مقالة منهجية

التصوير الجزيئي المكاني للجليكوم باستخدام مطيافية الكتلة

1.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69154

⸱

نوفمبر 28, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Advanced Spatial Biomolecule Research (CASBR), University of Florida, Gainesville, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Florida, Gainesville, 3Markey Cancer Center, University of Kentucky, 4Department of Pathology & Laboratory Medicine, University of Kentucky

في هذه المقالة

ملخص

يوضح هذا البروتوكول الخطوات الرئيسية لتمكين قياس دقيق وقابل للتكرار لكل من الجليكوجين والجليكان المرتبط بالنيتروجين باستخدام تصوير الطيف الكتلي.

الملخص

التنظيم المكاني للجليكوم داخل الأنسجة هو مفتاح الأساس الجزيئي للوظيفة الفسيولوجية. يعد الغليكوم المتنوع والديناميكي ضروريا للعمليات الخلوية الأساسية، بما في ذلك الأيض، والإشارات، والالتصاق. أدت الابتكارات في علم الأحياء المكاني إلى فتح طرق جديدة للتصوير الجزيئي المكاني لفئات مختلفة من الغليكوم. هنا، نصف بروتوكولا محسنا للتصوير الجزيئي المكاني للجليكوم في كبد الفئران المجمد حديثا. يشمل سير العمل (1) الحصاد السريع والتجميد، (2) التقسيم بالتجميد عند أفضل سمك وموقع، (3) تحضير الأنسجة وهضم الإنزيمات على الأنسجة باستخدام الإنزيمات النشطة للكربوهيدرات، (4) تطبيق مصفوفة وجمع البيانات بواسطة تصوير مطيافية الكتلة بمساعدة المصفوفة بالليزر (MALDI-MSI)، و(5) معالجة البيانات وتصويرها لوضع النتائج في السياق البيولوجي. يسمح استخدام هذا النهج بالحصول على خرائط مكانية مفصلة للجليكانات والجليكوجين المرتبطة بالنيتروجين، مما يكشف عن ميزات فسيولوجية وخلوية رئيسية. تسمح هذه البيانات بتحديد التباين المكاني الرئيسي للجليكومية المرتبط بوظائف الكبد وخلل وظائفه. يتيح هذا السير من إجراء جليكوميات مكانية قابلة للتكرار وحساسية عالية للكبد. بالإضافة إلى ذلك، فهي قابلة للتكيف بسهولة مع أنسجة أو أنواع أخرى، مما يسهل رؤى مكانية جديدة حول بيولوجيا الغليكوم في الصحة والأمراض.

المقدمة

يتوسع مجال علم الأحياء المكاني بسرعة، مقدما رؤى حاسمة حول التعقيد الديناميكي المكاني الجزيئي الحيوي للكائنات الحية. يتم استخدام عدة طرق لدراسة الجزيئات الحيوية المميزة في سياق بيولوجي. بينما بعض التقنيات متخصصة للغاية، برز مطيافية الكتلة (MS) كتقنية عامة مهمة لقياس مجموعة واسعة من الجزيئات الحيوية في سياق الخلايا أو الأنسجة أو الكائنات الحية.

تصوير التحليل المغناطيسي/التحليل التفصيلي للكتلة بمساعدة المصفوفة (MALDI-MSI) هو أحد التقنيات العامة الناشئة لتصوير الجزيئات الحيوية المكانية متعددة الأبعاد. تم تأسيسه في البداية لتصوير البروتينات والببتيدات في شرائح الأنسجة1. منذ ذلك الحين، تم توسيعها لتشمل العديد من العينات والجزيئات البيولوجية المتنوعة2. يمكن تطبيق هذه التقنية على عينات خلوية3، وعضويات4، ونماذج5، وعينات المرضى 6,7. يمكن قياس بعض الفئات الجزيئية مباشرة باستخدام طرق تعتمد على MSI، بما في ذلك العديد من المستقلبات والدهون، بينما تتطلب أنواع أخرى من الجزيئات الحيوية الأكثر تعقيدا، مثل البروتينات والجليكانات، علاجا إنزيميا أو كيميائيا لتكون مناسبة للكشف القائم على MSI 2,8.

تم تطبيق MALDI-MSI أيضا على التحليل المكاني للجليكانات والجليكوجين المرتبطة بالنيتروجين، باستخدام سير عمل تتطلب معالجة إنزيمية لإنتاج شظايا جليكان مناسبة للكشف عن MSI 9,10,11,12,13,14,15. يتم فصل N-جليكان من بقايا الأسبارجين في البروتينات التي تحتوي على PNGase F، وسلاسل الجلوكوز من الجليكوجين تمزق بالإيزوأميلاز. المزايا الرئيسية لتحليل الجليكوجين في MALDI هي أنه يوفر تعريفا مكانيا لتوزيع الجليكوجين في العينة البيولوجية، وقياسا نسبيا، ومعلومات حول تفرع سلاسل الجلوكوز. نظرا لأن سير عمل N-glycan وglycogen يتطلب معالجة إنزمية للعينة لتحليل MSI، فقد تم دمجهما في سير عمل متكامل لتحليل الغليكوم (الشكل 1A). يتطلب هذا السير تحضيرا دقيقا للعينات البيولوجية ومعالجة محددة لتمكين تحليل التصلب المتعدد، يليه جمع البيانات ومعالجتها. بينما يتطلب سير العمل سلسلة من الخطوات المتخصصة، فإنه ينتج بيانات جليكوم مكانية غنية وعالية الجودة قابلة للتكرار بدرجة عالية ويمكن تكييفها لأنواع مختلفة من العينات16. بالإضافة إلى ذلك، فإن سير العمل يكون نمطيا، بحيث يمكن إجراء خطوات معالجة العينات من قبل مختبرات بحثية مستقلة قبل تقديم العينات إلى منشآت متخصصة تقوم بالخطوات الأخيرة من جمع وتحليل بيانات MALDI-MSI.

البروتوكول

تم إجراء هذا البحث وفقا لإرشادات لجنة رعاية واستخدام المؤسسية (IACUC) في جامعة فلوريدا. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. حصاد الكبد

