يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

بروتوكول الميوكين الناجم عن التمرين CLCF1 للتحقيق في آليات حماية العظام RANKL / OPG في هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث

598 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69172

⸱

نوفمبر 7, 2025

 ,  , 
1Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه المقالة بروتوكولا شاملا للتحقيق في عامل السيتوكين الشبيه بالكارديوتروپين 1 (CLCF1) كوسيط ناتج عن التمرين لحماية العظام من خلال تعديل محور RANKL / OPG في هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث.

الملخص

حددت الدراسات الحديثة عامل السيتوكين الشبيه بالكارديوتروفين 1 (CLCF1) على أنه "جزيء شباب" ناتج عن التمرين يتوسط فوائد العضلات والعظام ، ولكنه ينخفض مع تقدم العمر. يصف هذا البروتوكول نهجا منهجيا للتحقيق في الدور التنظيمي ل CLCF1 في حماية العظام بوساطة التمرين عبر آليات الحديث المتبادل للمناعة. تشمل المنهجية تحليل العينات السريرية ، وتقنيات التوصيف الجزيئي ، والمقايسات الوظيفية لتوضيح تأثير CLCF1 على منشط المستقبلات لمحور إشارات العامل النووي - رابط κB (RANKL) / osteoprotegerin (OPG). من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) ، والنشاف الغربي ، وتحرير جينات CRISPR / Cas9 ، وأنظمة الاستزراع المشترك ، يوضح هذا البروتوكول إجراءات الحماية المزدوجة للعظام ل CLCF1 عبر تثبيط ناقضات العظم بوساطة STAT1 وتعزيز بانيات العظم بوساطة STAT3. تتيح الطرق الموصوفة التقييم الشامل لأنماط تعبير CLCF1 ، وتحليلات الارتباط مع معلمات كثافة المعادن في العظام ، والتقييم الميكانيكي لتدخلات العلاج المحتملة لمحاكاة التمرين. على عكس العلاجات التقليدية المضادة للامتصاص التي تستهدف في المقام الأول ناقضات العظم ، قد توفر التدخلات القائمة على CLCF1 ميزة فريدة تتمثل في تعزيز تكوين العظام في نفس الوقت مع تثبيط الارتشاف. يوفر هذا البروتوكول للباحثين إجراءات موحدة للتحقيق في تنظيم التمثيل الغذائي للعظام بوساطة السيتوكينات الناجم عن التمرين ويسهل تطوير التدخلات العلاجية المستهدفة لاضطرابات العظام المرتبطة بالعمر.

المقدمة

يمثل هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث (PMOP) مثالا نموذجيا على التدهور العضلي الهيكلي المرتبط بالعمر حيث يؤدي خلل تنظيم الجهاز المناعي إلى فقدان العظام المرضي1،2،3. على الرغم من أن التمرين معترف به على نطاق واسع باعتباره التدخل غير الدوائي الأكثر فعالية لمنع تدهور العظام المرتبط بالعمر ، إلا أن الآليات الجزيئية الدقيقة الكامنة وراء حماية العظام التي يسببها التمرين ظلت بعيدة المنال حتى وقت قريب4. تطور الفهم المعاصر لعملية التمثيل الغذائي للعظام إلى ما هو أبعد من أطر الغدد الصماء التقليدية ليشمل تفاعلات المناعة العظمية المعقدة والعضلات العضلية التي يسببها التمرين والتي تحكم التوازن الهيكلي5.

يمثل التحديد الأخير لعامل السيتوكين الشبيه بالكارديوتروپين 1 (CLCF1) كعامل ناتج عن التمرين يكافح التدهور العضلي الهيكلي المرتبط بالعمر نقلة نوعية في فهم الحديث المتبادل بين العظاموالعضلات 6. يشرح هذا الاكتشاف الرائد التأثيرات الراسخة للحماية من العظام للتمرين من خلال آلية جزيئية غير معروفة سابقا ، مما يضع CLCF1 كوسيط رئيسي لتقويم العظام الناجم عن التمرين7. أظهرت الفئران المعدلة وراثيا التي تفرط في التعبير عن CLCF1 تكوين العظام المحسنا ، وتحكما محسنا للجلوكوز ، وأداء بدنيا فائقا مقارنة بالضوابط من النوعالبري 6 ، مما يشير إلى أن مكملات CLCF1 يمكن أن تحاكي فوائد التمرين في المجموعات المستقرة أو ضعاف الحركة.

يعرف العلاج بمحاكاة التمرين على أنه تدخلات دوائية تكرر حركية CLCF1 التي يسببها التمرين ، مما يوفر فوائد علاجية مشابهة للنشاط البدني من خلال المسارات الجزيئية8. عامل السيتوكين الشبيه بالكارديوتروفين 1 (CLCF1) ، المعين بدلا من ذلك على أنه نيووروتروفين -1 (NNT-1) أو عامل تحفيز الخلايا البائية -3 (BSF-3) ، ينتمي إلى عائلة السيتوكين الإنترلوكين -6 (IL-6) ويظهر وظائف بيولوجية متعددة الاتجاهات8. يتميز في الأصل بخصائصه العصبية في بقاء الخلايا العصبية الحركية الشوكية وتطورها ، وقد برز دور CLCF1 كميوكين ناتج عن التمرين كمجال مهم للتحقيق. أثبتت الدراسات السريرية الحديثة صحة CLCF1 كمؤشر حيوي لحالة صحة العظام ، مما يدل على أن مستويات بروتين CLCF1 في خلايا الدم المحيطية أحادية النواة تنخفض بشكل كبير لدى النساء بعد انقطاع الطمث المصابات بهشاشة العظام مقارنة بالضوابط الصحية9. أظهرت هذه الدراسات ارتباطات إيجابية بين تعبير CLCF1 وكثافة معادن العظام في مواقع هيكلية متعددة ، مما يوفر التحقق السريري الذي يعزز الإمكانات الانتقالية للتدخلات العلاجية المستهدفة ل CLCF1.

تعمل السيتوكينات من خلال مجمعات مستقبلات غير متجانسة ، بما في ذلك مستقبلات عامل التغذية العصبية الهدبي القابلة للذوبان (sCNTFR) والعامل الشبيه بمستقبلات السيتوكين -1 (CRLF-1) ، لتنظيم الاستجابات الخلوية المتنوعة10،11. أوضحت الدراسات الميكانيكية الحديثة نموذج الإشارات المزدوجة حيث يمنع CLCF1 في نفس الوقت ارتشاف العظام ويعزز تكوين العظام2،6،7،9. يحدث هذا الإجراء المزدوج من خلال محول الإشارة التفاضلية ومنشط تنشيط مسار النسخ (STAT): تتوسط فسفرة STAT1 في قمع ناقضات العظم عن طريق التدخل في منشط المستقبلات لإشارات العامل النووي - الترابط κB (RANKL) الناجم عن العامل النووي - κB (NF-κB) ، في حين أن تنشيط STAT3 في بانيات العظم يعزز التعبير عن علامات تكوين العظام ، بما في ذلك الفوسفاتيز القلوي وأوستيوكالسين.

يظل فهم كيفية ترجمة استجابات التمرين الحادة إلى تكيفات مزمنة للعظام أمرا بالغ الأهمية للتطور العلاجي13. في حين أن ارتفاع CLCF1 الحاد بعد نوبات التمرين الفردية يوفر رؤى ميكانيكية ، فإن الاستجابات الحادة المتكررة على مدى أسابيع إلى شهور قد تؤدي إلى تأثيرات مستدامة لحماية العظام من خلال الإشارات التراكمية والتكيفات الخلوية14.

