق أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل وقم بتصفية المادة الطافية في الأنبوب. أضف 5 مل من المخزن المؤقت PBS المعقم لتخفيف المحلول وتجنب انسداد الفلتر.
    ملاحظة: تضمن خطوة التصفية أن جميع الجسيمات الداخلية في المادة الطافية <450 نانومتر عند بدء خطوات العزل.
  6. أعد تعليق الحبيبات باستخدام 5 مل من المخزن المؤقت المعقم PBS من الخطوة 2.4 والماصة لأعلى ولأسفل 20 مرة على الأقل لخلط الحبيبات جيدا. تحتوي الحبيبات على حويصلات أخرى داخل الخلايا. قم بإعداد حقنة سعة 10 مل متصلة بفلتر حقنة 0.45 ميكرومتر فوق أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل وقم بتصفية محلول الحبيبات في الأنبوب. أضف 5 مل إضافية من المخزن المؤقت PBS المعقم لتخفيف المحلول وتجنب انسداد الفلتر.
    ملاحظة: تضمن خطوة التصفية أن جميع الحويصلات من الحبيبات <450 نانومتر عند بدء خطوات العزل.

3. عملية عزل الجسيمات الداخلية والحويصلات الأخرى داخل الخلايا

  1. قم بتخفيف المادة الطافية المفلترة من الخطوة 2.5 ومحلول الحبيبات المصفى من الخطوة 2.6 باستخدام مخزن مؤقت PBS معقم إلى حجم نهائي يبلغ 30 مل في أنابيب 50 مل ، على التوالي. قم بتخزين العينات في درجة حرارة 4 درجات مئوية (الشكل 1 أ).
    ملاحظة: يمكن تخزين العينات عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة. إذا لم يكن هناك وقت كاف لتنفيذ الخطوات التالية في نفس اليوم ، فيمكن تخزينها في الثلاجة عند 4 درجات مئوية ثم الانتظار حتى اليوم التالي لمواصلة التجربة.
  2. قم بتشغيل الجهاز وابدأ برنامج التنظيف اليومي ، والذي يستغرق عادة 20 دقيقة.
  3. اختر جهاز عزل EXODUS المتوسط (M EID) للعزل. قم بتركيب محول أنبوب 50 مل وضع أنبوب 50 مل مع العينة في موضع العينة. انقر فوق EID out على الشاشة وقم بتحميل M EID.
    ملاحظة: EID المتوسط مخصص لعينة 20-50 مل ، وتوصي ب 30 مل.
  4. إعداد البرنامج:
    1. أدخل اسم العينة وحجم العينة.
    2. حدد نوع العينة: Plasma.
    3. حدد البرنامج: البلازما. سترونج ما. أ 03.
    4. حدد أنبوب الطرد المركزي: 50 مل.
    5. قم بتشغيل وضع النقاء العالي.
    6. حدد خيار البرنامج 3000.
    7. انقر فوق موافق للبدء.
      ملاحظة: تستغرق عملية العزل بأكملها من 1 إلى 2 ساعة حتى تكتمل. سيستغرق التركيز العالي للعينات وقتا أطول.
  5. استعادة الجسيمات الداخلية والحويصلات داخل الخلايا الأخرى:
    1. استرجع معرف EID وأحضره إلى الغطاء للخطوات التالية.
    2. انقل 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS المعقم إلى EID باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. شطف جانبي الغشاء النانوي المسامي 20 مرة ، على التوالي.
    3. اجمع الجسيمات الداخلية أو الحويصلات الأخرى داخل الخلايا ، وأعد تعليقها في 200 ميكرولتر في أنبوب 1.5 مل. قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية إذا تم استخدامه في 24-48 ساعة ، أو عند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
      ملاحظة: يحتوي اللوات على الجسيمات الداخلية أو غيرها من الحويصلات داخل الخلايا ويستخدم لمزيد من التحليل والثقافة المشتركة مع خلايا عضلة القلب. تكون عينة الجسيمات الداخلية مستقرة عند تخزينها عند -80 درجة مئوية لمدة 5 أشهر ، بناء على البيانات التي تم الحصول عليها.