  1. القتل الرحيم والتشريح الحيواني
    1. إجراء خلع عنق الرحم وقطع الرأس لقتل الفأر (وفقا لبروتوكولات معتمدة مؤسسيا).
      ملاحظة: في هذا المثال، تم استخدام فأر بري من نوع C57BL/6J عمره 6 أشهر. في هذا العمر، الفئران تزن ~25-33 جرام. مجموعة واسعة من الأعمار والأحجام والسلالات مناسبة جدا لهذا التحليل.
    2. ضع فورا على وسادة ماصة وكشف تجويف البطن باستخدام مشرط معقم.
    3. باستخدام ملقط ومقص معقمين، عزل الكبد مع أقل قدر من التلاعب وتلف الأنسجة.
      ملاحظة: تحدث التغيرات الأيضية بسرعة. تجنب التروية أو التخدير إذا أمكن، وتأكد من تنفيذ خطوات التشريح بأسرع وقت ممكن17.
  2. اغسل ونظف المناديل بسرعة.
    1. اغمس الكبد بلطف في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لإزالة أي دم.
    2. اغمس النسيج في ماء منزوع الأيونات (DI) مرتين.
    3. امش الماء الزائد بلمس المنديل بلطف على مساحة نظيفة.
      ملاحظة: يجب قطع العينات الأكبر من ما يمكن وضعه على شريحة المجهر القياسية إلى قطع قبل التجميد.
  3. تجميد العينات
    1. ضع الكبد المنظف مباشرة في قارب وزن بوليسترين مبرد مسبقا يطفو على النيتروجين السائل.
    2. بمجرد أن يتغير لون النسيج إلى لون لامع معتم، يستغرق حوالي 3 دقائق، ثم ضع المنديل في عبوات ورق الألمنيوم الجاهزة والمميزة على الثلج الجاف.
    3. ضع عبوات ورق الألمنيوم مع العينات في فريزر بدرجة حرارة -80 درجة مئوية للتخزين. يمكن تخزين العينات على المدى الطويل عند -80 درجة مئوية.

2: تحضير عينة بيولوجية

  1. التحضير للتقسيم بالتجميد
    1. تأكد من تشغيل الكريوستات وموازنة درجة الحرارة المناسبة للنسجة، بين -16 درجة مئوية و-20 درجة مئوية. درجة الحرارة الدقيقة تعتمد على نوع النسيج. يجب تقسيم الكبد بدرجة حرارة أعلى قليلا، حوالي -16 °م إلى -17 °م، لمنع تمزقات الأنسجة، بينما يجب تقسيم الأنسجة الأخرى عند -20 °م.
    2. تأكد من وجود على الأقل فشتي تشاكس، وفرشاة طلاء رقيقتان، وملقط رفيع، وملقط زجاجي بحجم 70 مم عند درجة حرارة جهاز التبريد. بالإضافة إلى ذلك، قم بإدخال الملصقات بالقلم قبل وضعها في الكريوستات للتأقلم.
    3. انقل النسيج من الفريزر بدرجة حرارة -80 درجة مئوية إلى التجميد على الثلج الجاف.
    4. اترك الأنسجة لتتأقلم مع درجة الحرارة في الكريوستات لمدة لا تقل عن 30 دقيقة.
    5. تأكد من عدم وجود ضرر في حافة الزجاج وأنه ناعم حيث يلتقي النسيج بدليل مضاد الدوران عن طريق تمرير إصبع مقاس القفاز على الحافة.
    6. ضع الإدخال الزجاجي في دليل مضاد الانقلاب.
    7. خذ شفرة منخفضة الملف وأدخلها بعناية في حامل الشفرة المفتوح، وأغلق حامل الشفرة. ضع واقي الشفرة الأحمر فوق الشفرة حتى يتم تقسيمها.
    8. قم بتركيب النسيج على الصندوق باستخدام وسط تركيب M1، وهو متوافق مع التصلب المتعدد. ضع وسط تركيب بدرجة حرارة الغرفة M1 على الشاك داخل جهاز التبريد، مع تغطية حلقتين على الأقل على الناقل حتى يثبت النسيج في مكانه.
      ملاحظة: غالبا ما يستخدم مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) في التبريد الكامل؛ ومع ذلك، فإنه يسبب كبت الأيونات في تطبيقات التصلب السوكترول ويجب تجنبه. إذا كان لا بد من استخدام OCT، فيجب استخدام بروتوكول متعدد الخطوات إضافي لتقليل أو إزالة OCT. بالإضافة إلى ذلك، بعض مراكز موارد MS لا تحلل العينات التي تم تضمينها في OCT.
    9. خذ ملقطا مبردا وأزل النسيج من ورق الألمنيوم. استخدم الملقط لوضع النسيج على الزاوية المطلوبة.
    10. ضع الصندوق في التجميد للسماح للوسائط التراكب بالتجمد، حوالي دقيقتين. بمجرد تجميده، سيتصلب ويبدو معتما.
  2. التجميد لنسيج الكبد
    1. ضع التشك مع المنديل المثبت في حامل التشكس. ضع العصا بحيث يقطع النسيج بزاوية 90° مع الشفرة.
    2. اسحب حامل التثبيت حتى لا يلمس النسيج الشفرة. أدخل الشاك ببطء حتى يصبح النسيج مجاورا مباشرة للشفرة لبدء التقسيم.
    3. ابدأ التقسيم بشريحة بسماكة 30 ميكرومتر لإزالة الأنسجة غير المرغوب فيها.
    4. تأكد من أن عمق صفيحة الدرفلة يخلق جزءا أملسا وألا يتدحرج النسيج فوق لوح اللف. إذا كان هذا هو الحال، فخف صفيحة الرول قليلا. إذا حرك النسيج صفيحة اللف وضربها مرة ثانية عند إعادة ضبط الدوران، فشد صفيحة اللف قليلا.
    5. مع اقتراب المقطع المطلوب، قلل السماكة المقصودة للشريحة إلى 10 ميكرومتر، أو سمكة أخرى مرغوبة مناسبة للتطبيق المحدد.
    6. أكمل 10 دورات حتى يكون الزاوية في السماكة المناسبة لمنع التأخر والأجزاء غير المستوية.
    7. استخدم فرشاة طلاء مبردة لتنظيف المرحلة استعدادا للتقطيع. أغلق لوحة الرول فوق الشفرة وخذ ببطء جزءا من النسيج.
    8. ارفع لوحة الرول واستخدم فرشاتي الطلاء المبردتين والرقيقتين لتحريك الجزء بلطف بعيدا عن الشفرة. اسحب القسم إلى جانب المسرح لتسهيل التثبيت على الشريحة.
    9. خذ شريحة مبردة من حامل شريحة في الكريوستات وضع إصبع السبابة على الجانب المقابل من الشريحة عن مكان وضع النسيج لمدة 10 ثوان.
    10. ضع السلايد برفق على المنديل وارفعه مرة أخرى. لا تضغط بقوة، لأن ذلك سيمزق الأنسجة. يجب أن يذوب النسيج على الشريحة ويصبح شفافا.
    11. انقل الشرائح بسرعة إلى مجفف للتجفيف. جفف الشريحة في المجفف لمدة ساعة.
    12. بعد التجفيف، يمكن معالجة الشرائح مباشرة لمعالجة MS أو تفريغ الهواء وتخزينها عند -80 درجة مئوية.

