يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

إشارات Neuregulin1-ErbB4 المشاركة في الوخز بالإبر تعزز تجدد المايلين في فئران إصابة الحبل الشوكي

448 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69166

⸱

فبراير 20, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Emergency and Intensive Care Unit, Beijing Anzhen Nanchong Hospital of Capital Medical University & Nanchong Central Hospital, 2Department of Neurology, Beijing Anzhen Nanchong Hospital of Capital Medical University & Nanchong Central Hospital, 3Department of Emergency and Intensive Care Unit, First Affiliated Hospital, Kunming Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تهدف هذه الدراسة إلى دراسة تأثيرات الوخز بالإبر الكهربائية على تجديد الميالين في نموذج الفئران لمرض الحبل الشوكي والتحقق مما إذا كان مسار الإشارة Neuregulin1 (NRG1)-ErbB4 يلعب دورا في هذه العملية.

الملخص

غالبا ما تؤدي إصابة الحبل الشوكي (SCI) إلى خلل عصبي شديد، ويعد إصلاح المايلين خطوة حاسمة في تعافي الوظائف العصبية. العلاج الكهربائي بالإبر الصينية (EA)، وهو طريقة علاجية تجمع بين الوخز بالإبر التقليدي والتحفيز الكهربائي، تم تطبيقه على نطاق واسع في مجال إصلاح الأعصاب. ومع ذلك، لم يتم توضيح مسارات الإشارة المحددة في EA بشكل كامل. تهدف هذه الدراسة إلى دراسة تأثيرات EA على تجديد المايلين في فئران SIP والتحقق مما إذا كان مسار الإشارة Neuregulin1 (NRG1)-ErbB4 يلعب دورا في هذه العملية. تم تحفيز الجرذان المشوه الشوكي بسبب إصابة مشبك تمدد الأوعية الدموية في الجزء الشوكي من T10. تم زرع قسطرة بولي إيثيلين (PE) في قناة الفقرات بين المساحات الفقرية L5-6 وثبتت تحت الجلد لإنشاء نظام طويل الأمد لتوصيل الدواء. تم إعطاء NRG1 الخارجي ومضاده عبر قسطرة PE كل يومين، بحجم 20 ميكرولتر لكل حقنة. تم تطبيق علاج EA في نقاط الوخز بالإبر دازهوي (GV14) ومينغمن (GV4) كل يومين، واستمرت كل جلسة لمدة 30 دقيقة لمدة 4 أسابيع متتالية. أظهرت النتائج أن علاج EA عزز بشكل كبير التعبير عن بروتين الميالين الأساسي (MBP) في أنسجة الحبل الشوكي وحسن الوظائف الحركية للطرف الخلفي لدى الفئران. علاوة على ذلك، أنتج NRG1 الخارجي تأثيرات مشابهة لتأثيرات EA. في الختام، يلعب مسار الإشارة NRG1-ErbB4 دورا مهما في تجديد المايلين الناتج عن EA في فئران الحبل الشوكي.

المقدمة

إصابة الحبل الشوكي هي حالة صادمة تؤدي إلى عجز عصبي شديد، وغالبا ما تظهر بضعف حركي، وفقدان الحواس، وضعف الجهاز العصبي، مع معدل حدوث سنوي يقارب 40-80 حالة لكل مليون شخص حول العالم 1,2. بعد الإصابة، يعد تمزق المحور وفقدان المايلين من السمات المرضية الأساسية التي تعيق توصيل الإشارات العصبية3. يتكون المايلين من الخلايا الأوليغونددرية في الجهاز العصبي المركزي (CNS) وخلايا شوان في الجهاز العصبي الطرفي (PNS)، وسلامة الناخبين حيوية للتوصيل السريع لنبضات الأعصاب4. ومع ذلك، فإن الاستجابة الالتهابية، والإجهاد التأكسدي، وتكون الندبة الدبقية في البيئة الدقيقة المحلية بعد الحبل الشوكي تثبط تجدد المايلين بشكل كبير، مما يؤدي إلى خلل عصبي مزمن5. وفي الوقت نفسه، يؤدي موت الخلايا العصبية التلوثية (OLs) بعد الحبل الشوكي إلى إزالة الميالين من المحاور العصبية، وهي عملية تتطور بشكل مزمن ومستمر. أظهرت الدراسات أن إزالة الميالين المحورية في النماذج البشرية والحيوانية يمكن إصلاحها بفعالية من خلال تجديد المايلين6. لذلك، فإن استكشاف استراتيجيات لتعزيز إصلاح المايلين هو أحد الاتجاهات الرئيسية في علاج التهاب الحبل الشوكي.

الوخز بالإبر، كتقنية طبية تقليدية قديمة، تم تطبيقه على نطاق واسع في الممارسة السريرية عبر عدة دول، بما في ذلك الصين وكورياواليابان. تم اعتماد EA، الذي يجمع بين الوخز بالإبر التقليدي والتحفيز الكهربائي، على نطاق واسع في البيئات السريرية. تظهر الأدلة المتزايدة أن EA له تأثيرات علاجية على أمراض مختلفة، خاصة في تعزيز تجديد المايلين بعد إصابة الحبل الشوكي. اختيار نقاط الوخز بالإبر أمر بالغ الأهمية أثناء علاج EA، مثل GV14 وGV49. تقع GV14 أسفل النتوء الشوكي للفقرة العنقية السابعة، بالقرب من خط منتصف العمود الفقري، بينما تقع GV4 بين النقوش الشوكية للفقرة القطنيةالثانية والثالثة. أظهرت دراسات سابقة أن مسارات الإشارات الالتهابية، والإجهاد التأكسدي، والعوامل العصبية الضارية، والالتهام الذاتي تلعب دورا في إصلاح المايلين الناتج عن EA 10,11,12. علاوة على ذلك، تشير الأدلة المتزايدة إلى أن نقاط الوخز بالإبر المحددة مثل GV14 وGV4 تلعب دورا نشطا في تعزيز تجديد المايلين خلال علاج EA 13,14,15. ومع ذلك، لم يتم توضيح الآليات الجزيئية التي من خلالها EA تجدد الميالين بعد إصابة الحبل الشوكي بشكل كامل.