ينبع الأساس المنطقي للتحقيق في CLCF1 في الفيزيولوجيا المرضية المناعية العظمية من دوره الراسخ في تنظيم الخلايا الليمفاوية البائية والاعتراف بأن الخلايا البائية تشكل منتجين مهمين لكل من RANKL و osteoprotegerin (OPG) 12،13. يعمل منشط المستقبلات لمحور العامل النووي - κB (RANKL) / osteoprotegerin (OPG) كآلية تنظيمية مركزية لتمايز ناقضات العظم وارتشاف العظام14،15. على عكس أفراد عائلة IL-6 الآخرين الذين أظهروا تحكما تنظيميا في توازن الهيكل العظمي من خلال تعديل إعادة تشكيل العظام ، توفر آلية حماية العظام المزدوجة الفريدة من CLCF1 إمكانات علاجية فائقة16،17،18.

تشمل مزايا هذا البروتوكول على المنهجيات الحالية نهجه الشامل لممارسة التحقيق المناعي العظمي ، والذي يتضمن كلا من تحليل الارتباط السريري والدراسات الخلوية الميكانيكية لتوفير رؤى متعدية في تنظيم التمثيل الغذائي للعظام بوساطة CLCF1. يتم تعزيز الأهمية السريرية لهذا البروتوكول من خلال الأدلة الناشئة على أنه يمكن تعديل مستويات CLCF1 من خلال تدخلات نمط الحياة ، مما يضعها كهدف علاجي قابل للتنفيذ لاضطرابات العظام المرتبطة بالعمر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة أخلاقيات البحث المؤسسي (البروتوكول #2024-CHSD-0156) ويلتزم بإعلان مبادئ هلسنكي. امتثلت جميع الإجراءات الحيوانية لإرشادات لجنة رعاية واستخدام المؤسسية (البروتوكول # 2024-037). قدم جميع المشاركين موافقة خطية مستنيرة.

1. جمع العينات السريرية وتقييم التدخل في التمرين

  1. توظيف المشاركين وتقييم تاريخ التمرين
    1. تجنيد النساء بعد انقطاع الطمث اللواتي تتراوح أعمارهن بين 55 و 75 عاما لمدة لا تقل عن 1 سنة بعد انقطاع الطمث.
    2. قم بتقييم تاريخ التمرين التفصيلي ، بما في ذلك تكرار النشاط البدني وشدته ونوعه ومدته على مدار الأشهر الستة الماضية باستخدام استبيانات النشاط البدني الموحدة.
    3. صنف المشاركين إلى مجموعات مستقرة (< 150 دقيقة في الأسبوع) ونشطة بشكل معتدل (150-300 دقيقة في الأسبوع) ونشطة للغاية (> 300 دقيقة في الأسبوع) بناء على إرشادات منظمة الصحة العالمية.
    4. إجراء تقييم شامل للتاريخ الطبي والفحص البدني ، بما في ذلك مراجعة الأدوية وفحص الأمراض المصاحبة.
    5. احصل على قياسات قياس امتصاص الأشعة السينية ثنائية الطاقة (DXA) باستخدام مقياس الكثافة Hologic Discovery A باستخدام برنامج APEX v4.5. قم بإجراء المعايرة اليومية باستخدام شبح العمود الفقري. ضع المريض مستلقيا مع رفع الساقين على كتلة تحديد المواقع وفقا لإرشادات الجمعية الدولية لقياس الكثافة السريرية (ISCD).
    6. تصنيف المشاركين وفقا لمعايير هشاشة العظام لمنظمة الصحة العالمية (درجة T ≤ -2.5 SD).
    7. تطبيق معايير الاستبعاد: العلاج المسبق المضاد لهشاشة العظام خلال 12 شهرا، العلاجات المثبطة للمناعة، أمراض العظام الأيضية، هشاشة العظام الثانوية، أو موانع اختبار التمرين.
  2. تقييم استجابة CLCF1 الناجم عن التمرين
    1. اجمع عينات الدم الأساسية بين الساعة 8:00-10:00 صباحا بعد 12 ساعة من الصيام طوال الليل في أنابيب EDTA.
    2. تنفيذ بروتوكول التمرين الحاد الموحد: 45 دقيقة المشي معتدل الشدة عند 65-70 ٪ الحد الأقصى لمعدل ضربات القلب. احسب الحد الأقصى لمعدل ضربات القلب باستخدام صيغة كارفونين (220 عاما)19. قم بممارسة التمارين الرياضية على جهاز المشي الآلي مع مراقبة مستمرة لمعدل ضربات القلب عبر جهاز مراقبة حزام الصدر. حافظ على سرعة المشي عند 3.5-4.5 كم / ساعة مع تعديل الدرجة لتحقيق معدل ضربات القلب المستهدف.
    3. اجمع عينات الدم بعد التمرين في نقاط زمنية 1 ساعة و 4 ساعات و 24 ساعة لتقييم حركية CLCF1 ، مع الحفاظ على ظروف جمع متسقة.
    4. قم بتخزين أقاليم المصل عند -80 درجة مئوية لقياس كمية CLCF1 اللاحقة. استخدم مجموعة CLCF1 ELISA البشرية بنطاق كشف 31.2-2000 بيكوغرام / مل. تمييع العينات 1: 2 في مخفف الفحص. قم بإعداد منحنى قياسي من 7 نقاط باستخدام تخفيفات تسلسلية 2 ضعف. قم بتشغيل العينات بشكل مكرر. قراءة اللوحات عند 450 نانومتر مع تصحيح الطول الموجي 540 نانومتر. قبول معامل التباين (CV) < 20٪ بين التكرارات.
  3. بروتوكول التدخل في التمارين الطولية
    1. صمم برنامج تمرين تقدمي لمدة 12 أسبوعا مع ثلاث جلسات في الأسبوع.
    2. اجمع عينات الدم في الأساس و 4 و 8 و 12 أسبوعا لتحليل مسار CLCF1.
    3. تقييم تحسينات اللياقة البدنية باستخدام اختبار VO2 max في خط الأساس ونقطة النهاية.
    4. ربط التغيرات CLCF1 بتحسينات BMD المقاسة بواسطة DXA في 12 أسبوعا.
    5. توثيق تكيفات التدريب ، بما في ذلك تحمل التمرين وأنماط التعافي.

2. عزل ومعالجة الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC)

  1. عزل PBMC الأمثل لتحليل CLCF1
    1. اجمع 20 مل من عينات الدم الوريدية في أنابيب تحتوي على EDTA (5 مل EDTA لكل أنبوب) في ظروف معقمة.
    2. معالجة العينات في غضون ساعتين من الجمع للحصول على بقاء الخلية المثلى والحفاظ على تعبير CLCF1.
      1. تمييع عينات الدم 1: 1 بالمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) في درجة حرارة الغرفة. امزج 20 مل من الدم مع 20 مل من PBS.
      2. طبقة الدم المخفف فوق وسط تدرج الكثافة في أنابيب مخروطية 50 مل. استخدم وسط تدرج كثافة 15 مل لكل 20 مل من الدم المخفف (نسبة 1: 1.33).
    3. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بدون فرامل.
    4. قم بشفط طبقة PBMC بعناية في واجهة البلازما-Ficoll باستخدام ماصة باستور المعقمة.
    5. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS الذي يحتوي على 2٪ مصل أبقار الجنين (FBS) عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق.
  2. تقييم صلاحية الخلية وقياس خط الأساس CLCF1
    1. تحديد قابلية الخلية للبقاء باستخدام طريقة استبعاد التربان الزرقاء (الهدف > قابلية البقاء بنسبة 95٪)20.
    2. تقييم تعبير CLCF1 الأساسي داخل الخلايا مباشرة بعد العزل.
    3. اضبط تركيز الخلية إلى 1 × 106 خلايا/مل في وسط مناسب.
    4. تخصيص الخلايا للتطبيقات النهائية أو تخزينها في النيتروجين السائل. قم بتجميد PBMCs في وسط تجميد يحتوي على 90٪ FBS + 10٪ DMSO. استخدم حاوية تجميد بمعدل متحكم فيه عند -1 درجة مئوية / دقيقة إلى -80 درجة مئوية. قم بتخزين 1 مل من الكميات (5 × 106 خلايا / قارورة) في عبوات تبريد.