3. تحضير شرائح لمؤشر MSI للجليكوميكس

  1. تحضير الإنزيمات
    ملاحظة: يمكن شراء PNGase F منخفض الملح الجاهز للمتلازمة الميثوسوبية واستخدامها مباشرة.
    1. يتطلب الإيزوأميلاز الغسيل الكلوي لإزالة الملح الزائد لتطبيقات التصلب المتعدد. حضر كوب أو أكثر من كوب الغسيل بوضعهما في ماء HPLC لمدة 15 دقيقة.
    2. قم بتحليل 200 ميكرولتر من الإيزوأميلاز الأصلي باستخدام كوب غسيل كلى بسعة 500 ميكرولتر في 14.3 مل من ماء HPLC لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية، دون تحريك. استبدل 14.3 مل من ماء HPLC بماء HPLC الطازج وقم بتحليل الداليز لمدة 16 ساعة إضافية (ليلا) عند 4 درجات مئوية. استبدل 14.3 مل من ماء HPLC بماء HPLC الطازج وقم بتحليل الديل لمدة 8 ساعات إضافية عند 4 درجات مئوية.
    3. قم بإزالة الإيزوأميلاز من الكوب بلطف باستخدام ماصة وضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق بحجم 1.5. قس الحجم الكلي لمحلول الإيزوأميلاز بعد الغسيل الكلوي (بوحدة μL). من النشاط الابتدائي للمخزون، عادة 200 وحدة/مل، والحجم النهائي، احسب الحجم الكلي المطلوب ل3 وحدات من الإيزوأميلاز.
    4. معادلات البيبت من 3 وحدات إيزوأميلاز إلى أنابيب PCR ذات جدران رقيقة. أنابيب التجميد السريعة في النيتروجين السائل. تخزين عند -80 درجة مئوية. يمكن استخدام أنبوب واحد من محلول الإيزوأميليز التحليل لكل بروتوكول رش، وهو ما يكفي لأربع شرائح رش. تجنب دورات التجميد/الذوبان للحفاظ على نشاط الإنزيمات.
  2. تثبيت وغسل الأنسجة
    1. ضع الشرائح في حامل شرائح واغمرها في وعاء زجاجي مملوء ب 10٪ فورمالين محصور محايد (NBF) لمدة ساعة واحدة.
    2. أزل الشرائح من NBF. اغمر الشرائح في 70٪ إيثانول لمدة ساعتين.
    3. حضر أربع برطمانات كوبلين تحتوي على 70٪، 80٪، 90٪، و100٪ إيثانول. ضع ملصقات واضحة على كل برطمان لتجنب الالتباس أثناء الغسل المتسلسل.
    4. نقل الشرائح بشكل متتالي كما يلي: 70٪ إيثانول لمدة 5 دقائق، 80٪ إيثانول لمدة 5 دقائق، 90٪ إيثانول لمدة 5 دقائق، 100٪ إيثانول لمدة 5 دقائق.
    5. انقل الشرائح إلى طبق بتري زجاجي مملوء بالزيلين الطازج 100٪. تأكد من أن الشرائح مغمورة بالكامل. حضن الشرائح على شاكر بسرعة 70 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة، حسب محتوى الدهون في الأنسجة. كرر هذه الخطوة مرتين إضافيتين باستخدام الزيلين الطازج في كل غسل.
      ملاحظة: تم تصميم هذا البروتوكول للسماح بأقصى إزالة دهون، حيث من المعروف أن الدهون تؤدي إلى كبت الأيونات، وبالتالي أقصى قابلية للتكرار. ومع ذلك، يؤدي ذلك إلى عدم توطين الإشارات، مما يقلل من الدقة التي يمكن الحصول عليها. قد يقلل تقليل خطوات الغسيل، وتقييد وقت المعالجة، والتحكم الدقيق في الرطوبة من إزالة التمركز وبالتالي يؤدي إلى تحسين دقة البيانات.
    6. ضع شرائح في مجفف طوال الليل لتجف.
    7. ضع شرائح في 70٪ إيثانول لمدة دقيقة واحدة لإعادة الترطيب. ضع الزلاجات في ماء DI لمدة 3 دقائق. كرر غسل الماء بالماء الطازج باستخدام DI.
    8. جفف الشرائح في جهاز تجفيف لمدة 10 دقائق، أو حتى تجف تماما.
  3. تحضير الشرائح لتطبيق الإنزيمات
    1. جهز غرفة رطوبة HTX للحضانة عن طريق وضع منشفة ورقية مشبعة بماء DI أسفل الرف المعدني. ضع الغرفة في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
    2. جهز جهاز تبخير الطعام عن طريق ملء خزان المياه إلى الأعلى بماء الصنبور. اضبط المؤقت على 60 دقيقة لتشغيل الجهاز.
    3. تحضير محلول العزل الستركوني بإضافة 50 مل من الماء بدرجة HPLC، و25 ميكرولتر من أنهيدريد الستركوني، و2 ميكرولتر من 12 M HCl إلى أنبوب فالكون بسعة 50 مل. استخدم الدوامة الحل لعشر ثوان لخلطها جيدا. كل أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل من المخزن الستركوني يكفي لأربع شرائح كهربائية. تحقق من أن درجة الحموضة للمحلول هي 3.0 (النطاق المقبول: 2.5-3.5).
    4. املأ كل ورقة بريدية بمحلول الستركونيك المحضر. ضع السلايد بحيث يكون النسيج مواجها للداخل لمنع النسيج من ملامسة الجوانب والسماح باسترجاع المستضدات بفعالية. يمكن استخدام شريحتين لكل ميل، باستخدام وضعي الحواف بحيث تكون كلتا الشريحتين متجهتين للداخل.
    5. تحقق من أن البخار ينبعث من جهاز التبخير الغذائي. ضع الأقراص في جهاز التبخر واحتضن لمدة 30 دقيقة.
    6. نقل الرسائل إلى حمام ماء تابع للمعهد لمدة 5 دقائق. استبدل نصف المحلول الستركوني في العلبة بماء DI واتركه لمدة 5 دقائق أخرى. كرر هذا التخفيف مرتين إضافيتين.
    7. أزل كل المذيب واغسل الشرائح بإضافة ماء DI بنسبة 100٪ إلى ملف الشريحة ثم إزالة ماء DI. باستخدام مناديل مختبرية، جفف النقاط حول أي مناطق لا توجد فيها الأنسجة.
    8. ارسم دائرة ومثلثا على ظهر كل شريحة لتحديد المواقع القياسية الداخلية. ضع 1 ميكرولتر من بيروكسيداز الفجل الحار 1 ملغ/مل (HRP؛ دائري) و1 ميكرولتر من جليكوجين كبد الأرنب بتركيز 10 ملغ/مل (مثلث) على مقدمة الشريحة.
    9. ضع شرائح في المجفف لمدة 15 دقيقة لتجف تماما.
  4. رش الإنزيمات والهضم
    1. أزل أنبوبا واحدا من PNGase F المحمول بسعة 100 ميكروغرام (500 وحدة/ميكروغرام) وأنبوب واحد بثلاث وحدات إيزوأميلاز ودع الكوب يذوب لمدة 10 دقائق. أنابيب الدوران عند ~2000 × g لمدة 5 ثوان في أنبوب طرد مركزي دقيق. هذا الإنزيم كاف لرش 4 شرائح فقط.
    2. مضخة 50 ميكرولتر من ماء DI لكل أنبوب PNGase F متحمس، ثم الدوامة بلطف لمدة 10 ثوان، والدوران في ميكروفوج ~2000 × جرام لمدة 5 ثوان. تقطع محلول 50 ميكرولتر PNGase F مباشرة إلى أنبوب الإيزوأميلاز. أضف ماء HPLC إلى الحجم النهائي 1 مل.
    3. قم بتدوير أنبوب الطرد المركزي الدقيق الإنزيمي المزدوج 10 ثوان وادور للأسفل ~2000 × g لمدة 5 ثوان.