يعد NRG1 عضوا في عائلة عوامل نمو البشرة، وبناء على منطقته الطرفية الأمية، يمكن تصنيفه إلى ستة أنواع (I-VI)16. يلعب NRG1 وعائلة مستقبلاته، ErbB (ErbB1/2/3/4)، أدوارا مهمة في تطور وإصلاح الجهاز العصبي، بما في ذلك عمليات مثل هجرة الخلايا العصبية، والتمايز، وإعادة التخييم، وتكوين المشابك العصبية. خلال تطور الجهاز العصبي العصبي، تتكاثر خلايا شوان (SCs) وتهاجر على محااور عصبي العصبية لتكوين الميالين، ويلعب مسار الإشارة NRG1-ErbB4 دورا رئيسيا في نضوج خلايا شوان السلفية17,18. أظهرت دراسات سابقة أن مسار إشارات NRG1 يشارك في تمايز الخلايا الجذعية العصبية إلى خلايا شوان ويعزز إصلاح الميالين للخلايا العصبية بعد الشواء19. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت إحدى الدراسات أنه بعد إصابة الحبل الشوكي، يعزز مسار الإشارة NRG1-ErbB4 تحول خلايا الخلايا السلفية للغودد إلى خلايا شبيهة بشوان مع قدرة إعادة ميلين20. أنشأ أليكس وآخرون نظام زراعة مشتركة لخلايا جذعية متعددة القدرات مستحثة من الإنسان وخلايا شوان الجرذانية، ووجدوا أن حجب مسار إشارات NRG1-ErbB بالأدوية يثبط بشكل كبير الميالين العصبي، مما يوفر دليلا مباشرا على دور هذا المسار في تعزيز الميل المحوري الحسي البشري21. أظهرت دراسة أخرى أيضا أن علاج EA يمكن أن يرفع من تعبير NRG1 في الحبل الشوكي ويخفف الألم الالتهابي22.

الأبحاث حول تأثير EA على مسار إشارة NRG1-ErbB4 في SII محدودة، ولا تزال الآليات الأساسية غير واضحة. تهدف هذه الدراسة إلى دراسة ما إذا كان تحفيز EA عند نقاط الوخز بالإبر GV14 وGV4 يمكن أن ينظم نقل الإشارات ل NRG1-ErbB4 ويستكشف دوره المحتمل في تعزيز تجديد الميالين واستعادة الوظائف العصبية لدى فئران الحبل الشوكي. هذه هي الدراسة الأولى التي تفحص العلاقة بين مسار إشارات NRG1-ErbB4 وتجديد المايلين الناتج عن EA في فئران إصابة الحبل الشوكي، مقدمة أدلة تجريبية لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة وفعالة لسرطان الحبل الشوكي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الالتزام بجميع الإرشادات الأخلاقية خلال التجربة لتقليل معاناة الحيوانات. تمت الموافقة على بروتوكول التجربة والتصميم من قبل لجنة التجارب الحيوانية في جامعة كونمينغ الطبية (رقم الموافقة. KMMU2021051) وأجريت وفقا لإرشادات الجامعة لأبحاث الحيوانات. تم الحصول على ذكور بالغة من فئران سبراج-داولي (عمرها 8 أسابيع، وزنه 250-270 جرام، n = 60) من جامعة كونمينغ الطبية (يونان، الصين).

تحضير الحيوانات

تم إيواء الحيوانات في بيئة محكمة ذات رطوبة ثابتة، ودرجة حرارة معتدلة، ودورة ضوء وظلام مدتها 12 ساعة. تم توزيع الحيوانات عشوائيا إلى 11 مجموعة: مجموعة عمليات التشذير (S, n = 6)، مجموعة الحبل الشوكي (M, n = 6)، SCI مع مجموعة معالجة EA (M + EA, n = 6)، SCI مع مجموعة معالجة NRG-1β (M + NRG-1β، n = 6)، SCI مع مجموعة مذيب DMSO 5٪ (M + D، n = 6)، SCI مع مثبط PD158780 ومجموعة معالجة NRG-1β (M + PD+NRG-1β, n = 6)، SCI مع مثبط PD158780 ومجموعة علاج EA (M + EA + PD، n = 6)، SCI مع المذيب ومجموعة علاج EA (M + EA + D، n = 6)، SCI مع shRNA ومجموعة علاج EA (M + EA + shRNA، n = 6)، SCI مع shRNA ومجموعة علاج EA (M + EA + shRNA، n = 6)، SCI مع shRNA غير مستهدف يحتوي على فيروس لينتيفيروس ومجموعة علاج EA (M + EA + NC، n = 6)، SCI مع مجموعة معالجة shRNA (M + shRNA, n = 6). تم تحديد حجم العينة الحالي بناء على خبرتنا السابقة مع نماذج وتدخلات مشابهة، والتي أظهرت باستمرار تأثيرات ذات دلالة كبيرة مع هذا الرقم. علاوة على ذلك، وعلى الرغم من حجم العينة، لاحظنا فروقا إحصائية قوية وذات دلالة في النتائج الرئيسية، مما يعزز الثقة في النتائج المبلغ عنها.