  6. الجسيمات الداخلية Elute وغيرها من الحويصلات داخل الخلايا ل WB:
    1. استرجع معرف EID. انقل 80 ميكرولتر من مخزن تحلل WB إلى EID. شطف جانبي الغشاء النانوي المسامي 20 مرة ، على التوالي.
    2. احتضان EID على الثلج لمدة 30 دقيقة لضمان الذوبان الكامل، ومخزن الماصة المؤقت داخل EID كل 10 دقائق. اجمع الجسيمات الداخلية أو غيرها من الحويصلات داخل الخلايا في أنابيب سعة 1.5 مل. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 14,000 × جم عند 4 درجات مئوية. اجمع وقم بتخزين المواد الطافية في درجة حرارة -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. تخلص من الحبيبات إذا بقيت أي حبيبات في الأنبوب.

4. القياس الكمي لبروتين الجسيم الداخلي وتوصيف الحويصلة

  1. تحليل اللطخة الغربية
    1. وفر 5 ميكرولتر من كل عينة لتحديد تركيز البروتين باستخدام مقايسة حمض البيسينشونيك (BCA).
    2. تمييع العينات في 4× Laemmli عينة عازلة واخلطها جيدا عن طريق الدوامة. سخني العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتغيير طبيعة البروتينات.
    3. قم بالطرد المركزي للعينات المشوهة عند 14,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية واجمع المادة الطافية الناتجة لتحليلها.
    4. قم بتجميع المواد الهلامية البولي أكريلاميد في جهاز الرحلان الكهربائي واملأ الغرفة بمخزن مؤقت يعمل بكبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS).
    5. قم بتحميل علامة الوزن الجزيئي وعينات البروتين المحضرة على الهلام ، واختيار نسبة الأكريلاميد المناسبة بناء على الوزن الجزيئي للبروتينات المستهدفة.
      ملاحظة: عادة ، يتم تحميل 20 ميكروغرام من البروتين لكل بئر لكل من محللات أنسجة القلب ومحللات الجسيم الداخلي.
    6. قم بتشغيل الجل على 6 فولت لمدة 120 دقيقة تقريبا أو حتى تصل مقدمة الصبغة إلى قاع الجل.
    7. نقل البروتينات من الجل إلى غشاء فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) باستخدام نظام نقل النشاف الغربي.
      ملاحظة: تعمل طريقة النقل الرطب أيضا بشكل جيد.
    8. اشطف غشاء PVDF لفترة وجيزة باستخدام محلول ملحي مخزن من تريس يحتوي على 0.05٪ توين -20 (TBST).
    9. سد الغشاء مع TBST مع 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    10. احتضان الغشاء طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الجسم المضاد الأولي (جدول المواد) الخاص بالعلامة الداخلية المختارة ، باستخدام هزاز لطيف.
    11. في اليوم التالي ، اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBST ، ويستمر كل غسيل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على هزاز.
      ملاحظة: الغسيل السليم ضروري لتقليل الخلفية غير المحددة. تأكد من بقاء الغشاء رطبا تماما طوال العملية.
    12. احتضان الغشاء بالجسم المضاد الثانوي المناسب (جدول المواد) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
    13. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBST ، كل غسيل يستمر لمدة 10 دقائق على الروك في درجة حرارة الغرفة.
    14. ضع الركيزة الكيميائية على الغشاء للكشف عن البروتينات المرتبطة بالأجسام المضادة.
    15. استخدام نظام تصوير هلام لفضح الغشاء والتقاط صور للبروتينات.
  2. تحليل تشتت الضوء الديناميكي (DLS)
    1. يتم قياس حجم الجسيمات وإمكانات زيتا للجسيمات الداخلية باستخدام تقنية تشتت الضوء الديناميكي (DLS)17. باستخدام Litesizer 500 (Anton Paar) المجهز ببرنامج Kalliope الإصدار 2.10.4. يتم إجراء قياسات DLS ثلاث مرات باستخدام ليزر 658 نانومتر بزاوية كشف 90 درجة عند 25 درجة مئوية.
    2. قم بعمل تخفيف "الكرات النانوية القياسية الحجم" في الماء فائق النقاء ، وأضف حجم 1 مل في الكوفيت القابل للتصرف ، وضعه في الغرفة.
      ملاحظة: استخدم الكرة النانوية القياسية (سواء كانت صغيرة أو كبيرة) وفقا للحجم المتوقع للعينة غير المعروفة.