3. التحليل الكمي الشامل للتعبير الجيني

  1. استخراج الحمض النووي الريبي وتنقيته مع اعتبارات خاصة ب CLCF1
    1. Lyse 1 × 106 PBMCs في 1 مل من كاشف تحلل الحمض النووي الريبي في غضون ساعة واحدة من العزل.
    2. أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم ، دوامة بقوة ، واحتضن لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. جهاز طرد مركزي عند 12,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لتحقيق فصل الطور.
    4. انقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد ، أضف حجما متساويا من الأيزوبروبانول.
    5. قم بترسيب الحمض النووي الريبي بالطرد المركزي عند 12,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    6. اغسل حبيبات الحمض النووي الريبي بنسبة 75٪ إيثانول ، وجففها بالهواء ، وتذوب في ماء خال من النوكلياز.
    7. تقييم سلامة الحمض النووي الريبي باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز أو المحلل الحيوي (RIN المستهدف >7.0).
  2. النسخ العكسي وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي مع مجموعات التمهيدي المحدثة
    1. حدد تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام التحليل الطيفي الضوئي (نسبة الهدف A260/A280 1.8-2.2).
    2. قم بإجراء النسخ العكسي باستخدام 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي مع مجموعة كاشف النسخ العكسي.
    3. تحضير تفاعلات qPCR: قم بإعداد 20 ميكرولتر من التفاعلات تحتوي على 10 ميكرولتر من Master Mix ، و 0.8 ميكرولتر من كل برايمر (مخزون 10 ميكرومتر ، 400 نانومتر نهائي) ، و 2 ميكرولتر من قالب (كدنا) (50 نانومول) ، و 6.4 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. قم بتشغيل ثلاث نسخ. استخدم نظام PCR في الوقت الفعلي.
    4. استخدم تسلسلات التمهيدي التي تم التحقق من صحتها:
      1. CLCF1 إلى الأمام: 5'-CCTCCTGCTTCTTGCCTACC-3',
        الخلف: 5'-TGCCACCATGTTTGTTTCCT-3'
      2. CRLF1 إلى الأمام: 5'-TGAAGCTCATCCTGCAGTTC-3',
        الخلف: 5'-CAGCATCTCCTCCTTGATGC-3'
      3. STAT1 إلى الأمام: 5'-CAGCTTCAGCAGCTTGACTC-3',
        الخلف: 5'-AAGGTCAGCGATGTCTTCAG-3'
      4. STAT3 إلى الأمام: 5'-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3',
        الخلف: 5'-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3'
    5. تنفيذ بروتوكول qPCR: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.
    6. تحليل النتائج باستخدام طريقة 2 (-ΔΔCt) مع تطبيع β-actin21.
  3. تحليل لوحة الجينات للاستجابة للتمرين
    1. تشمل الجينات المستجيبة للتمرين: IL-6 و TNF-α و IL-1β و BDNF و IGF-1 والميوستاتين.
    2. استخدم تسلسلات التمهيدي التي تم التحقق من صحتها:
      1. IL-6 إلى الأمام: 5'-AGCCACTCACCTCTCAGAAC-3',
        الخلف: 5'-GCCTCTTTGCTCTCACAC-3';
      2. TNF-α إلى الأمام: 5'-CCCAGGGACCTCTCTCTTAATC-3',
        الخلف: 5'-ATGGGCTACAGGCTTGTCACT-3';
      3. IL-1β إلى الأمام: 5'-ACAGATGAAGTGCTCCTTCCA-3',
        الخلف: 5'-GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT-3';
      4. BDNF إلى الأمام: 5'-TAACATGGCTGCGCGTGT-3 '،
        الخلف: 5'-CGAGTGGGTCACAGCGGCAG-3';
      5. منتدى إدارة الإنترنت-1 إلى الأمام: 5'-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGGGA-3',
        الخلف: 5'-GCCTCCTTAGATCACAGCTCC-3';
      6. الميوستاتين إلى الأمام: 5'-AGTGACGGGCTCTTTGGAAGA-3',
        الخلف: 5'-GTTTCAGAGGCCGGTCAAGT-3'.
    3. ربط التغيرات الناجمة عن التمرين في CLCF1 بأنماط تعبير الميوكين الأخرى.
    4. تقييم نسب التعبير المشترك CLCF1 / CRLF1 كمؤشرات لتكوين مركب السيتوكين الوظيفي.

4. تحليل تعبير البروتين المحسن مع التركيز على مسار STAT

  1. استخراج البروتين وقياسه كميا لتحليل STAT
    1. Lyse PBMCs في محلول التحلل (150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1٪ NP-40 ، 0.5٪ ديوكسيكولات الصوديوم ، 0.1٪ SDS ، 50 ملي Tris-HCl pH 8.0) مكمل بالبروتياز وكوكتيلات مثبطات الفوسفاتاز.
    2. أضف بعض مثبطات الفوسفاتيز المحددة: أورثوفانادات الصوديوم (1 ملليمتر) وفلوريد الصوديوم (50 ملليمتر) قبل الاستخدام مباشرة.
    3. احتضان التحلل على الجليد لمدة 30 دقيقة مع دوامة دورية بسرعة متوسطة كل 10 دقائق.
    4. جهاز طرد مركزي عند 12,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة الحطام الخلوي.
    5. تحديد تركيز البروتين باستخدام مقايسة برادفورد أو طريقة BCA22.
    6. اضبط تركيزات البروتين على 2 ميكروغرام / ميكرولتر في مخزن مؤقت للعينة وقم بتخزينه عند -80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل لتطبيقات النشاف الغربي.
  2. تحليل شامل للوصمة الغربية مع تركيز إشارات STAT
    1. قم بإعداد 10 مل من المواد الهلامية SDS-PAGE بنسبة 10٪ باستخدام محاليل الأكريلاميد / بيساكريلاميد القياسية.
    2. قم بتحميل 20 ميكروغرام من البروتين لكل حارة جنبا إلى جنب مع علامات الوزن الجزيئي الملطخة مسبقا وحلها عند 120 فولت لمدة 90 دقيقة.
    3. نقل البروتينات إلى أغشية PVDF عند 100 فولت لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية باستخدام عازلة النقل (25 ملي مولار تريس ، 192 ملي جلايسين ، 20٪ ميثانول).
    4. سد الأغشية مع 50 مل من الحليب الجاف الخالي من الدسم 5٪ في محلول ملحي مخزن-Tris مع 0.1٪ Tween-20 (TBST).
    5. احتضان الأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 درجات مئوية: مضاد CLCF1 (1: 1,000); Anti-CRLF1 (1: 1,000); مكافحة OPG (1: 1,000); مكافحة رانكل (1: 1,000); Anti-JAK2 (1: 1,000) ؛ مضاد للفوسفو JAK2 (Tyr1007/1008 ، 1: 1،000) ؛ Anti-STAT1 (1: 1,000) ؛ مضاد للفوسفو-STAT1 (Tyr701 ، 1: 1،000) ؛ Anti-STAT3 (1: 1,000) ؛ مضاد للفوسفو-STAT3 (Tyr705 ، 1: 1،000) ؛ مضاد β الأكتين (1:1,000)
    6. اغسل الأغشية 3 مرات لمدة 10 دقائق مع 15 مل من TBST. احتضان الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
    7. كشف نطاقات البروتين باستخدام ركيزة التلألؤ الكيميائي المحسنة. الصورة باستخدام نظام التصوير الكيميائي مع تحسين التعريض الضوئي التلقائي. حدد الكمية باستخدام تحليل قياس الكثافة باستخدام أداة تحليل الهلام ImageJ v1.53.
  3. تحليل المسار المزدوج STAT1 / STAT3
    1. احسب نسب phospho-STAT1/total STAT1 و phospho-STAT3/total STAT3 باستخدام الإصدار 1.54f من برنامج ImageJ/Fiji.
    2. تقييم توازن تنشيط STAT1 / STAT3 كمؤشر للنشاط الوظيفي CLCF1.
    3. ربط أنماط تنشيط STAT بنسب تعبير RANKL / OPG.
    4. قم بتقييم فسفرة STAT1 / STAT3 عبر اللطخة الغربية في 0 و 15 و 30 و 60 و 120 و 240 دقيقة بعد علاج CLCF1. تطبيع البروتين الفوسفو إلى مستويات البروتين الكلية باستخدام قياس الكثافة.