نموذج جرذ SCI

تم استخدام مشبك تمدد الأوعية الدموية من ياسارجيل (تيتانيوم، قوة إغلاق قياسية تبلغ 70 جم) لإنشاء نموذج فأر لمرض الحبل الشوكي باستخدام تقنية المشبك (الشكل 1A). تم تخدير الفئران ببنتوباربيتال الصوديوم بنسبة 2٪ (30 ملغ/كغ، داخل الصفاق) ووضعت على طاولة العمليات. تم إجراء شق بطول 3-4 سم في الجلد الخلفي، تلاه تشريح طبقة بطبقة للأنسجة تحت الجلد والعضلة لكشف النتوءات الشوكية الصدرية والأقواس الفقرية في T9-11. تم استخدام مشبك وعائي لإزالة النتوء الشوكي الصدري T10 وقوس الفقرات، مما كشف الحبل الشوكي بالكامل. تم وضع مشبك تمدد الأوعية الدموية في ياسارجيل عموديا فوق كامل مقطع T10 وأطلق بسرعة بعد فترة توقف استمرت 60 ثانية. كان يعتبر النموذج ناجحا إذا لوحظت علامتان أو أكثر من العلامات التالية: (1) ارتعاش تشنج في الجسم، (2) رد فعل الذيل المتحرك، و(3) علامات قرصة سوداء مرئية على الحبل الشوكي. بعد التأكد من وجود دم دموي كاف، تم تعقيم الجرح وخياطته. في مجموعة العمليات الوهمية، تم إجراء نفس الإجراء، باستثناء أن الحبل الشوكي لم يكن مشبكا. بعد العملية، تلقت الفئران محلول ملحي طبيعي (3 مل، داخل الصفاق) لإعادة الترطيب والبنسلين (100,000 وحدة، داخل الصفاق) مرة في الصباح ومرة في المساء لمدة 3 أيام متتالية لمنع العدوى. تم تقديم المساعدة اليدوية في التبول حتى استعاد التبول التلقائي (مرتين يوميا).

أنابيب داخل الجرذان وتوصيل الأدوية

وفقا لطريقة ستوركسون وآخرين، تم زرع قسطرة في الفضاء تحت العنكبوتية في الفئران قبل أسبوع من تحفيز نموذج الحبل الشوكي. بعد التخدير، تم تثبيت الفئران على طاولة العمليات، وتم كشف المساحة بين الفقرات L5-6. تم استخدام إبرة 19G لاختراق عموديا للجثة الجافية وغشاء العنكبوت. تم التقدم بالإبرة حوالي 1-2 مم، وبعد اختراق غشاء العنكبوتية، شعرت بإحساس بالفراغ، تلاه تدفق واضح لسائل دماغي شوكي، مما يشير إلى نجاح الثقب. تم إدخال قسطرة PE-10 (بولي إيثيلين، قطر داخلي 0.38 مم، قطر خارجي 1.09 مم) في الفراغ تحت العنكبوتية على طول إبرة الثقب. تم دفع القسطرة إلى طول يقارب 3 سم، مع وضع طرف القسطرة بالقرب من جسم الفقرة L3. أثناء الإدخال، لوحظت اهتزاز الذيل وارتعاش الأطراف الخلفية في الفئران، وتدفق سائل دماغي شوكي عبر القسطرة، مما أكد موقع القسطرة داخل الفضاء تحت العنكبوتية.

تم إذابة كل من NRG-1β و PD158780 في ثنائي ميثيل كبريتسيد (DMSO) ثم تم تخفيفهما لاحقا بسائل دماغي شوكي صناعي (ACSF)، مما ضمن بقاء تركيز DMSO النهائي أقل من 0.5٪. كانت تركيزات العمل النهائية 20 نانوميل ل NRG-1β و20 ميكرومولار ل PD15878024. في اليوم الثاني بعد الإصابة بالحبل الشوكي، تلقت الفئران في مجموعة M + NRG-1β حقن داخل القبعة بمقدار 20 ميكرولتر من NRG-1β كل يومين. تم إعطاء الفئران في مجموعة M + EA + PD 20 ميكرولتر من PD158780 داخل الطرف25 ساعة قبل علاج EA.

علاج EA

فياليوم الثالث بعد الجراحة، تم تثبيت الفئران على طاولة العلاج للعلاج بالإبر الكهربائية (EA) عند نقاط الوخز بالإبر GV14 وGV4 (الشكل 1B). تم إدخال إبرتين للوخز بالإبر (0.25 مم × 13 مم) في هاتين النقاطين بعمق 3-4 مم. تم إجراء علاج EA باستخدام جهاز إبر كهربائي بنمط موجي كثيف (موجة متفرقة عند 2 هرتز وموجة كثيفة عند 10 هرتز، بنسبة تردد 1:5). تم ضبط شدة الإخراج على 5 (حوالي 0.5 مللي أمبير) لمدة 30 دقيقة كل يومين.

التقييم السلوكي

تم تقييم وظيفة الحركة الحركية باستخدام مقياس باسو، بيتي، وبريسنهان (BBB)رقم 27، الذي يقيم حركة الأطراف، والمشي، والتنسيق، ووضع الكفوف في النقاط الزمنية التالية: 0، 3، 7، 14، 21، و28 يوما بعد الجراحة ( الشكل 2D). يتراوح مقياس BBB من 0 (يمثل الشلل الكامل) إلى 21 (يشير إلى المشي الطبيعي). تم إجراء جميع التقييمات بشكل مستقل من قبل باحثين اثنين كانا أعمى عن تعيينات مجموعات التجريب.