    3. افتح برنامج DLS وانقر على علامة تبويب القياس الجديدة . حدد حجم الجسيمات من وضع القياس. قم بتسمية الملف في حقل Untitled وضع معلمات الإدخال (مذيب ، درجة حرارة ، إلخ) ، وانقر فوق ابدأ. بعد تحديد حجم الجسيمات القياسية ، أخرج الكوفيت من الغرفة.
    4. قم بتخفيف "مادة زيتا المرجعية المحتملة" في ماء فائق النقاء ، وضعها في كوفيت أوميغا المحتملة زيتا ، وضعها في غرفة الكوفيت. انقر فوق علامة تبويب القياس الجديدة في البرنامج. حدد جهد زيتا من وضع القياس. قم بتسمية الملف في حقل Untitled وضع معلمات الإدخال (المذيب ، درجة الحرارة ، إلخ) ، وانقر فوق ابدأ.
    5. لتحديد حجم الجسيمات وإمكانات زيتا للإندوسومات ، قم بتخفيف عينة الجسيم الداخلي في ماء فائق النقاء ، وضعها في الكوفيت المعنية ، وضعها في غرفة الكوفيت. خذ القياسات بنفس الطريقة الموضحة للمعايير.
      ملاحظة: قم بعمل تخفيف للعينات غير المعروفة وفقا لتركيز العينات في الماء عالي النقاء.
  3. تحليل NanoFCM
    ملاحظة: يتم تحديد تركيزات الجسيمات الداخلية باستخدام NanoFCM Flow NanoAnalyzer مع برنامج Professional Suite V2.318. يتم الحصول على إشارة الجسيمات لمدة دقيقتين باستخدام ليزر أزرق 488 نانومتر مضبوطا على 20 ميجاوات مع اضمحلال SS بنسبة 0.2٪ و / أو ليزر أحمر 638 نانومتر مضبوطا على 8 ميجاوات مع اضمحلال SS بنسبة 10٪ ، عند ضغط أخذ عينات يبلغ 1.0 كيلو باسكال معدل وصيانة بواسطة وحدة ضغط قائم على الهواء. تركز العينة على 1.4 ميكرومتر باستخدام الماء فائق النهر كسائل غمد عبر تغذية الجاذبية. يتم اختبار ومعايرة محاذاة الليزر المثلى باستخدام حبات مراقبة الجودة كوكتيل السيليكا النانوية (S16M-Exo). يتم إجراء قياسات معايرة الحجم قبل التحليل باستخدام حبات قياسية بحجم S16M-Exo (كوكتيل جزيئات السيليكا النانوية يحتوي على أقطار 68 و 91 و 113 و 155 نانومتر من الجسيمات بتركيز معروف 2.17 × 1010/ مل).
    1. اكتساب معيار التركيز:
      1. ابدأ وتهيئة سيولة nanoFCM. قم بتخفيف حبات مراقبة الجودة (1: 100) في ماء فائق النقاء مفلتر بالغشاء 0.22 ميكرومتر ، وأضفه إلى أنبوب 0.5 مل ، وضعه في حجرة التحميل. حدد QC FL SiNPs من القائمة المنسدلة عينة Inf وأدخل عامل التخفيف لعينة حبات مراقبة الجودة.
      2. من القائمة المنسدلة تدفق العينة ، حدد التعزيز لإدخال عينة مراقبة الجودة بسرعة عالية وإزالة محلول التنظيف من النظام لمدة 45 ثانية. أثناء التعزيز ، اضبط طاقة الليزر على 20/50 مللي فولت لليزر الأزرق 488 نانومتر و 20/100 ميجاوات لليزر الأحمر 638 نانومتر ، مع تسوس SS بنسبة 0.2٪.
      3. حدد أخذ العينات من القائمة المنسدلة تدفق العينة وقم بضبط العتبة للإشارة الكبيرة. أثناء أخذ العينات، اضبط محاذاة عدسة تكثيف الإشارة يدويا ومحاذاة عدسة التركيز البؤري بالليزر من البرنامج، إذا لزم الأمر. يجب أن يظل الضبط التلقائي للعتبة لإشارة كبيرة بين 50-120 لقناة التشتت الجانبية وأقل من 75 لكلتا قناتي التألق.
