مقالة منهجية

تحضير ومعالجة الشريان المتكلس مع مورفولوجيا محفوظة وRNA للتحليل المكاني الرقمي

DOI:

10.3791/69159

⸱

يناير 23, 2026

 ,  ,  , 
1Division of Vascular Surgery, Department of Surgery, University of Washington, 2Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of Washington, 3Division of Vascular Surgery, VA Puget Sound Health Care System

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتضمن هذا البروتوكول سير عمل خطوة بخطوة للعينات الوعائية المتكلسة: معالجة الأنسجة، إزالة الكلس، التحقق من صحة الحمض النووي الريبي، كشف مستوى التكلس، واستراتيجيات اختيار المناطق ذات الاهتمام باستخدام جهاز Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). الهدف هو تقديم طريقة شاملة للحفاظ على شكل نسيج الأوعية الدموية والحمض النووي الريبي لتحليل النسخ المكاني الموثوق.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقوم علم النسخ المكاني برسم خرائط ملفات النسخ الكاملة مباشرة على أقسام الأنسجة، ويربط بين الأحياء الخلوية والتعبير الجيني وكيف تؤثر هذه الأنشطة على الصحة والمرض. على الرغم من أن هذا النهج قد غير علم الأورام وعلوم الأعصاب والمناعة وعلوم النمو والعديد من المجالات، إلا أنه أصبح أقل استخداما في علم الأحياء الوعائي، رغم أن أمراض الأوعية الدموية لا تزال سببا رئيسيا للوفاة على مستوى العالم. يبرز عقبان: الشرايين والأوردة توفر سطحا مسطحا قليلا للتقسيم، والعينات المريضة، غالبا ما تكون تصلب الشرايين أو متخثرة أو محملة باللويحات أو متكلسة، تتطلب علاجات قاسية مثل إزالة الكالسيف التي تعرض الشكل وسلامة الحمض النووي الريبي للخطر. ومع ذلك، فإن هذه الأوعية نفسها، بهياكلها الطبقية المتداخلة من العلاقة المحيطة والوسائط والأدفينتيسيا، مثالية للتحليل المكاني لأن كل طبقة تستضيف أنواعا مختلفة من الخلايا وبرامج جينية تتفاعل عبر الجدار.

قليل من البروتوكولات التفصيلية تتناول كيفية تحضير الأنسجة الوعائية لعلم النسخ المكاني. هذا النقص يحد من قدرة الباحثين على استغلال الإمكانيات الكاملة للتقنية. لسد هذه الفجوة، نقدم سير عمل خطوة بخطوة محسن لشرايين الظنبوب البشرية ذات الآفات المتقدمة. يغطي البروتوكول التعامل مع الأنسجة، والتثبيت، وإزالة الكالسية بشكل صحيح للحفاظ على البنية وجودة الحمض النووي الريبي، يليه التلوين النسيجي لدرجة شدة التكلس. كما نصف بناء مصفوفة الأنسجة الدقيقة (TMA) للحد من تأثيرات الدفعات واستراتيجيات اختيار منطقة الاهتمام (ROI) على جهاز NanoString GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP).

من خلال خفض الحواجز التقنية، يمكن هذا البروتوكول الباحثين في الأوعية الدموية من توليد بيانات نقل وظيفية مكانية موثوقة ودراسة الأنشطة النسخية الخاصة بالطبقة في الأوعية السليمة والمصابة. نتوقع أن يسرع من اكتشاف الآليات الكامنة وراء تكلس، والالتهاب، وتصلب الشرايين الداخلي، وغيرها من الأمراض الوعائية، ويعزز تبني أوسع لعلم النسخ المكاني في علم الأحياء الوعائي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على مدار العقد الماضي، تقاربت التسلسل من الجيل الجديد والتصوير عالي الدقة لتطوير علم النسخ المكاني، وهو طريقة لقياس النسخ الكامل مع الحفاظ على الموقع الدقيق لكل نسخ في أقسام الأنسجة 1,2. عند اقترانها بحقل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) الذي ينضج بسرعة، توفر الأساليب المكانية مسارا فعالا لربط التوقيعات الجينية بأنواع خلايا محددة وحالات وأماكن محالف داخل النسيج أو العضو، مما يثري فهمنا لآليات المرضبشكل كبير 3,4,5,6,7 . يتم تطوير منصات تجارية متعددة مثل 10X Visium، NanoString GeoMx وCosMx، Slide-seq، وDBiT-seq، وكل منها مدعوم ببروتوكولات محسنة للأنسجة الرخوة عالية الخلية مثل الأورام وأنسجة الدماغ. يشهد المجال نموا هائلا، حيث قامت PubMed بفهرسة حوالي 150 منشورا في عام 2023، وما يقارب 300 في عام 2024، وتسير على طريق تجاوز 500 في عام 2025. على الرغم من هذا الارتفاع، لا يزال علم الأحياء الوعائي ممثلا تمثيلا ناقصا مقارنة بالسرطان وعلوم الأعصاب وعلم المناعة.