جمع عينات

بعد انتهاء التجربة، تم تثبيت الفئران المخدرة على منصة تشريح لجمع الأنسجة. تم فتح تجويف البطن لكشف الحجاب الحاجز بالكامل، والذي تم شقه بعناية بمقص القزحية لتجنب إصابة الأوعية الدموية. ثم تم قطع القفص الصدري على طول الحواف الضلعي لكشف القلب، ثم تم إدخال إبرة في البطين الأيسر عند القمة، وتم حقن حوالي 300-400 مل من PBS المبرد مسبقا بسرعة لتطهير الدم الجهازي حتى تدفق سائل شفاف من الأذين الأيمن. لتحليل البروتين الجزيئي، تم إيقاف التروية في هذه المرحلة، وتم تشريح العمود الفقري. بعد إزالة الأضلاع والعضلات المجاورة لكشف الفقرات، تم تحديد جزء T10، وتم جمع قطعة من الحبل الشوكي بطول حوالي 1 سم من الروسترال والذيل إلى T10 باستخدام مقص القزحية، ثم تم تجميده في النيتروجين السائل وتخزينه عند -80 درجة مئوية. للفحص الشكلي، تم تحويل التروية إلى 4٪ بارافورمالديهايد بعد PBS، مع نجاح التثبيت يشير إلى انقباض العضلات وتيبس الجذع. ثم تم تشريح نفس الجزء الفقري بعناية للحفاظ على بنية الأنسجة وتثبيته لاحقا في بارافورمالديهيد بنسبة 4٪ عند 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة.

صبغة الهيماتوكسيلين والإيوزين

وضعت أقسام البرافين في الحبل الشوكي في فرن بدرجة حرارة 60 درجة مئوية للتسخين المسبق لمدة 30 دقيقة. إزالة الشمع: زيلين I لمدة 15 دقيقة تليها زيلين II لمدة 15 دقيقة. إعادة الترطيب: معالجة ب 100٪ إيثانول لمدة دقيقتين، ثم 95٪ إيثانول لمدة دقيقتين، ثم 80٪ إيثانول لمدة دقيقتين، تليها 70٪ إيثانول لمدة دقيقتين. وأخيرا أقوم بالماء المقطر لمدة 5 دقائق. تم تلوين الهيماتوكسيلين لمدة 7 دقائق، تلاها شطفها بالماء المقطر لإزالة محلول التلوين المتبقي. تم إجراء التمايز في كحول حمض الهيدروكلوريك بنسبة 1٪ لمدة 3 ثوان، تلاها شطفه بالماء المقطر لإزالة محلول التلوين المتبقي. تم التنظيف بماء الأمونيا بنسبة 5٪ لمدة دقيقتين، ثم غسل محلول البلوغ المتبقي. تم تلوين الإيوزين لمدة 30 ثانية، ثم شطفها بالماء المقطر لإزالة محلول التلوين المتبقي. تم تجفيف الأجزاء باستخدام 70٪ إيثانول لمدة 10 ثوان، ثم 80٪ إيثانول لمدة 10 ثوان، وأخيرا بإيثانول 100٪ لمدة 30 ثوان. تم تنظيف المحلول بالعلاج بالزيلين لمدة 5 دقائق. بعد تركيبها، تم تجفيف الشرائح بالهواء، وتم التقاط الصور بعد التجفيف.

لوكسول فاست بلوين بلو

تم إزالة الشمع من الأقسام مرتين بالزيلين لمدة 10 دقائق لكل منها، ثم صبغت بمحلول تلوين المايلين LFB، وحضنتها طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، تمت إزالة محلول التلوين الزائد باستخدام 90٪ إيثانول. تم تمييز الأقسام بمحلول تفاضل لوكسول لمدة 10 ثوان (C0631S)، تلاها الغمر في إيثانول 75٪ لمدة 30 ثانية حتى أصبحت المادة الرمادية صافية. وأخيرا، تم تلوين الأقسام بمحلول تلوين الإيوزين لمدة دقيقة واحدة.

البلوط الغربي

تم غلي عينات البروتين في الماء لمدة 5 دقائق. تم تحميل ما مجموعه 5 ميكرولتر من مؤشر البروتين أولا في جل الرحلان الكهربائي، تلاها تحميل متسلسل لعينات البروتين المختبرة. بدأ الرحلان الكهربائي عند 80 فولت حتى يتم فصل نطاقات المؤشرات بوضوح، ثم يرفع الجهد إلى 130 فولت ويستمر حتى اكتمال الرحلان الكهربائي. تم تنشيط أغشية PVDF المقطوعة مسبقا في الميثانول لمدة دقيقة واحدة، ثم وضعت على ورق الفلتر، ووضعت فوقها الجل المحضر. تم نقل البروتين بتيار ثابت قدره 300 مللي أمبير، مع تعديل زمن النقل حسب الوزن الجزيئي (± 10 دقائق). بعد النقل، وضع غشاء PVDF في صندوق حضانة، وشطف بمحلول TBST لمدة 5 دقائق، ثم تم حجبه بحليب خالي الدسم بنسبة 5٪ في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز لمدة ساعتين. تم غسل الغشاء بعد ذلك ثلاث مرات باستخدام مخزن TBST لمدة 5 دقائق لكل منها قبل الحضانة باستخدام الأجسام المضادة الأولية، بما في ذلك GAPDH (1:2000)، توبولين (1:2000)، NRG1 (1:1000)، ErbB4 (1:1000)، وMBP (1:1000)، طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع هز خفيف. في اليوم التالي، تم غسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام مخزن TBST لمدة 5 دقائق لكل مرة، ثم حضن بجسم مضاد ثانوي، مضاد للأرانب (1:4000)، على درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز لمدة ساعتين. بعد الغسل باستخدام TBST، تم تصور أشرطة البروتين باستخدام التلوين الكيميائي. استيراد صورة المربع إلى برنامج ImageJ وإجراء طرح الخلفية باستخدام نصف قطر كرة دوارة يبلغ 50 بكسل. بالنسبة للأشرطة المائلة، استخدم أداة الخط المجزأ لتقويم الأشرطة. استخدم أداة المستطيل لاختيار الشرائط المستهدفة وإنشاء ملف تعريف للكثافة عن طريق اختيار مسارات الرسم لعرض قيم التدرج الرمادي للأشرطة. استخدم أداة Magic Wand لتقسيم القمم واستخراج قيم التدرج الرمادي. بعد حفظ البيانات، استخدم برنامج GraphPad Prism لإنشاء الرسوم البيانية الشريطية.