      4. انقر فوق الوقت للتسجيل للحصول على البيانات لمدة 120 ثانية. تأكد من أن منطقة الاهتمام (ROI) تتراوح بين 1500-15000 عند الحصول على البيانات. احفظ ملف النتيجة في المجلد المنبثق بامتداد "nfa" وقم بإلغاء تحميل أنبوب العينة.
        ملاحظة: بعد كل تشغيل للعينة ، استخدم محلول التنظيف (1x) لإزالة العينة المعالجة من الأنبوب عن طريق تعزيزها لمدة 45 ثانية. بعد ذلك ، اغمس طرف الشعيرات الدموية في الماء النقي لإزالة محلول التنظيف المتبقي من خارج الشعيرات الدموية قبل تحميل العينة التالية.
    2. حجم الاستحواذ القياسي:
      1. قم بتخفيف "الخرز القياسي بالحجم" (1: 100) في ماء ألتربور مفلتر بالغشاء 0.22 ميكرومتر وضعه في حجرة التحميل. حدد 68-155 S16M-Exo من القائمة المنسدلة Sample Inf وأدخل عامل التخفيف لعينة الخرز القياسية للحجم.
      2. من القائمة المنسدلة تدفق العينة ، حدد تعزيز لتقديم حبات الحجم القياسية وإزالة محلول التنظيف من النظام لمدة 45 ثانية. أثناء التعزيز ، اضبط طاقة الليزر على 8/50 مللي فولت لليزر الأزرق 488 نانومتر و 20/100 ميجاوات لليزر الأحمر 638 نانومتر ، مع 10٪ اضمحلال SS.
      3. حدد أخذ العينات من القائمة المنسدلة تدفق العينة وقم بضبط العتبة لإشارة صغيرة. يجب أن تكون أربع قمم مميزة (68 نانومتر ، 91 نانومتر ، 113 نانومتر ، 155 نانومتر) مرئية في النافذة. انقر فوق الوقت للتسجيل للحصول على البيانات لمدة 120 ثانية. احفظ ملف النتائج في المجلد المنبثق بامتداد "nfa" وقم بإلغاء تحميل أنبوب العينة.
    3. الاستحواذ القياسي الفارغ:
      1. استخدم الماء فائق النقاء أو (المخزن المؤقت / المخفف للعينة) لأخذ القياس في نفس العملية كما هو موضح أعلاه ، واحفظ الملف باسم "فارغ" في المجلد بامتداد "nfa" ، وتفريغ أنبوب العينة.
    4. تحديد تركيز الجسيمات الداخلية
      1. خفف عينة الجسيم الداخلي في ماء فائق النقاء وضعها في حجرة التحميل.
      2. بعد تعزيز العينة وأخذ عينات منها، انقر فوق وقت التسجيل لبدء القياسات. إذا لم تكن العتبة ضمن نطاق 50-120 لقناة التشتت الجانبية ، أو كان عائد الاستثمار أكثر من 15,000 ، ففكر في تخفيف العينة.
    5. تحليل البيانات:
      1. قم بالتبديل من علامة التبويب "الاستحواذ " إلى علامة التبويب "التحليل " في البرنامج وافتح ملفات "nfa" المحفوظة. قم بتعيين معيار التركيز عن طريق فتح الملف المحفوظ لنتائج مراقبة الجودة date__QC FL SnNPs.nfa ، وتعيين العتبة على إشارة كبيرة بالنقر فوق أداة تعيين العتبة.
      2. حدد تركيز الجسيمات باستخدام أداة بوابة الدائرة. انقر فوق Count STD وتحقق من تركيز حبات مراقبة الجودة (2.17 × 1010 / مل) قبل إغلاق النافذة.
      3. لتعيين معيار الحجم، افتح الملف date_68-155 S16M-Exo.nfa. انقر فوق أداة الحجم لفتح نافذة إنشاء المنحنى القياسية وتعيين عتبة الإشارة الصغيرة بالنقر فوق أداة تعيين العتبة.
      4. حدد S16 exo 68-155 نانومتر من القائمة المنسدلة معرفة من قبل المستخدم . انقر فوق البحث عن قمم لتحديد ذروة شدة SS للمجموعات ذات الأحجام الأربعة.