الأنسجة الصلبة أو المعدنية، مثل العظام والغضاريف والأسنان والشرايين أو الأوردة المحملة باللويحات والمتكلسة، أثبتت أنها أقل ملاءمة بكثير. العقبات التقنية متعددة الأوجه. أولا، تتطلب الأنسجة ذات المصفوفات المعدنية الكثيفة الاستلقاء أو إزالة حمضية، وهي علاجات عدوانية قد تفكك الحمض النووي الريبي وتشوه شكل الأنسجة. ثانيا، الأنسجة المريضة، سواء كانت مصابة أو ليفية، غالبا ما تحتوي على عدد قليل من الخلايا الحية المدمجة في مصفوفة خارج الخلية الوفيرة (ECM)، مما يقلل من إنتاج النسخ ويعقد تطبيع البيانات. بالإضافة إلى ذلك، تمتلك الأنسجة الوعائية بنية رقيقة متحدة المركز (إنتيما، وسط، أدفنتيسيا) ملفوفة حول تجويف أجوف. سمك الجدار المحدود، خاصة الطبقة الداخلية ذات الخلية الواحدة، يعني أن مناطق الالتقاط قد تحتوي على أنسجة قليلة، وقد تتمزق المقاطع أو تنفصل أثناء خطوات التلوين والتهجين التي تستغرق عدة ساعات. نتيجة لذلك، لا تزال الدراسات المكانية في النسخ النسيجية الوعائية نادرة، رغم أن أمراض القلب والأوعية الدموية تصنف باستمرار من أبرز أسباب الوفاة والمراضة الخطيرة على مستوى العالم. تركز أوراق البروتوكول الموجودة بشكل كبير على معالجة البيانات، أو التصور، أو المنصات غير NanoString GeoMx 8,9,10,11,12,13. من بين هذه الأوراق، قليل منها يصف طرقا على مستوى الطاولة لمعالجة الشرايين الظنبوب المريضة، وهي وعاء ذو صلة سريرية في مرض الشرايين الطرفية (PAD)، خاصة لمرضى السكري الذين يشكلون نسبة متزايدة من السكان المصابين.

لسد هذه الفجوة، نقدم سير عمل شامل للشرايين الظنبوبية البشرية المتكلسة التي تم الحصول عليها من مرضى PAD الذين خضعوا للبتر. يشمل البروتوكول ما يلي: (1) تقليم الأنسجة وتشريحها مباشرة بعد السحب من غرفة العمليات؛ (2) تثبيت الأنسجة بشكل صحيح وإزالة الكالسية التي تحافظ على سلامة شكل الأنسجة والحمض النووي الريبي؛ (3) بناء مصفوفات أنسجة موفرة للتكاليف (TMAs) لتقليل تأثيرات الدفعات؛ (4) التهجين في منظار RNAscope وصبغة الكالسيوم النسيجة لمراقبة الجودة؛ و(5) استراتيجية اختيار منطقة الاهتمام (ROI) المصممة خصيصا للشرايين الظنبوب المتكلسة على منصة GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). تشمل هذه الخطوات جميع الإجراءات قبل جمع العينات على جهاز DSP، وتحضير المكتبة، والتسلسل، وتحليل البيانات.