التألق المناعي

تم إزالة الشمع من أقسام البارافين مرتين مع الزيلين لمدة 10 دقائق لكل منها وأعيد ترطيبها عبر سلسلة إيثانول متدرجة. تم استرجاع المستضدات عن طريق غلي الأقسام في محلول حمض الستريك 5٪ لمدة 15 دقيقة، ثم العرقلة بمحلول 10٪ من مصل الماعز لمدة ساعتين. ثم تم حضنة الأقسام طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية باستخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: NRG-1 وحيد النسيلة للفأر (1:200)، وErbB4 أحادي النسيلة للأرنب (1:300)، وMBP وحيد النسيلة البشري (1:300). بعد ثلاث غسلات باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات يحتوي على 0.1٪ ترايتون X-100 (PBST) لمدة 10 دقائق لكل منها، تم حضان الأقسام لمدة ساعة واحدة في الظلام باستخدام الأجسام المضادة الثانوية التالية: IgG مضاد للفئران الموسوم ب FITC (1:500)، وIgG مضاد للأرانب الموسوم ب FITC (1:500)، وIgG المضاد للإنسان من الماعز الموسوم ب FITC (1:500). تم غسل الأقسام ثلاث مرات باستخدام PBST لمدة 10 دقائق لكل منها، ثم ثبتت وتركيبت بمادة مضادة للتدرج للحفاظ على إشارات الفلورسنت. كانت الزلاجات تخزن عند 4 درجات مئوية في الظلام. بعد تحديد موقع الخلايا المستهدفة تحت عدسة موضوعية بحجم 10x باستخدام مجهر فلوري، انتقل إلى عدسة 40x لالتقاط صورة الفلورة.

تفاعل بوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (RT-PCR)

تم تصميم المبادئات ل ErbB4 والجين المرجعي GAPDH باستخدام موقع NCBI الإلكتروني. كانت تسلسلات البادئات كما يلي: تمهيد أمامية ErbB4 : ACAGCCCTCCTCCTGCCTAC؛ تمهيد ErbB4 العكسي: ATCTCAGCCGTTGCACCCT; الدليل الأمامي GAPDH : CCCAGCTTAGGTTCATCATCAGGT; برايمر عكسي GAPDH : TACGCCAAATCCGTTCACA. تم وضع نسيج الحبل الشوكي بحجم فول الصويا تقريبا في أنبوب طرد مركزي بحجم 1.5 مل، وأضيف 600 ميكرولتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي الكلي. تم تجانس الأنسجة تماما وحضانها على الثلج لمدة 5 دقائق، تلاها الطرد المركزي بقوة 12,000 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم نقل المادة الفائقة إلى أنبوب جديد بسعة 1.5 مل، وأضيف 400 ميكرولتر من الكلوروفورم. تم خلط الخليط جيدا وطرد مركزه عند 12,000 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم نقل المادة الفائقة مرة أخرى إلى أنبوب جديد، وأضيف 400 ميكرولتر من الأيزوبروبانول. تم حضن المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، تلاها الطرد المركزي بحرارة 12,000 × جرام لمدة 10 دقائق. تم التخلص من المادة الفائقة، وغسلت حبيبة RNA ب 400 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 75٪. بعد الطرد المركزي عند 7,500 x g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، تم التخلص من المادة الفائقة، وقلب الأنبوب ليجف في الهواء على سطح نظيف. تم إذابة حبيبة RNA في 60 ميكرولتر من الماء الخالي من الحمض الريني، وخلطها جيدا، وتم قياس تركيز الحمض الريبي. تم تسجيل نقاء وتركيز الحمض النووي الريبي من خلال قياس الامتصاص عند 260 نانومتر و280 نانومتر، مما يضمن أن نسبة 260/280 كانت حوالي 2.0. لتخليق cDNA، تم خلط التفاعل 1 (يحتوي على ممحاة gDNA، إلخ) والتفاعل 2 (يحتوي على نسخ عكسي، إلخ) بشكل كامل، وتم حضن الخليط عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تم إعداد نظام تفاعل PCR الفلوري وفقا لتعليمات مجموعة تخليق cDNA. تمت إضافة عينة بسعة 2 ميكرولتر إلى 23 ميكرولتر من خليط تفاعل PCR، وتم إجراء التضخيم وفقا لبروتوكول مجموعة PCR الكمية الفلورية. تم ضبط درجة حرارة التلدين على 60 درجة مئوية، وكانت شروط التضخيم كما يلي: ما قبل التلدين: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، دورة واحدة؛ تفاعل PCR: 95 °C لمدة 3 ثوان، 60 °م لمدة 30 ثانية، 40 دورة؛ تم إجراء تحليل منحنى التفكك كما يلي: 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، تليها زيادة تدريجية من 60 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية مع اكتساب إشارة فلورية مستمرة. تم قياس وحساب قيم Ct باستخدام برنامج Bio-Rad الحاسوبي، وتم تحديد مستويات mRNA النسبية باستخدام طريقة 2-ΔΔCt .

إرشادات السلامة والتعامل

تثبيت بارافورمالديهايد: استخدم البارافورمالديهايد حصريا في غطاء أبخرة جيد التهوية. ارتد دائما معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE)، بما في ذلك الكمامة، وقفازات، معطف مختبر، ونظارات السلامة. خزن محلول البارافورمالديهايد في وعاء مغلق بإحكام، بعيدا عن مصادر الشمس المباشرة والحرارة. التخلص من النفايات البارافورمالديهايد وفقا لإرشادات السلامة المختبرية لجامعة كونمينغ الطبية بوضعها في حاوية نفايات خطرة.