      5. حدد الملف الفارغ وانقر فوق تعيين فارغ لتحديد عدد الإيجابيات الخاطئة لإزالة العينة. لتحليل تركيز الجسيم الداخلي ، حدد العينة أولا واضبط العتبة على إشارة صغيرة بالنقر فوق أداة العتبة المحددة. قدم البيانات الكمية كتقرير الحجم (نانومتر) والتركيز (الجسيمات / مل).

5. ثقافة عضلة القلب الأولية

ملاحظة: عزل خلايا عضلة القلب باستخدام مجموعة عزل خلايا عضلة القلب الأولية ، والتي توفر كواشف كافية لعزل خلايا عضلة القلب من ما يصل إلى 50 قلبا من قلوب الفئران أو الفئران حديثي الولادة. تشتمل المجموعة أيضا على مكونات مناسبة لدعم ثقافة خلايا عضلة القلب الأولية. يجب إزالة جميع الوسائط والمخازن المؤقتة بحذر لتجنب إزعاج الخلايا. يوصى باستخدام سحب الماصة يدويا باستخدام طرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر، ويجب تجنب الشفط بالفراغ. يجب تبريد محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) مسبقا إلى 4 درجات مئوية قبل بدء الإجراء.

  1. إعادة تشكيل إنزيم عزل خلايا عضلة القلب 1 (يحتوي على غراء) ، المتوفر في المجموعة ، بإضافة 2. مل من HBSS المبرد إلى قارورة واحدة. تخلط برفق لمدة 5 دقائق تقريبا أو حتى يذوب الإنزيم تماما. احتفظ بمحلول الإنزيم على الثلج طوال العملية.
    ملاحظة: قارورة واحدة من الإنزيم 1 المعاد تكوينه كافية لعزل خلايا عضلة القلب من 10 قلوب لحديثي الولادة. يمكن تخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر وهو مستقر لدورتين من التجميد والذوبان. إذا تم تخزينه عند 4 درجات مئوية ، يجب استخدام المحلول في غضون أسبوع واحد لضمان النشاط الأنزيمي.
  2. ضع قلوب حديثي الولادة المشرحة حديثا في معقم فردي 1. أنابيب الطرد المركزي الدقيقة مل وإضافة 500 ميكرولتر من HBSS المثلج البارد على الفور إلى كل أنبوب.
    ملاحظة: يوصى بمعالجة قلب واحد لكل أنبوب لزيادة الإنتاجية والتكاثر.
  3. فرم أنسجة القلب إلى شظايا 1 مم مكعب باستخدام مقص تشريح معقم. اغسل كل عينة مرتين ب 500 ميكرولتر من HBSS المثلج لإزالة الدم المتبقي.
  4. أضف إلى كل أنبوب 200 ميكرولتر من إنزيم عزل خلايا عضلة القلب المعاد تكوينه 1 (غراء) و 10 ميكرولتر من إنزيم عزل خلايا عضلة القلب 2 (الذي يحتوي على ثرثروليسين) ، المتوفر في المجموعة. امزج الأنابيب برفق واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 30-35 دقيقة.
    ملاحظة: يتم توفير إنزيم عزل خلايا عضلة القلب 2 كمعلق في HBSS ويجب إذابته على الجليد قبل الاستخدام. قم بتجانس الإنزيم عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل لضمان تعليق موحد قبل إضافته إلى العينات.
  5. بعد الهضم الأنزيمي ، قم بشفط محلول الإنزيم بعناية واغسل كل عينة مرتين ب 500 ميكرولتر من HBSS المثلج.
  6. أضف مل من DMEM الكامل لعزل الخلايا الأولية إلى كل أنبوب. قم بتشويه الأنسجة برفق عن طريق سحب العاصة لأعلى ولأسفل 25-30 مرة باستخدام طرف ماصة معقم 1.0 مل. قلل من تكوين فقاعات الهواء خلال هذه الخطوة.
    ملاحظة: يؤدي تعطيل الأنسجة عن طريق سحب العينات إلى تحسين إنتاجية الخلايا. ومع ذلك، قد يؤدي الإفراط في سحب العينات إلى تلف الخلايا.