على الرغم من أن هذه المبادئ تظهر على منصة DSP المشار إليها، إلا أنها يمكن أن توجه تحضير الأنسجة لنظام 10X Visium أو منصات أخرى، كما أن المنهجية قابلة للتكيف بسهولة مع طبقات الأوعية الدموية أو نماذج. قد يكون هذا البروتوكول مناسبا للأنسجة البنكية الحيوية وأنسجة ما بعد الوفاة، لكن نجاحه يعتمد بشكل حاسم على حفظ الأنسجة وتثبيتها وظروف تخزينها. يجب تثبيت الأنسجة مباشرة بعد الحصاد لتقليل وقت الإقفاري (ويفضل خلال ساعة واحدة). يوصى باستخدام الفورمالين المحايد المخزن القياسي بنسبة 10٪ (NBF) لمدة لا تقل عن 16 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT). يجب أن تزرع الأنسجة فورا بعد التثبيت ولا تخزن في الإيثانول لأكثر من 3 أيام. تظل كتل البارافين المثبتة في الفورمالين (FFPE) المعالجة والمخزنة تحت الظروف الموصى بها مناسبة للتنميط المكاني لمدة تقارب 3 سنوات، رغم أن جودة الحمض النووي الريبي تتراجع مع تقدم عمر الكتلة. وبناء عليه، يوصى بتقييم جودة الحمض النووي الريبي للعينات منخفضة الخلية، والكتل المخزنة على مدى 6 أشهر، وعينات البنك الحيوي، والأنسجة بعد الوفاة. تعتمد جودة RNA الدنيا المقبولة على الاختبار المختار، واختيار العائد على الاستثمار، والدقة المرغوبة، وتوصيات المنشأة الأساسية. في الواقع، يوصى عادة بوجود حوالي 50-100 نواة لكل جزء لتحقيق نتائج قوية. تدعم منصة DSP كل من FFPE والأنسجة المجمدة الطازجة. في هذا البروتوكول، نركز على أنسجة FFPE.

بينما تركز هذه الدراسة على الترجمة المكانية، إلا أنها مدمجة بسهولة مع scRNA-seq. باستخدام مجموعات بيانات scRNA-seq المنشورة وفك الالتفاف المكاني الحسابي، يمكن تقدير نسب نوع الخلية لكل نقطة مكانية، ويمكن إسقاط حالات الخلايا المعرفة ب scRNA seq على بنية الأنسجة. من خلال الحفاظ على كل من بنية وسلامة الحمض النووي الريبي، يتيح بروتوكولنا التحقق من صحة الخلايا الفردية أو الجزيء الواحد في المراحل النهائية، مما يعزز الرؤية البيولوجية من العينات الوعائية الثمينة ويبنى على نطاق أوسع لعلم النسخ المكاني في أبحاث علم الأحياء الوعائي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع إجراءات جمع عينات شرايين بشرية من قبل مجلس مراجعة قسم الأشخاص البشريين بجامعة واشنطن (IRB) ومجلس مراجعة العينات التابع لنظام رعاية الصحة في فرجينيا بوجيت ساوند (سياتل، واشنطن). تم الحصول على موافقات مكتوبة مستنيرة من المرضى قبل جمع الأنسجة. المواد والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تقليم الأنسجة وتثبيتها

  1. تقليم الأنسجة
    1. جهز حقيبة النقل باستخدام تغليف متعدد الطبقات، يحتوي على أنبوب داخلي، وحاوية ثانوية، وعبوة شحن خارجية، وحقيبة عينات موجهة للخطر البيولوجي. املأ أنبوب الطرد المركزي الداخلي بسعة 50 مل بسعة 30 مل من التخزين وسط Dulbecco المعدل (DMEM) الذي يحتوي على 1٪ من 4-[2-هيدروكسي إيثيل]-1-بيبرازين إيثان سلفونيك أسيد (HEPES) و1٪ بنسلين-ستربتوميسين (P/S).
    2. ضع شرايين الظنبوب الأمامية (AT)، والظنبوب الخلفية (PT)، وشرايين الظنبوب الشظية (PR) (ويفضل > طول 5 سم) بشكل منفصل في أنابيب الطرد المركزي بحجم 50 مل. انقل العلب على الثلج من غرفة العمليات إلى غرفة زراعة الأنسجة.
      ملاحظة: يوصى بأن يكون طول العينة المجمعة لا يقل عن 5 سم للسماح بالنسخ وتخزين الأنسجة بالبرد الكافي لإجراء تقييمات أو التحقق من صحتها.
    3. انقل كل شريان إلى طبق بتري بقطر 100 مم باستخدام الوسط. قم بإزالة الأوسجة الضامة المحيطة بالأوعية الدموية الزائدة باستخدام مقص ومقطط معقم، مع ترك الجدار الشرياني فقط (الأدفنتيسيا للداخل).
      ملاحظة: تعامل مع الأنسجة في خزانة السلامة البيولوجية وقم بتقليم الأنسجة بمحلول تعطيل RNase لمنع تلوث الحمض النووي الريبي. استخدم مشرطات ومقطط معقمة؛ بين العينات، اشطفها بماء معقم وخال من النوكلياز لإزالة البقايا وامسح جيدا بنسبة 70٪ إيثانول.
    4. اشطف الشريان المقصوص لفترة وجيزة باستخدام محلول دولبيكو الملحي الفوسفات المخزن (PBS) في طبق بتري جديد. ضع لوح تقطيع معقم داخل طبق جديد وانقل الشريان عليه.
    5. اقطع الشريان مقطعا عرضيا إلى أجزاء بحجم 1 سم باستخدام شفرة جراحية.
  2. تثبيت الأنسجة وتخزينها
    1. قم بتجميد جزئين في أنابيب التبريد للحفاظ على النيتروجين السائل (LN2) وتخزينهما للأعمال المستقبلية على البروتين/الحمض النووي الريبي.
    2. ضع الأجزاء المتبقية في أنابيب بحجم 15 مل تحتوي على 10٪ من NBF وثبت عند 4 درجات مئوية لمدة 24-48 ساعة للأجزاء الشريانية بطول 1 سم.
      ملاحظة: ينصح باستخدام 10٪ من عدم وجود ال NBF. إذا كنت تستخدم 4٪ بارافورمالديهايد (PFA)، قم بتحضيره حديثا أو تحقق من درجة حموضة محايدة قبل الاستخدام لتقليل ضرر RNA.