حل DMSO: يمكن امتصاص DMSO عبر الجلد والدخول إلى الجسم. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات ونظارات السلامة، أثناء التعامل. خزن DMSO في حاوية محكمة الإغلاق بدرجة حرارة الغرفة، بعيدا عن العوامل المؤكسدة القوية. التخلص من نفايات DMSO وفقا لإرشادات السلامة المختبرية لجامعة كونمينغ الطبية بوضعها في حاوية نفايات خطرة.

تخدير بنتوباربيتال: البنتوباربيتال هو مادة خاضعة للرقابة ويجب التعامل معه فقط من قبل أشخاص معتمدين. تجنب التعرض العرضي أثناء التعامل وتأكد من التهوية المناسبة أثناء الاستخدام. ارتد معدات الحماية المناسبة. تخزين البنتوباربيتال في خزانة مغلقة بدرجة حرارة الغرفة، تحت إشراف موظفين معتمدين. التخلص من نفايات البنتوباربيتال وفقا لإرشادات جامعة كونمينغ الطبية للمواد الخاضعة للرقابة، مع ضمان تصاريح الاستخدام السليمة وإجراءات التخلص من النفايات.

التخلص العام من النفايات: يجب التخلص من جميع المواد الكيميائية والكواشف الخطرة وفقا لإرشادات إدارة المختبرات في جامعة كونمينغ الطبية. تأكد من أن جميع المواد النفايات مصنفة بشكل صحيح ووضعها في حاويات مناسبة للتخلص الآمن.

التحليل الإحصائي

أجريت جميع التجارب على ثلاث نسخ أو أكثر. تم تطبيع قيم كثافة النطاق للبروتينات المستهدفة مع تلك الخاصة بمجموعة الضبط لتسهيل المقارنات بين المجموعات. تعرض البيانات كمتوسط (نطاق رباعي) أو متوسط ± انحراف معياري، حيث يمثل n عدد الفئران. بالنسبة للبيانات الموزعة بشكل طبيعي، تم تقييم الفروق ذات الدلالة الإحصائية بين المجموعات باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA). بالنسبة للبيانات غير الموزعة بشكل طبيعي، تم تطبيق اختبار كروسكال-واليس H لمقارنة المجموعات. تم تحديد الدلالة الإحصائية عند p < 0.05.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يظهر تلوين H&E وتسجيل ال BBB التأثيرات الوقائية لتحليل الحقن الشوكي على فئران الحبل الشوكي

تم استخدام التلوين H&E لفحص شكل وبنية خلايا القرن الخلفية للحبل الشوكي (الشكل 2D). كشفت نتائج H&E أنه في المجموعة S، كانت خلايا القرن الخلفية مرتبة بشكل مرتب، مع خطوط خلايا محددة جيدا ونوى مركزية. على النقيض من ذلك، انخفض عدد خلايا القرن الخلفية في المجموعة M، مع ترتيب خلايا غير منظم، وتكون الفراغات، وتضخم الخلايا الدبقية، و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تظهر هذه الدراسة أن علاج EA يخفف من تجويف الحبل الشوكي وإزالة المايلين بعد الحبل الشوكي، مما يعزز إعادة الميالين من خلال زيادة تنظيم تعبير بروتين MBP، وبالتالي يحسن من وظيفة الطرف الخلفي الحركي لدى الفئران. علاوة على ذلك، حددنا مسار الإشارة NRG-1/ErbB4 كوسيط حاسم في إعادة التشكيل العصبي وآلية علاجية محتملة تعزز من خلالها EA إعادة الميالين واستعادة وظيفة الطرف الخلفي الحركية في فئران الحبل الشوكي.

يتم اضطراب توصيل الأعصاب في الحبل الشوكي بسبب عوامل مختلفة، مما ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه لا توجد لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

نشكر المؤلفين على مساهماتهم في هذه الدراسة. وقد حظيت هذه الدراسة بدعم مالي من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC 81960817, 82260387) وبرنامج البحوث الأساسية الخاص بخطة العلوم والتكنولوجيا التابع لإدارة العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة يونان (202301AS070020). مشروع البحث والتطوير العلمي لكلية شمال سيتشوان الطبية (CBY22-QNA20)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجموعة كشف بروتين BCA  بيوتايم بيوتكنولوجيP0012Sتحليل البروتين الكمي
جهاز الوخز بالإبر الكهربائيةجهاز هواتو للوخز بالإبر الكهربائية، SDZ-V، سوتشو—المعدات العلاجية
IgG المعتمد من FITC على شكل ماعز معاد للبشربيوتايمA0556الأجسام المضادة الثانوية الفلورية
IgG المضاد للفئران الماعز الموسوم ب FITCبيوتايمA0568الأجسام المضادة الثانوية الفلورية
IgG المضاد للأرانب المصنف من FITCبيوتايمA0562الأجسام المضادة الثانوية الفلورية
مجهر الفلورةأوليمبوس——
MBP وحيد النسيلة البشريأبكامab209328الأجسام المضادة المحددة
محلول تلوين المايلين LFBسولاربيولوجياG3240صبغة غمد المايلين
ميليبور ECLميليبورWBKLS0100كواشف الكشف
وايد النسيلة NRG-1 في الفأر  سانتا كروزSC-57384الأجسام المضادة المحددة
نانودروب ND-1000لاب تك—
نسخة تجريبية NRG1-1شركة نوفوبروتين تكنولوجيC753بيتا NRG1-1 البشري المؤتلف.
PD158780تقنية GlpBioGC15925مثبط مستقبل عامل النمو الجلدي (EGFR) التيروزين كيناز
قناة PE-10بيكتون، ديكنسون وشركاه427401الحقن داخل القضيب
صوديوم البنسلين للحقنشركة هاربين تشونغجينغ للتكنولوجيا الحيوية80451182العلاج المضاد للعدوى بعد العملية
أرنب أحادي النسيلة ErbB4أبكامAB109273الأجسام المضادة المحددة
مجموعة RNAiso Plusتاكارا9109كواشف RT-PCR
مجموعة كاشف RTتاكاراRR037Aكواشف RT-PCR
الأجسام المضادة الثانويةبيوتايم بيوتكنولوجي—الأجسام المضادة المحددة
الصوديوم بنتوباربيتالسيغما-ألدرتش69020100تخدير الحيوانات
مقطع تمدد الأوعية الدموية ياسارجيلشركة ريبستوك إنسترومنتس GmbH—بناء نموذج إصابة الحبل الشوكي لدى الجرذان