  7. قم بالطرد المركزي للمادة الطافية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
  8. قم بإزالة Complete DMEM بعناية باستخدام ماصة. أضف 1 مل من DMEM الطازج الكامل إلى الأنبوب والماصة لأعلى ولأسفل 25-30 مرة باستخدام طرف ماصة معقم سعة 1.0 مل. تجنب فقاعات الهواء عند سحب العينات.
  9. بعد أن يكون النسيج معلقا أحادي الخلية بشكل أساسي ، أضف 0.5 مل من DMEM الكامل لعزل الخلايا الأولية لكل أنبوب لرفع الحجم الإجمالي إلى 1.5 مل. الجمع بين معلقات الخلية الفردية لتحديد تركيز الخلية وصلاحية الخلية.

6. الزراعة المشتركة مع خلايا عضلة القلب

  1. زرع خلايا عضلة القلب في طبق 60 مم وإضافة DMEM كاملة إلى الحجم الإجمالي.
    ملاحظة: من المتوقع أن يتم زرع كل قلب فأر حديث الولادة في طبق واحد ، ومن المتوقع أن يكون الحجم الإجمالي لكل بئر 5 مل (الشكل 1 ب).
  2. احتضن الطبق 60 مم عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، استبدل الوسيط بحجم مكافئ من DMEM الكامل الطازج لعزل الخلايا الأولية الذي يحتوي على مكمل نمو خلايا عضلة القلب المخفف 1000x.
  3. انقل شطف الجسيم الداخلي الناتج عن الخطوة 3 من -80 درجة مئوية إلى -20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم ضع الجسيمات الداخلية على الجليد وقم بإذابتها تدريجيا.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي الذوبان التدريجي على الجليد إلى جعل غشاء الجسيمات الداخلية أكثر سلامة ويقلل من التدهور.
  4. بعد 48 ساعة ، اخلطي كل 100 ميكرولتر من إلوات الجسيم الداخلي مع 5 مل من DMEM الكامل الطازج واستبدل الوسط القديم في كل طبق. الجسيمات الداخلية للثقافة المشتركة مع خلايا عضلة القلب لمدة 24 ساعة.
  5. اغسل خلايا عضلة القلب ب 2 مل من PBS المعقمة على البارد. أضف محلول التحلل المثلج إلى كل طبق مع 80-100 ميكرولتر من محلول التحلل. اكشط الخلايا باستخدام مكشطة خلايا بلاستيكية باردة واجمع الخلايا في أنابيب سعة 1.5 مل.
  6. قم بتنفيذ بروتوكول WB الموضح في الخطوة 4.1.
  7. بالنسبة للتلطيخ المناعي (IF) ، اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
    1. بذور خلايا عضلة القلب في شريحة غرفة 8 آبار. قم بتخفيف التعليق أحادي الخلية باستخدام DMEM المكتمل من 1.5 مل إلى 3 مل.
    2. بذرة 300 ميكرولتر من التعليق لكل غرفة. كرر الخطوات 6.2-6.4.
    3. قم بتثبيت خلايا عضلة القلب ب 200 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة واغسلها ب 200 ميكرولتر من PBS المعقم ثلاث مرات. شريحة الغرفة المكونة من 8 آبار جاهزة ل IF.