5. خروج المغلوب الجيني المتقدم بوساطة كريسبر / Cas9 مع التحقق من الصحة

  1. تعزيز بناء ناقلات الفيروسات العدسية
    1. تصميم الحمض النووي الريبي أحادي الدليل (sgRNA) الذي يستهدف تسلسل جينات CLCF1:
      TTGAAGTCTGGCTCGTTGAA-3'.
    2. قم بتضمين تسلسلات sgRNA إضافية لتحسين كفاءة خروج المغلوب:
      GCTTGAACGAGCCAGACTTC-3'.
    3. استنساخ sgRNAs في ناقل الفيروسات العدسية باستخدام تقنيات الاستنساخ الجزيئي القياسية.
    4. تحقق من سلامة البناء من خلال تحليل تسلسل الحمض النووي.
    5. قم بتقييم كفاءة قطع sgRNA باستخدام T7 endonuclease I cisay23.
    6. قم بتضمين التحقق من صحة خصوصية المسار باستخدام مثبطات: AG490 (JAK2 ، 50 ميكرومتر) ، فلودارابين (STAT1 ، 10 ميكرومتر) ، وإحصائي (STAT3 ، 5 ميكرومتر).
    7. قم بإجراء تجارب الإنقاذ باستخدام بنيات STAT النشطة تأسيسيا للتحقق من صحة ضرورة المسار.
  2. بروتوكول نقل فيروسات عدسية محسن
    1. ثقافة خلايا راجي في وسط RPMI-1640 (500 مل) مكملة ب 10٪ FBS. حافظ على جميع مزارع الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. قم بموازنة وسائط الثقافة مسبقا لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
    2. معالجة الخلايا مسبقا بالبوليبرين (8 ميكروغرام / مل) لتعزيز كفاءة التنقل.
    3. إنتاج فيروس عدسي باستخدام خلايا HEK293T مع عبوات وبلازميدات مغلفة عن طريق تعدين فوسفات الكالسيوم. حدد العيار بواسطة p24 ELISA (> 108 TU / مل المطلوبة). اتبع إجراءات احتواء BSL-223.
    4. تحويل الخلايا بفيروس عدسي بتعدد العدوى (MOI) 100. تغيير الوسائط بعد 24 ساعة من النقل. اختيار الخلايا المحولة باستخدام بورومايسين (4 ميكروغرام / مل) لمدة 7 أيام ، ثم تضخيم منطقة 500 نقطة أساس تمتد عبر الموقع المستهدف باستخدام شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية: التمسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، تليها 35 دورة تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتلدين عند 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، مع تمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. لفحص النويكلياز الداخلي T7 ، قم بتفكيك منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل وإعادة تلدينها ، وقم بالهضم باستخدام نوكلياز داخلي T7E1 لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، ثم قم بتحليل المنتجات على جل الاغاروز بنسبة 2٪.
    5. تحقق من كفاءة خروج المغلوب الجيني من خلال النشاف الغربي وتسلسل سانجر24،25.
    6. قم بإجراء تحليل خارج الهدف باستخدام GUIDE-seq أو منهجية مماثلة26.
      ملاحظة: توضح الأدلة الحديثة أن كفاءة إفراز CLCF1 تتطلب تعبيرا مشتركا مع بروتين مرافق CRLF1. ضع في اعتبارك مناهج خروج المغلوب المزدوج للاستئصال الوظيفيالكامل 27.

6. نظام الزراعة المشتركة الشامل مع تقليد التمرين

ملاحظة: للتحقق من الصحة الانتقالية ، التكيف مع نماذج الفئران المبيضة عن طريق إعطاء rhCLCF1 بمعدل 10 ميكروغرام / كجم من الداخل يوميا لمدة 4 أسابيع ، وتقييم كثافة العظام عن طريق التصوير المقطعي المحوسب.

  1. إعداد متقدم للثقافة المشتركة Raji-MG-63
    1. بذور MG-63 خلايا شبيهة بانيات العظم في 24 بئر غرف سفلية بكثافة 2 × 104 خلايا / بئر في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 و 95٪ رطوبة. قم بموازنة الوسائط مسبقا في الحاضنة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام. لتحسين الترجمة ، استبدل بانيات العظم البشرية الأولية (الكثافة 1 × 104 / جيد) من مصادر تجارية.
    2. ضع إدخالات غشاء بحجم المسام 0.4 ميكرومتر في الآبار التي تحتوي على خلايا MG-63.
    3. خلايا راجي البذرية (من النوع البري ، أو CLCF1-بالضربة القاضية ، أو الإفراط في التعبير عن CLCF1) في الغرف العلوية بكثافة 1 × 105 خلايا / بئر.
    4. حافظ على المزارع المشتركة في وسط RPMI-1640 كامل (2 مل في الغرفة السفلية ، 1.5 مل في الغرفة العلوية) لفترات تجريبية محددة (7 ، 14 ، 21 يوما) عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    5. قم بتضمين مجموعات العلاج المؤتلف CLCF1 (5-10 نانوغرام / مل) لتقييم العلاقات بين الجرعة والاستجابة.
  2. بروتوكول علاج CLCF1 لمحاكاة التمرين
    1. عالج أنظمة الزراعة المشتركة بتركيزات فسيولوجية من CLCF1 المؤتلف (5-10 نانوغرام / مل) بناء على المستويات التي يسببها التمرين.
    2. تطبيق نظام العلاج النابض CLCF1: تطبيق CLCF1 لمدة 2 ساعة نبضات في 0 و 8 و 16 ساعة في اليوم 1 ، متبوعا بالتعرض المستمر لمدة 24 ساعة ، ثم كرر الدورة. مدة العلاج الإجمالية: 7 أيام مع 9 نبضات إجمالية.
    3. تقييم التأثيرات المعتمدة على الوقت في 1 ساعة و 4 ساعات و 24 ساعة و 7 أيام بعد العلاج.
    4. راقب حركية الفسفرة STAT1 / STAT3 في كلا مجموعتي الخلايا عبر اللطخة الغربية في 0 ، 15 ، 30 ، 60 دقيقة. الخلايا المحللة في المخزن المؤقت (500 ميكرولتر) مع مثبطات ، تطبيع إلى إجمالي STAT1/3 و β-actin.
  3. تقييم تمايز هقوي العظام المعزز
    1. تحفيز التمايز العظمي باستخدام وسط هشاشة العظام القياسي الذي يحتوي على حمض الأسكوربيك (50 ميكروغرام / مل) ، β-جليسروفوسفات (10 مل) ، وديكساميثازون (10 نانومتر). قم بتغيير الوسط العظمي كل 3 أيام (2 مل الغرفة السفلية ، 1.5 مل الغرفة العلوية). تحضير محلول حمض الأسكوربيك الطازج لكل تغيير ؛ يظل β-الجليسروفوسفات والديكساميثازون مستقرين.
    2. قم بتقييم نشاط الفوسفاتيز القلوي (ALP) باستخدام مقايسة إنزيم الألوان في الأيام 7 و 14 و21 و 28. استخدم 500 ميكرولتر من حجم الاستخراج. اقرأ عند 405 نانومتر. تطبيع إلى إجمالي محتوى البروتين. نطاق الألوان المتوقع: أصفر فاتح (منخفض) إلى أصفر غامق (مرتفع).
    3. تقييم ترسب الكالسيوم من خلال تلطيخ Alizarin Red S وقياسه كميا في اليوم 21. مستخلص يحتوي على 500 ميكرولتر من كلوريد سيتيل بيريدينيوم ، يقرأ عند 540 نانومتر ، نطاق اللون المتوقع: وردي فاتح (تمعدن منخفض) إلى أحمر غامق (تمعدن عالي).
    4. تحديد كمية التمعدن عن طريق قياس الامتصاص عند 540 نانومتر بعد استخراج كلوريد سيتيل بيريدينيوم.
    5. تحليل التعبير الجيني العظمي: RUNX2 و ALP و COL1A1 و OCN و OPGباستخدام بروتوكولات qPCR الموضحة في الخطوة 3.2.
    6. تقييم العلامات المتعلقة باناضم العظام: TRAP و cathepsin K و RANKL في خلايا MG-63.