    4. شغل جهاز HTX M5 وافتح برنامج HTX M5. تأكد من أن نوع الدرج مضبوط على Ambient تحت تبويب النظام .
    5. قم بإيقاف مضخة كناور بالضغط على زر الإيقاف في الجهة الأمامية اليمنى. شغل مضخة الحقنة الخارجية باستخدام المفتاح في لوحتها الخلفية.
    6. في برنامج HTX، تحت تبويب الطرق ، اختر الطريقة المناسبة لرش الإنزيمات المزدوجة. يجب ضبط المعاملات على درجة حرارة الفوهة 45 درجة مئوية، 15 مرورا، معدل تدفق 0.025 مل/دقيقة، سرعة 1200 مم/دقيقة، تباعد المسارات 3 مم، نمط CC، ضبط الضغط على 10 psi، معدل تدفق الغاز 3 لتر/دقيقة، وارتفاع الفوهة 40 مم.
    7. انتقل إلى تبويب درجة الحرارة واضبط درجة حرارة فوهة الرش على 45 درجة مئوية. استخدم مفتاح ربط لنقل خط الرش إلى الموصل العلوي.
    8. افتح صمام غاز النيتروجين فائق النقاء وتأكد من أن ضغط الرشاش 10 psi. على مضخة الحقنة، اضبط معدل التدفق إلى 95 ميكرولتر/دقيقة.
    9. باستخدام حقنة وإبرة جديدة، املأ بماء HPLC بسعة 4 مل من HPLC. أزل كل الفقاعات. مرر 2 مل من الماء عبر جزء بقطر ~6 إنش من خط الرش إلى كأس نفايات.
    10. قم بتوصيل الحقنة بخط الرش وتشغيل الماء عبر مضخة الحقنة عن طريق التشغيل بسرعة 95 ميكرولتر/دقيقة لمدة 5 دقائق.
    11. أثناء سحب مضخة الحقنة، قم بتثبيت الشرائح على الزاوية السفلية اليسرى من الصينية المسخنة باستخدام دليل محاذاة معدني لضمان وجود الأنسجة داخل منطقة الرش. تحت تبويب العينة ، حدد معلمات X و Y لمنطقة الرش مع السماح برش زائد طفيف لضمان تغطية كاملة للسحاق.
    12. بعد 5 دقائق، أوقف المضخة، افصل المحقنة، اسحب الهواء إليها، ثم ادفع الهواء عبر خط الرشاش لتصريف أي ماء متبق. كرر ذلك حسب الحاجة.
    13. قم بتحميل محلول الإنزيم المزدوج في حقنة جديدة ووصل بالمضخة، لضمان عدم بقاء فقاعات.
    14. ثبت الحقنة على خط الرشاش. على مضخة الحقنة، اضبط معدل التدفق إلى 25 ميكرولتر/دقيقة.
    15. عندما تصل فوهة الرش إلى 45 درجة مئوية، اضغط زر Start تحت علامة Cycle . انقر على لا عند طلب تشغيل مضخة كناور. اضغط زر التشغيل على مضخة الحقنة لبدء الرش.
    16. ضع شريحة فارغة تحت فوهة الرش للتأكد من ترسيب رذاذ الإنزيم المرئي. بمجرد الملاحظة، انقر على الاستمرار في البرنامج، ضع غطاء الزجاج على الرشاش، وراقب الرذاذ لضمان تطبيق متساو، كما هو موحد الترطيب.
    17. عندما تنتهي دورة الرش، اضغط على زر التوقف على المضخة، وأوقف غاز النيتروجين، ثم اضغط على تأكيد حمل الصمام. نظف خط ومرحلة الرشاش وأوقف الرشاش، لضمان عودة مضخة كناور للعمل.
    18. حضن الشرائح في غرفة الرطوبة HTX عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين، مع وضع الشرائح متجهة للأعلى. بعد الانتهاء، ضع الشرائح في المجفف لمدة 15 دقيقة. يمكن أن تبقى الشرائح في المجفف طوال الليل، أو يمكن الاستمرار في البروتوكول.
  5. إعداد ومصفوفات MALDI وتطبيقها
    1. قبل تطبيق المصفوفة، التقط صورة بصرية للشريحة باستخدام ماسح ضوئي.
    2. ازن 40 ملغ من CHCA الصلب داخل أنبوب مخروطي بحجم 15 مل. قم بإذابة مسحوق CHCA في محلول يحتوي على 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك و50٪ أسيتونيتريل (ACN) بتركيز 7 ملغ/مل.
    3. قم بعمل سونيك لحل المصفوفة لمدة 10 دقائق باستخدام دورات تشغيل 90 ثانية و30 ثانية إيقاف. كرر هذه الخطوات خمس مرات لضمان الذوبان الكامل والتجانس.
    4. شغل جهاز HTX M5 وافتح برنامج HTX M5. افتح صمام غاز النيتروجين واضبط ضغط النظام على 10 psi.
    5. في برنامج HTX، تحت تبويب الطرق ، اختر الطريقة المناسبة لرش مصفوفة CHCA. تم ضبط المعاملات على درجة حرارة الفوهة 79 درجة مئوية، 10 مرات مرور، معدل تدفق 0.1 مل/دقيقة، سرعة 1300 مم/دقيقة، تباعد المسارات 3 مم، نمط CC، ضبط الضغط على 10 psi، معدل تدفق الغاز 3 لتر/دقيقة، وارتفاع الفوهة 40 مم.
    6. انتقل إلى تبويب درجة الحرارة ، واضبط درجة حرارة فوهة الرش على 79 درجة مئوية. تحت تبويب المضخة ، اضبط معدل التدفق على 100 ميكرولتر/دقيقة.
    7. ثبت الشرائح على الزاوية السفلية اليسرى من الصينية المسخنة باستخدام دليل معدني لضمان المحاذاة الصحيحة في منطقة الرش. تحت تبويب العينة ، حدد معلمات X و Y لمنطقة الرش مع السماح برش زائد طفيف لضمان تغطية كاملة للسحاق.
    8. استخدم حقنة ذات استخدام مرة واحدة وإبرة لسحب 5.5 مل من 50٪ ACN (إزالة الفقاعات).
    9. اضبط الرشاش على وضع التحميل. أدخل حقنة ACN واحقن ACN. قم بإزالة حقنة ACN واستبدلها فورا بحقنة جديدة تحتوي على 5.5 مل من محلول CHCA المفلتر، مع الحقن مع تجنب الفقاعات. اضبط الرشاش على وضع الرش.
    10. عندما تصل فوهة الرش إلى 79 درجة مئوية، اضغط زر Start تحت علامة Cycle Tab. انقر على نعم عند الطلب.
    11. استخدم شريحة اختبار فارغة وضعها تحت فوهة الرش. لتأكيد ترسيب الرش المرئي للمصفوفة، سيتم العثور على ترسيب مصفوفة صفراء على الشريحة. بعد الملاحظة، انقر على متابعة، ضع غطاء الزجاج على الآلة، وراقب الرش للتأكد من قوامه. الرش المتسق سينتج شريحة ذات شفافية موحدة.
    12. عندما تنتهي دورة الرش، اضبط الرشاش على وضع التحميل واضغط على تأكيد حمل الصمام.
    13. نظف الرشاش بضبط المضخة على 300 رطل لكل بوصة مربعة وخفض درجة الحرارة إلى 30 درجة مئوية. امتصاص ودفع عبر الخط 5 مل من 50٪ أسيتونونتريل مرتين و5 مل من 50٪ ميثانول مرتين. امسح المسرح بقوة 100٪ ميثانول. عندما تصل درجة الحرارة إلى 30 درجة مئوية، قم بالتبديل إلى LOAD، وإيقاف الغاز، وأوقف الرشاش، وتأكد من إعادة تشغيل مضخة كناور.
    14. ضع الشرائح في المجفف لمدة 15 دقيقة حتى تجف المصفوفة تماما. يجب تشغيل الشرائح في أقرب وقت ممكن بعد الرش، خلال 14 يوما كحد أقصى، لضمان جمع بيانات موثوق مع الإشارة المناسبة إلى الضوضاء.