      تنبيه: عند التعامل مع 4٪ PFA ، يرجى ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. يرجى التخلص من 4٪ PFA في حاوية مناسبة بعد الاستخدام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا بفحص مستويات التعبير عن علامات الجسيمات الداخلية المبكرة ، والجسيمات الداخلية المتأخرة ، والجسيمات الحالة ، والبلعمة الذاتية بين خمس مجموعات: تحلل أنسجة القلب ، والكسر النووي ، وجزء الميتوكوندريا ، والحويصلات الأخرى داخل الخلايا من الخطوة 2.6 والخطوة 3.6 ، والجسيمات الداخلية من الخطوة 2.5 والخطوة 3.6. أظهرت نتيجة اللطخة الغربية أن EEA1 (مستضد الجسيمات الداخلية المبكرة 1) لديه أعلى مستوى تعبير في الجسيمات الداخلية ولم يتم التعبير عنه تقريبا في المجموعات الأخرى (الشكل 2 أ ، ب

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة ، نقدم طريقة سريعة وقابلة للتكرار لعزل الجسيمات الداخلية عالية النقاء من أنسجة قلب الفئران من خلال الجمع بين التجزئة تحت الخلوية ومنصة عزل فائقة السرعة14. غالبا ما تكون الأساليب التقليدية لعزل الجسيمات الداخلية ، مثل الطرد المركزي بتدرج الكثافة12 أو العزل المناعي ، كثيفة الوقت والعمالة وتتطلب كميات كبيرة من الأنسجة أو الأجسام المضادة المتخصصة. من خلال دمج بروتوكول التجانس الميكانيكي مع تقنية الترشيح النانوي ، قمنا بتبسيط عملي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال المنح التالية: منحة المعهد الوطني للقلب والرئة والدم 2R01HL121700-06A1 و R01HL172834-01 إلى MW ، جمعية القلب الأمريكية 24TPA1303770 و 25EIA1422015 منحة MW الولايات المتحدة EPA84045701 إلى XL.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
µ-Slide 8 جيد مرتفععبيدي80806-90
1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيق المتدرجالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1615-5500
10x تريس / جلايسين العازلةبيو راد1610734
4x Laemmli عينة العازلةبيو راد1610747
جهاز طرد مركزي على الطاولةإيبندورفجهاز الطرد المركزي Eppendorf 5810R
مصل الألبومين البقري   ؛سيغماأ 9418
مصفاة الخليةكورنينجCLS431750حجم المسام 40   ؛ μ م ، معقم
أطباق زراعة الأنسجة CELLSTARVWR82050-546بوليسترين ، معقم ، 60 مم وحاد ؛ 15 ملم
نظام التصوير ChemiDocبيو رادشيميدوك XRS +
محلول التنظيفنانو إف سي إم17159
DMEM لمجموعات عزل الخلايا الأولية بيرسفيشر العلميةPI88287
DTTفيشر العلميةBP172
دولبيكو ق محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)ثيرمو ساينتفيك10010023
كاشف الكشف عن النشاف الغربي ECLبيو راد1705061
إيدتاسيغماE4884
المنطقة الاقتصادية الأوروبية1إشارات الخلية3288 ثانيةWB (1:1000)
إيجا تي إي تي إيسيغماE-4378-25
العيدهجرهMA03 العيد
رقم 72إشارات الخلية5033 ثانيةWB (1:1000)
ايثانولمتجر أبحاث UH200 دليل ، 5 جالون
إكسودوس H-600هجرهإتش -600
جابد ديبروتين تك10494-1-APWB (1:5000)
هانك محلول الملح المتوازن (HBSS)ثيرمو ساينتفيك14175095
HEPESسيغما[إتش3375]
الخالطفيشر العلمية15340167
KClسيغماص 3911
مصباح1أبكامأب320851WB (1:2000)
LC3إشارات الخلية2775 ثانيةWB (1:1000)
Litesizer 500 أنطون بارلايت سايزر 500معدات أخرى مثل Zetasizer (Malvern) أو DLS   ؛ (Wyatt) يمكن استخدامها
إم شيريبيوربيتالجرم السماوي 66657WB (1:500)
كلوريد 2فيشر العلميةBP214-500
كلوريد الصوديومسيغماس7653
نانو إف سي إمنانو إف سي إمتحليل التدفق النانوي
معايير حجم الكرات النانويةثيرمو ساينتفيك3020 أ
مجهر متحد البؤر AXR من نيكوننيكونأكسر
محلول بارافورمالديهايد 4٪ في برنامج تلفزيونيسانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةSC-281692
مجسات وضع العلامات على Phalloidinإنفيتروجينطائفة A22284إذا (1:500)
أطقم فحص البروتين بيرس BCAثيرمو ساينتفيك23227
طقم بيرس لعزل خلايا عضلة القلب الأوليةثيرمو ساينتفيك88028
مرشح حقنة البولي إيثر سلفونميليبورSLHPR33RSحجم المسام 0.45   ؛ μ م ، معقم
جل البروتين مسبقة الصببيو راد4561093
خرز مراقبة الجودةنانو إف سي إمكيو إس 2503
راب7إشارات الخلية9367 قWB (1:1000)
RIPA تحلل واستخراج المخزن المؤقتثيرمو ساينتفيك89900
روش فوس ستوب (كوكتيل PI)روش4906837001
السيليكا النانويةنانو إف سي إمS16M-Exo
سكروزسيغما84097
دوار دلو متأرجحبيكمان كولترSW55Ti
مجموعات نقل نظام النقل التوربيني Trans-Blot RTAبيو راد1704270
المراهقين 20بيو راد1662404
جهاز الطرد المركزي الفائقبيكمان كولترأوبتيما XE-90
أنابيب الطرد المركزي الفائق بيكمان كولتر326819
حمام التنظيف بالموجات فوق الصوتيةبرانسون الموجات فوق الصوتيةCPX952238R
VWR أنبوب سنت 50 ملVWR89039-656
جهاز طرد مركزي أنبوبي VWR 15 ملVWR89039-666
المواد المرجعية المحتملة Zetaأنطون بار175108

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (11), 679-696 (2018).