7. التحليل الإحصائي المتقدم وتفسير البيانات

  1. المنهجية الإحصائية الشاملة
    1. قم بإجراء اختبار الحالة الطبيعية باستخدام اختبار Shapiro-Wilk لجميع المتغيرات المستمرة29. استخدم الاختبارات غير المعلمية عند انتهاك افتراضات الحالة الطبيعية (ص < 0.05).
    2. قم بتطبيق اختبار Mann-Whitney U للمقارنات غير المعلمية بين المجموعات30.
    3. إجراء تحليل ارتباط سبيرمان لدراسات الارتباط بين مستويات CLCF1 والمعلمات السريرية31.
    4. قم بإجراء تحليل انحدار متعدد لتقييم المتنبئين المستقلين ل BMD.
    5. استخدم المقاييس المتكررة ANOVA لتحليل الدورة الزمنية للتدخل في التمرين32.
    6. تطبيق تصحيح Bonferroni للمقارنات المتعددة33.
    7. حدد عتبة الدلالة الإحصائية عند p < 0.05 لجميع التحليلات.
  2. تحسين عرض البيانات وتحليلها
    1. تقديم البيانات المستمرة كمتوسط ± الانحراف المعياري أو الوسيط مع النطاق الربيعي.
    2. قم بإنشاء مخططات ارتباط لتعبير CLCF1 مقابل BMD ، وعدد الخلايا الليمفاوية ، ومعلمات التمرين باستخدام GraphPad Prism v9 للإحصائيات ، و ImageJ v1.53 لقياس الكثافة. لا حاجة إلى برامج نصية مخصصة. إنشاء ROC عبر أداة Prism المدمجة ؛ الارتباطات عبر سبيرمان في المنشور.
    3. قم بإنشاء مخططات الدورة الزمنية لحركية استجابة CLCF1 التي يسببها التمرين.
    4. تطوير منحنيات خصائص تشغيل المستقبل (ROC) ل CLCF1 كمؤشر حيوي لهشاشة العظام.
      ملاحظة: تم إنشاء صور لطخة غربية تمثيلية باستخدام تحليل قياس الكثافة الكمي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يوضح تنفيذ هذا البروتوكول بنجاح الدور التنظيمي ل CLCF1 في عملية التمثيل الغذائي للعظام بوساطة المناعة باستخدام مناهج تجريبية متعددة. تظهر دراسات التحقق السريري انخفاضا كبيرا في تنظيم تعبير CLCF1 في مرضى PMOP مقارنة بالضوابط الأصحاء ، كما هو موضح في الشكل 1 أ ، أظهر تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لخلايا الدم المحيطية أحادية النواة أن مستويات الحمض النووي الريبي النسبية CLCF1 قد انخفضت بشكل ملحوظ في مجموعة PMOP (ن = 109...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر البروتوكول الموضح هنا إطارا منهجيا شاملا للتحقيق في دور CLCF1 كوسيط ناتج عن التمرين لحماية العظام من خلال تحليل منهجي لمحور RANKL / OPG. حددت الأبحاث الحديثة CLCF1 كعامل ناتج عن التمرين يكافح التدهور العضلي الهيكلي المرتبط بالعمر ، مما يجعله وسيطا مركزيا لحماية العظام التي يسببها التمرين34،35،36. يعالج هذا البروتوكول المعزز فجوة معرفية حرجة في علم المناعة العظمية من خلال توفير منهجية موحدة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى أصحاب البلاغ تضارب في المصالح للإعلان.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون المشاركين الذين تطوعوا لهذه الدراسة والموظفين السريريين في المستشفى المركزي التابع لجامعة شاندونغ الطبية الأولى لمساعدتهم في توظيف المرضى وجمع العينات. نشكر فنيي المختبرات على دعمهم لتجارب زراعة الخلايا والبيولوجيا الجزيئية. قام H.Z. بتصميم وتصميم الدراسة ، وإجراء التجارب ، وتحليل البيانات ، وكتابة المخطوطة. ساهم H.L. في التصميم التجريبي وجمع البيانات ومراجعة المخطوطات. أشرف يوسف على المشروع وقدم ملاحظات نقدية وحرر المخطوطة. قام جميع المؤلفين بمراجعة المخطوطة النهائية ووافقوا عليها لتقديمها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<سترونغ>سيل كلتشر ميديا & المواد الكيميائية
كبريتات ثنائي الميثيل (DMSO)سيغما-ألدرتشD2650Purpose_Application:  مكون وسط الحفظ بالتجميد
Specifications_Comments: درجة علم الأحياء الجزيئي، مصفى بالتعقيم
DMEM mediumثيرمو فيشر العلمي11965092Purpose_Application:  متوسط زراعة الخلايا العظمية MG-63
Specifications_Comments: تركيبة عالية الجلوكوز مع L-جلوتامين
مصل الأبقار الجنيني (FBS)ثيرمو فيشر العلمي16000044Purpose_Application:  مكمل زراعة الخلايا (معطل بالحرارة)
Specifications_Comments: تم تعطيله بالحرارة عند 56Â ° C لمدة 30 دقيقة
البنسلين-ستريبتوميسينثيرمو فيشر العلمي15140122Purpose_Application:  مكمل المضادات الحيوية للزراعة المعقمة
Specifications_Comments: مخزون 100X، تركيز نهائي 1٪
بوليبرين (بروميد هيكساديميثرين)سانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةSC-134220Purpose_Application:  معزز تحويل الفيروسات اللينتي
Specifications_Comments: 8 & Icirc; ¼ تركيز العمل في الجاذبية إلى الملليتر
بوروميسين ثنائي الهيدروكلوريدإنفيفوجينالنملة-PR-1Purpose_Application:  مضاد حيوي انتقائي للخلايا المحولة
Specifications_Comments: 4 & Icirc; ¼ تركيز اختيار الجاذبية/مل لمدة 7 أيام
RPMI-1640 متوسطثيرمو فيشر العلمي11875093Purpose_Application:  وسط زراعة خلايا اللمفاوية B-B راجي
Specifications_Comments: مع إل-جلوتامين، بدون الفينول الأحمر المفضل
محلول تريبان بلوثيرمو فيشر العلمي15250061Purpose_Application:  تقييم بقاء الخلية
Specifications_Comments: حل 0.4٪ لاختبار الاستبعاد
حاوية تجميد بمعدل تحكمثيرمو فيشر العلمي5100-0001Purpose_Application:  تجميد الخلايا بمعدل تحكم (-1Â ° C/min)
Specifications_Comments: السيد فروستي أو ما يعادله ل -1Â ° تبريد C/min
أنابيب جمع الدم من EDTAبكالوريوس العلوم الحيوية366643Purpose_Application:  جمع الدم الوريدي باستخدام مضاد التخثر
Specifications_Comments: سعة 10-20 مل، أنابيب علوية بنفسجية
تدرج كثافة Ficoll-Paque PLUSسيتيفا (GE Healthcare)17144003Purpose_Application:  عزل PBMC عبر الطرد المركزي بالكثافة
Specifications_Comments: معقم ومختبر بواسطة السموم الداخلية لفصل الخلايا
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)ثيرمو فيشر العلمي14190144Purpose_Application:  غسل الخلايا وتخفيف المحلول