4. جمع بيانات الجليكوميكس MALDI-MSI

  1. التحضير لجمع البيانات
    1. ثبت السلايد في حامل عينة جهاز MALDI باستخدام محول الشريحة. أدخل حامل العينة في جهاز التصوير المتعدد وتأكد من أنه مثبت بشكل صحيح للتصوير.
    2. افتح برنامج flexImaging واستورد صورة الشريحة البصرية المسجلة سابقا، انظر الخطوة 3.4.1. إذا لزم الأمر، قم بمعايرة محاذاة الصورة مع مرحلة الجهاز بحيث تكون أقسام الأنسجة والبقع القياسية في وضع صحيح لاختيار المنطقة.
    3. حدد مناطق التصوير لأقسام الأنسجة، ومعيار HRP، ومعيار الجليكوجين، ومربع مصفوفة التحكم في البرنامج. حدد كل منطقة كمنطقة منفصلة.
    4. اضبط حجم خطوة النقط النقطي إلى 50 ميكرومتر، مما ينتج دقة بكسل بين 50 × 50 ميكرومتر.
    5. في برنامج التحكم في الأجهزة، اختر وضع MS بالأيونات الإيجابية واضبط نطاق المسح إلى m/z 500 - 4000 مع قطع كتلة منخفضة تبلغ 700.00 م/ز.
    6. قم بتحميل مجموعة معلمات ضبط التصوير MALDI المحسنة مسبقا في برنامج التحكم بالآلات (أو إدخال القيم يدويا إذا لزم الأمر). تحقق من أن جهود المصدر والأيونات الضوئية مضبوطة على القيم المحددة: إزاحة لوحة MALDI 50.0 فولت؛ الانحراف 1 دلتا 70.0 فولت؛ القمع 1 RF 500.0 Vpp; قمع 2 RF 500.0 Vpp; RF متعدد الأقطاب 500.0 Vpp؛ طاقة الأيونات 5.0 إلكترون فولت. تأكد من إعدادات توقيت خلية التصادم وTOF: طاقة التصادم 10.0 إلكترون فولت؛ تصادم RF 4000.0 Vpp؛ زمن النقل 180.0 ميكروثانية؛ تخزين النبضات قبل 25.0 ميكروثانية.
    7. تأكد من إعدادات الليزر تحت تبويب الليزر. اختر Imaging 50 ميكرومتر كخيار افتراضي.
    8. معاير مطياف الكتلة باستخدام خليط معاير خارجي مثل خليط التنغيم. قدم المعايرة وشغل روتين معايرة الآلة. اضبط المعايرة بحيث يكون خطأ دقة الكتلة ضمن 0.001٪ ودرجة دقة المعايرة 100٪.
    9. اضبط عملية الاقتناء لتنفيذ دفعة من 320 طلقة ليزر عند تردد 10,000 هرتز. يجب ضبط توهين الليزر إلى 37٪ للحفاظ على شدة الإشارة ضمن النطاق الديناميكي الأمثل. قم بضبط طلقات الليزر والتخفيف حسب الحاجة.
    10. استخدم وظيفة محاذاة الشعاع الآلية، وضبط ملف الهدف، وضبط التركيز لضمان تركيز الليزر بشكل صحيح على العينة. في منطقة خارج الأنسجة، نفذ تعديل الشعاع التلقائي تحت تبويب الليزر في برنامج التحكم لمحاذاة الليزر مع عدسات الأيون. سيضمن ذلك ضبط الليزر والمرحلة لجمع البيانات الأمثل. وأخيرا، نفذ توليد ملفات التعريف للهدف وضبط التركيز في تبويب حامل العينة.
    11. تأكد من أن النقاط القياسية الداخلية تنتج القمم الأيونية المتوقعة، مما يشير إلى الجاهزية لجمع البيانات. يجب أن يكون معدل ضربات القلب ذروة بارز في الجليكان عند 1211.42. كان يجب أن يكون الجليكوجين قد تباعدة قمم بارزة بانتظام، مع أعلى قمم شدة عند 1013.32، 1175.37، و1337.43.
      ملاحظة: إذا تم تحديد مشاكل في الشدة، أعد النظر في تكوين الليزر. إذا تم تحديد مشاكل في دقة الكتلة، أعد النظر في المعايرة.
  2. جمع بيانات MALDI-MSI
    1. ابدأ عملية اقتناء تصوير MALDI-MS للمناطق المحددة بالنقر على زر البدء في برنامج التصوير. يقوم الجهاز تلقائيا بتمرير الليزر على كل منطقة محددة بفواصل 50 ميكرومتر، مكتسبا طيف MS1 موجبة الأيون (m/z 500-4000) عند كل بكسل. الوقت المعتاد لجمع البيانات لعملية قسم الكبد عند هذا الدقة هو 135 دقيقة.
      ملاحظة: بعد التشغيل، يقوم الجهاز تلقائيا بحفظ الطيف لكل بكسل يتم الحصول عليه، مما ينشئ مجلد .d يحتوي على البيانات الخام.

