تحضير ومعالجة الشريان المتكلس مع مورفولوجيا محفوظة وRNA للتحليل المكاني الرقمي

Hong Niu; Keisuke Kamada; Emily Beirne; Gale L. Tang

doi:10.3791/69159

يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحضير ومعالجة الشريان المتكلس مع مورفولوجيا محفوظة وRNA للتحليل المكاني الرقمي

3.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69159

⸱

يناير 23, 2026

Hong Niu^*¹ , Keisuke Kamada^*¹ , Emily Beirne² , Gale L. Tang¹^,³

¹Division of Vascular Surgery, Department of Surgery, University of Washington, ²Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of Washington, ³Division of Vascular Surgery, VA Puget Sound Health Care System

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يتضمن هذا البروتوكول سير عمل خطوة بخطوة للعينات الوعائية المتكلسة: معالجة الأنسجة، إزالة الكلس، التحقق من صحة الحمض النووي الريبي، كشف مستوى التكلس، واستراتيجيات اختيار المناطق ذات الاهتمام باستخدام جهاز Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). الهدف هو تقديم طريقة شاملة للحفاظ على شكل نسيج الأوعية الدموية والحمض النووي الريبي لتحليل النسخ المكاني الموثوق.

الملخص

يقوم علم النسخ المكاني برسم خرائط ملفات النسخ الكاملة مباشرة على أقسام الأنسجة، ويربط بين الأحياء الخلوية والتعبير الجيني وكيف تؤثر هذه الأنشطة على الصحة والمرض. على الرغم من أن هذا النهج قد غير علم الأورام وعلوم الأعصاب والمناعة وعلوم النمو والعديد من المجالات، إلا أنه أصبح أقل استخداما في علم الأحياء الوعائي، رغم أن أمراض الأوعية الدموية لا تزال سببا رئيسيا للوفاة على مستوى العالم. يبرز عقبان: الشرايين والأوردة توفر سطحا مسطحا قليلا للتقسيم، والعينات المريضة، غالبا ما تكون تصلب الشرايين أو متخثرة أو محملة باللويحات أو متكلسة، تتطلب علاجات قاسية مثل إزالة الكالسيف التي تعرض الشكل وسلامة الحمض النووي الريبي للخطر. ومع ذلك، فإن هذه الأوعية نفسها، بهياكلها الطبقية المتداخلة من العلاقة المحيطة والوسائط والأدفينتيسيا، مثالية للتحليل المكاني لأن كل طبقة تستضيف أنواعا مختلفة من الخلايا وبرامج جينية تتفاعل عبر الجدار.

قليل من البروتوكولات التفصيلية تتناول كيفية تحضير الأنسجة الوعائية لعلم النسخ المكاني. هذا النقص يحد من قدرة الباحثين على استغلال الإمكانيات الكاملة للتقنية. لسد هذه الفجوة، نقدم سير عمل خطوة بخطوة محسن لشرايين الظنبوب البشرية ذات الآفات المتقدمة. يغطي البروتوكول التعامل مع الأنسجة، والتثبيت، وإزالة الكالسية بشكل صحيح للحفاظ على البنية وجودة الحمض النووي الريبي، يليه التلوين النسيجي لدرجة شدة التكلس. كما نصف بناء مصفوفة الأنسجة الدقيقة (TMA) للحد من تأثيرات الدفعات واستراتيجيات اختيار منطقة الاهتمام (ROI) على جهاز NanoString GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP).

من خلال خفض الحواجز التقنية، يمكن هذا البروتوكول الباحثين في الأوعية الدموية من توليد بيانات نقل وظيفية مكانية موثوقة ودراسة الأنشطة النسخية الخاصة بالطبقة في الأوعية السليمة والمصابة. نتوقع أن يسرع من اكتشاف الآليات الكامنة وراء تكلس، والالتهاب، وتصلب الشرايين الداخلي، وغيرها من الأمراض الوعائية، ويعزز تبني أوسع لعلم النسخ المكاني في علم الأحياء الوعائي.

المقدمة

على مدار العقد الماضي، تقاربت التسلسل من الجيل الجديد والتصوير عالي الدقة لتطوير علم النسخ المكاني، وهو طريقة لقياس النسخ الكامل مع الحفاظ على الموقع الدقيق لكل نسخ في أقسام الأنسجة ^1,2. عند اقترانها بحقل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) الذي ينضج بسرعة، توفر الأساليب المكانية مسارا فعالا لربط التوقيعات الجينية بأنواع خلايا محددة وحالات وأماكن محالف داخل النسيج أو العضو، مما يثري فهمنا لآليات المرض^{بشكل كبير} 3,4,5,6,7