Specifications_Comments: معقم، درجة زراعة الخلايا
<> الحمض النووي الريبي المقاوم واستخراج qPCR
الكلوروفورم (درجة ACS)سيغما-ألدرتشC2432Purpose_Application:  فصل الطور في استخراج الحمض النووي الريبي
Specifications_Comments: درجة كاشف ACS، ودورة السيرك؛ ‰ ¥ نقاء 99٪
الإيثانول (75٪، درجة جزيئية)سيغما-ألدرتشE7023Purpose_Application:  غسل حبيبات RNA
Specifications_Comments: درجة علم الأحياء الجزيئي، تحضير طازج
الأيزوبروبانول (الدرجة الجزيئية)سيغما-ألدرتشI9516Purpose_Application:  ترسيبات RNA ترسيب
Specifications_Comments: درجة علم الأحياء الجزيئي، ودورة السيرك؛ ‰ ¥ نقاء 99.5٪
مياه خالية من النوكليازثيرمو فيشر العلميAM9930Purpose_Application:  تحضير تفاعل PCR
Specifications_Comments: خالي من DNase/RNase، تم اختباره لتطبيقات PCR
فيلم لاصق بصريثيرمو فيشر العلمي4311971Purpose_Application:  الختم البصري لألواح qPCR
Specifications_Comments: الجودة البصرية لتطبيقات qPCR
ألواح PCR (96-well)ثيرمو فيشر العلميN8010560Purpose_Application:  تنسيق 96 بئر لتقنية qPCR
Specifications_Comments عالية الإنتاجية: أبيض، قاع شفاف للكشف البصري
شرائط أنابيب PCRثيرمو فيشر العلميAB0451Purpose_Application:  تفاعلات PCR صغيرة الحجم
Specifications_Comments: شرائط ب8 أنابيب مع أغطية فردية
مجموعة كاشف RT برايم سكريبتنبذة تاكاراRR037APurpose_Application:  النسخ العكسي للحمض النووي الريبي إلى cDNA
Specifications_Comments: باستخدام ممحاة gDNA لإزالة الحمض النووي الجيني
مزيج SYBR Green Masterأنظمة حيوية تطبيقية4309155Purpose_Application:  تضخيم واكتشاف PCR في الوقت الحقيقي
Specifications_Comments: باستخدام صبغة ROX المرجعية لتطبيع
كاشف تريزول (تحلل RNA)ثيرمو فيشر العلمي15596026Purpose_Application:  تحليل الخلايا واستخراج الحمض النووي الريبي
Specifications_Comments: تخزين في 4Â ° C، استخدمها خلال 6 أشهر
تحليل <القوي>البروتين - ويسترن بلوت
أكريلاميد/بيس-أكريلاميد (29:1)بيو-راد1610146Purpose_Application:  بلمرة جل SDS-PAGE
Specifications_Comments: محلول أكريلاميد بنسبة 30٪
مجموعة اختبار بروتين BCAثيرمو فيشر العلمي23225Purpose_Application:  قياس تركيز البروتين
Specifications_Comments: متوافق مع التقليل لقياس دقيق
ركيزة التوألؤ الكيميائي المعزز (ECL)ثيرمو فيشر العلمي32106Purpose_Application:  كشف البروتينات الكيميائية المتوهجة
Specifications_Comments: كشف حساسية الفيمتوغرام
الحليب الجاف خالي الدسممختبر علمي170-6404Purpose_Application:  عامل حاجز البقع الغربية
Specifications_Comments: درجة الحجب، خلفية منخفضة
كوكتيل مثبط الفوسفاتازروش للعلوم التطبيقية4906845001Purpose_Application:  منع إزالة الفسفرة البروتينية
Specifications_Comments: يشمل حمض الأوكاديك والكاليكولين A
سلم البروتين المسبقبيو-راد1610394Purpose_Application:  معايير الوزن الجزيئي المرجعية
Specifications_Comments: نطاق 10-250 كيلو دالتون مع 11 نطاقا
كوكتيل مثبط البروتيازاتروش للعلوم التطبيقية11697498001Purpose_Application:  منع تحلل البروتين أثناء التحليل
Specifications_Comments: خال من EDTA للفوسفاتاز المعتمد على المعادن
أغشية PVDF (0.45 & Icirc؛ ¼ m)ميليبور سيغماIPVH00010Purpose_Application:  غشاء نقل البروتين (0.45 & Icirc؛ ¼ m pore)
Specifications_Comments: خلفية فلورية منخفضة
مخزن تحليل RIPAتقنية الإشارة الخلوية9806SPurpose_Application:  استخراج بروتين الخلايا الكاملة
Specifications_Comments: محلول تحلل جاهز للاستخدام مع المنظفات
مخزن تحميل العينة (4X)بيو-راد1610747Purpose_Application:  تحضير عينات البروتين ل SDS-PAGE
Specifications_Comments: تحميل الصبغة ب Icr; ²-ميركابتوإيثانول
مخزن SDS-PAGE الجاريبيو-راد1610732Purpose_Application:  الرحلان الكهربائي البروتيني
Specifications_Comments: نظام المخزن الثلاثي-جلايسين-SDS
فلوريد الصوديومسيغما-ألدرتش201154Purpose_Application:  تثبيط إضافي للفوسفاتاز
Specifications_Comments: تركيز عمل 50 ملليمولار
الصوديوم أورثوفاناديتسيغما-ألدرتشS6508Purpose_Application:  حفظ الفسفرة JAK2/STAT
Specifications_Comments: تركيز عمل 1 ملليمول، تحضير طازج
مركز المخزن الانتقاليبيو-راد1704156Purpose_Application:  نقل البروتين شبه الجاف
Specifications_Comments: مركز 10X، مخفف قبل الاستخدام
محلول ملحي معبأ بثلاثي مع Tween-20 (TBST)تقنية الإشارة الخلوية9997SPurpose_Application:  غسل الغشاء وتخفيف الأجسام المضادة
Specifications_Comments: 0.1٪ توين-20، درجة الحموضة 7.6
<قوي>كريسبر/تحرير الجينات
مجموعة نقل فوسفات الكالسيومبروميغاE1200Purpose_Application:  نقل الحمض النووي إلى خلايا التغليف
Specifications_Comments: كفاءة عالية في النقل لإنتاج فيروسات العدسة
مجموعة استخراج جل الحمض النوويتشياغن28706Purpose_Application:  تنقية منتجات PCR للتسلسل
Specifications_Comments: نظام تنقية قائم على الأعمدة
ناقل GV371 اللينتيفيروسالشركة جينكيم المحدودةGV371Purpose_Application:  تعبير كريسبر/كاس9 لجين الضرب
Specifications_Comments: نظام لينتيفيروسات CRISPR/Cas9 المستعد للاستخدام
HEK293T خط الخليةATCCCRL-3216Purpose_Application:  خط خلايا تغليف لينتيفيروس
Specifications_Comments: خط خلايا تغليف قابلة للنقل القابل للنقل
خدمة تسلسل سانجرشركة ماكروجينتقليدPurpose_Application:  التحقق من الإغلاق والتحليل غير الهدفي
Specifications_Comments: تسلسل قياسي مع تمهيدات مخصصة
T7 إندونوكلياز Iمختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةM0302SPurpose_Application:  التحقق من كفاءة القطع في كريسبر
Specifications_Comments: إبطان النوكلياز الخاص بعدم التطابق للتحقق من صحة كريسبر