2. إزالة الكالسية، معالجة الأنسجة، والتقسيم

  1. جهز محلول إزالة الكالسية: إذابة حمض الإيثيلين-ديامين-رباعي الأسيتيك الصلب (EDTA) إلى 10٪ (بدون ضد) في محلول تثبيت RNA (RSS). الترشيح غير مطلوب. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 9.2 باستخدام حبيبات هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) لإذابة EDTA بالكامل، ثم خفض إلى 5.2 مع 10 M HCl، وهو الرقم الهيدروجيني العامل النموذجي ل RSS ويساعد في الحفاظ على سلامة RNA.
  2. اشطف الأنسجة المثبتة في PBS يدويا لفترة وجيزة. انقل كل عينة إلى أنبوب بسعة 15 مل يحتوي على محلول إزالة الكتليك وحرك على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 72 ساعة.
  3. عند اكتمال إزالة الكالسية، اغسل العينات في PBS (2 × 5 دقائق). ضع الأنسجة في أشرطة كاسيت وحملها في معالج الأنسجة باستخدام برنامج معالجة 4 ساعات.
  4. دمج عدة مقاطع شريان في كل كتلة نسيجية. حدد منطقة الأنسجة المقيدة على الخلف المنزلق وتأكد من أن جميع الأقسام تقع ضمن هذه المنطقة.
  5. قم بتقليم البارافين الزائد. قم بتقسيم الكتل عند 5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم وشفرات منخفضة الارتفاع، وثبت أقسام الأنسجة داخل منطقة الشريحة المحددة.
    ملاحظة: تخلص من الأقسام القليلة الأولى بعد المواجهة وجمع أقسام الأنسجة التالية. استخدم فرش خالية من RNase ونظف حوض الماء بين دفعات العينات.
  6. جهز على الأقل أربعة أقسام تسلسلية لكل كتلة لإجراء صبغات مختلفة وتجربة التحليل المكاني الرقمي (DSP). خزن الشرائح على درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام (ويفضل < 6 أشهر).