5. تحليل بيانات MALDI-MSI

  1. استيراد وتصدير البيانات
    1. استيراد مجموعة البيانات إلى مختبر SCiLS أو برنامج تحليل MSI مكافئ، لعرض خرائط شدة الأيونات للغليكوم عبر أقسام الأنسجة.
    2. مختبر SCiLS المفتوح. اختر جديد. اختر ملف .mis من تشغيل MALDI.
    3. بمجرد فتح ملف .mis في SCiLS، اضغط على التالي. اختر النطاق التلقائي لمدى m/z. اختر المحور التلقائي لمعاملات المحور. اختر حجم الحاوية المطلق. انقر على التالي ثم على الاستيراد. اختر المجلد الذي سيتم حفظ الملف فيه.
    4. بعد الانتهاء من الاستيراد، افتح ملف .slx الجديد.
    5. انقر على الملف، واستيراد، واختر قائمة الميزات من خيار الملف. استيراد تعليقات glycome وإنشاء صور أيونية بالذهاب إلى لوحة قائمة الميزات، واختيار القائمة الصحيحة، والنقر على زر إنشاء صور أيونية.
      ملاحظة: تتوفر قوائم ميزات قوية ل N-جليكان16، 18، 19 وجليكوجين13.
    6. قم بتطبيع البيانات حسب الحاجة. يعد عدد الأيونات الكلي (TIC) هو أكثر أنواع التطبيع استخداما.
    7. بمجرد تحميل صور الأيونات، تصفح قائمة الميزات وتأكد من تكامل القمم الصحيح، مع تعديل يدويا للميزات التي لم يتم فيها دمج الذروة بالكامل. للضبط، انقر بزر اليسار على الذروة أثناء الضغط على زر Shift. بمجرد دمج القمة، اضغط على زر التحكم ومفتاح المسافة على لوحة المفاتيح. هذا سيولد صورة أيونية جديدة للقمة المعدلة.
    8. بعد تكرار ذلك لبقية قائمة الميزات، داخل لوحة الصور الأيونية، اختر قائمة ميزات الحفظ ، سم القائمة، وانقر على حفظ.
    9. اذهب إلى الملف، جدول الميزات، وافتح جدول قائمة الميزات الذي تم حفظه للتو. الترتيب حسب الذكريات/العلاقة. ستظهر الميزات المعدلة مع خلية فارغة في عمود الاسم. قم بإعادة تسمية القمم المعدلة عن طريق نسخ ولصق الاسم وإزالة القمة الأصلية عن طريق اختيار زر إزالة الصف المحدد من قائمة الميزات الموجود في منتصف جدول الميزات.
    10. بعد تعديل جميع الأسماء، يتم الحصول على قائمة نهائية مشروحة للذروة. انقر على زر إضافة الشدة الموجود بالقرب من زر الحذف. من هنا، اختر العينات المهمة لتصدير متوسط شدة الميزات المشروحة لكل منطقة تم تصويرها.
    11. تأكد من اختيار وضع معالجة فترة المساحة القصوى وعدد الأيونات الكلي للتطبيع. انقر على موافق. ستظهر أعمدة جديدة مع البيانات المقابلة. لتصدير البيانات، اختر السهم المؤشر للخارج واحفظها ك .csv.

النتائج

سمحت المعالجة الدقيقة للكبد من فأر بري، بما في ذلك قطع مقطع عرضي كامل (الشكل 1A)، بتعريف الغليكوم بواسطة MALDI-MSI، مع أوليغوسكاريدات مشتقة من الجليكوجين وغليكانات N المرتبطة ب N على نطاق من m/z (الشكل 1B). كان الجليكوجين متمركزا بشكل واسع في جميع خلايا الكبد الكبدية ويفتقر إلى الأوعية والأنسجة الضامة في المسارات البوابتية، كما هو متوقع (الشكل 1C,D). ومن المهم أن بيانات MALDI-MSI سمحت بقياس كل من التوزيع المكاني للجليكوجين وكذلك توزيع طول السلسلة، وهي سمة رئيسية للجليكوجين في حالات الأيض الطبيعية والأمراض (الشكل 1D). بالإضافة إلى ذلك، تظهر الجليكانات المرتبطة بالنيروجين المتنوعة منظمات متنوعة. يتراوح التوزيع المكاني المرصود من توزيع واسع في خلايا الكبد (الشكل 1E) إلى البؤر الإقليمية، بما يتوافق مع التنظيم الجيب للكبد (الشكل 1F)، إلى تحديد محدد لعناصر مجرى البوابة (الشكل 1G-I).

figure-results-1
الشكل 1: تحليل MALDI-MSI جليكوم لكبد الفئران. (أ) مخطط للطرق الحرجة في تحضير العينات، وجمع البيانات، والتحليل. (ب) عينات من طيف الكتلة المستمدة من النهج. الأسهم الحمراء تظهر الأوليجوسكاريدات المتباعدة بانتظام مشتقة من الجليكوجين، والتي تختلف بأحادي السكري الجلوكوز الواحد. الأسهم الزرقاء تدل على N-جليكانات، التي توجد موزعة في جميع أنحاء الأطياف. في الكبد، تكون ذروات الجليكوجين أكثر وضوحا عموما، خاصة عند قيم m/z الأعلى. (ج) التوزيع المكاني لمالتوهيكساز (DP6) المستخرج من الجليكوجين في الكبد. (د) توزيع أطوال سلاسل الجليكوجين في الكبد. (E-G) التوزيع المكاني لأنواع الجليكان المرتبطة بالنيتروجين المختلفة في الكبد. (H) تلوين الهيماتوكسيلين وإيوزين (H&E) لمنطقة مركزية مركزة، إلى جانب التعليقات التشريحية. (I) إدخال مركز مقابل يظهر التموقع المكاني لجليكان N-مرتبط إضافي (Hex5dHex1HexNAc5) في عناصر مسار الباب. أشرطة المقياس: 500 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

MALDI-MSI هو أداة ناشئة لعلم الأحياء المكاني للجليكوم. ومن المهم أن هذا البروتوكول يركز على جمع البيانات باستخدام أجهزة محددة، إلا أنه يمكن تكييفه بسهولة مع منصات MALDI-MSI من عدة موردين13. معالجة العينات متطابقة حتى الطريقة الرابعة، رغم أن بعض البائعين قد يطلبون استخدام شرائح متخصصة. تتيح تعديلات جمع البيانات، باستخدام معلمات خاصة بمنصة MALDI-MSI، التكيف السريع لهذا البروتوكول. يمكن استخدام برامج خاصة بالبائع لمعالجة البيانات، كما هو موضح في الخطوة 5، أو بدلا من ذلك، يمكن استخدام منصات لمعالجة بيانات MALDI-MSI الصارمة والقابلة للتكرار19.

يعد MALDI-MSI أداة مفيدة بشكل خاص لفهم علم الأحياء لأن الأعضاء والأنسجة والخلايا المختلفة لها أنماط مختلفة للجليكوم. الكبد مناسب جدا لتحليل الجليكوم لأنه يحتوي على مستويات عالية من الجليكوجين وأنواع مختلفة من الجليكانات المرتبطة بالنيتروجين13. أعضاء أخرى تحتوي على مستويات أعلى وتنوع من الجليكانات المرتبطة بالنيتروجين ومستويات أقل من الجليكوجين13. ومن المهم أن الغليكوم يختلف في أعضاء مختلفة حسب الحالة الأيضية والحالة المرضية للكائن الحي، لذا يوفر الغليكوم مصدرا غنيا للمعلومات البيولوجية 5,14,15,20. يعد التطوير المستمر لإنزيمات فريدة نشطة في الكربوهيدرات لتحليل MALDI-MSI بتوسيع تحليل الجليكوم إلى جزيئات حيوية متعامدة إضافية في الجليكوم.

على الرغم من امتلاكه العديد من المزايا، إلا أن MALDI-MSI محدود حاليا في الدقة مقارنة بالأدوات الأخرى المستخدمة في علم الأحياء المكاني. استخدم هذا البروتوكول جمع بيانات بدقة 50 ميكرومتر. ورغم أنها ممتازة للتحليل الفسيولوجي، إلا أن البيانات بدقة خلية واحدة ستدفع المجال بشكل كبير21. على وجه الخصوص، يمكن أن يكون التمركز الحاجز حاجزا كبيرا أمام زيادة الدقة في المنهجيات التي تستخدم رش الإنزيمات والحضانة اللاحقة في الظروف الرطبة. التطورات الحديثة في أجهزة معالجة العينات، ومنهجيات معالجة العينات، وأجهزة جمع البيانات، واستخدام التسمية الانتقائية، ومعالجة البيانات تسمح لجمع بيانات MALDI-MSI بالاقتراب من دقة الخلوي22,23. ومع ذلك، هناك مقايضات بين الدقة والإشارة إلى الضوضاء وقيود جوهرية مبنية على طرق تحضير العينات الحالية ل MALDI يجب أخذها في الاعتبار. تطبيقات محددة جدا تحقق بالفعل هدف MALDI-MSI أحادي الخلية باستخدام ابتكارات في كل من معالجة العينات24 والخوارزميات الجديدة، مما يشير إلى أن الحلول العامة لهذه المشكلات في متناول اليد 25,26,27.

بعد جمع البيانات، يمكن تلوين الشريحة عبر H&E لأغراض التعليق النسيجي. ومع ذلك، يرتبط تلف الخلايا والأنسجة بجمع بيانات MALDI-MSI، لذا تحد هذه الاستراتيجية من مدى التعليق الخلوي. بدلا من ذلك، يمكن استخدام شرائح الأنسجة المتسلسلة لتحليل H&E. توفر هذه الاستراتيجية بيانات عالية الجودة، لكنها تتطلب محاذاة وتكامل قطع عينات منفصلة.

ومن الجدير بالذكر أن الأنسجة المدمجة بالبارافين المثبتة في الفورمالين (FFPE) مناسبة جدا لتحليل الجليكوم بواسطة MALDI-MSI مع تغييرات طفيفة في بروتوكول تحضيرالعينة 13. ومع ذلك، لا يمكن استخدام أنسجة FFPE بفعالية في علم الأيض والتحليلات المشابهة، لذا يفضل استخدام العينات المجمدة حديثا، كما هو موضح هنا، في الأساليب متعددة الأوميكس28. يعد تحضير العينات عنصرا أساسيا في أي خط أنابيب MSI للجزيئات الحيوية المتقلبة، مما يتطلب طرقا خاصة لجمع والتعامل مع العينات 17,29,30.

تتقدم المنهجيات لتوسيع نطاق واستخدام الأساليب القائمة على MALDI-MSI بسرعة مع تحسينات كبيرة في الأجهزة والبرمجيات19. بالإضافة إلى ذلك، فإن الأساليب الحديثة متعددة الأبعاد28 ومتعددة الوسائط21 ، مع التعلم الآلي والذكاء الاصطناعي، تعد واعدة بشكل خاص للتعامل مع هذه مجموعات البيانات المعقدةللغاية 31.

الإفصاحات

R.C.S.، M.S.G.، وC.W.V.K. هم مديرون مشاركون لمركز أبحاث الجزيئات الحيوية المكانية المتقدمة (CASBR) في جامعة فلوريدا، وهم مؤسسون مشاركون لشركة Sugar3 LLC. تلقت R.C.S. دعما بحثيا و/أو رسوم استشارية من Maze Therapeutics. حصلت M.S.G. على دعم بحثي، ومركبات بحثية، أو رسوم استشارية من Maze Therapeutics، Valerion Therapeutics، Ionis Pharmaceuticals، PTC Therapeutics، وAro Biotherapeutics. إم. س.ج. عضو في المجلس الاستشاري العلمي لمؤسسة تشلسي هوب، متلازمة نقص الغلوط1، ومؤسسة أمراض جسم بولي جلوكوزان للبالغين.

شكر وتقدير

نشكر أعضاء مختبرات فاندر كوي، صن، وجينتري على مناقشاتهم المثمرة. وقد دعمت هذه الدراسة منح من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) لمرفق الموارد المشتركة لشراء العينات الحيوية وعلم الأمراض الانتقالية في مركز ماركي للسرطان بجامعة كنتاكي، P30CA177558 إلى دكتوراه في إدارة الأعمال، R01AG066653، R01CA266004، R01AG078702، R01CA288696، RM1NS133593 إلى R.C.S.، R35NS116824 إلى M.S.G.، R01DC019054 إلى C.W.V.K.، وكلية الطب بجامعة فلوريدا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الوسادة السفلية الماصةدينفيل ساينتيفكB1623
الأسيتونيتريل (ACN)سيغما-ألدرتش34851-4X4L
رقائق الألمنيومفيشر ساينتفيك 15078292
أنهيدريد السيتراكونيكسيغما-ألدرتش125318
أنبوب مخروطي (15 ملمتر)القلوية العلميةCW5600
جرار كوبلينعلوم الحياة DWK900570
Cryostat لايكاCM1860
كريستات تشاكلايكا14041926491
جهاز إزالة المجففبيل آرتF424004131
كوب الغسيل الكلويثيرمو فيشر88400
الإيثانولفيشر ساينتفيك 22032601
جهاز التبخر الغذائيRival CKRVSTLM21   
إدخال زجاجي (70 مم)شركة جيلLGI50
الجليكوجينسيغما-ألدرتشG8876المعيار
بيروكسيداز الفجل الحار (HRP)سيغما-ألدرتشP8125المعيار
مياه HPLCسيغما-ألدرتش270733-4X4L
HTX Ssprayتقنيات HTXM5
حمض الهيدروكلوريكفيشر ساينتفيك A144-500
إيزوأميلازميغازيمإي-إيسامي
مضخة كناوركناورP 4.1 S
شفرة منخفضة الملفعلوم المجهر الإلكتروني63059-01
وسائط التثبيت M1إبريديا1310
مطياف الكتلةبروكر دالتونيكسtimsTOF fleX
أنبوب ميكروفوج (1.5 ملم)القلوية العلميةCN3016
إبرةBD305109
الفورمالين المحايد المخزن NBFميليبور سيغماHT501128-4L
غاز النيتروجينإيرغازNIUHP300
PBSفيشر ساينتفيك SH30256. FS
أنابيب PCRشركاء ميد سبلاي62-1091-1
PNGase F PRIME-LY ULTRA نبذة عن بولدوجNZPULT10LY
مختبر SCiLSبروكر دالتونيكس1889000
شاكرثيرمو ساينتفيك88882007
Slide   علوم المجاهر الإلكترونية71873-02
ملف الشرائحمنتجات RPI212620A
سونيكاتر (بيوروبتور بيكو)دياجونودB01080010
الملقط المعقمDR InstrumentsS08098
مشرط معقمWPIWPI-500240
مقص معقمأدوات العلوم الدقيقة14084-08
حقنة    غراينجر19G342
مضخة الحقنةالعصر الجديدNE-300
شريطفيشر ساينتفيك 15-901-R
فرشاة طلاء رقيقةأنيزوس#00
حمض ثلاثي فلورو أسيتيكسيغما-ألدرتشT6508-1L
مزيج التون، تركيز منخفض ESIأجيلينتG1969-85000
قوارب الوزنسيغما-ألدرتشHS120882
زيلينسيغما-ألدرتش534056
α-cyano-4-حمض الهيدروكسي سيناميك (CHCA)شركة كايمان للكيماويات15254

المراجع

  1. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: Localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
  2. Buchberger, A. R., Delaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: A review of emerging advancements and future insights. Anal Chem. 90 (1), 240-265 (2018).
  3. Ouedraogo, R., Daumas, A., Capo, C., Mege, J. L., Textoris, J. Whole-cell MALDI-TOF mass spectrometry is an accurate and rapid method to analyze different modes of macrophage activation. J Vis Exp. 82, e50926(2013).
  4. Khalil, S. M., Cappuccio, G., Li, F., Maletic-Savatic, M. Molecular imaging of human brain organoids using mass spectrometry. J Vis Exp. 211, e66997(2024).
  5. Sun, R. C., et al. Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation. Cell Metab. 33 (7), 1404-1417 (2021).
  6. Aichler, M., Walch, A. Maldi imaging mass spectrometry: Current frontiers and perspectives in pathology research and practice. Lab Invest. 95 (4), 422-431 (2015).
  7. Conroy, L. R., et al. High-dimensionality reduction clustering of complex carbohydrates to study lung cancer metabolic heterogeneity. Adv Cancer Res. 154, 227-251 (2022).
  8. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).
  9. Powers, T. W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry workflow for spatial profiling analysis of N-linked glycan expression in tissues. Anal Chem. 85 (20), 9799-9806 (2013).
  10. Drake, R. R., Powers, T. W., Norris-Caneda, K., Mehta, A. S., Angel, P. M. In situ imaging of N-glycans by MALDI imaging mass spectrometry of fresh or formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Curr Protoc Protein Sci. 94 (1), e68(2018).
  11. Stanback, A. E., et al. Regional n-glycan and lipid analysis from tissues using MALDI-MS imaging. STAR Protoc. 2 (1), 100304(2021).
  12. Hawkinson, T. R., Sun, R. C. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging of glycogen in situ. Methods Mol Biol. 2437, 215-228 (2022).
  13. Young, L. E. A., et al. In situ mass spectrometry imaging reveals heterogeneous glycogen stores in human normal and cancerous tissues. EMBO Mol Med. 14 (11), e16029(2022).
  14. Conroy, L. R., et al. Spatial metabolomics reveals glycogen as an actionable target for pulmonary fibrosis. Nat Commun. 14 (1), 2759(2023).
  15. Clarke, H. A., et al. Glycogen drives tumor initiation and progression in lung adenocarcinoma. Nat Metab. 7 (5), 952-965 (2025).
  16. Wallace, E. N., et al. An N-glycome tissue atlas of 15 human normal and cancer tissue types determined by MALDI imaging mass spectrometry. Sci Rep. 14 (1), 489(2024).
  17. Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. J Vis Exp. 166, e62008(2020).
  18. Mcdowell, C. T., et al. Imaging mass spectrometry and lectin analysis of N-linked glycans in carbohydrate antigen-defined pancreatic cancer tissues. Mol Cell Proteomics. 20, 100012(2021).
  19. Palmer, A., et al. FDR-controlled metabolite annotation for high-resolution imaging mass spectrometry. Nat Methods. 14 (1), 57-60 (2017).
  20. Colpaert, M., et al. Neurological glycogen storage diseases and emerging therapeutics. Neurotherapeutics. 21 (5), e00446(2024).
  21. Taylor, M. J., Lukowski, J. K., Anderton, C. R. Spatially resolved mass spectrometry at the single cell: Recent innovations in proteomics and metabolomics. J Am Soc Mass Spectrom. 32 (4), 872-894 (2021).
  22. Chan, Y. H., et al. Gel-assisted mass spectrometry imaging enables sub-micrometer spatial lipidomics. Nat Commun. 15 (1), 5036(2024).
  23. Lim, M. J., et al. Maldi Hiplex-IC: Multiomic and multimodal imaging of targeted intact proteins in tissues. Front Chem. 11, 1182404(2023).
  24. Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J Am Soc Mass Spectrom. 18 (9), 1646-1652 (2007).
  25. Rappez, L., et al. Spacem reveals metabolic states of single cells. Nat Methods. 18 (7), 799-805 (2021).
  26. Grgic, A., Cuypers, E., Dubois, L. J., Ellis, S. R., Heeren, R. M. A. Maldi MSI protocol for spatial bottom-up proteomics at single-cell resolution. J Proteome Res. 23 (12), 5372-5379 (2024).
  27. Dressman, J. W., Bayram, M. F., Angel, P. M., Drake, R. R., Mehta, A. S. Single-cell multiomic MALDI-MSI analysis of lipids and N-glycans through affinity array capture. Anal Chem. 97 (24), 12493-12502 (2025).
  28. Clarke, H. A., et al. Spatial mapping of the brain metabolome, lipidome, and glycome. Nat Commun. 16 (1), 4373(2025).
  29. Juras, J. A., et al. In situ microwave fixation provides an instantaneous snapshot of the brain metabolome. Cell Rep Methods. 3 (4), 100455(2023).
  30. Cantrell, A. R., et al. Protocol for high-power, brain-focused microwave fixation to define rodent metabolism. STAR Protoc. 6 (2), 103794(2025).
  31. Ma, X., et al. An AI-driven framework to map the brain metabolome in three dimensions. Nat Metab. 7 (4), 842-853 (2025).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

رسم خرائط الجليكومتصوير طيف الكتلةتصوير طيف الكتلة بامتزاز الليزر بمساعدة المصفوفةالغليكانات المرتبطة بالنيتروجينتحديد تموضع الغليكوجينالهضم الإنزيمي للأنسجةجليكوميات كبد الفئرانالإنزيمات النشطة كربوهيدراتياًالتغاير الجليكومي المكاني
التصوير الجزيئي المكاني للجليكوم باستخدام مطيافية الكتلة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.