<سترونغ>إليسا & اختبارات مناعة
ألواح ELISA (96 بئر، قاع مسطح)كورنينج3590Purpose_Application:  تفاعل الركيزة ELISA
Specifications_Comments: عالي الارتباط ومسطح القاع ل ELISA
ELISA مجموعة ثنائية CLCF1 البشريةR& دي سيستمزDY1234Purpose_Application:  قياس كمية بروتين CLCF1 (31.2-2000 بيغم/مل)
Specifications_Comments: نطاق الكشف: 31.2-2000 pg/mL، CV & 10%
p24 مجموعة إليسا (عيار لينتيفيرال)شركة زيبتوميتريكس801111Purpose_Application:  تحديد عيار اللينتيفيرال
Specifications_Comments: لتحديد عيار العدسة الفيروسية (>10â ¸ TU/mL)
<اختبارات قوية>وظيفية
مجموعة تلطيع أليزارين ريد إسسيغما-ألدرتشA5533Purpose_Application:  تصور ترسيب الكالسيوم
Specifications_Comments: محلول 2٪ في ماء مقطر، درجة حموضة 4.1-4.3
مجموعة نشاط الفوسفاتاز القلويأبكامab83369Purpose_Application:  قياس النشاط الإنزيمي ALP
Specifications_Comments: اختبار لوني، يقرأ عند 405 نانومتر
حمض الأسكوربيك (L-أسكوربيك اسكوربك)سيغما-ألدرتشA4544Purpose_Application:  مكون الوسط العظامي
Specifications_Comments: 50 & Icirc; ¼ تركيز نهائي للغ/ملتر
كلوريد سيتيل بيريدينيومسيغما-ألدرتشC9002Purpose_Application:  استخراج Alizarin Red S للقياس
Specifications_Comments: محلول 10٪ لاستخراج الصبغة
ديكساميثازونسيغما-ألدرتشD4902Purpose_Application:  مكون وسط العظام
Specifications_Comments: تركيز نهائي 10 نانومتر
Î ²-جليسروسفاتسيغما-ألدرتشG9422Purpose_Application:  مكون وسط العظام
Specifications_Comments: تركيز نهائي 10 ملليمولار
وسط التمايز العظميبروموسيلC-28010Purpose_Application:  تحفيز تمايز الأرواستيات العظمية
Specifications_Comments: وسط تقويمي كامل جاهز للاستخدام
إدخالات زراعة الخلايا في ترانسويل (0.4 & Icirc؛ ¼ m)كورنينج3470Purpose_Application:  نظام الزراعة المشتركة مع 0.4 & Icirc; ¼ فصل m
Specifications_Comments: غشاء تيريفثالات بولي إيثيلين، عقيم
Equipment - الآلات الرئيسية
الطرد المركزي (عالي السرعة، مبرد)إبندورف5430RPurpose_Application:  معالجة العينات وفصل الخلايا
Specifications_Comments: مبرد، الحد الأقصى 30,000 × g
نظام تصوير الإضاءة الكيميائيةمختبرات بيو-راد12003154Purpose_Application:  تصوير وقياس البلوط الغربي
Specifications_Comments: توثيق الجل وتصوير البقعة الغربية
حاضنة ثاني أكسيد الكربون (مرطبة)ثيرمو فيشر العلمي51030287Purpose_Application:  صيانة زراعة الخلايا (37Â ° C، 5٪ CO2)
Specifications_Comments: ثلاثي الغاز (CO2/O2/N2)، التحكم في الرطوبة
جهاز مراقبة معدل ضربات القلب (حزام الصدر)بولار إلكتروH10Purpose_Application:  المراقبة المستمرة لمعدل ضربات القلب
Specifications_Comments: الاتصال بالبلوتوث، وAcirc; ± دقة 1 نبضة في الدقيقة
جهاز Hologic Discovery جهاز DXAشركة هولوجيكالاكتشاف أPurpose_Application:  قياس كثافة المعادن العظمية
Specifications_Comments: مع برنامج APEX v4.5، يتطلب مراقبة جودة يومية
قارئ الميكروبليت (متعدد الأوضاع)بيوتيك إنسترومنتسالتآزر H1Purpose_Application:  قراءة وقياس الامتصاص للوحة ELISA
Specifications_Comments: الأشعة فوق البنفسجية، الفلورة، كشف التلميع
جهاز المشي الآليلايف فيتنس95TiPurpose_Application:  التدخل الرياضي المعياري
Specifications_Comments: السرعة المتغيرة من 0 إلى 16 كم/س، 0-15٪ انحدار.
نظام PCR في الوقت الحقيقي (CFX96 أو ما يعادله)مختبرات بيو-راد1855195Purpose_Application:  تضخيم وكشف PCR في الوقت الحقيقي
Specifications_Comments: كتلة بسعة 96 بئرا، قادرة على التدرج
software & أدوات التحليل
برنامج APEX الإصدار 4.5 (تحليل DXA)شركة هولوجيكالإصدار 4.5Purpose_Application:  تحليل DXA وحساب BMD
Specifications_Comments: تحليل BMD مع قاعدة بيانات مرجعية
مايسترو Bio-Rad CFXمختبرات بيو-رادCFX مايستروPurpose_Application:  تحليل بيانات qPCR وتحديد CT
Specifications_Comments: تحليل PCR في الوقت الحقيقي وتصدير البيانات
GraphPad Prism v9.0برنامج جراف بادالإصدار 9.0Purpose_Application:  التحليل الإحصائي وتوليد الرسوم البيانية
Specifications_Comments: برنامج إحصائي مع توليد الرسوم البيانية
ImageJ/Fiji v1.53المعاهد الوطنية للصحةالإصدار 1.53Purpose_Application:  قياس كثافة النقاط الغربية وتحليل الصور
Specifications_Comments: تحليل الصور باستخدام أدوات القياس
مايكروسوفت إكسل 365شركة مايكروسوفت365Purpose_Application:  تنظيم البيانات والحسابات الأساسية
Specifications_Comments: تنظيم البيانات والوظائف الإحصائية الأساسية
<قوي>مستهلك ومواد استهلاكية أدوات بلاستيكية
أنابيب الطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 ملإبندورف22363204Purpose_Application:  تخزين ومعالجة العينات بحجم صغير
Specifications_Comments: خالي من DNase/RNase ومنخفض الارتباط
أنابيب مخروطية بسعة 15 ملكورنينج430766Purpose_Application:  معالجة عينات متوسطة الحجم
Specifications_Comments: بولي بروبيلين، مدرج مع أغطية
ألواح زراعة الخلايا ذات 24 بئركورنينج3524Purpose_Application:  إعداد الزراعة المشتركة والاختبارات الوظيفية
Specifications_Comments: معالجة زراعة الأنسجة، قاع مسطح
أنابيب مخروطية بسعة 50 ملكورنينج430829Purpose_Application:  جمع عينات ومعالجتها بكميات كبيرة
Specifications_Comments: بولي بروبيلين، مدرج مع أغطية
الكرايوفيال (1 مل)ثيرمو فيشر العلمي375418Purpose_Application:  تخزين الخلايا والعينات طويل الأمد عند -80Â ° C
Specifications_Comments: خيط خارجي، ختم O-ring، -196Â ° تصنيف C
معابد باستور (عقيمة)فيشر ساينتيفك13-678-20APurpose_Application:  جمع عينات معقمة ونقلها
Specifications_Comments: ملفوفة بشكل فردي، معقمة

المراجع

  1. Rachner, T. D., Khosla, S., Hofbauer, L. C. Osteoporosis: now and the future. Lancet. 377 (9773), 1276-1287 (2011).
  2. Chen, X., et al. Association of cardiotrophin-like cytokine factor 1 levels in peripheral blood mononuclear cells with bone mineral density and osteoporosis in postmenopausal women. BMC Musculoskelet Disord. 22 (1), 62(2021).
  3. Ilesanmi-Oyelere, B. L., et al. Inflammatory markers and bone health in postmenopausal women: a cross-sectional overview. Immun Ageing. 16, 15(2019).
  4. Ahn, N., Kim, K. Effects of 12-week exercise training on osteocalcin, high-sensitivity C-reactive protein concentrations, and insulin resistance in elderly females with osteoporosis. J Phys Ther Sci. 28 (8), 2227-2231 (2016).
  5. Graves, D. T., Li, J., Cochran, D. L. Inflammation and uncoupling as mechanisms of periodontal bone loss. J Dent Res. 90 (2), 143-153 (2011).
  6. Kang, J. S., et al. Exercise-induced CLCF1 attenuates age-related muscle and bone decline in mice. Nat Commun. 16 (1), 4743(2025).
  7. Sims, N. A. Cardiotrophin-like cytokine factor 1 (CLCF1) and neuropoietin (NP) signalling and their roles in development, adulthood, cancer and degenerative disorders. Cytokine Growth Factor Rev. 26 (5), 517-522 (2015).
  8. Oliveira, M. C., Vullings, J., van de Loo, F. A. J. Osteoporosis and osteoarthritis are two sides of the same coin paid for obesity. Nutrition. 70, 110486(2020).
  9. Yokota, S., et al. Cardiotrophin-like cytokine factor 1 alleviates bone loss in osteoporosis mouse models by suppressing osteoclast differentiation through activating interferon signaling and repressing the nuclear factor-κB signaling pathway. Bone. 153, 116140(2021).
  10. Ponzetti, M., Rucci, N. Updates on osteoimmunology: what's new on the cross-talk between bone and immune system. Front Endocrinol (Lausanne). 10, 236(2019).
  11. Larsen, J. V., et al. Cytokine-like factor 1, an essential facilitator of cardiotrophin-like cytokine:ciliary neurotrophic factor receptor α signaling and sorLA-mediated turnover. Mol Cell Biol. 36 (8), 1272-1286 (2016).
  12. de Vries, T. J., et al. What are the peripheral blood determinants for increased osteoclast formation in the various inflammatory diseases associated with bone loss. Front Immunol. 10, 505(2019).
  13. Weitzmann, M. N. The role of inflammatory cytokines, the RANKL/OPG axis, and the immunoskeletal interface in physiological bone turnover and osteoporosis. Scientifica (Cairo). 2013, 125705(2013).
  14. Srivastava, R. K., Dar, H. Y., Mishra, P. K. Immunoporosis: immunology of osteoporosis-role of T cells. Front Immunol. 9, 657(2018).
  15. Ming, J., Cronin, S. J. F., Penninger, J. M. Targeting the RANKL/RANK/OPG axis for cancer therapy. Front Oncol. 10, 1283(2020).
  16. Sobacchi, C., Menale, C., Villa, A. The RANKL-RANK axis: a bone to thymus round trip. Front Immunol. 10, 629(2019).
  17. Wang, T., He, C. TNF-α and IL-6: the link between immune and bone system. Curr Drug Targets. 21 (3), 213-227 (2020).
  18. Jones, S. A., Jenkins, B. J. Recent insights into targeting the IL-6 cytokine family in inflammatory diseases and cancer. Nat Rev Immunol. 18 (12), 773-789 (2018).
  19. Villafaina, S., Biehl-Printes, C., Parraca, J. A., de Oliveira Brauner, F., Tomas-Carus, P. What mathematical models are accurate for prescribing aerobic exercise in women with fibromyalgia. Biology (Basel). 11 (5), 704(2022).
  20. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  21. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(−ΔΔC(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  22. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Bradford assay for determining protein concentration. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (4), 102269(2020).
  23. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Sci Rep. 8 (1), 888(2018).
  24. Mousavi Kahaki, S. A., Ebrahimzadeh, N., Fahimi, H., Moshiri, A. Development of an optimized protocol for generating knockout cancer cell lines using the CRISPR/Cas9 system, with emphasis on transient transfection. PLoS One. 19 (11), e0310368(2024).
  25. Eren, K., Taktakoğlu, N., Pirim, I. DNA sequencing methods: from past to present. Eurasian J Med. 54 (Suppl1), 47-56 (2022).
  26. Wienert, B., Wyman, S. K., Yeh, C. D., Conklin, B. R., Corn, J. E. CRISPR off-target detection with DISCOVER-seq. Nat Protoc. 15 (5), 1775-1799 (2020).
  27. Crisponi, L., Buers, I., Rutsch, F. CRLF1 and CLCF1 in development, health and disease. Int J Mol Sci. 23 (2), 992(2022).
  28. Ansari, S., Ito, K., Hofmann, S. Alkaline phosphatase activity of serum affects osteogenic differentiation cultures. ACS Omega. 7 (15), 12724-12733 (2022).
  29. Ghasemi, A., Zahediasl, S. Normality tests for statistical analysis: a guide for non-statisticians. Int J Endocrinol Metab. 10 (2), 486-489 (2012).
  30. Rousseaux, C. G., Gad, S. C. Haschek and Rousseaux's handbook of toxicologic pathology. , 3rd ed, Academic Press. (2013).
  31. Spiegelman, D. Commentary: some remarks on the seminal 1904 paper of Charles Spearman: the proof and measurement of association between two things. Int J Epidemiol. 39 (5), 1156-1159 (2010).
  32. Cleophas, T. J., Zwinderman, A. H., van Ouwerkerk, B. M. Methods for analyzing cardiovascular studies with repeated measures. Neth Heart J. 17 (11), 429-433 (2009).
  33. Haynes, W. Encyclopedia of systems biology. , Springer. New York. (2013).
  34. Kang, J. S., et al. Exercise-induced CLCF1 attenuates age-related muscle and bone decline in mice. Nat Commun. 16 (1), 4743(2025).
  35. Zhao, C., Gong, Y., Zheng, L., Zhao, M. Untargeted metabolomic reveals changes in muscle metabolites of mice during exercise recovery and mechanisms of whey protein and whey protein hydrolysate in promoting muscle repair. Food Res Int. 184, 114261(2024).
  36. Koltun, K. J., et al. Effect of acute resistance exercise on bone turnover in young adults before and after concurrent resistance and interval training. Physiol Rep. 12 (3), e15906(2024).
  37. Li, J. JAK-STAT and bone metabolism. JAK-STAT. 2 (3), e23930(2013).
  38. Sims, N. A. The JAK1/STAT3/SOCS3 axis in bone development, physiology, and pathology. Exp Mol Med. 52 (8), 1185-1197 (2020).
  39. Zhao, X., et al. Puerarin alleviates osteoporosis in rats by targeting the JAK2/STAT3 signaling pathway. Biomol Biomed. 24 (6), 1651-1661 (2024).
  40. Terpos, E., Ntanasis-Stathopoulos, I., Gavriatopoulou, M., Dimopoulos, M. A. Pathogenesis of bone disease in multiple myeloma: from bench to bedside. Blood Cancer J. 8 (1), (2018).
  41. Okamoto, K., et al. Osteoimmunology: the conceptual framework unifying the immune and skeletal systems. Physiol Rev. 97 (4), 1295-1349 (2017).
  42. Sims, N. A. Influences of the IL-6 cytokine family on bone structure and function. Cytokine. 146, 155655(2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مايوكين CLCF1سيتوكين مستحث بالتمرينتأشير RANKL OPGالتآثر المناعي العظميتحليل qPCRلطخة ويسترنتحرير الجينات بتقنية CRISPRتثبيط ناقضات العظم
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.