المراجع

  1. McDonald, J. W., Sadowsky, C. Spinal-cord injury. Lancet. 359 (9304), 417-425 (2002).
  2. Mohammadi, E., Villeneuve, L. M., Smith, Z. A. Spinal Cord Injury: The Global Incidence, Prevalence, and Disability From the Global Burden of Disease Study 2019. Spine. 48 (24), 1767(2023).
  3. Anjum, A., et al. Spinal Cord Injury: Pathophysiology, Multimolecular Interactions, and Underlying Recovery Mechanisms. Int J Mol Sci. 21 (20), 7533(2020).
  4. Fang, M., Chen, L., Tang, T., Qiu, M., Xu, X. The committed oligodendrocyte precursor cell, a newly-defined intermediate progenitor cell type in oligodendroglial lineage. Glia. 71 (11), 2499-2510 (2023).
  5. Hellenbrand, D. J., et al. Inflammation after spinal cord injury: a review of the critical timeline of signaling cues and cellular infiltration. J Neuroinflammation. 18 (1), 284(2021).
  6. Pukos, N., et al. Chronic demyelination and myelin repair after spinal cord injury in mice: A potential link for glutamatergic axon activity. Glia. 71 (9), 2096-2116 (2023).
  7. Birch, S., Robinson, N. Acupuncture as a post-stroke treatment option: A narrative review of clinical guideline recommendations. Phytomedicine. 104, 154297(2022).
  8. Jiang, K., Sun, Y., Chen, X. Mechanism Underlying Acupuncture Therapy in Spinal Cord Injury: A Narrative Overview of Preclinical Studies. Front Pharmacol. 13, 875103(2022).
  9. Wang, X., et al. Electroacupuncture at Dazhui (GV14) and Mingmen (GV4) protects against spinal cord injury: the role of the Wnt/β-catenin signaling pathway. Neural Regen Res. 11 (12), 2004-2011 (2016).
  10. Li, S. S., et al. Electroacupuncture treatment improves motor function and neurological outcomes after cerebral ischemia/reperfusion injury. Neural regen res. 17 (7), 1545-1555 (2022).
  11. Liu, C., et al. Electroacupuncture promotes oligodendrocyte differentiation and myelin repair in a rat model of vascular dementia: Investigation of the mechanism from NF-κB-mediated inflammation. Neuroscience. 572, 21-34 (2025).
  12. Tong, T., et al. Electroacupuncture ameliorates chronic unpredictable mild stress-induced depression-like behavior and cognitive impairment through suppressing oxidative stress and neuroinflammation in rats. Brain Res Bull. 206, 110838(2024).
  13. Ahn, S. M., et al. Electroacupuncture ameliorates memory impairments by enhancing oligodendrocyte regeneration in a mouse model of prolonged cerebral hypoperfusion. Sci Rep. 6, 28646(2016).
  14. Kong, Y., Yang, J., Fan, Y. Q., Wang, W. S., Zhang, Y. T. "Huayu Tongluo" moxibustion improves learning-memory ability and promotes myelin regeneration by regulating Sonic Hedgehog signaling pathway in vascular dementia rats. Zhen Ci Yan Jiu. 48 (6), 578-584 (2023).
  15. Chen, W. C., et al. Influence of electroacupuncture of Dazhui (EX-B2) and Mingmen (GV4) on NR2B expression in anterior horns of spinal cord in rats with acute spinal cord injury. Zhen Ci Yan Jiu. 44 (2), 95-101 (2019).
  16. Mei, L., Nave, K. A. Neuregulin-ERBB signaling in the nervous system and neuropsychiatric diseases. Neuron. 83 (1), 27-49 (2014).
  17. Birchmeier, C., Bennett, D. L. Neuregulin/ErbB Signaling in Developmental Myelin Formation and Nerve Repair. Curr Top Dev Biol. 116, 45-64 (2016).
  18. Chen, S., et al. Neuregulin 1-erbB signaling is necessary for normal myelination and sensory function. J Neurosci. 26 (12), 3079-3086 (2006).
  19. Bartus, K., et al. ErbB receptor signaling directly controls oligodendrocyte progenitor cell transformation and spontaneous remyelination after spinal cord injury. Glia. 67 (6), 1036-1046 (2019).
  20. Tao, F., et al. Role of neuregulin-1/ErbB signaling in stem cell therapy for spinal cord injury-induced chronic neuropathic pain. Stem cells. 31 (1), 83-91 (2013).
  21. Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140 (4), 898-913 (2017).
  22. Wan, C., et al. Neuregulin1-ErbB4 Signaling in Spinal Cord Participates in Electroacupuncture Analgesia in Inflammatory Pain. Front Neurosci. 15, 636348(2021).
  23. Tseropoulos, G., et al. Immobilized NRG1 Accelerates Neural Crest like Cell Differentiation Toward Functional Schwann Cells Through Sustained Erk1/2 Activation and YAP/TAZ Nuclear Translocation. Adv Sci (Weinh). 11 (33), e2402607(2024).
  24. Luo, M., et al. Neuronal activity-dependent myelin repair promotes motor function recovery after contusion spinal cord injury. Brain Res Bull. 166, 73-81 (2021).
  25. Hesp, Z. C., Goldstein, E. Z., Miranda, C. J., Kaspar, B. K., McTigue, D. M. Chronic oligodendrogenesis and remyelination after spinal cord injury in mice and rats. J Neurosci. 35 (3), 1274-1290 (2015).
  26. Levy, G., et al. Gtf2i-encoded transcription factor Tfii-i regulates myelination via Sox10 and Mbp regulatory elements. Nat Commun. 16 (1), 8518(2025).
  27. Cescon, M., et al. Gut microbiota depletion delays somatic peripheral nerve development and impairs neuromuscular junction maturation. Gut Microbes. 16 (1), 2363015(2024).
  28. Ayar, Z., et al. The effect of low-level laser therapy on pathophysiology and locomotor recovery after traumatic spinal cord injuries: a systematic review and meta-analysis. Laser Med Sci. 37 (1), 61-75 (2022).
  29. Ghane, N., Beigi, M. H., Labbaf, S., Nasr-Esfahani, M. H., Kiani, A. Design of hydrogel-based scaffolds for the treatment of spinal cord injuries. J Mater Chem B. 8 (47), 10712-10738 (2020).
  30. Laskin, J. J., Waheed, Z., Thorogood, N. P., Nightingale, T. E., Noonan, V. K. Spinal Cord Stimulation Research in the Restoration of Motor, Sensory, and Autonomic Function for Individuals Living With Spinal Cord Injuries: A Scoping Review. Arch Phys Med Rehabil. 103 (7), 1387-1397 (2022).
  31. Li, G., et al. Epidural Spinal Cord Stimulation Promotes Motor Functional Recovery by Enhancing Oligodendrocyte Survival and Differentiation and by Protecting Myelin after Spinal Cord Injury in Rats. Neurosci Bull. 36 (4), 372-384 (2020).
  32. Csomó, K. B., et al. A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats. J Vis Exp. (181), e63534(2022).
  33. Li, J. J., et al. Animal Models for Treating Spinal Cord Injury Using Biomaterials-Based Tissue Engineering Strategies. Tissue eng part b-re. 28 (1), 79-100 (2022).
  34. Coman, I., Barbin, G., Charles, P., Zalc, B., Lubetzki, C. Axonal signals in central nervous system myelination, demyelination and remyelination. J Neurol Sci. 233 (1-2), 67-71 (2005).
  35. Inouye, H., Kirschner, D. A. Evolution of myelin ultrastructure and the major structural myelin proteins. Brain Res. 1641 (Pt A), 43-63 (2016).
  36. Chen, X., Li, H. Neuronal reprogramming in treating spinal cord injury. Neural Regen Res. 17 (7), 1440-1445 (2022).
  37. Huang, S., et al. Protective Effect of Electroacupuncture on Neural Myelin Sheaths is Mediated via Promotion of Oligodendrocyte Proliferation and Inhibition of Oligodendrocyte Death After Compressed Spinal Cord Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1870-1881 (2015).
  38. Kang, Z., et al. Electroacupuncture promotes regeneration and repair of myelin sheath of corpus callosum in demyelination mice. Zhen Ci Yan Jiu. 45 (1), 1-7 (2020).
  39. Zhu, K., et al. Electroacupuncture Promotes Remyelination after Cuprizone Treatment by Enhancing Myelin Debris Clearance. Front Neurosci. 10, 613(2017).
  40. Lu, J. Y., et al. Effects of electroacupuncture at different acupoints on the histomorphology of neurogenic bladder and the expression of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels in interstitial cells of Cajal in a rat model of suprasacral spinal cord injury. Ann Palliat Med. 9 (6), 3830-3838 (2020).
  41. Tu, W. Z., et al. The regulatory effect of electro-acupuncture on the expression of NMDA receptors in a SCI rat model. Life Sci. 177, 8-14 (2017).
  42. Ding, Z., et al. Neuregulin-1 converts reactive astrocytes toward oligodendrocyte lineage cells via upregulating the PI3K-AKT-mTOR pathway to repair spinal cord injury. Biomed Pharmacother. 134, 111168(2021).
  43. Kataria, H., et al. Neuregulin-1 promotes remyelination and fosters a pro-regenerative inflammatory response in focal demyelinating lesions of the spinal cord. Glia. 66 (3), 538-561 (2018).
  44. Schmitd, L. B., et al. Deletion of murine Sarm1 results in a microenvironment that delays peripheral nerve regeneration after injury. Sci Transl Med. 17 (819), eadp9155(2025).
  45. Hu, X., et al. Pan-ErbB inhibition impairs cognition via disrupting myelination and aerobic glycolysis in oligodendrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (45), e2405152121(2024).
  46. Størkson, R. V., Kjørsvik, A., Tjølsen, A., Hole, K. Lumbar catheterization of the spinal subarachnoid space in the rat. J Neurosci Methods. 65 (2), 167-172 (1996).
  47. Rahimi-Movaghar, V., Jazayeri, S. B. When do we start Basso, Beattie, and Bresnahan assessment after experimental spinal cord injury. Acta Med Iran. 51 (8), 5183(2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

علاج الوخز الإبري الكهربائيترميم العصبالبروتين الأساسي للميالينوظيفة الطرف الخلفينقاط الوخز الإبريالبروتين المنظم للنيورون 1 (NRG1) خارجي المنشأمسار الإشارة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.