3. التهجين الميداني بنظام RNAscope (ISH) والتلوين النسيجي

  1. RNAscope ISH
    1. اخبز شرائح السحب في فرن جاف على حرارة 60 درجة مئوية طوال الليل لتعزيز التصاق الأنسجة بالشرائح.
    2. إزالة البارافين: غمر شرائح في الزيلين (3 × 5 دقائق)، تليها 100٪ إيثانول (2 × 3 دقائق). السحب الجاف عند 60 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
    3. قم بإجراء اختبار RNAscope 2.5 HD Red ISH وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. حجب بيروكسيداز داخلي بنسبة 3٪H2O لمدة 10 دقائق عند العلاج الطبيعي؛ اشطفه بماء مقطر (DI).
    4. حضن الشرائح في مخزن استرجاع مسخن مسبقا بدرجة حرارة 100 درجة مئوية (مخفف بنسبة 1:10 في ماء DI) لمدة 15 دقيقة (استخدم 200 مل من مخزن الاسترجاع لرف يحتوي على ما يصل إلى 24 شريحة في البخار)، واغمس في الإيثانول 100٪ 5 مرات، وسحب شرائح جافة عند 60 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. أنشئ حاجزا كاره للماء للمحاليل حول الأنسجة باستخدام قلم PAP الكاره للماء.
    5. ضع الشرائح في رف فرن التهجين، أضف 200 ميكرولتر من مكمل الإنزيم الهضمي (مخفف مسبقا من قبل البائع في زجاجات القذارة) إلى كل شريحة، وحضن على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. اشطف الشرائح مرتين بماء DI.
    6. طبق مسبار التحكم الإيجابي من PPIB البشري على الشرائح وحضانة لمدة ساعتين عند درجة حرارة 40 درجة مئوية. اغسل الشرائح مرتين في مخزن الغسيل.
    7. قم بتضخيم تسلسلي: AMP1 عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة؛ AMP2 عند 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة؛ AMP3 عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة؛ AMP4 عند 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة؛ AMP5 في RT لمدة 30 دقيقة؛ وAMP6 على RT لمدة 15 دقيقة. اغسل لمدة دقيقتين ودقيقتين بينهما.
    8. أضف محلول سريع أحمر يعمل، ثم احتضن عند RT لمدة 10 دقائق. قم بتصريف، ثم غمره السلايد في ماء DI، ثم غمس 5 مرات في ماء DI العذب. تأكد من أن نقاط التحكم الإيجابية في Ppib تظهر كنقاط حمراء منفصلة ومتقطعة.
    9. قم بصبغ مضاد بمحلول جيل 1 هيماتوكسيلين، ثم غمس 5 مرات في 2 تغيير من ماء DI، والأزرق في هيدروكسيد الأمونيوم 0.02٪، واغمس 5 مرات في تغييرين من ماء DI. تأكد من أن النوى تصبغ باللون الأزرق وأن شكل الأنسجة محفوظ. اترك الشرائح لتجف طوال الليل ثم غط الغطاء باستخدام وسط تركيب.
  2. صبغة أليزارين ريد S
    1. لأقسام تسلسلية إضافية، كرر إزالة البارافين وإعادة الترطيب في الخطوات 3.1.2.
    2. أكد أن محلول Alizin Red S العامل pH هو 4.1-4.3.
    3. اغمر السلايدات في أليزارين الأحمر S لمدة 30-60 ثانية، أو حتى تتطور ترسبات الكالسيوم إلى لون برتقالي-أحمر.
    4. تخلص من الصبغة الزائدة. جفف ب 20 غمسة سريعة في 100٪ أسيتون، ثم 20 غمسة في الأسيتون: الزيلين (1:1).
    5. نظف الزلاجات في حمامين جديدين من الزيلين، كل منهما 3 دقائق. غطاء منزلق مع وسط تركيب.

4. إعداد شرائح DSP في GeoMx واختيار العائد على الاستثمار

  1. قبل البدء، نظف جميع المعدات والحاويات بمحلول تعطيل RNAse وجففها أو شطفها بماء معالج ب DEPC لمنع تلوث RNA. اتبع تعليمات اختبار تحليل التصنيف المكاني للRNA.
  2. اخبز شرائح السحب في فرن جاف على حرارة 60 درجة مئوية طوال الليل لتعزيز التصاق الأنسجة بالشرائح.
  3. إزالة البارافين وإعادة الترطيب: اغمر الشرائح في الزيلين (3 × 5 دقائق)، تليها 100٪ إيثانول (2 × 5 دقائق)، و95٪ إيثانول مخفف في ماء معالج ب DEPC لمدة 5 دقائق. انقل الشرائح إلى 1× PBS لمدة دقيقة واحدة.
  4. حضانة السلايدات في مخزن استرجاع مستضدات مسبقا بدرجة حرارة 100 °C Tris/EDTA pH 9.0 لمدة 20 دقيقة، وانقل الشرائح إلى 1× PBS لمدة 5 دقائق عند RT.
  5. حضن شرائح في بروتيناز K المسخن مسبقا بسعة 1.0 ميكروغرام/مل لمدة 15 دقيقة ثم اشطفها ب 1× PBS لمدة 5 دقائق عند RT.
  6. قم بتثبيط الشرائح بعد التركيب في 10٪ NBF (200 ميكرولتر لكل شريحة) لمدة 5 دقائق عند RT، واغسل في PBS لمدة 5 دقائق.
  7. أزل الشرائح من PBS، واضغط على منشفة ورقية، وامسح السائل الزائد المحيط بالمنديل باستخدام Kimwipe، وضعه في رف التلوين التهجيني.
  8. أضف 200 ميكرولتر من محلول التهجين (مخفف بنسبة 1:10 في المخزن W) إلى كل شريحة وطبق شريحة تهجين. أغلق غرفة التهجين، وأدخلها في الفرن، وحضن الغرفة عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
  9. ينزلق في محلول سترات الملح والصوديوم (SSC، 2×)، ويسمح لانزلاق التهجين بالانزلاق من تلقاء نفسه خلال 5 دقائق.
  10. اغسل الشرائح في محلول غسيل صارم مكون من أجزاء متساوية من 4× SSC وفوراميد منزوع الأيونات عند 37 درجة مئوية، 25 دقيقة لكل غسل. اغسل الشرائح في 2× SSC buffer، دقيقتين لكل غسلة.
  11. قم بإغلاق الشرائح باستخدام Buffer W عند RT لمدة 30 دقيقة.
  12. غط الأنسجة بمحلول الأجسام المضادة الأولية (Rabbit anti-CD45) لمدة ساعة واحدة في صندوق انزلاق غرفة الرطوبة عند RT، ثم اغسله بمحلول SSC 2× 3x.
  13. ضع محلول الأجسام المضادة الثانوي (Magat Anti-Rabbit IgG-AF647) لمدة ساعة واغسله في محلول SSC بسعة 2× SSC.
  14. غط الأنسجة بجسم مضاد موسوم (Mouse Anti-SMA-AF488) لمدة ساعة واحدة في صندوق شرائح غرفة الرطوبة عند RT. اغسل في 2× SSC buffer.
  15. صبغ الشرائح لمدة 10 دقائق في مؤشر نووي 2 ميكرومولار Syto83 مخفف في مخزن W لمدة 10 دقائق.
  16. مسح الشرائح باستخدام أداة تحليل الحمض النووي الريبي لرؤية تلوين العلامات الشكلية (morphologi). اختر العائد على الاستثمار من الآفات القريبة والبعيدة إلى المتكلسة في كل نسيج شرياني، مع توضيح الموقع الخاص بكل عائد على العائد.
    ملاحظة: توخي الحذر لمنع تكون فقاعات الهواء عند تطبيق شريحة التهجين على أقسام الأنسجة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوجه البروتوكول الموضح هنا الباحثين من استلام الشرايين الظنبوب إلى توليد شرائح TMA التي تحتفظ بالشكل وسلامة الحمض النووي الريبي لتحليل النسخ المكاني. كما يوضح الطرق النسيجة لرؤية ترسبات الكالسيوم في الشرايين، وتلوين العلامات الشكلية واستراتيجيات اختيار العائد على العائد.

في الشكل 1، تكون الشرايين ثابتة بنسبة 10٪ من NBF (الخطوة 2). يخترق NBF الأنسجة بسرعة، مما يقلل من تحلل الحمض الريبي، كما أن حاجز الفوسفات الخاص به (pH 7.0) يعادل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول الخطوات المطلوبة لتحضير شرايين الظنبوب البشرية المتكلسة للتحليل المكاني الترانسكريبتومي على جهاز NanoString GeoMx DSP. شرايين الظنبوب، مثل جميع الأوعية، تحتوي على طبقات داخلية متحدة المركز، ووسط، وأدفنتيسيا، وكل منها يحتوي على مجموعات خلاوية مميزة تنظم الإصابة والإصلاح. الحفاظ على بنية هذه الطبقات أمر ضروري لتحليلات النسخ الرمزي بحل الطبقات، ومع ذلك فإن عدة خطوات تحضيرية غالبا ما يتم تجاهلها قد تضر بهذا الهدف.

بعد الحصول على أنسجة الشرايين،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل بمنحة أولية من وزارة شؤون المحاربين القدامى في بوجيت ساوند، وجائزة VA للاستحقاق I01 BX004975-02، والموارد واستخدام المرافق في مركز رعاية الصحة في بيوجيت ساوند.  العمل هو عمل المؤلفين ولا يعكس بالضرورة موقف أو سياسة وزارة شؤون المحاربين القدامى أو حكومة الولايات المتحدة.  نود أن نشكر خدمة التصوير التي تقدمها كلية الأنسجة والتصوير الأساسية (HIC) في جامعة واشنطن.  نود أن نشكر الدكتور شريرام أكيليش على إرشاده في تجارب DSP في جامعة واشنطن ومجموعته في مختبرات MANTIS: مركز UW Spatial Biology.  نود أيضا أن نشكر نيشي إيفانوف في مركز أبحاث السكري بجامعة واشنطن على التلوين النسيجي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
وسط النسر المعدل في دولبيكو (DMEM)، عالي الجلوكوز، بيروفات ثيرمو فيشر العلمي11995065
محلول العزل 4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-بيبرازين إيثانيسلفونيك حمض (HEPES)، 1 Mثيرمو فيشر العلمي15630080
البنسلين-ستريبتوميسين (P/S)، 10,000 وحدة U/mLثيرمو فيشر العلمي15140122
10٪ فورمالين مخزن محايد (NBF)ميليبور سيغما65346-M
حمض الإيثيلين-ديامين-رباعي الأسيتيك (EDTA)ميليبور سيغما3620
حل تثبيت RNAlaterثيرمو فيشر العلميAM7024محلول تثبيت الحمض النووي الريبي (RSS)
بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)شركة التشخيص الخلوي المتقدمة322335
حل استرجاع الأهدافشركة التشخيص الخلوي المتقدمة322001
بروتياز بلسشركة التشخيص الخلوي المتقدمة322331مكمل الإنزيمات الهضمية
DapB (التحكم السلبي)شركة التشخيص الخلوي المتقدمة310043
مخزن غسيل RNAscope (مجموعة اختبار RNAscope 2.5 HD Red ISH)شركة التشخيص الخلوي المتقدمة320058
AMP1شركة التشخيص الخلوي المتقدمة324511
AMP2شركة التشخيص الخلوي المتقدمة324512
AMP3شركة التشخيص الخلوي المتقدمة324513
AMP4شركة التشخيص الخلوي المتقدمة324514
AMP5 الأحمرشركة التشخيص الخلوي المتقدمة324515
AMP6 الأحمرشركة التشخيص الخلوي المتقدمة324516
فاست ريد أشركة التشخيص الخلوي المتقدمة324517
PPIB البشريشركة التشخيص الخلوي المتقدمة313901
جيل s هيماتوكسيلينميليبور سيغماGHS132
استرجاع المستضدات، رقم الهيدروجينات Tris/EDTA 9ثيرمو فيشر العلمي00-4956-58
إنزيم البروتيناز Kثيرمو فيشر العلميAM2546
حل التهجين - HS WTAالنانوترينج121401102
هيبريسليبانزلاق التهجين
حل التهجين-المخزن Rالنانوترينج121300313
الأرنب ضد CD45 الإشارات الخلوية1317
المخزن Wالنانوترينج121300313
ماعز مضاد للأرنب IgG-AF647جاكسون إيمينوسيرسيرش111-605-144
فأرة مضادة ل SMA-AF488 ثيرمو فيشر العلمي53-9760
Syto83 ثيرمو فيشر العلميS11364
شفرة جراحيةبكالوريوس العلوم الحيوية371110
سوبرفروست  Plus Microscope Slidesثيرمو فيشر العلمي1255015
قلم ImmEdge
شفرات الميكروتومثيرمو فيشر العلمي22-500-125
RNase AWAYحل تعطيل RNase
<قوي>معدات
فرن التهجين HybEZ  شركة التشخيص الخلوي المتقدمة321710
الملف المكاني الرقمي GeoMxNanostring النموذج: GeoMx DSP
منصة الوصول إلى البيانات: مركز تحكم GeoMx DSP (الإصدار 3.1.2.12)		إعداد مسح القناة: في FITC، زمن الانفجار هو 300 مللي ثانية، والفلوروفور هو AlexaFluro 488؛ بالنسبة للقناة Cy3، زمن التعريض هو 50 مللي ثانية، والفلوروفور هو Syto83؛ وبالنسبة للقناة Cy5، زمن التعريض هو 300 مللي ثانية، والفلوروفور هو AlexaFluor 647.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rao, A., Barkley, D., França, G. S., Yanai, I. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
  2. Dries, R., et al. Advances in spatial transcriptomic data analysis. Genome Res. 31 (10), 1706-1718 (2021).
  3. Schmitd, L. B., et al. Spatial and transcriptomic analysis of perineural invasion in oral cancer. Clin Cancer Res. 28 (16), 3557-3572 (2022).
  4. Bassiouni, R., et al. Spatial transcriptomic analysis of a diverse patient cohort reveals a conserved architecture in triple-negative breast cancer. Cancer Res. 83 (1), 34-48 (2023).
  5. Hirz, T., et al. Dissecting the immune suppressive human prostate tumor microenvironment via integrated single-cell and spatial transcriptomic analyses. Nat Commun. 14 (1), 663(2023).