  2. Gould, G. W., Lippincott-Schwartz, J. New roles for endosomes: from vesicular carriers to multi-purpose platforms. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (4), 287-292 (2009).
  3. Bissig, C., Gruenberg, J. Lipid sorting and multivesicular endosome biogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (10), a016816(2013).
  4. Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).
  5. Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: origins unknown, biogenesis complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 759-774 (2013).
  6. Singh, J., et al. Endosome transcriptomics reveal trafficking of Cajal bodies into multivesicular bodies. bioRxiv. , (2025).
  7. Scott, C. C., Gruenberg, J. Ion flux and the function of endosomes and lysosomes: pH is just the start: the flux of ions across endosomal membranes influences endosome function not only through regulation of the luminal pH. Bioessays. 33 (2), 103-110 (2011).
  8. Lopez-Verrilli, M. A. Exosomes: mediators of communication in eukaryotes. Biol Res. 46 (1), 5-11 (2013).
  9. Corbeil, D., et al. Uptake and fate of extracellular membrane vesicles: nucleoplasmic reticulum-associated late endosomes as a new gate to intercellular communication. Cells. 9 (9), 1931(1931).
  10. Curran, J., et al. EHD3-dependent endosome pathway regulates cardiac membrane excitability and physiology. Circ Res. 115 (1), 68-78 (2014).
  11. Kapustin, A. N., et al. Vascular smooth muscle cell calcification is mediated by regulated exosome secretion. Circ Res. 116 (8), 1312-1323 (2015).
  12. Marsh, M., et al. Rapid analytical and preparative isolation of functional endosomes by free flow electrophoresis. J Cell Biol. 104 (4), 875-886 (1987).
  13. de Araújo, M. E., Lamberti, G., Huber, L. A. Isolation of early and late endosomes by density gradient centrifugation. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (11), 1013-1016 (2015).
  14. Chen, Y., et al. Exosome detection via the ultrafast-isolation system: EXODUS. Nat Methods. 18 (2), 212-218 (2021).
  15. Miao, L., et al. Cardiomyocyte orientation modulated by the Numb family proteins-N-cadherin axis is essential for ventricular wall morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (31), 15560-15569 (2019).
  16. Miao, L., et al. The spatiotemporal expression of Notch1 and Numb and their functional interaction during cardiac morphogenesis. Cells. 10 (9), 2192(2021).
  17. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-what they are and what they are not. J Control Release. 235, 337-351 (2016).
  18. Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Rev Rep. 18 (3), 1067-1077 (2022).
  19. Wilson, J. M., et al. EEA1, a tethering protein of the early sorting endosome, shows a polarized distribution in hippocampal neurons, epithelial cells, and fibroblasts. Mol Biol Cell. 11 (8), 2657-2671 (2000).
  20. Dumas, J. J., et al. Multivalent endosome targeting by homodimeric EEA1. Mol Cell. 8 (5), 947-958 (2001).
  21. Bucci, C., et al. Rab7: a key to lysosome biogenesis. Mol Biol Cell. 11 (2), 467-480 (2000).
  22. Langemeyer, L., Fröhlich, F., Ungermann, C. Rab GTPase function in endosome and lysosome biogenesis. Trends Cell Biol. 28 (11), 957-970 (2018).
  23. Wang, C., et al. Investigation of endosome and lysosome biology by ultra pH-sensitive nanoprobes. Adv Drug Deliv Rev. 113, 87-96 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة