مقالة منهجية

طرق المشبك الديناميكي للتحقيق في ضعف استثارة الخلايا العصبية المرتبطة بالتوحد

1.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69155

⸱

أكتوبر 17, 2025

 , 
1Department of Biology, Miami University

في هذه المقالة

ملخص

يمكن أن ينشئ الفيزيولوجيا الكهربية للمشبك الديناميكي روابط سببية بين عجز إطلاق الخلايا العصبية والخلل الوظيفي في القناة الأيونية. نصف طرق وبروتوكولات المشبك الديناميكي في الخلايا العصبية بركنجي المخيخية للفأر ، مع ملاحظة الموارد المفيدة والاعتبارات التقنية. في دراسة تمثيلية ، نضيف توصيل الصوديوم النموذجي إلى الخلايا العصبية Tsc1 - / - Purkinje لإنقاذ إطلاق النار المتكرر.

الملخص

ينشأ اضطراب طيف التوحد (ASD) من مجموعة واسعة من العوامل الوراثية والبيئية. في حين أن العديد من الطفرات المرتبطة باضطراب طيف التوحد تعطل تطور المشبك أو اللدونة ، فقد ثبت أن عددا متزايدا يغير التعبير عن القنوات الأيونية ذات الجهد الكهربائي وعملها ، مما يؤدي إلى عجز في الاستثارة الجوهرية العصبية. يمكن استخدام تسجيلات مشبك الجهد الخلوي الكامل لتوصيف كيفية تأثير الطفرات المرتبطة باضطراب طيف التوحد على وظيفة القناة الأيونية. ومع ذلك ، فشلت هذه التجارب في التقييم المباشر لكيفية تأثير التوصيل الأيوني المتغير على إطلاق إمكانات العمل العصبي. تعمل الفيزيولوجيا الكهربية الديناميكية للمشبك على سد هذه الفجوة من خلال تمكين الحقن في الوقت الفعلي للتوصيلات الأيونية المحددة من قبل المستخدم في الخلايا العصبية الحية. يسمح هذا بالاختبار السببي لكيفية تأثير التغييرات في خصائص القناة الأيونية على النشاط الكهربائي لنوع معين من الخلايا. في مقالة الطرق هذه ، نصف كيفية تنفيذ الفيزيولوجيا الكهربية الديناميكية للمشبك في الخلايا العصبية بركنجي للفأر البالغة المسجلة في ظل الظروف الفسيولوجية في شرائح الدماغ المخيخية المعدة بشكل حاد. تعد الخلايا العصبية Purkinje نموذجا مناسبا بشكل خاص لهذا العمل لأن لديها قدرة جوهرية على إطلاق إمكانات عمل متكررة وعالية التردد (20-100 هرتز) ومتورطة باستمرار في خلل الدائرة المخيخية المرتبط باضطراب طيف التوحد. نحن نركز على Tsc1 ، وهو جين تعد طفرات فقدان وظيفته من بين الأسباب أحادية الجين الأكثر شيوعا لاضطراب طيف التوحد. في الخلايا العصبية في بركنجي الفأر ، تم ربط حذف Tsc1 أيضا بانخفاض تعبير قناة الصوديوم (Nav) ذات الجهد الكهربائي. نحن نستخدم نماذج الحالة الحركية ماركوف لمحاكاة وإعادة إنتاج خصائص التوصيل الملاحي للخلايا العصبية في بركنجي والمضي قدما في استخدام المشبك الديناميكي لتقييم كيفية تأثير التغييرات في الموصلية الملاحية بشكل مباشر على الإطلاق الجوهري للخلايا العصبية المخيخية السليمة. نحن نقدم التعليمات والموارد لتعديل وضبط نماذج التوصيل الأيوني. من خلال دمج نمذجة التوصيل الأيوني ، والمشابك الديناميكية ، وتقنيات المشبك التقليدية ، يوفر هذا النهج إطارا قويا ومرنا لربط الاضطرابات الجينية بالنتائج الفسيولوجية في الخلايا العصبية ذات الصلة باضطراب طيف التوحد.

المقدمة

غالبا ما أكدت التحقيقات السابقة في الدوافع الجزيئية والخلوية لاضطراب طيف التوحد (ASD) على الخلل الوظيفي المشبكي باعتباره أمرا أساسيا في الفيزيولوجيا المرضية للاضطراب1،2. أظهرت العديد من الدراسات زيادة كثافة المشبك الضادات2،3،4 ، وضعف التقليم المشبكي5 ، والتغيرات في بروتينات كثافة ما بعد المشبكي6،7 في نماذج ASD. ومع ذلك ، فقد أظهر العمل الأخير أن التغييرات في استثارة الخلايا العصبية الجوهرية هي أيضا محركات لأمراض اضطراب طيف التوحد. على سبيل المثال ، كشفت نماذج الفئران المعدلة وراثيا لاضطراب طيف التوحد وخطوط الخلايا المشتقة من المريض عن ضعف توليد إمكانات الفعل في بركنجيالمخيخي 8،9،10 والخلايا العصبية الهرمية القشرية11 ، بالإضافة إلى استثارة التغصنات المخففة والتكامل المشبكي في فئات فرعية من الخلايا العصبية الهرمية القشرية12. تعد اعتلالات القنوات التي تنطوي على طفرات فقدان الوظيفة في SCN2A ، والتي تشفر قناة الصوديوم ذات الجهد الكهربائي (Nav) Nav1.2 وحدة فرعية α المسام المكونة ، الآن سببا أحادي الجين معروفا ل ASD13 ، وقد ثبت أنه يسبب عجزا في الاستثارة الجوهرية لفئات مختلفة من الخلايا العصبية المركزية14،15،16،17. مع تقدم هذه الأنواع من التحقيقات ، من المهم إنشاء روابط سببية بين التغيرات المسببة للأمراض في الموصلات الأيونية وتأثيرات هذه التغييرات على الخلايا العصبية ووظيفة الدائرة. يوفر الفيزيولوجيا الكهربية الديناميكية للمشبك نهجا فعالا لهذه المهمة. شارب وآخرون (1992 و 1993) 18،19 ، جنبا إلى جنب مع روبنسون وكاواي (1993) 20 وصف في البداية طرق المشبك الديناميكية التي يتم فيها حقن / إضافة توصيل أيوني غير خطي محاكي ، مع أو بدون خصائص تعتمد على الجهد ، في الخلايا العصبية الحية ، مما يسمح للباحثين بتقييم كيفية تأثير الخصائص أو التغييرات المفترضة في التوصيل الأيوني بوابات الجهد على إطلاق الخلايا العصبية21 ، 22.

تم تسهيل تنفيذ تجارب المشبك الديناميكي من خلال العديد من أنظمة البرامج المتاحة مجانا مثل RTXI23 و QuB24،25 و StdpC26. ومع ذلك ، فقد أدت التطورات الحديثة إلى تبسيط تنفيذ المشبك الديناميكي باستخدام أنظمة التوصيل والتشغيل التجارية التي تتيح تطوير موصلات النموذج وتعديلها وتطبيقها على جهاز كمبيوتر واحد وضمن حزمة برامج واحدة. هنا ، نقدم بروتوكولات لأداء المشبك الديناميكي باستخدام نظام Sutter dPatch27 ونقدم عينة تحقيق نختبر فيه كيفية تأثير الحذف المستهدف للتصلب الحدني 1 (Tsc1) 9 ، وهو موضع سائد للطفرات ل ASD28 ، على إطلاق الخلايا العصبية المخيخية بركنجي نتيجة للتغيرات في التعبير عن توصيل الصوديوم المسور بالجهد8.

البروتوكول

تم إجراء جميع التجارب على وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل إرشادات لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة ميامي (البروتوكول # 1044). استخدمت التجارب الفئران من الذكور والإناث من النوع البري C57BL / 6J وخطوط معدلة وراثيا بخلفية سلالة C57BL / 6J. بالنسبة للتجارب الفيزيولوجية الكهربية ، كانت تتراوح أعمارها بين 6-7 أسابيع. تم أخذ جميع التسجيلات من الخلايا العصبية بركنجي في الفصيصات 5 أو 6 أو 7 في الدودة المخيخية.

1. الإعداد وإعداد الأنسجة لتجارب مشبك رقعة الخلايا العصبية بركنجي

  1. تحضير 1 لتر من السائل النخاعي الدماغي الاصطناعي (ACSF) يحتوي على: 125 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.5 ملي كلوريد الصوديوم ، 1.25 ملي هيدروكسيد الصوديوم2PO4 ، 25 ملي هيدروكسيد الصوديوم3 ، 2 ملي كلور الكالسيوم2 ، 1 ملي MgCl2 ، و 25 ملي سكر العنب عند درجة الحموضة 7.4 (~ 300 مللي أوسم / لتر). قم أيضا بإعداد 250 مل من "محلول القطع" الذي يحتوي على: 240 ملي السكروز ، 2.5 ملي KCl ، 1.25 ملي NaH2PO4 ، 0.5 ملي كلور الكالسيوم2 ، و 7 ملي MgCl2. قم بتدوير (فقاعة) ACSF ومحاليل القطع بغاز الكربوجين (95٪ O2/5٪ CO2) لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام وبشكل مستمر طوال جميع التجارب.
  2. قم بإعداد حجرة احتجاز شريحة الدماغ مملوءة ب ACSF لاستخدامها لاحقا. تأكد من غمر شرائح المخيخ (بمجرد إضافتها إلى حجرة الشريحة) مع تعرض جانبي شرائح المخيخ ل ACSF. أنجز ذلك عن طريق وضع شرائح مغمورة على شبكة نايلون ممتدة بإحكام مغمورة أيضا.
  3. قم بإعداد محطة الجراحة. جاهز أربع قطع من الشريط اللاصق التي سيتم استخدامها لتثبيت المخدر. في دلو مملوء بالثلج أو مقلاة ثلج ، ضع النصف السفلي من طبق بتري في الثلج بحيث تكون الجدران متجهة لأسفل وقاع طبق بتري متجها لأعلى. ضع ورق ترشيح (≥ 3 سم2) على قاع طبق بتري وشبعه ب 2-3 مل من محلول التقطيع.
    ملاحظة: بالنسبة للتجارب الموصوفة ، يتم استخدام اهتزاز ضغط لتقطيع 350 ميكرومتر شرائح المخيخ parasagittal. باستخدام الضغط ، يتم لصق أنسجة التقطيع على أنبوب عينة بلاستيكي يتناسب مع أنبوب معدني رفيع محيط. أثناء التقطيع ، يتم دفع أنبوب العينة عبر الأنبوب المعدني ، والذي يظل ثابتا. بعد لصق الأنسجة على أنبوب العينة ، يتم تضمين الأنسجة في الأغروز الدافئ بنسبة 2٪. يتم لصق شفرة الضغط على حامل ثابت ، يتم توصيله بذراع الاهتزاز. لا تتطلب الأنواع الأخرى من الاهتزازات تضمين الأنسجة في الاغاروز الدافئ ، ولكن يجب أن تعمل بشكل جيد بالمثل للتجارب الموصوفة.
  4. أيضا ، في الجليد ، ضع شفرة حلاقة أحادية الحواف ودورق صغير (10 مل) مملوء بمحلول القطع. احتفظ بكتلة تقشعر لها الأبدان ، والتي تستخدم لتبريد الاغاروز الدافئ بسرعة بمجرد إضافته إلى أنبوب العينة ، بالإضافة إلى حقنة سعة 30 مل مملوءة بمحلول القطع المبرد على الثلج. تأكد من توصيل المحقنة سعة 30 مل بقسم 30-60 سم من الأنبوب الوريدي (IV) (عبر مستدق ذكر Luer lock) متصل (في الطرف النهائي) بإبرة (≥ 26 جم) بقاعدة أنثوية Luer lock.
  5. ضع محلول التقطيع المتبقي في فريزر -80 درجة مئوية. بمجرد أن يصبح محلول التقطيع هذا قوام ثلجي (20-25 دقيقة) ، أخرجه من الفريزر -80 درجة مئوية وضعه على الثلج.
  6. قم بتخدير فأر بالغ يبلغ من العمر 5-8 أسابيع بحقنة داخل الصفاق بمقدار 1 مل / كجم من وزن من كوكتيل الكيتامين (10 مجم / مل) / إكسيلازين (0.25 مجم / مل).
  7. اصنع محلول أغاروز بنسبة 2٪ عن طريق إذابة 0.5 جم من الاغاروز في 25 مل من محلول القطع. بعد تخدير (لا يستجيب لقرصة إصبع القدم) ، قم بتسخين محلول الاغاروز بنسبة 2٪ (~ 30 ثانية في الميكروويف) وانقل محلول الاغاروز الدافئ إلى حمام مائي 40 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب إكمال الخطوات المرقمة 1.8-1.18 بشكل عاجل وقبل أن يتصلب الاغاروز الدافئ.
  8. قم بتثبيت أطراف على طاولة الجراحة بشريط لاصق. باستخدام المقص ، افتح التجويف الصدري للحيوان ، وتأكد من عدم قطع الرئتين وأعضاء البطن. استخدم ملقط أو مرقئ للقفل لإبقاء القفص الصدري مفتوحا ، مما يؤدي إلى تعريض القلب. لتحقيق ذلك ، قم بقفل الملقط على عظم القص وضعه بعناية باتجاه الجزء الأمامي من (مع وجود ثقوب إصبع الأداة بجوار رأس).
  9. أدخل الإبرة المتصلة بحقنة 30 مل في البطين الأيسر واستخدم الملقط لضغط الأنسجة حول الإبرة ، مع تثبيت الإبرة داخل الغرفة اليسرى داخل البطين. باستخدام المقص الجراحي ، قم بعمل قطع صغير في الأذين الأيمن وقم بتشغيل بسرعة ب 25 مل من محلول القطع المبرد.
    ملاحظة: تأكد من دخول البرفوزيت إلى البطين الأيسر ويخرج من الأذين الأيمن ، مما يؤدي إلى تنظيف الدم من الدورة الدموية للحيوان.
  10. عند اكتمال التروية ، قم بقطع رأس بسرعة وقطع فروة الرأس على طول خط الوسط من الرأس باتجاه البريجما لفضح سطح الجمجمة.
  11. باستخدام المقص ، قم بإزالة النسيج الضام من الجانب الخلفي للجمجمة ، وقم بإزالة أنسجة الحبل الشوكي الزائدة ، مما يضمن عدم بروز الحبل الشوكي من الثقبة العظمية.
  12. ضع شفرة مقص واحدة في الثقبة المغنوم واقطع على طول محيط الجمجمة على كلا الجانبين الزمني باتجاه بريجما ، تاركا بعض أنسجة الجمجمة في مكانها عند بريجما.
  13. ضع شفرة مقص أو نصف ملقط ناعم في الثقبة العظمية وارفعها بشكل متفوق ، مع فصل الجمجمة عن الدماغ. احرص على عدم دفع شفرة المقص أو الملقط إلى الدماغ أثناء رفع الجمجمة.
  14. استخدم أداة جراحية بملعقة لغرف تحت الدماغ (من الأمام) وإزالة الدماغ بعناية إلى دورق 10 مل يحتوي على محلول قطع مبرد ، مع الحرص على حماية المخيخ أثناء نقل الدماغ. قم بالتغيير إلى قفازات نظيفة في هذه المرحلة.
  15. قم بإزالة الدماغ بعناية من الدورق (باستخدام أداة الملعقة) وضعه على ورق الترشيح (على طبق بتري). استخدم الشفرة أحادية الحواف للقطع على طول المحور النظمي على بعد بضعة ملليمترات من خط الوسط. تخلص من الأنسجة المقسمة الأصغر حجما. قم بعمل قطع إكليلي ثان في منتصف الطريق من خلال الدماغ الأمامي (الأمامي للمخيخ). تخلص من الأنسجة المقطوعة إكليليا التي تكون أمام المخيخ.
  16. قم بتمرير الشفرة أحادية الحافة أسفل الجزء الأمامي من الدماغ الأمامي وارفعها لتدوير الأنسجة المتبقية بحيث يكون جانب القطع النظيمي الأولي متجها لأسفل (على ورق الترشيح) ويكون نصف الكرة المخيخية غير المقطوع مواجها لأعلى.
  17. ضع أنبوب العينة في وضع مستقيم في الثلج وأضف طبقة رقيقة من الغراء الفائق (لاصق سيانوأكريلات) على سطح الأنبوب. باستخدام أداة ملعقة مع انحناء 90 درجة ، انقل أنسجة المخ بعناية من ورق الترشيح إلى سطح أنبوب العينة ، مع الحفاظ على اتجاه الأنسجة. تأكد من استمرار مواجهة نصف الكرة المخيخية غير المصقول. بمجرد وضع الأنسجة / لصقها على أنبوب العينة ، حرك الأنبوب المعدني لأعلى بحيث يحيط بأنسجة المخ.
  18. باستخدام ماصة آلية سعة 10 مل ، املأ أنبوب العينة بالاغاروز الدافئ (تضمين أنسجة المخ). قم بتبريد الأنسجة بسرعة (المضمنة الآن في الاغاروز الدافئ) عن طريق تثبيت كتلة التبريد حول الأنبوب المعدني لمدة ~ 30 ثانية.
  19. ضع أنبوب العينة في حجرة الحمام الاهتزازية واملأ الحمام بمحلول القطع المشقوط. قم برش محلول القطع باستمرار أثناء تقطيع أنسجة المخ ، لكن لا تعرض شرائح المخيخ مباشرة لفقاعات الغاز.
  20. قطع شرائح 300-350 ميكرومتر ، وانقل كل شريحة على الفور إلى حجرة تثبيت الشريحة ، مملوءة بدرجة حرارة الغرفة المتناثرة ACSF. بمجرد وضع جميع الشرائح في حجرة الشرائح ، احتضن حجرة الشرائح في حمام مائي بدرجة حرارة 33 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة.
  21. بعد 25 دقيقة في الحمام المائي ، ضع حجرة الشريحة (مرة أخرى) في درجة حرارة الغرفة ، وانتظر 35 دقيقة إضافية على الأقل قبل محاولة تسجيل التصحيح من أي من شرائح المخيخ.

2. تكوين نموذج التوصيل القائم على ماركوف في المشبك الديناميكي

ملاحظة: المشبك الديناميكي هو التطبيق في الوقت الفعلي للتوصيل النموذجي لخلية حية. يتم تسجيل / أخذ عينات من جهد الغشاء عبر قطب كهربائي حاد أو رقعة ، ويتم إرسال الإشارة الرقمية إلى برنامج المشبك الديناميكي ، والذي يحسب ، باستخدام نموذج (نماذج) التوصيل الأيوني الذي يتم تطبيقه ، حقن تيار المشبك الديناميكي المناسب للجهد الذي تم أخذ عينات منه. يتم إرسال إشارة حقن تيار المشبك الديناميكي المحسوبة إلى مكبر الصوت ومرحلة الرأس ليتم حقنها (عبر القطب) في الخلية. لكي تتم إضافة الموصلية النموذجية بشكل مناسب إلى الخلية التي تطلق إمكانات العمل ، والتي تؤدي إلى تغييرات عابرة سريعة في جهد الغشاء ، يجب أن يكون تردد أخذ عينات الجهد مرتفعا بدرجة كافية ، ويجب أن يكون التأخير بين عينة الجهد وحقن تيار المشبك الديناميكي (يسمى أحيانا زمن الانتقال) ضئيلا وثابتا29.

  1. قبل أي تجربة مشبك ديناميكي ، قم بتطوير أو الحصول على النموذج الرياضي للتوصيل (الموصلات) الأيونية لاستخدامها في تجربة المشبك الديناميكي. يمكن أن تكون هذه النماذج في شكل نموذج حالة حركية ماركوف ، أو نموذج هودجكين هكسلي (HH) ، أو موصلية سلبية (خطية). تأكد من أن نموذج التوصيل المختار يعيد إنتاج الخصائص الحركية والمعتمدة على الجهد للتوصيل الأيوني المقصود بدقة.
    ملاحظة: قد يؤكد المجربون خصائص التوصيل الأيوني النموذجي ، قبل استخدامه في تجارب المشبك الديناميكي ، عن طريق اختبار التوصيل النموذجي (في السيليكو) في دراسات محاكاة مشبك الجهد. يتم وصف الخصائص والاعتبارات المهمة لحالة ماركوف الحركية ونماذج التوصيل العالي في قسم المناقشة. توضح الخطوات أدناه إعداد نموذج توصيل ماركوف في برنامج المشبك الديناميكي.
  2. قم بإنشاء أو الحصول على مخطط انتقال حالة ماركوف لنموذج التوصيل لاستخدامه في تجارب المشبك الديناميكي. استخدم هذا الرسم التخطيطي لتجميع نموذج توصيل ماركوف بدقة داخل برنامج المشبك الديناميكي (الموضح أدناه).
    ملاحظة: SutterPatch هو برنامج الحصول على بيانات مضخم dPatch. يمكن إجراء تجارب المشبك الديناميكي داخل البرنامج ، مما يسمح بتجميع وتطبيق الموصلات النموذجية عبر حقن التيار أثناء بروتوكولات المشبك الحالي. يظهر مخطط انتقال حالة ماركوف لموصلية الصوديوم ذات الجهد الكهربائي النموذجي ، بناء على قياسات تيار Nav من الخلايا العصبية Purkinje للفأر ، في الشكل 1 أ. تم تطوير هذا النموذج بواسطة Ransdell et al. ، 202230 وتم استخدامه للتحقيق في دور مكونات تيار الصوديوم الثابتة والمتجددة في إطلاق الخلايا العصبية Purkinje31. ترتبط حالات البوابات (C و IC و IF و IS و O) بثوابت معدل الانتقال ، يشار إليها بالمتغيرات (على سبيل المثال ، S0 و S3 و S1 و S4). يتم استخدام هذا النموذج في تجارب المشبك الديناميكي التمثيلي ، وهو متاح للتنزيل على GitHub: https://github.com/morenomdphd/Resurgent_INa.
  3. في برنامج الحصول على البيانات ، افتح نافذة محرر المشبك الديناميكي من علامة التبويب SutterPatch > محرر المشبك الديناميكي أو بالنقر فوق الرمز المقابل في نافذة لوحة القيادة. تظهر أجزاء من نافذة محرر المشبك الديناميكي في الشكل 1 ب.
    ملاحظة: تحتوي نافذة محرر المشبك الديناميكي على جميع الإعدادات اللازمة لتطبيق التوصيل النموذجي أثناء بروتوكول تسجيل المشبك الحالي. تسمح واجهة تجمع التوصيل (الشكل 1 ب ، أعلى اليسار) للمستخدمين بتنظيم مجموعات توصيل النموذج وتحميلها في وقت واحد.
  4. في واجهة تجمع التوصيل (الشكل 1 ب، أعلى اليسار)، قم بإنشاء تجمع بالنقر فوق جديد وتسميته حسب الرغبة. بمجرد تحديد تجمع التوصيل ، على يمين النافذة في واجهة محدد Headstage (الشكل 1 ب ، أسفل اليسار) ، حدد نوع النموذج لتجمع التوصيل المعني (النموذج - ماركوف ، هودجكين هكسلي ، الموصلية المتغيرة ، إلخ) ومتى يجب تطبيق الموصلية (الموصلات) النموذجية ، مثل أثناء الروتين / البروتوكول (الوضع النشط). تسمح واجهة محدد Headstage أيضا بتحديد معدل تحديث المشبك الديناميكي (بالكيلو هرتز) ومصدر إشارة الجهد (انظر الشكل 1 ب ، على اليمين). بالنسبة إلى مصدر إشارة الجهد ، حدد المسرح الأمامي الذي يسجل إشارة الجهد.
  5. في لوحة محدد Headstage، على سبيل المثال نموذج ماركوف توصيل التنقل (الشكل 1 أ)، حدد نموذج ماركوف للنموذج، أثناء عمليات المسح للوضع النشط، 200 كيلو هرتز لمعدل التحديث، والمسرح 1 لمصدر إشارة الجهد. تحقق من إشارة تطبيق وأمر إلى AuxOUT1 لبدء حسابات النموذج استجابة لإشارة الجهد وإضافة حقن تيار المشبك الديناميكي إلى أي بروتوكولات تيار المشبك ، على التوالي (الشكل 1 ب ، أسفل اليسار).
  6. أسفل لوحات محرر المشبك الديناميكي الرئيسية توجد مصفوفة الحالة (الشكل 1 ج ، أسفل). قم بتحرير مصفوفة الحالة بالنقر أولا فوق تحرير معلمات النموذج في واجهة محدد Headstage (الشكل 1 ب ، أسفل اليسار). ستظهر نافذة جديدة بجانب المحرر تسمى معلمات نموذج ماركوف المشبك الديناميكي. في هذه اللوحة ، أدخل معادلات مصفوفة الحالة التي تمثل توصيل نموذج ماركوف.
  7. في لوحة إعدادات القناة (الشكل 1 ب، أعلى اليمين)، حدد نماذج التوصيل المحفوظة التي يجب تطبيقها (في المشبك الديناميكي). بدلا من ذلك ، حدد قناة فارغة وابدأ في إنشاء توصيل نموذج جديد. على يمين هذه اللوحة ، أدخل عكس V (إمكانات انعكاس أيونات التوصيل النموذجية). لدراستنا باستخدام موصلية الصوديوم، أدخل 55.0 mV لتعكس إمكانات انعكاس الصوديوم بناء على ACSF والمحلول الداخلي للقطب الكهربائي.
  8. أيضا في لوحة إعدادات القناة ، قم بتوفير عدد الحالات الحركية للتوصيل المحدد (انظر الشكل 1 ب ، المربع الأحمر العلوي الأيمن). هنا ، أدخل 9 لتعكس الحالات الحركية التسعة للتوصيل النموذجي (انظر الشكل 1 أ).
  9. أسفل لوحة إعدادات القناة توجد لوحة معادلات الحالة . ضع المعادلات الثابتة لمعدل انتقال الحالة بشكل مناسب في مصفوفة حالة البوابات لتعكس الترتيب الطوبولوجي لنموذج ماركوف. أدخل المعادلات في لوحة معادلات الحالة وقم بتوفير معرف ، بدءا من "S0" (الشكل 1 ب ، في الوسط).
    ملاحظة: الترتيب الذي يتم به إدخال هذه المعادلات ليس مهما ، طالما أن هذه المتغيرات مملوءة بشكل مناسب في مصفوفة حالة البوابة لتعكس طوبولوجيا نموذج ماركوف.
  10. لملء مصفوفة حالة البوابة بمتغيرات ثابت المعدل المحددة الآن ، انقر فوق تحرير مصفوفة الحالة على الجانب الأيمن من لوحة معادلات الحالة (الشكل 1 ب ، الوسط). يتم إعطاء كل حالة حركية رقما يبدأ من 0. على سبيل المثال ، بالنسبة لنموذج الحالة ثنائية الحركة ، الذي يحتوي على الحالتين X و Y ، سيتم استدعاء هذه الحالات "0" و "1" وستتضمن ثابتين لمعدل الانتقال a1 و b1 ، حيث ينتقل a1 من 0 إلى 1 ، وينتقل b1 من 1 إلى 0.
  11. لتوصيل هذه المعادلات بشكل مناسب باستخدام محرر مصفوفة الحالة (الشكل 1 ب ، الأسفل) ، أدخل ثوابت المعدل في جدول يحتوي على صفوف وأعمدة مرقمة ، كلاهما يبدأ من 0 (انظر المثال في الشكل 1 ج).
    ملاحظة: يتم تحديد الحركة من حالة إلى أخرى من خلال موقعها في هذا الجدول في شكل "صف إلى عمود". على سبيل المثال ، في مثال نموذج الحالتين في الخطوة 2.1 ، يعتمد الانتقال من الحالة 0 إلى الحالة 1 على ثابت المعدل "a1" الذي يتم وضعه بعد ذلك في الصف 0 ، العمود 1. يقود ثابت معدل الانتقال "b1" الانتقالات من الحالة 1 إلى الحالة 0 ، وبالتالي يجب وضع ثابت المعدل في الصف 1 ، العمود 0. في الشكل 1 ج ، تحتوي مصفوفة حالة البوابات النموذجية على ثوابت معدل تعكس طوبولوجيا نموذج التوصيل الملاحي الموضح في الشكل 1 أ. على سبيل المثال ، "S0" هو ثابت المعدل الذي يحدد التحولات من IC1 إلى الحالة الحركية IC2 ؛ وهكذا ، يتم وضع "S0" في الصف 0 ، العمود 1 من مصفوفة حالة البوابة (الشكل 1 ج). تقوم المعادلات الثابتة لمعدل الانتقال التي تحدد كل متغير ثابت معدل بملء مصفوفة الحالة المملوءة (الشكل 1 ج ، أقل).
  12. نظرا لأن معادلات ثابت المعدل متصلة من خلال لوحة محرر مصفوفة الحالة ، فإن الاتصالات (الصف والعمود المقابلان) ستملأ لوحة الاتصالات بجوار المعادلة (الشكل 1 ب ، منتصف اليمين). لاحظ حالة الفتح / التوصيل في نموذج توصيل الصوديوم التمثيلي (الشكل 1 أ) ، المضافة إلى الصف والعمود 7 من الشكل 1 ج (أعلى ، مربعات حمراء) ، وهو أمر مهم للخطوة التالية.
  13. في الشكل 1 ب (أسفل اليمين) ، استخدم لوحة معادلات التوصيل (nS) لتحديد سعة توصيل النموذج الذي سيتم تطبيقه أثناء المشبك الديناميكي. حدد الحالات المفتوحة / الموصلة في نموذج ماركوف وقدم قيمة التوصيل (الشكل 1 ب ، أسفل ، مربع أحمر).
  14. في هذه التجربة ، أدخل "400 nS" في المربع "G7" ، والذي يضيف قيم ذروة تيار Nav التي تشبه ذروة تيارات Nav المقاسة في دراسات مشبك الجهد على الخلايا العصبية Purkinje للفأر.
  15. بمجرد اكتمال الخطوات المذكورة أعلاه، انقر فوق تحميل لتجهيز النموذج لتطبيق المشبك الديناميكي بمجرد بدء روتين المشبك الحالي.
  16. استخدم عملية مماثلة لترتيب نماذج HH ؛ ومع ذلك ، أضف معادلات لتحديد حالات البوابات المستقلة (في معادلات البوابة) والتوصيل تحت G كحد أقصى.
  17. لتطبيق الموصلية الديناميكية للمشبك ، قم أولا بإنشاء روتين المشبك الحالي باستخدام محرر الروتين (انقر فوق علامة التبويب SutterPatch > محرر الروتين) (الشكل 1 د). لإنشاء روتين المشبك الحالي، حدد قناة الإخراج الأصلية (وهي StimOut1 في هذا المثال). سيؤدي هذا إلى فتح لوحة تسمح للمستخدم بتحديد إخراج الأمر الحالي أثناء الروتين. تأكد من ضبط وضع التسجيل على CC_Mode في المحرر الروتيني.
    ملاحظة: في التجارب التمثيلية ، نظرا لأن هذا البروتوكول يعمل مع خلايا إطلاق تلقائي ، يتم استخدام روتين / بروتوكول مشبك تيار خال من الفجوات يحتوي على حقن تيار صفري.
  18. في قنوات إدخال المحرر الروتيني (الشكل 1D ، أعلى اليمين) ، حدد إشارات الإدخال ، والتي ، أثناء التجارب ، ستملأ نوافذ النطاق المسجلة. يجب أن تتضمن هذه المدخلات إشارة جهد ، وتشمل أيضا حقن تيار أمر الروتين ، بالإضافة إلى حقن تيار المشبك الديناميكي ، المسمى Current1 و AuxIN1 ، على التوالي (الشكل 1D ، أسفل اليسار).
  19. بالنسبة لإجراءات المشبك الحالي التي تتضمن أوامر حقن تيار إيجابي و / أو سالب ، سيتم دمج إشارة حقن تيار الأمر تلقائيا مع إشارة تيار المشبك الديناميكي. قم بإنشاء نافذة نطاق ظاهري لطرح الإشارة الحالية للأمر بحيث يكون هناك سجل لحقن تيار المشبك الديناميكي المعزول. لإنشاء نافذة النطاق الظاهري الجديدة، حدد أولا قناة إدخال إضافية عن طريق تحديد خانة الاختيار Virtual1.
  20. ضمن محرر الروتين، ضمن نوع الرياضيات، حدد المعادلة وحدد (ضمن القناة المصدر) إشارة إدخال الأمر لروتين المشبك الحالي، والتي في هذا المثال هي Current1. أدخل معادلة في الحقل المفتوح لطرح إشارة أمر المشبك الحالي من إشارة حقن تيار المشبك الديناميكي.
    ملاحظة: بالنسبة لتجربة المثال هذه، يتم ذلك باستخدام المعادلة t[3]-t[2]. تعرض نافذة نطاق Virtual1 الآن حقن تيار المشبك الديناميكي (معزول عن إشارة الأمر الحالية). يتمتع المستخدمون بالقدرة على تخصيص تسميات قنوات الإدخال أو الإخراج بالنقر المزدوج ضمن التسمية.

3. الحصول على تسجيلات المشبك الحالي من الخلايا العصبية Purkinje للفأر في شرائح المخيخ parasagittal

  1. قم بتجهيز جهاز الفيزيولوجيا الكهربية بغرفة شرائح الأنسجة (الجاذبية) التي يتم تدفئتها مع ACSF إلى درجة حرارة فسيولوجية قريبة (34-36 درجة مئوية). ضع بحذر شريحة مخيخية نظيرية في حجرة الشرائح واستخدم شريحة قيثارة للحفاظ على شريحة المخيخ في وضع مغمور وثابت. تأكد من أن القطب الأرضي المكلور ومسبار درجة الحرارة مغموران أيضا ومستقران داخل غرفة شريحة المخيخ.
  2. حدد موقع طبقة الخلايا العصبية Purkinje باستخدام عدسة موضوعية غامرة 40x. الخلايا العصبية بركنجي كبيرة وعلى شكل دمعة. عادة ما يبدو غشاء البلازما لخلايا بركنجي السليمة أملسا ، والنواة غير مرئية.
  3. بمجرد تحديد خلية بركنجي سليمة واستهدافها لتسجيل المشبك ، اضبط العدسة الموضوعية المجهرية لأعلى. ضع والتركيز على طرف قطب كهربائي دقيق زجاجي متصل بحامل قطب كهربائي ومسرح الرأس. تحكم في القطب الرأسي / القطب الكهربائي الدقيق بواسطة معالج دقيق آلي ثلاثي المحاور.
    ملاحظة: بالنسبة لهذه التجارب ، تأكد من أن الأقطاب الكهربائية الدقيقة لها قيم مقاومة تتراوح من 2-4 MΩ ومملوءة بمحلول داخلي مناسب لمشبك التيار. يحتوي المحلول الداخلي المستخدم في التجارب التمثيلية على: 144 ملي كلوريد الكلوريد (كلوريد الصوديوم) و(4 مللي مولار من الغلوكونات) و(0.2 ملي مولار من الغلوكونات) و(0.2 مللي مولار من الغدة الصودية) و(10 ملي مولار من الغدة الصودية) و(4 ملي مولار من مادة الغلوسوند الصوديومية) و(4 ملي مولار من مادة الغلوكونات التفاعلية) و(0.5 ملي مولار من الغلوكونات الأمريكية) و(0.2 ملي مولار من الغلوكونات الإنجليزية) و(3 ملي مولار من الغلوزون الغني كلوريد الصوديوم) و(10 ملي مولار من الغدة الصودية) و(4 ملي مولار من مادة البولي سوسيد الصوديوم) و(4 ملي مولار من مادة البولي سوسيد الصوديوم) و(4 ملي مو
  4. قبل الاقتراب من الخلايا العصبية Purkinje المستهدفة ، أضف 2-3 مل من ضغط الهواء الإيجابي إلى منفذ ضغط حامل القطب.
  5. قم بالتبديل إلى وضع VC على لوحة التحكم في مكبر الصوت وقم بتطبيق وظائف تعويض القطب الكهربائي وإزاحة جهد القطب. في المثال هنا ، قم بذلك بالنقر فوق تلقائي بجوار خيارات تعويض القطب وإزاحة الجهد.
  6. ابدأ بروتوكول اختبار ختم الغشاء المستمر (انقر فوق اختبار الغشاء). اضبط معلمات اختبار الغشاء على (أو بالقرب من) 5 مللي ثانية بخطوة 5 مللي فولت أو 10 مللي فولت. اضبط إمكانات الاحتفاظ (V-holding) على 0 مللي فولت.
  7. حرك القطب الصغير نحو الخلية المستهدفة ، واضبط المستوى البؤري للحفاظ على التركيز عند طرف القطب أو أقل قليلا. ضع القطب الكهربائي فوق غشاء بلازما الخلية المستهدفة قليلا. استخدم المعالج الدقيق والضغط الإيجابي من طرف القطب لدفع الحطام خارج الخلية بعيدا عن سوما الخلية المستهدفة ، و "تنظيف" الغشاء السطحي.
  8. بعد أن تصبح الخلية المستهدفة خالية من الحطام خارج الخلية ، ضع القطب ببطء بالقرب من سطح الغشاء في الطرف العريض من سوما الخلايا العصبية Purkinje ، والتي يمتد منها المحور العصبي من جسم الخلية. عندما يتم إنزال طرف القطب الكهربائي إلى الغشاء ، من المحتمل أن تصبح الغمازة مرئية على سطح الغشاء (بسبب الضغط الإيجابي للقطب الكهربائي). في هذه المرحلة ، حرر الضغط الإيجابي واستخدم شفط الفم لتطبيق كمية صغيرة من الضغط السلبي.
  9. في لوحة التحكم في مكبر الصوت ، قم بتغيير إمكانات الاحتفاظ ب V إلى -80 مللي فولت (من 0 مللي فولت). عند مراقبة اختبار ختم الغشاء، عندما تحقق مقاومة الماصة ≥ 1 جيجا أوم، قم بزيادة الضغط السلبي وانقر فوق وظيفة انطلاق على لوحة اختبار ختم الغشاء لتمزق الغشاء وتحقيق تكوين مشبك التصحيح الخلية بالكامل.
  10. استخدم بروتوكولا موجزا لمشبك الجهد لقياس الخصائص السلبية للغشاء (قيم السعة ومقاومة الإدخال) قبل التبديل ، عبر لوحة تحكم مكبر الصوت ، إلى وضع المشبك الحالي.
  11. بعد التبديل إلى وضع المشبك الحالي ، قم بتطبيق تعويض توازن الجسر إلى ≥ 70٪.
  12. قبل تطبيق موصلية المشبك الديناميكية مع قطب كهربائي رقعة ، قم بتصحيح خطأ جهد الوصلة (والذي يتم حسابه بناء على تكوين محاليل القطب الداخلي و ACSF). بالنسبة للحلول في التجارب التمثيلية، اطبق تصحيح جهد الوصلة بمقدار 17.5 mV. في دراسات المشبك الديناميكي ، يعد التصحيح الدقيق لجهد الوصلة أمرا بالغ الأهمية بحيث يتم استخدام إشارة جهد دقيقة بواسطة نموذج (طرازات) التوصيل لحساب حقن تيار المشبك الديناميكي.

4. تطبيق الموصلية الديناميكية المشبك

  1. نظرا لأن الخلايا العصبية Purkinje تطلق إمكانات العمل المتكررة تلقائيا ، فقم بتسجيل خصائص إطلاق النار قبل إضافة (أو طرح) توصيل أيوني نموذجي لاختبار صحة الخلية وقياس الخصائص الأساسية لاستثارة الغشاء. قم بتطبيق الموصلية النموذجية بالنقر فوق تحميل في نافذة إعدادات المشبك الديناميكي . ستظهر الآن ملصق DynC صغير على وحدة تحكم dPatch ، مع تراكب CC (انظر الشكل 1D ، المربعات الحمراء).
  2. بعد تشغيل / تحميل المشبك الديناميكي ، يتم تطبيق توصيل المشبك الديناميكي تلقائيا أثناء تنشيط روتين / بروتوكول المشبك الحالي. اعرض الحقن الديناميكي لتيار المشبك على نافذة النطاق المقابلة لإشارة الإدخال المحددة AuxIN1 .
    ملاحظة: تعد التسجيلات المتناوبة لإطلاق النار التلقائي مع وبدون تطبيق الموصلات الديناميكية بوساطة المشبك مهمة لتحديد كيفية تأثير توصيل النموذج المطبق على الاستثارة ، ولتحديد ما إذا كانت مستويات الإثارة الأساسية مستقرة / متسقة طوال التجربة.

النتائج

في التجارب المقدمة ، نطبق ، باستخدام المشبك الديناميكي ، موصلية الصوديوم ذات الجهد الكهربائي (Nav) على الخلايا العصبية البالغة (6-7 أسابيع) من خلايا بركنجي المخيخية للفأر المعزولة بشكل حاد في تحضير شريحة مخيخية طفرية السهمية. يتم إجراء الدراسات على الفئران البرية (الضابطة) والفئران المعدلة وراثيا ، حيث يتم استخدام إعادة تركيب Cre-loxP لحذف التصلب الحدبي 1 (Tsc1) بشكل انتقائي من الخلايا العصبية المخيخية Purkinje. مركب التصلب الحدبي (TSC) هو اضطراب متعدد الأجهزة ناتج عن طفرات فقدان الوظيفة في TSC1 أو TSC232،28،33. عادة ما يتم تشخيص الأفراد المصابين ب TSC باضطرابات الصرع والضعف الإدراكي واضطراب طيف التوحد34،35. تظهر الفئران المصابة بحذف Tsc1 الخاص بالخلايا العصبية Purkinje ، والمشار إليها هنا باسم Tsc1mut / mut ، العديد من الأنماط الظاهرية السلوكية المرتبطة باضطراب طيف التوحد ، بما في ذلك ضعف الوظيفة الحركية ، وسلوك التفاعل الاجتماعي ، والأصوات ، بالإضافة إلى السلوكيات المتكررة المبالغ فيها9،36. Tsc1mut / mut كما ثبت أن الخلايا العصبية بركنجي قد خففت من إطلاق إمكانات الفعل (الشكل 2 أ ، ب) ، والذي يرتبط بانخفاض كبير في سعات تيار التبحرية (الشكل 2 ج) وتعبير قناة التنقل في الأجزاء الأولية المحورية من الخلايا العصبية بركنجي Tsc1mut / mut 8. التيارات الملاحية في الخلايا العصبيةبركنجي Tsc1mut / mut لها خصائص حركية وتعتمد على الجهد مماثلة مثل الخلايا العصبية البرية من النوعالبري 8. في نموذج الماوس المعدل وراثيا Tsc1mut / mut ، استخدمنا المشبك الديناميكي لاختبار ما إذا كانت إضافة توصيل Nav إلى الخلايا العصبية Tsc1mut / mut Purkinje يمكن أن تنقذ إطلاق النار المتكرر. نواصل اختبار ما إذا كان طرح توصيل Nav في الخلايا العصبية من النوع البري يتسبب في توهين مماثل في إطلاق الخلايا العصبية Purkinje كما تم قياسه في Tsc1mut / mut الخلايا العصبية Purkinje (الشكل 2 ب). لطرح موصلية Nav المعبر عنها أصلا ، قمنا بتطبيق موصلية Nav باستخدام المشبك الديناميكي. ومع ذلك ، فإن قطبية التوصيل معكوسة.

يحتوي نموذج الحالة الحركية ماركوف (الشكل 1 أ) المستخدم لمحاكاة توصيل Nav للخلايا العصبية Purkinje على تسع حالات حركية ، ثماني منها غير موصلة ، والتي تم تصنيفها على أنها مغلقة (C1 و C2 و C3) ، معطلة ومغلقة (IC1 و IC2) ، سريعة التعطيل (IF1 و IF2) ، ومعطلة ببطء (IS). هناك حالة حركية واحدة مفتوحة / موصلة (O)30،31. تحدد ثوابت معدل الانتقال ، الموضحة بين الحالات الحركية المسماة (الشكل 1 أ) نسبة القنوات / التوصيل المحاكي الذي يشغل كل حالة حركية. يؤثر جهد الغشاء على كل ثوابت من ثوابت معدل النموذج. يتم عرض تيارات Nav المحاكاة التي ينتجها هذا النموذج (في السيليكو) في تجارب محاكاة مشبك الجهد (باللون الأحمر) على يمين تيارات Nav المقاسة من الخلايا العصبية Purkinje المعزولة بشكل حاد ، والتي تظهر باللون الأسود (الشكل 1 أ ، أقل). يتم تقديم أمر الجهد الذي يستحضر تيارات Nav المحاكاة (الحمراء) والخلايا العصبية Purkinje (السوداء) فوق الآثار الحالية باللون الأسود. لاحظ ، في أمر الجهد ، تؤدي خطوة إزالة الاستقطاب الأولية (إلى 0 مللي فولت) إلى تيار صوديوم داخلي سريع العابر ، والذي ، في التتبع المحاكي ، يعكس القنوات التي تمر من الحالات المغلقة غير الموصلة إلى الحالة الحركية المفتوحة ، مما يسمح بتيار داخلي قصير قبل أن تتراكم قنوات الحالة المفتوحة في الحالات الحركية المعطلة بسرعة (IF1 و IF2). خطوة الجهد لإزالة الاستقطاب هذه قصيرة (5 مللي ثانية) ويتم لاحقا رفع جهد الغشاء إلى جهد مستقطب وسيط يبلغ -45 مللي فولت ، حيث يتم الاحتفاظ بالجهد لمدة 80 مللي ثانية (الشكل 1 أ ، أقل). خلال خطوة جهد إعادة الاستقطاب هذه ، من الجدير بالذكر أن هناك عودة لتيار الصوديوم الداخلي ، وهو مكون تيار يشار إليه باسم تيار الصوديوم المتجدد (INaR). خلال هذه الخطوة التي تبلغ 80 مللي ثانية إلى -45 مللي فولت ، يظهر INaR اضمحلالا بطيئا (مقارنة ب INaT) في السعة ، ويصل في النهاية إلى حالة ثابتة من التيار الداخلي ، وهو مكون تيار Nav المستمر (INaP). يعكس تنشيط INaR النموذجي (الشكل 1 أ ، أقل ، أحمر) أثناء إعادة استقطاب الغشاء قنوات محاكاة تتعافى من الحالات الحركية سريعة التعطيل (IF1 + IF2) إلى الحالة المفتوحة / الموصلة. بمرور الوقت (عند -45 مللي فولت) ، يتراكم جزء من القنوات المحاكاة التي تشغل الحالة المفتوحة في حالة حركية بطيئة التنشيط (IS) ، والتي تنعكس مع اضمحلال INaR ، ويظل جزء من هذه القنوات في الحالة المفتوحة / الموصلة ، وينعكس على أنه المكون الحالي INaP للحالة المستقرة30،31.

في التجارب / النتائج التمثيلية ، تمت إضافة نموذج التوصيل Nav Markov (الشكل 1 أ) إلى الخلايا العصبية البالغة في بركنجي في شرائح المخيخ المعزولة بشكل حاد. يتم تقديم تصوير كاريكاتوري لهذا الإعداد التجريبي في الشكل 3 أ. لتطبيق موصلية Nav النموذجية عبر حقن تيار المشبك الديناميكي ، استخدمنا نظام مضخم dPatch (كما هو موضح في الشكل 3 ب) ، والذي يحتوي على تحويل تناظري إلى رقمي (A / D) ورقمي إلى تناظري (D / A) متكامل تماما. يتعامل هذا النظام أيضا مع تحويلات الإشارة عبر معالجات ARM الأساسية المدمجة (خارج الكمبيوتر الشخصي) ويحتوي على دائرة FPGA (مصفوفة قابلة للبرمجة ميدانية) مدمجة تتيح المعالجة الفورية تقريبا لإشارات الإدخال وردود الفعل (إرسال إشارات الإخراج) إلى قطب حقن التيار27. تضمنت التجارب هنا تطبيق (في المشبك الديناميكي) لنموذج توصيل ماركوف المعقد ، والذي تمكنا من تطبيقه بمعدلات تحديث الحقن الحالية التي تصل إلى 500 كيلو هرتز.

أدت إضافة موصلية Nav المحاكاة (400 نانوثانية) إلى الخلايا العصبية Tsc1mut / mut Purkinje أثناء تسجيلات مشبك التيار الخالي من الفجوات إلى زيادات واضحة في ترددات إطلاق النار المتكررة للخلايا (الشكل 3C1 ، D1) ، مما يشير إلى أن إضافة توصيل Nav في هذه الخلايا قد يكون كافيا لإنقاذ العجز في Tsc1mut / mut استثارة الخلايا العصبية Purkinje ، على الرغم من أننا لم نفحص الذخيرة الكاملة للعجز الذي تم الإبلاغ عنه في Tsc1mut / mut استثارة الخلايا العصبية بركنجي8. كما يتضح من الآثار التمثيلية الموضحة في الشكل 3C2 (العلوي) ، تتمتع الخلايا العصبية البركنجي من النوع البري بقدرة جوهرية على إطلاق إمكانات العمل المتكررة عند الترددات العالية. باستخدام المشبك الديناميكي ، قمنا بطرح موصلية Nav النموذجية من الخلايا العصبية Purkinje من النوع البري من خلال تطبيق موصلية Nav النموذجية بقطبية عكسية (سلبية) (-400 نانوثانية). أدى طرح الموصلية البحرية النموذجية إلى انخفاض فوري وواضح في إطلاق النار المتكرر (الشكل 3C2 ، أقل) ، وهو ما يتوافق أيضا مع الفرضية القائلة بأن تيارات Nav المخفضة المقاسة في Tsc1mut / mut تساهم الخلايا العصبية Purkinje في خصائص إطلاق النار المخففة المقاسة في هذه الخلايا8. عبر العديد من الخلايا العصبية Tsc1mut / mut أو البرية من النوع البري ، أدت تجارب المشبك الديناميكية هذه ، التي تمت فيها إضافة أو طرح الموصلية البحرية ، على التوالي ، إلى تأثيرات متسقة على تردد إطلاق النار. أدت إضافة الموصلية البحرية بشكل كبير (ص = 0.029) إلى زيادة تردد إطلاق الخلايا العصبية بركنجي Tsc1mut / mut (الشكل 3D1) ، وفي الخلايا العصبية بركنجي من النوع البري ، أدى طرح توصيل Nav بشكل كبير (P = 0.031) إلى تقليل تردد إطلاق النار (الشكل 3D2) (اختبار t المزدوج للطالب).

figure-results-1
الشكل 1: إعداد نموذج ماركوف في برنامج المشبك الديناميكي. (أ) يظهر مخطط انتقال حالة ماركوف لنموذج يعيد إنتاج خصائص توصيل التنقل البحري المقاسة في الخلايا العصبية بركنجي المخيخية للفأر30. يتضمن هذا النموذج تسع حالات حركية. من بين هذه الحالات ، 8 حالات غير موصلة: ثلاث حالات مغلقة (C) ، واثنتان معطلتان (IC) ، واثنتان معطلان بسرعة (IF) ، وواحدة بطيئة التنشيط (IS). يشتمل النموذج على حالة حركية واحدة مفتوحة (O) ، والتي يتم توصيلها. بين الحالات الحركية المجاورة ، يتم تحديد انتقال الاتصالات / إشغال الحالة بمرور الوقت من خلال ثوابت معدل الانتقال ، كما هو موضح على أنها S0-S15. لاحظ أنه يتم أيضا تعيين قيمة عددية (حمراء) لكل حالة حركية، والتي تسمح للمستخدمين بتحديد نموذج ماركوف وطوبولوجيا الحالة الحركية الخاصة به في مصفوفة حالة البوابات (كما هو موضح في اللوحة C، الموضحة أدناه). (ب) يتم تقديم اللوحات / الواجهات الرسومية التي يعمل بها المستخدمون في محرر المشبك الديناميكي SutterPatch. لاحظ أن ترتيب لوحات محرر المشبك الديناميكي هذه لا يتوافق مع الترتيب كما يظهر في برنامج المشبك الديناميكي. بالإضافة إلى ذلك، لا يتم عرض جميع اللوحات المرتبطة بمحرر المشبك الديناميكي. (ج) (اللوحة العلوية) يظهر مثال على مصفوفة حالة البوابات مع المتغيرات التي تم إدخالها والتي تتوافق مع طوبولوجيا مخطط انتقال الحالة الموضح في اللوحة أ. تبرز المربعات الحمراء الموجودة على مصفوفة حالة البوابات الصف والعمود 7 ، والتي تتوافق مع الحالة الحركية المفتوحة (O) للنموذج. داخل العمود 7، يتم سرد جميع ثوابت المعدل التي تحدد التحولات إلى الحالة الحركية المفتوحة (O)، وداخل الصف 7، يتم سرد جميع ثوابت المعدل التي تحدد الانتقالات التي تخرج من الحالة الحركية المفتوحة (O). مع هذه المنظمة ، تصف مصفوفة حالة البوابات عدد الحالات الحركية ، ومتغيرات ثابت المعدل ، والطوبولوجيا (الترابط بين الحالات الحركية) للنموذج. تظهر في (D) لوحات SutterPatch / واجهات المستخدم المرتبطة بتحميل نماذج توصيل المشبك الديناميكي ، جنبا إلى جنب مع الواجهات المتضمنة في إنشاء إجراءات المشبك الحالية. يتم وصف تفاعلات المستخدم مع هذه النماذج في خطوات البروتوكول 2.17-2.20. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: Tsc1mut / mut الخلايا العصبية بركنجي لديها استثارة غشائية مخففة مقارنة بعناصر التحكم من النوع البري. (أ) تكشف تسجيلات المشبك الحالي للخلية الكاملة من النوع البري (العلوي والأسود) و Tsc1mut / mut (السفلي ، الأزرق) عن إطلاق مخفف في الخلية الطافرة Tsc1 . (ب) ترددات إطلاق النار المنخفضة في الخلايا العصبية Tsc1mut / mut Purkinje ، مقارنة بعناصر التحكم من النوع البري ، متسقة عبر الخلايا. متوسط (±± SEM) تردد إطلاق النار التلقائي للخلايا العصبية بركنجي Tsc1mut / mutأقل بشكل ملحوظ (P < 0.0001) مقارنة بالخلايا من النوع البري (اختبار Welch غير المزاوج t ؛ التحكم N = 13 ، ن = 32 ؛ Tsc1mut / mut N = 6 ، n = 21). (ج) تكشف قياسات مشبك الجهد لتيارات Nav في الخلايا العصبية البالغة بركنجي أن متوسط (±± SEM) ذروة تيار Nav سريع العابر (INaT) ينخفض بشكل كبير في Tsc1mut / mut خلايا ، مقارنة بعناصر التحكم من النوع البري. (P = 0.007 ، RM ثنائي الاتجاه ANOVA ؛ التحكم في النوع البري: N = 6 ، n = 22 ، أسود ؛ Tsc1mut / mut: N = 6 ، n = 16 ، المربعات الزرقاء). مثال I سجلاتNaT ، التي يتم استحضارها بواسطة خطوة إزالة الاستقطاب -35 mV ، تظهر كلوحة داخلية على يمين اللوحة C. البيانات المنشورة سابقا في براون وآخرون 8. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

تعمل الدوائر المخيخية في الحس العميق والتحكم الحركي37،38 ولكنها أيضا حاسمة للسلوكيات المعقدة مثل التفاعلات الاجتماعية والمعالجة العاطفية39،40،41. غالبا ما يرتبط علم الأمراض في بنية المخيخ ووظيفته باضطراب طيف التوحد42،43،44،45،46. إن الهندسة المعمارية البسيطة للدوائر المخيخية47 والدور الواضح للمخيخ في أمراض اضطراب طيف التوحد تجعلها منطقة دماغية جذابة للتحقيق في الدوافع الجزيئية والخلوية للعجز السلوكي لاضطراب طيف التوحد ، بالإضافة إلى العلاجات المحتملة. يوفر الفيزيولوجيا الكهربية الديناميكية للمشبك أداة مهمة لهذه التحقيقات ، مما يمكن الباحثين من اختبار العلاقات السببية مباشرة بين التغيرات المرتبطة باضطراب طيف التوحد في خصائص القناة الأيونية / الموصلات الأيونية وإطلاق الخلايا العصبية المخيخية. في حين أن طرق المشبك الديناميكي مناسبة بشكل خاص لتحقيقات التغيرات المرتبطة باضطراب طيف التوحد في استثارة الخلايا العصبية ، فإن هذه التقنية مناسبة للتحقيق في مجموعة من الآليات المرضية التي تؤثر على الخلايا ذات الأغشية القابلة للاستثارة. بالإضافة إلى ذلك ، يظل المشبك الديناميكي أداة ممتازة لتشريح العمليات المعقدة التي تنظم من خلالها الخلايا العصبية وخلايا العضلات وتحافظ على إطلاق الفعل المحتمل المناسب.

يتطلب التنفيذ الدقيق لتجارب المشبك الديناميكي تحكما دقيقا في المعلمات التقنية. على وجه التحديد ، يجب أن يعرف المجربون ويفهموا عواقب التباين المحتمل في التأخير بين أخذ عينات الجهد وحقن التيار ، والذي يشار إليه غالبا باسم الارتعاش29 ، بالإضافة إلى الخصائص السلبية للقطب الكهربائي ، وقيود المشبك الفضائي ، والدقة الفسيولوجية للمستحضر التجريبي قيد التحقيق. Bettencourt et al. (2008) 48 و Butera et al. (2001) 29 أظهر سابقا أن تحقيق معدلات أخذ عينات عالية لا تقل عن 50 كيلو هرتز أمر بالغ الأهمية لالتقاط الموصلات الأيونية السريعة بدقة ، مع الحفاظ على زمن انتقال التغذية الراجعة بشكل مثالي أقل من 25٪ (≤ 5 ميكرو ثانية) من فاصل أخذ العينات. يمكن أن تكون معدلات أخذ العينات الاسمية التي أبلغت عنها الأنظمة التجارية ، ولا سيما الأنظمة الأساسية المستندة إلى Windows ، مضللة. ومن ثم ، غالبا ما يكون التحقق المستقل من الأداء ضروريا ، والذي تمت مناقشته بمزيد من التفصيل من قبل Milescu et al. (2008) 25 و Clausen et al. (2012) 49. يجب أيضا مراعاة قيود المشبك الفضائي ، خاصة عند العمل مع الخلايا العصبية السليمة التي لها أشكال معقدة وخصائص غشاء غير متساوية الجهد. على سبيل المثال ، ستؤدي محاولة تطبيق (أو طرح) توصيل باستخدام قطب كهربائي بعيد عن موقع التكامل ، مثل AIS ، إلى تصوير غير دقيق لتأثيرات التوصيل المطبق. قد تتسبب مقاومة القطب الكهربائي الضعيفة (العالية) ، وتعويض السعة غير الكافي ، و / أو الفشل في تصحيح خطأ محتمل الوصلة أيضا في تحريف قياسات الجهد (إشارة الإدخال) ، وبالتالي التطبيق غير الصحيح للموصلات الأيونية النموذجية50،51.

الآلاف من نماذج ماركوف و HH متاحة مجانا للباحثين في قواعد البيانات عبر الإنترنت مثل ModelDB52 و Channelpedia53 ، بدعم من مشروع الدماغ البشري ومختبر الدوائر الدقيقة العصبية ، على التوالي. تتضمن قواعد البيانات هذه نماذج للتوصيل المشبكي ، وموصلات القناة الأيونية ، ونماذج الخلايا العصبية القائمة على التوصيل ، والتي يتم كتابتها بشكل أساسي بلغة NEURON أو MATLAB أو Python. توفر ملفات قاعدة البيانات عادة معادلات النموذج الضرورية بالإضافة إلى أي معلومات متنوعة حول نوع (أنواع) الخلية والتجارب التي أبلغت النموذج.

يحتوي كل من نماذج التوصيل Markov و HH على حالات / متغيرات بوابات توصيل (محاكاة القنوات المفتوحة / المنشطة) وغير الموصلة (محاكاة القنوات المغلقة). ومع ذلك ، تختلف أنواع النماذج هذه في الطريقة التي يتم بها حساب قيمة التوصيل عند كل جهد تم أخذ عينات منه ، حيث تتطلب نماذج ماركوف مزيدا من القوة الحسابية ولكنها توفر مزيدا من التفاصيل في خصائص البوابات للقنوات المحاكاة. على سبيل المثال ، في نماذج HH ، تكون الحالات الموصلة وغير الموصلة متغيرات مستقلة ، يتم تحديد كل منها بواسطة مدخلات الجهد وحركية البوابات للحالةالمعنية 54،55. على عكس نماذج ماركوف ، لا تحاكي نماذج HH أو تقيد التحولات بين حالات البوابات ، مثل عبور القنوات المحاكاة من الحالة الحركية المنشطة / المفتوحة مباشرة إلى الحالة الحركية سريعة التعطيل في نموذج توصيل الصوديوم المسوربالجهد 25. هذا يجعل نماذج HH أقل تعقيدا من الناحية الحسابية54,55 ويمكن المحققين من إضافة نماذج HH متعددة سريعة التوصيل في وقت واحد ، مع الحفاظ على معدلات عالية لأخذ العينات والتحديث.

تتكون نماذج الحالة الحركية ماركوف من حالات حركية منفصلة ، والتي قد تكون موصلة أو غير موصلة ، وهذه الحالات مترابطة في طوبولوجيا ثابتة. في محاكاة نموذج ماركوف ، يتم حساب التوصيل عند كل جهد تم أخذ عينات منه بنسبة القنوات المحاكاة التي تشغل الحالة (الحالات) الحركية الموصلة يتم تحديد نسبة قنوات المحاكاة التي تشغل كل حالة حركية (بمرور الوقت) من خلال ثوابت المعدل ، وهي معلمات تحكم معدل انتقال إشغال الحالة من حالة حركية إلى أخرى. تحتوي ثوابت المعدل على وحدات من الثواني العكسية (s-1) ، تمثل احتمال انتقال لكل وحدة زمنية. اعتمادا على النموذج ، قد تعتمد قيم المعدل الثابتة على عوامل ديناميكية مثل الجهد أو درجة الحرارة.

في نماذج ماركوف ، تستخدم المعادلات التفاضلية العادية لوصف الإشغال المعتمد على الوقت لكل حالة حركية. تحكم هذه المعادلات كيفية تطور احتمال التواجد في كل حالة بمرور الوقت ، بناء على ثوابت معدل الانتقال. يتم تمثيل ذلك بمصفوفة معدل Q: figure-discussion-156. كما نوقش أعلاه ، قد تتأثر ثوابت معدل الانتقال (r) ، التي تحدد الحركة بين الحالات ، بجهد الدخل (V) والمعلمات α و β ، والتي تعكس حركية التوصيل عبر الفولتية. يمكن وصف هذه المعادلات على النحو التالي: figure-discussion-2، ويمكن تمثيلها بصريا في شكل رسوم بيانية تتضمن اتصالات (ثوابت معدل الانتقال) داخل وخارج كل حالة حركية للنموذج56،57،58. يمكن العثور على مناقشة مفيدة حول تطوير نماذج ماركوف وطوبولوجيتها في Schoening and Silva (2024) 56.

منذ بداية المشبك الديناميكي في شكله الحالي ، حيث يتم نمذجة الموصلات الأيونية غير الخطية وتطبيقها (عبر قطب كهربائي لحقن التيار) على الخلايا الحية في الوقت الفعلي19،59 ، تطورت الأساليب والموارد لهذه التقنية ، ويمكن الوصول إليها بشكل متزايد وفعالة من حيث التكلفة بسبب الابتكارات مثل الأنظمة منخفضة التكلفة القائمة على المتحكماتالدقيقة 60 والبرمجيات المجانية مفتوحة المصدر23 ، 25،26. تعمل الأنظمة التجارية ، مثل dPatch من Sutter Instrument أو Cybercyte من Cytocybernetics ، على تسهيل التنفيذ السريع لتجارب المشبك الديناميكي من خلال حلول الأجهزة والبرامج المتكاملة27،61.

يتيح تعدد استخدامات المشبك الديناميكي تطبيقات متنوعة ، بما في ذلك إنشاء نقاط اشتباك عصبي كيميائية وكهربائية افتراضية ، وتضمين الخلايا العصبية الحقيقية داخل الشبكات الاصطناعية (أو العكس) ، وإضافة قنوات أيونية افتراضية62. الأهم من ذلك ، يمكن تعديل الاعتماد على الجهد والخصائص الحركية واتساعات التوصيل المطبق بسرعة ، مما يسمح للمحققين باختبار كيفية تأثير تحجيم معلمة واحدة أو أكثر على إطلاق جهد العمل واستثارةالغشاء 31. توفر أنظمة اليوم معدلات أخذ عينات عالية ، مما يتيح التطبيق الدقيق للموصلات العابرة السريعة ويمكن دمجها بسهولة مع المعدات الفيزيولوجية الكهربية التقليدية60،63 ، مما يؤدي إلى ترسيخ المشبك الديناميكي كطريقة مثالية لتعزيز فهمنا لوظيفة الخلايا العصبية والخلل الوظيفي.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نود أن نشكر تيلي غالياتساتوس وجوش ستانفورد من Sutter Instrument على مساعدتهما في الاستفسارات الفنية. كما نعرب عن تقديرنا ونشكر جان دولزر للمساعدة في بدء دراسات المشبك الديناميكي dPatch.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
CaCl2فيشر كيميكالC79-500 الكاشف
أنابيب زجاجية شعرية بوروسيليكية جدار قياسي OD 1.5 مم ID 0.86 مم طول 10 سموارنر إنسترومنتس64-0793معدات
كلين بنشTMC63-9090Eمعدات
كومبريستوم VF-500-Z فيبراتوم الآلات التمهيديةhttps://precisionary.com/product-category/compresstome-parts/parts-by-model/vf-500-0z/معدات
ديل أوبتي بليكس 7080ديلhttps://www.dell.com/en-us/shop/desktop-computers/optiplex-7080-tower-and-small-form-factor/spd/optiplex-7080-desktop/s005o7080sffusمعدات
ديكستروزفيشر كيميكالD16-500 الكاشف
نظام مضخم dPatchآلة ساترFG-DPATCHمعدات
EGTAإي إم دي ميليبور324626-25GMالكاشف
هيبسفيشر كيميكال7365-45-9الكاشف
سخان داخليوارنر إنسترومنتس64-0102معدات
KClفيشر كيميكالP330-500 الكاشف
الكيتامينمنتجات ديترا البيطرية193.40620.3 الكاشف
ك-جلوكوناتشركة TCI للكيماوياتG0040الكاشف
برنامج لين لابساينتفيكاhttps://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-linlab-2معدات
حمام الماء LSE 6Lكورنينج6783معدات
Mg-ATPسيغما-ألدرتش74804-12-9الكاشف
MgCl2فيشر كيميكال012288.A9الكاشف
طراز P-1000 مسحب بيبتآلة ساترFG-P1000معدات
NaClفيشر كيميكالS271-500 الكاشف
Na-GTPMP Biomedicals56001-37-7الكاشف
NaH2PO4ج. ت. بيكر02-004-220 الكاشف
NaHCO3فيشر كيميكالS233-500 الكاشف
برنامج العيونديجيتال أوبتيكس المحدودةhttps://www.scientifica.uk.com/products/qimaging-ocular-softwareمعدات
شفرة الحلاقةبيرسونا60-0139-CTNمعدات
القيثارة السلايسوارنر إنسترومنتس64-0255معدات
سلايسكوب برو 3000ساينتفيكاhttps://www.scientifica.uk.com/products/slicescope-pro-3000معدات
السوبر لاصقلوكتايت8040-00-142-9193معدات
برنامج ساتر باتشآلة ساترhttps://www.sutter.com/amplifiers/sutterpatchمعدات
متحكم في درجة الحرارةوارنر إنسترومنتس64-2400معدات
زيلازينMP Biomedicals158307الكاشف