  6. Wang, F., et al. Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 9 (24), eadf5464(2023).
  7. Eyers, M., et al. Digital spatial profiling of the microenvironment of muscle invasive bladder cancer. Commun Biol. 7 (1), 737(2024).
  8. Del Rossi, N., Chen, J. G., Yuan, G. C., Dries, R. Analyzing spatial transcriptomics data using giotto. Curr Protoc. 2 (4), e405(2022).
  9. Sona, S., Bradley, M., Ting, A. H. Protocols for single-cell RNA-seq and spatial gene expression integration and interactive visualization. STAR Protoc. 4 (1), 102047(2023).
  10. Ibarra-Lopez, V., et al. Spatial profiling of protein and rna expression in tissue: An approach to fine-tune virtual microdissection. J Vis Exp. (185), e62651(2022).
  11. Mancinelli, L., Schoedel, K. E., Weiss, K. R., Intini, G. Methods to enable spatial transcriptomics of bone tissues. J Vis Exp. (207), e66850(2024).
  12. Sun, P., Li, M., Ye, K. Protocol to decipher complex spatial transcriptomics data using stminer. STAR Protoc. 6 (2), 103838(2025).
  13. Luo, Z., Schmitz, R. J. Protocol for preparing fresh frozen soybean tissues for spatial transcriptomics. STAR Protoc. 6 (2), 103790(2025).
  14. Li, B., et al. Spatial gene expression of human coronary arteries revealed the molecular features of diffuse intimal thickening in explanted hearts. Int J Mol Sci. 26 (5), 1949(2025).
  15. Pelisek, J., et al. Swiss vascular biobank: Evaluation of optimal extraction method and admission solution for preserving RNA from human vascular tissue. J Clin Med. 12 (15), 5109(2023).
  16. Nam, S. K., et al. Effects of fixation and storage of human tissue samples on nucleic acid preservation. Korean J Pathol. 48 (1), 36(2014).
  17. Juwayria,, et al. Microarray integrated spatial transcriptomics (MIST) for affordable and robust digital pathology. NPJ Syst Biol Appl. 10 (1), 142(2024).
  18. Wang, H., et al. Systematic benchmarking of imaging spatial transcriptomics platforms in ffpe tissues. bioRxiv. , (2023).
  19. Smith, K. D., et al. Rigor and reproducibility of spatial transcriptomics performed on clinically sourced human tissues. Lab Invest. 104190, (2025).
  20. Amancherla, K., et al. Dynamic responses to rejection in the transplanted human heart revealed through spatial transcriptomics. bioRxiv. , (2025).
  21. Bolen, M., Xue, Q. -S., Tansey, M. G. Ffpe tissue microarray protocol. , (2024).
  22. Wisner, L., Larsen, B., Maguire, A. Manual construction of a tissue microarray using the tape method and a handheld microarrayer. J Vis Exp. (184), e63086(2022).
  23. Zhao, P., et al. Single-cell RNA-seq reveals a critical role of novel pro-inflammatory endothelial cells in mediating adverse remodeling in coronary artery-on-a-chip. Sci Adv. 7 (34), eabg1694(2021).
  24. Fu, M., et al. Single-cell RNA sequencing of coronary perivascular adipose tissue from end-stage heart failure patients identifies SPP1+ macrophage subpopulation as a target for alleviating fibrosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 43 (11), 2143-2164 (2023).
  25. Mao, A., et al. Single-cell RNA-seq reveals coronary heterogeneity and identifies CD133+ TRPV4high endothelial subpopulation in regulating flow-induced vascular tone in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (3), 653-665 (2024).
  26. Li, C., et al. Single-cell RNA sequencing of the carotid artery and femoral artery of rats exposed to hindlimb unloading. Cell Mol Life Sci. 82 (1), 50(2025).
  27. Deroo, E., et al. A vein wall cell atlas of murine venous thrombosis determined by single-cell RNA sequencing. Commun Biol. 6 (1), 130(2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RNAscope

مقالات ذات صلة