المراجع

  1. Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), a009886-a009886 (2012).
  2. Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nat Commun. 5 (1), 4742(2014).
  3. Connor, S. A., et al. Altered cortical dynamics and cognitive function upon haploinsufficiency of the autism-linked excitatory synaptic suppressor MDGA2. Neuron. 91 (5), 1052-1068 (2016).
  4. Pagani, M., et al. mTOR-related synaptic pathology causes autism spectrum disorder-associated functional hyperconnectivity. Nat Commun. 12 (1), 6084(2021).
  5. Tang, G., et al. Loss of mTOR-dependent macroautophagy causes autistic-like synaptic pruning deficits. Neuron. 83 (5), 1131-1143 (2014).
  6. Fatemi, S. H., Eschenlauer, A., Aman, J., Folsom, T. D., Chekouo, T. Quantitative proteomics of dorsolateral prefrontal cortex reveals an early pattern of synaptic dysmaturation in children with idiopathic autism. Cereb Cortex. 34 (13), 161-171 (2024).
  7. Deneault, E., et al. Complete disruption of autism-susceptibility genes by gene editing predominantly reduces functional connectivity of isogenic human neurons. Stem Cell Rep. 11 (5), 1211-1225 (2018).
  8. Brown, S. P., Jena, A. K., Osko, J. J., Ransdell, J. L. Tsc1 deletion in Purkinje neurons disrupts the axon initial segment, impairing excitability and cerebellar function. Neurobiol Dis. 207, 106856(2025).
  9. Tsai, P. T., et al. Autistic-like behaviour and cerebellar dysfunction in Purkinje cell Tsc1 mutant mice. Nature. 488, 647-651 (2012).
  10. Sundberg, M., et al. Purkinje cells derived from TSC patients display hypoexcitability and synaptic deficits associated with reduced FMRP levels and reversed by rapamycin. Mol Psychiatry. 23, 2167-2183 (2018).
  11. Brumback, A., Sohal, V. Intrinsic excitability defects in specific subtypes of medial prefrontal cortex pyramidal neurons in a mouse model of autism. Neurology. 82 (10), I4-1.010(2014).
  12. Mitchell, D. E., Miranda-Rottmann, S., Blanchard, M., Araya, R. Altered integration of excitatory inputs onto the basal dendrites of layer 5 pyramidal neurons in a mouse model of Fragile X syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (2), e2208963120(2023).
  13. Sanders, S. J., et al. De novo mutations revealed by whole-exome sequencing are strongly associated with autism. Nature. 485, 237-241 (2012).
  14. Ben-Shalom, R., Keeshen, C. M., Berrios, K. N., An, J. Y., Sanders, S. J., Bender, K. J. Opposing effects on NaV1.2 function underlie differences between SCN2A variants observed in individuals with autism spectrum disorder or infantile seizures. Biol Psychiatry. 82 (3), 224-232 (2017).
  15. Spratt, P. W. E., et al. The autism-associated gene Scn2a contributes to dendritic excitability and synaptic function in the prefrontal cortex. Neuron. 103 (4), 673-685.e5 (2019).
  16. Nelson, A. D., et al. Physical and functional convergence of the autism risk genes Scn2a and Ank2 in neocortical pyramidal cell dendrites. Neuron. 112 (7), 1133-1149.e6 (2024).
  17. Zhang, J., et al. Severe deficiency of the voltage-gated sodium channel NaV1.2 elevates neuronal excitability in adult mice. Cell Rep. 36 (5), 100858(2021).
  18. Sharp, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. Artificial electrical synapses in oscillatory networks. J Neurophysiol. 67 (6), 1691-1694 (1992).
  19. Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends Neurosci. 16 (10), 389-394 (1993).
  20. Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. J Neurosci Methods. 49 (3), 157-165 (1993).
  21. Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends Neurosci. 27 (4), 218-224 (2004).
  22. Muñiz, C., Arganda, S., Rodríguez, F. B., De Polavieja, G. G. Realistic stimulation through advanced dynamic-clamp protocols. Computational Methods in Neural Modeling. Mira, J., Álvarez, J. R. , Springer. Berlin. 95-105 (2005).
  23. Ortega, F. A., Butera, R. J., Christini, D. J., White, J. A., Dorval, A. D. Dynamic clamp in cardiac and neuronal systems using RTXI. Methods Mol Biol. 1183, 327-354 (2014).
  24. Milescu, L. S., Tabak, J. Dynamic clamp on a Windows PC. Methods Mol Biol. 2188, 157-177 (2021).
  25. Milescu, L. S., Yamanishi, T., Ptak, K., Mogri, M. Z., Smith, J. C. Real-time kinetic modeling of voltage-gated ion channels using dynamic clamp. Biophys J. 95 (1), 66-87 (2008).
  26. Kemenes, I., et al. Dynamic clamp with StdpC software. Nat Protoc. 6 (3), 405-417 (2011).
  27. Dolzer, J. Patch clamp technology in the twenty-first century. Methods Mol Biol. 2188, 21-49 (2021).
  28. Crino, P. B., Henske, E. P. New developments in the neurobiology of the tuberous sclerosis complex. Neurology. 53 (7), 1384-1390 (1999).
  29. Butera, R. J., Wilson, C. G., DelNegro, C. A., Smith, J. C. A methodology for achieving high-speed rates for artificial conductance injection in electrically excitable biological cells. IEEE Trans Biomed Eng. 48 (12), 1460-1470 (2001).
  30. Ransdell, J. L., Moreno, J. D., Bhagavan, D., Silva, J. R., Nerbonne, J. M. Intrinsic mechanisms in the gating of resurgent Na+ currents. eLife. 11, e70173(2022).
  31. Brown, S. P., Lawson, R. J., Moreno, J. D., Ransdell, J. L. A reinterpretation of the relationship between persistent and resurgent sodium currents. J Neurosci. 44 (29), e2396232024(2024).
  32. European Chromosome 16 Tuberous Sclerosis Consortium. Identification and characterization of the tuberous sclerosis gene on chromosome 16. Cell. 75 (7), 1305-1315 (1993).
  33. Henske, E. P., Jóźwiak, S., Kingswood, J. C., Sampson, J. R., Thiele, E. A. Tuberous sclerosis complex. Nat Rev Dis Primers. 2 (1), 16036(2016).
  34. Wiznitzer, M. Autism and tuberous sclerosis. J Child Neurol. 19 (9), 675-679 (2004).
  35. Jeste, S. S., Sahin, M., Bolton, P., Ploubidis, G. B., Humphrey, A. Characterization of autism in young children with tuberous sclerosis complex. J Child Neurol. 23 (5), 520-525 (2008).
  36. Lawson, R. J., et al. Selective deletion of Tsc1 from mouse cerebellar Purkinje neurons drives sex-specific behavioral impairments linked to autism. Front Behav Neurosci. 18, 1474066(2024).
  37. Sherrington, C. S. The Integrative Action of the Nervous System. , Yale University Press. New Haven. (1911).
  38. Russell, J. S. R., Horsley, V. A. H. II Experimental researches into the functions of the cerebellum. Proc R Soc Lond. 55, 57-60 (1894).
  39. Rudolph, S., et al. Cognitive-affective functions of the cerebellum. J Neurosci. 43 (45), 7554-7564 (2023).
  40. Schmahmann, J. D. The cerebellum and cognition. Neurosci Lett. 688, 62-75 (2019).
  41. Beuriat, P. -A., Cristofori, I., Gordon, B., Grafman, J. The shifting role of the cerebellum in executive, emotional and social processing across the lifespan. Behav Brain Funct. 18 (1), 6(2022).
  42. Stoodley, C. J. Distinct regions of the cerebellum show gray matter decreases in autism, ADHD, and developmental dyslexia. Front Syst Neurosci. 8, 92(2014).
  43. Bruchhage, M. M. K., Bucci, M. -P., Becker, E. B. E. Cerebellar involvement in autism and ADHD. Handb Clin Neurol. 155, 61-72 (2018).
  44. Mosconi, M. W., Wang, Z., Schmitt, L. M., Tsai, P., Sweeney, J. A. The role of cerebellar circuitry alterations in the pathophysiology of autism spectrum disorders. Front Neurosci. 9, 296(2015).
  45. Weber, A. M., Egelhoff, J. C., McKellop, J. M., Franz, D. N. Autism and the cerebellum: evidence from tuberous sclerosis. J Autism Dev Disord. 30 (6), 511-517 (2000).
  46. Wang, S. S. -H., Kloth, A. D., Badura, A. The cerebellum, sensitive periods, and autism. Neuron. 83 (3), 518-532 (2014).
  47. Ransdell, J. L., Nerbonne, J. M. Voltage-gated sodium currents in cerebellar Purkinje neurons: functional and molecular diversity. Cell Mol Life Sci. 75 (19), 3495-3505 (2018).
  48. Bettencourt, J. C., Lillis, K. P., Stupin, L. R., White, J. A. Effects of imperfect dynamic clamp: computational and experimental results. J Neurosci Methods. 169 (2), 282-289 (2008).
  49. Clausen, C., Valiunas, V., Brink, P. R., Cohen, I. S. MATLAB implementation of a dynamic clamp with bandwidth of >125 kHz capable of generating INa at 37°C. Pflugers Arch. 465 (4), 497-507 (2013).
  50. Preyer, A. J., Butera, R. J. The effect of residual electrode resistance and sampling delay on transient instability in the dynamic clamp system. Annu Int Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2007, 430-433 (2007).
  51. Preyer, A. J., Butera, R. J. Causes of transient instabilities in the dynamic clamp. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17 (2), 190-198 (2009).
  52. McDougal, R. A., et al. Twenty years of ModelDB and beyond: building essential modeling tools for the future of neuroscience. J Comput Neurosci. 42 (1), 1-10 (2017).
  53. Ranjan, R., et al. Channelpedia: an integrative and interactive database for ion channels. Front Neuroinform. 5, 36(2011).
  54. Carbonell-Pascual, B., Godoy, E., Ferrer, A., Romero, L., Ferrero, J. M. Comparison between Hodgkin-Huxley and Markov formulations of cardiac ion channels. J Theor Biol. 399, 92-102 (2016).
  55. Andreozzi, E., Carannante, I., D'Addio, G., Cesarelli, M., Balbi, P. Phenomenological models of NaV1.5. A side by side, procedural, hands-on comparison between Hodgkin-Huxley and kinetic formalisms. Sci Rep. 9 (1), 17493(2019).
  56. Schoening, M. E., Silva, J. R. Creating Computational Models of Ion Channel Dynamics. Potassium Channels: Methods and Protocols. , Springer. New York. (2024).
  57. Mangold, K. E., et al. Identification of structures for ion channel kinetic models. PLoS Comput Biol. 17 (8), e1008932(2021).
  58. Silva, J. R., Cooper, P., Nichols, C. G. Modeling KATP-dependent excitability in pancreatic islets. Biophys J. 107 (9), 2016-2026 (2014).
  59. Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. J Neurophysiol. 69 (3), 992-995 (1993).
  60. Desai, N. S., Gray, R., Johnston, D. A dynamic clamp on every rig. eNeuro. 4 (5), (2017).
  61. Han, L., et al. Reconciling computer models and stem cell models of human cardiac repolarization: reply. Cardiovasc Res. 106 (1), 6-7 (2015).
  62. Wilders, R. Dynamic clamp: a powerful tool in cardiac electrophysiology. J Physiol. 576 (2), 349-359 (2006).
  63. Kullmann, P. H. M., Wheeler, D. W., Beacom, J., Horn, J. P. Implementation of a fast 16-bit dynamic clamp using LabVIEW-RT. J Neurophysiol. 91 (1), 542-554 (2004).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

طرق المشبك الديناميكي للتحقيق في ضعف استثارة الخلايا العصبية المرتبطة بالتوحد
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.